Download Factores que determinan el resultado de la transferencia no

FACTORES QUE DETERMINAN EL RESULTADO DE LA
TRANSFERENCIA NO QUIRURGICA DE EMBRIONES BOVINOS
Cutini, A.1 , Teruel, M.2 y Cabodevila, J.3
Trabajo Publicado en la Revista Taurus Nº 7: 28-39 y Nº 8: 35-47, 2000
Resumen
Los porcentajes de preñez que se obtienen luego de la transferencia no
quirúrgica de embriones se han incrementado de manera significativa en las
últimas décadas. No obstante, se considera factible mejorar la eficiencia de la
técnica en la que intervienen factores relacionados con el embrión, con la
receptora y con la transferencia propiamente dicha, produciéndose además
interacciones entre ellos. Dentro de los factores embrionarios, la calidad influye
claramente en el resultado de la transferencia, independientemente de que los
embriones sean frescos, criopreservados, micromanipulados y/o producidos in
vitro. La congelación afecta la viabilidad de los embriones producidos in vivo,
no obstante, como las diferencias no son sustanciales se compensan con las
ventajas que la técnica trae aparejada. La viabilidad pos transferencia de los
embriones producidos in vitro y/o micromanipulados es marcadamente inferior
a la de los embriones producidos in vivo, tales diferencias se acrecientan
cuando dichos embriones son criopreservados. En la selección de receptoras
son más importantes las condiciones de crianza, el manejo sanitario y el estado
nutricional de las mismas que su raza o categoría. Al momento de la
transferencia, la receptora ideal es aquella con sincronismo o con un
asincronismo de ±24 hs, en la que se ha comprobado la presencia del cuerpo
lúteo; además se debe relacionar el estadio de desarrollo embrionario con el
día del ciclo de la receptora. La experiencia del operario en el manejo del tracto
genital y la comodidad con que efectúa la maniobra condicionan el éxito de la
transferencia embrionaria, por ello es recomendable utilizar anestesia epidural
y sedantes dependiendo del temperamento de la receptora. La transferencia de
vesículas embrionarias y la aplicación de tratamientos hormonales, utilizados
para aumentar los porcentajes de preñez no han arrojado resultados que
justifiquen su aplicación.
1
Becario de Perfeccionamiento. Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de
Buenos Aires (CIC).
2
Profesor Adjunto. Departamento de Ciencias Biológicas.
3
Profesor Asociado. Departamento de Clínica.
Area de Reproducción. Grupo Consolidado de Investigación en Fisiología y Farmacología
Veterinaria (FISFARVET). Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Centro
de la Provincia de Buenos Aires. Campus Universitario. (7000) Tandil.
-1-
1. Introducción
En bovinos, la transferencia de embriones a través del cervix comenzó a
ser utilizada en trabajos experimentales en 1949. Dificultades de distinta índole
que se presentaron en el desarrollo del método hicieron que el nacimiento del
primer ternero se produjera recién en 1964 (71). En las últimas décadas, los
porcentajes de preñez se han incrementado de manera significativa
posibilitando actualmente obtener porcentajes de alrededor del 60%, aún con la
transferencia de embriones congelados (22).
Teniendo en cuenta un estudio de Xu y col. (119), donde el porcentaje
de preñez a primoinseminación promedió 64%, con un rango que varió entre 48
y 79%, un primer análisis comparando los resultados de ambas técnicas
llevaría a pensar que con la transferencia no quirúrgica se está cerca de
alcanzar el límite biológico. No obstante, al profundizar dicho análisis surgen
diferencias. Las hembras que retornan al celo en las primeras 3 semanas pos
inseminación son aquellas en las que no se produjo la fecundación o que
sufrieron mortalidad embrionaria temprana; por el contrario en la transferencia
embrionaria, las receptoras reciben embriones que al séptimo día de gestación
son morfológicamente normales. Según Dunne y col. (30), en la inseminación
artificial, un 10% de los ovocitos no son fecundados y la mayor parte de las
pérdidas embrionarias ocurren antes del día 14 de gestación. La transferencia
embrionaria permite evitar muchas de estas pérdidas, es por ello que pese a
los notables progresos registrados, se considera factible incrementar los
porcentajes de preñez que se obtienen actualmente con la transferencia no
quirúrgica.
El objetivo de este trabajo es efectuar un análisis de aquellos factores
que determinan el resultado de la transferencia no quirúrgica. Se abordarán
aspectos propios del embrión, de la receptora y del método, sin dejar de lado
las interacciones que se producen entre ellos. Finalmente, se discutirán
distintas alternativas que han sido utilizadas con la finalidad de mejorar la
eficiencia de la técnica.
2. Factores relacionados con el embrión
A partir del desarrollo de la técnica de transferencia se observó que tanto
la calidad de los embriones como el estadio de desarrollo y su edad podían
afectar el resultado de la aplicación de la misma. Además de los factores
propios del embrión, con la puesta a punto de técnicas tales como
criopreservación, micromanipulación y más recientemente producción in vitro
de embriones, otros factores se fueron sumando a aquellos que modificaban
los resultados de preñez.
Además, está demostrado que los resultados de preñez dependen no
sólo de cada factor embrionario, sino de la interacción que pueda existir entre
dos o más de ellos (11,37,54,108,110).
-2-
2. 1. Calidad embrionaria
La realización de una minuciosa evaluación de la calidad embrionaria es
de fundamental importancia para el éxito de la transferencia. Es así que
embriones clasificados como excelentes o buenos tienen una alta probabilidad
de alcanzar la preñez. No obstante, debe considerarse que embriones
calificados excelentes luego de ser transferidos normalmente, no terminan en
preñez, mientras que embriones de buena calidad y transferidos con algún tipo
de problema, resultan en preñeces y nacimientos normales (31). Este hecho
nos indica que si bien la calidad embrionaria puede determinar los resultados
obtenidos, otros factores relacionados con la receptora o con la transferencia
podrían modificar dichos resultados.
Resulta dificultoso comparar la información publicada por distintos
autores dado que se utilizan diferentes escalas para evaluar la calidad
embrionaria. Hasta mediados de la década del 90, se utilizó principalmente una
escala de 5 puntos, considerando a los embriones como excelentes, buenos,
regulares, malos o degenerados. Actualmente muchos autores optan por la
escala propuesta por la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria
que agrupa los embriones según su calidad en 4 grados: excelentes y buenos,
regulares, malos o degenerados.
En la Tabla 1 se muestran algunos resultados de preñez obtenidos luego
de la transferencia de embriones frescos (sin criopreservar) donde se observa
el efecto de la calidad de los mismos. Por otro lado, se ha reportado una mayor
incidencia de muerte embrionaria cuando se transfieren embriones de calidad
pobre, que cuando los mismos son morfológicamente normales (60).
Tabla 1. Efecto de la calidad embrionaria sobre el porcentaje de preñez pos
transferencia de embriones sin criopreservar.
Autores
Wright (116)
Hasler y
col. (36)
Reinchenbach
y col. (91)*
Hasler y col.
(37)*
Calidad embrionaria
buena
regular
pobre
buena
regular
pobre
excelente y buena
regular
pobre
excelente y buena
regular
a, b, c diferencias significativas (p< 0,05)
* Embriones producidos in vitro
-3-
Embriones
transferidos
n
1748
438
100
5521
304
76
61
41
27
1802
441
Receptoras
preñadas
n
%
1122
64,2 a
198
45,2 b
33
33,0 c
4037
73,1 a
181
59,5 b
31
40,8 c
33
54,1 a
21
51,2
7
25,9 b
1035
57,4 a
184
41,7 b
Por su parte, los resultados de preñez luego de transferir embriones
congelados de calidad excelente pueden diferir de los de calidad buena. Con
ambas calidades se obtienen mejores resultados que con aquellos de calidad
regular (6,50,70) (Tabla 2).
Tabla 2. Efecto de la calidad embrionaria pre-congelación sobre el porcentaje
de preñez pos transferencia.
Autores
Leibo (50)
Arreseigor y
col. (6)
Munar y col.
(70)
Embriones
transferidos
n
Calidad embrionaria
pre-congelación
excelente
buena
regular
excelente
buena
regular
excele nte
buena
regular
173
220
83
233
276
276
1633
565
123
Receptoras
preñadas
n
%
84
98
20
133
146
86
996
301
49
48,6 a
44,6 a
24,1 b
57,1 a
52,9 a
31,2 b
60,9 a
53,3 b
39,8 c
a, b, c diferencias significativas (p< 0,05)
2. 2. Estadio de desarrollo
El efecto que puede llegar a tener el estadio de desarrollo embrionario
sobre los porcentajes de preñez es un factor que ha sido estudiado por
diversos autores con resultados dispares. En algunos casos, blastocistos
tempranos y blastocistos resultaron en mayores porcentajes de preñez que
mórulas, blastocistos expandidos y blastocistos protruidos (36). Otros autores,
obtuvieron mejores resultados con blastocistos que con mórulas
(28,34,46,55,116); Dochi y col. (26), observaron que mórulas y blastocistos
tempranos resultaron en porcentajes de preñez más elevados que blastocistos
o blastocistos expandidos. Contrariamente, otros autores no han hallado efecto
del estadio de desarrollo (32,41,53,67,101).
Los porcentajes de preñez para embriones frescos producidos in vivo y
transferidos en estadio de mórula han sido muy variados oscilando entre 48 y
70%. Cuando los que se transfirieron fueron blastocistos, los porcentajes de
preñez fueron del 65-70% (32,36,67,116). Para embriones producidos in vivo y
congelados, los porcentajes de preñez fueron del 40% para mórulas y
blastocistos tempranos, disminuyendo a un 27% para blastocistos y
blastocistos expandidos (26). Para blastocistos protruidos, se han comunicado
resultados de preñez comparables a blastocistos tempranos y blastocistos
(28,67). Otros autores han obtenido menores porcentajes de preñez con este
estadio y lo atribuyen a daños mecánicos durante la recolección, inadecuados
sistemas de cultivo o a que sean menos viables por permanecer mayor tiempo
en el útero de las donantes superovuladas (36).
-4-
Para embriones producidos in vitro, los mayores porcentajes de preñez
(60%) resultaron con blastocistos tempranos, blastocistos y blastocistos
protruidos de 7 días de edad que a su vez fueron significativamente mayores
que para los mismos estadios pero para una edad de 8 días, lo cual estaría
indicando que la edad embrionaria sería lo determinante del éxito de la
transferencia y no el estadio en sí (37). Coincidentemente, Ling y col. (54),
comunicaron mejores resultados de preñez cuando se transfirieron mórulas de
día 5 a 6 y blastocistos de día 7 que blastocistos de día 6 y blastocistos
expandidos de días 7 a 8 corroborando una interacción entre estos dos factores
embrionarios. A su vez, resultados de preñez del 80% fueron comunicados por
Takeda y col. (108), cuando se utilizaron embriones de alta calidad,
independiente de que fueran mórulas, blastocistos tempranos, blastocistos o
blastocistos expandidos, confirmando la interacción del estadio de desarrollo
con otro factor embrionario como es la calidad.
2. 3. Edad embrionaria
Muchos de los datos publicados sobre el efecto de la edad embrionaria
y/o del estadio del desarrollo al momento de la transferencia sobre la tasa de
supervivencia, derivan del análisis retrospectivo de transferencias, donde el
factor edad se confunde con el grado de sincronismo y el método de
transferencia, entre otros. La mayoría de los embriones bovinos son
recolectados y transferidos con una edad de 6 a 8 días y no queda claro si
realmente hay un efecto de la edad en días o del estadio de desarrollo (29). A
su vez, distintos estudios han mostrado que no hubo diferencias en los
porcentajes de preñez luego de la transferencia de embriones de estas edades
(74,78,101,116). Por otro lado, la transferencia de embriones de 9 días o más,
prácticamente no se realiza, pues es dificultoso encontrar los embriones en el
medio de lavaje luego que los mismos han perdido la zona pelúcida. No
obstante cuando se realizaron transferencias con dichos embriones, los
resultados fueron contradictorios y mientras algunos autores no hallaron
disminución en los porcentajes de preñez (78,101), otros observaron menores
valores que cuando utilizaron aquellos de días 6 - 8 (36).
Los resultados de preñez luego de transferir embriones frescos
producidos in vitro, de día 6 ó 7 no mostraron diferencias significativas, con
valores de preñez al día 40 de gestación de 78 y 68% respectivamente (2). Por
su parte, Hasler y col. (37), habían comunicado resultados de preñez del 56%
para embriones de día 7 y de 43 y 41% para aquellos de día 8 y 9
respectivamente, no obstante, la transferencia de embriones clasificados como
excelentes y buenos ya sean de día 7 u 8 resultaron en mayores porcentajes
de preñez que aquellos de calidad regular. Ling y col. (54) obtuvieron mayores
porcentajes de preñez con mórulas de día 6 ó 7 y blastocistos de día 7 que con
blastocistos de día 6 ó blastocistos expandidos de día 7 u 8 quedando
demostrado una vez más la interacción entre factores embrionarios.
-5-
2. 4. Criopreservación
El efecto de la criopreservación de los embriones sobre los resultados de
preñez es muy variado y ello se debe a que se producen interacciones con
otros factores tales como la edad embrionaria, la calidad embrionaria y el
estadio de desarrollo y a su vez si los mismos han sido producidos in vivo o in
vitro. Es importante considerar además que los porcentajes de preñez
resultantes de la transferencia de embriones congelados son inversamente
proporcionales al tiempo transcurrido desde la recolección hasta el comienzo
de la congelación (117), dado que la viabilidad embrionaria disminuye
significativamente cuando dicho período es mayor de 3 hs (85). A su vez, la
calidad embrionaria pos descongelación también afecta los porcentajes de
preñez, con valores que oscila n entre 30% y 68% para embriones de calidad
regular y excelente respectivamente (68).
El método de criopreservación utilizado debe tenerse en cuenta. Cuando
los embriones son congelados convencionalmente, las tasas de preñez oscilan
entre 50 y 60% resulta ndo levemente inferiores a las obtenidas con embriones
frescos (7,15,22,26,40,67,70,79,85); cuando se utiliza la vitrificación como
método de conservación, los porcentajes de preñez oscilan entre 0 y 60%
(1,24,88,107,113). Las bajas temperaturas a las que son sometidos los
embriones así como las altas concentraciones de crioprotectores utilizadas
serían la causa de la disminución en la viabilidad de estos embriones
(25,81,87).
2. 5. Micromanipulación
Actualmente los embriones bovinos son micromanipulados con el fin de
obtener algunas células y proceder a la identificación del sexo previo a su
transferencia o para ser divididos en dos partes iguales (hemiembriones) y
producir mellizos idénticos, lo que permite la disponibilidad de animales
idénticos en los programas de transferencia embrionaria.
Con referencia a aquellos embriones que son destinados a la
identificación del sexo, los blastómeros son abordados penetrando la zona
pelúcida y aspirando 4 a 6 células o cortando la zona y los blastómeros con
una navaja. En trabajos realizados con embriones sexados y transferidos
frescos, la tasa de preñez fue de alrededor de 45%, observándose además que
los resultados dependieron de la calidad embrionaria (11,110).
En referencia a los embriones divididos, cuando son transferidos, los
porcentajes de preñez dependen de la calidad de los hemiembriones con
resultados que van desde un 76,2% de fetos para mitades de calidad muy
buena, hasta un 24,7% para aquellas de calidad regular (12) lo cual sugiere la
necesidad de destinar a la micromanipulación sólo aquellos embriones de
excelente y buena calidad. La sección de los embriones provoca una pérdida
celular embrionaria de aproximadamente 10%, que posiblemente compromete
-6-
la viabilidad de los embriones de calidad inferior (64). Las tasas de preñez
obtenidas con la transferencia de hemiembriones son muy variables con una
media que varía entre 50 y 60% (51,108). A su vez, la ausencia de la zona
pelúcida en los hemiembriones no afecta los porcentajes de preñez para
embriones transferidos frescos (45,64).
Un grupo especial de embriones a ser transferidos lo constituyen
aquellos que han sido micromanipulados y que posteriormente fueron
sometidos a criopreservación. La supervivencia de estos embriones es menor
que la de embriones intactos, y esta sensibilidad podría deberse a la
perforación de la zona pelúcida y/o a la reducción del número de células que
sufren estos embriones (56). Para mejorar la tasa de supervivencia se
implementaron distintas alternativas metodológicas, tales como sellar el orificio
practicado en la zona pelúcida cubriendo éste con una zona pelúcida adicional
o que el embrión micromanipulado sea embebido en agar, previniendo así la
pérdida de blastómeros adicionales, simplemente por una mejor protección
física durante el crecimiento de los cristales de hielo. También se ha intentado
mejorar la viabilidad de estos embriones realizando cultivos de los mismos en
células epiteliales oviductales (96,97) o modificando los protocolos de
congelación mediante el agregado de polivinilpirrolidona (106). Los resultados
obtenidos han sido sin embargo muy variados (49,56,86,92,96,97,99,111).
Los porcentajes de preñez obtenidos luego de la transferencia de los
embriones micromanipulados generalmente no superan el 30% siendo a su vez
muy variables según las condiciones de cultivo utilizadas, la calidad
embrionaria así como el protocolo de congelación empleado (19,38,80,99,111).
2. 6. Producción in vitro
En referencia a los embriones producidos in vitro, los mismos presentan
una serie de características propias que los diferencian de aquellos producidos
in vivo y que trae aparejado que los porcentajes de preñez luego de la
transferencia embrionaria no exceden en promedio el 40% siendo a su vez muy
variables con valores extremos de 24% y 54% (2,5,42,48,62,90,91,112,118). La
morfología y la bioquímica de los embriones producidos in vitro están afectadas
por las condiciones en que se desarrollan los mismos y que difieren de aquellas
que tienen cuando lo hacen in vivo. Dentro de ellas se encuentran la
temperatura constante, tensión controlada de oxígeno y dióxido de carbono, un
permanente intercambio entre el embrión y la madre entre otras. Estas
diferencias en el medio ambiente en que se desarrollan los embriones, se
traducen en que los mismos presentan mayor cantidad de cromosomas
anormales, blastómeros irregulares, un espacio perivitelino pequeño, una mala
compactación de las mórulas, blastocistos con forma irregular y menor número
de células, incremento en la cantidad de vacuolas citoplasmáticas y uniones
imperfectas entre blastómeros, entre otras fallas (63).
-7-
Se ha demostrado que cuando son criopreservados embriones
producidos in vitro, presentan una viabilidad pos descongelación que está
correlacionada con la velocidad con que ellos se segmentan luego de la
fecundación y por lo tanto con el tiempo que tardan en alcanzar el estadio de
blastocisto. Esto se traduce en diferencias en los porcentajes de preñez luego
de su transferencia, resultando en 42% para blastocistos de día 7 y sólo 20%
para aquellos de día 8 (37). No obstante, la combinación de calidad y edad
embrionaria fue la determinante de los porcentajes de preñez resultando los
valores más altos para aquellos embriones fecundados in vitro que presentaron
calidad excelente o buena al día 7 (59%), mientras que los menores
porcentajes se lograron con embriones de calidad regular al día 8 (30%) (37).
También se ha observado que cuando se emplean embriones producidos in
vitro existe una mayor incidencia de abortos tempranos y distocias que lo
normal, estas últimas aparentemente relacionadas con un incremento en el
peso al nacer de los terneros. Hasler y col. (37), encontraron entre un 7,6% y
11% de abortos y hasta un 15,6% de muertes al nacer, después de la
transferencia de dichos embriones.
3. Factores relacionados con la receptora
Si la manipulación de los embriones y su evaluación morfológica han
sido realizadas correctamente, se considera que todos los embriones
seleccionados se encuentran con posibilidades de establecer una preñez, por
lo tanto a partir de allí todo dependerá de la receptora y de la transferencia
(14).
Las receptoras deben ser reproductivamente sanas para recibir un
embrión y llevar la gestación a término, poseer un tamaño que les permita parir
sin grandes dificultades y deben ser de buena capacidad lechera para
alimentar al ternero de manera que le permita expresar su potencial genético
(3).
Existe evidencia que la procedencia de la receptora afecta
significativamente el porcentaje de preñez (27). La disponibilidad, el costo y la
adaptación al medio, en términos de alimentación, enfermedades y cambios
climáticos, son probablemente los factores más importantes que gobiernan la
elección de la receptora (14). La situación ideal es aquella donde las receptoras
son del propio establecimiento dado que su historia reproductiva es conocida y
al haber sido criadas en el lugar, el estrés sufrido será menor. Utilizando estas
receptoras, se suele obtener un 10% a un 15% más de preñez que con el
empleo de animales recientemente incorporados al rodeo (3).
Los trabajos de investigación de los últimos años han sido orientados
principalmente a los embriones, tendiendo a mejorar su viabilidad después de
la transferencia. En contraste, son menores los esfuerzos que se ha n hecho
para incrementar el potencial de las receptoras para preñarse y llevar la
gestación a término (65).
-8-
Los aspectos más relevantes relacionados con las receptoras que
pueden afectar el resultado final en un programa de transferencia embrionaria
son: raza, categoría, estado nutricional, empleo reiterado, calidad del cuerpo
lúteo y nivel de progesterona, sincronización con respecto a la donante y al
embrión.
3. 1. Raza
Las evidencias en la literatura sobre el efecto de la raza de la receptora
sobre el resultado de la transferencia son escasas. Generalmente se prefiere a
las razas cruzas antes que a las puras, posiblemente porque las primeras sean
más fértiles (14). Según la opinión de estos autores, las cruzas entre las razas
británicas y la Holstein son preferibles a las cruzas continentales porque ellas
son baratas, de tamaño medio y de buen potencial lechero, además algunas
cruzas continentales son consideradas temperamentales. Por otra parte,
prefieren animales de origen lechero, particularmente si se trata de vaquillonas
o vacas jóvenes, antes que animales para carne con cría al pie. Argumentan su
elección en que dichos animales son más dóciles y probablemente más fértiles.
Además, generalmente ofrecen menos dificultades para llevar a cabo la
transferencia.
No obstante, otros autores, si bien transfirieron embriones congelados y
vitrificados, no hallaron diferencias de preñez entre receptoras de razas
lecheras (46,0%), carniceras (43,2%) y doble propósito (43,9%) (114).
3. 2. Categoría
Este es un aspecto importante, pero con criterios encontrados respecto a
si es mejor utilizar vaquillonas o vacas. Los que proponen el uso de vacas lo
hacen argumentando que las mismas ya han parido alguna vez. Por otro lado,
las vaquillonas son seleccionadas principalmente como receptoras por razones
económicas, logísticas y técnicas, entre ellas podemos mencionar que es
menos probable que se encuentren bajo estrés nutricional o que tengan una
historia de problemas sanitarios, además el útero virgen es más apropiado para
recibir un embrión transferido. Se considera que, así como en la inseminación
artificial, en la transferencia embrionaria se obtiene mayor porcentaje de preñez
en vaquillonas que en vacas (3). Sin embargo, muchos autores no hallaron
diferencias (14,16,66,73,116) (Tabla 3).
-9-
Tabla 3. Tasas de preñez después de la transferencia de embriones en
vaquillonas y vacas.
Autores
Wright (116)
Callesen y col. (16)
Neumann y col. (73)
Categoría
Vaquillona
Vaca
Vaquillona
Vaca
Vaquillona
Vaca
Receptoras transferidas
n
porcentaje de preñez
245
58,4
2200
59,0
758
51
1316
46
1980
50,1
399
35,5
El porcentaje de receptoras que abortan después de que ha sido
confirmada la preñez ronda el 5% (16,17,18,44), resultando similar al reportado
en hembras inseminadas. Munar y col. (69), observaron mayor porcentaje de
abortos cuando se utilizaron como receptoras vaquillonas. Tales diferencias no
fueron corroboradas por otros autores (16,18).
Wright (116), observó que el estrés lactacional no tuvo efecto sobre la
tasa de preñez, no encontrando diferencias entre las vacas con terneros al pié
y las vacas secas. Por otro lado, Van Wagtendonk-de Leeuw y col. (114), no
hallaron diferencias de preñez entre receptoras que tenían de 1 a 7 pariciones.
Si bien las vacas pueden, en general, tener un porcentaje de preñez
ligeramente inferior a las vaquillonas, cuando también se tienen en cuenta la
supervivencia y la viabilidad de los terneros, la tasa de éxito final es de la
misma magnitud que cuando se emplean vaquillonas (3,16,18). Además el
cervix de las vaquillonas es estrecho y durante la fase luteal se encuentra
cerrado, lo cual dificulta en algunas ocasiones la inserción del instrumental de
transferencia, requiriendo un tiempo adicional que actúa negativamente sobre
el resultado final (43).
En las condiciones
de manejo semiintensivo o extensivo que
predominan en nuestro país, Alberio (3) recomienda la utilización de vacas
jóvenes de primera y segunda parición, las que al tener menos problemas al
parto permitirán obtener resultados superiores que con vaquillonas.
En síntesis, si bien existen razones biológicas, prácticas y técnicas que
justifican la elección de vaquillonas o vacas, tanto unas como otras pueden
resultar muy buenas receptoras después de una adecuada selección. La
elección de la categoría dependerá de las condiciones bajo las cuales se
desarrolle el programa de transferencia (16).
- 10 -
3. 3. Estado nutricional
La nutrición es un factor importante en el manejo de las receptoras y
afecta todos los aspectos de la reproducción. Por lo tanto, la receptora preñada
no debe ser tratada como cualquier otra vaca, ya que gestará y amamantará a
los terneros de mayor valor del establecimiento, resultando vital la alimentación
de las mismas para el éxito final de la transferencia (3).
La condición corporal de las receptoras y el contenido energético de la
alimentación que éstas reciben son los factores más importantes. El cambio
que se produce en la condición corporal entre el parto y la transferencia,
guarda estrecha relación con el contenido energético de la alimentación que la
receptora recibe en dicho período. Si se produce una disminución marcada de
la condición corporal se afectan el intervalo parto-celo y los porcentajes de
preñez y parición. Tomando como referencia la escala 1-5, es necesario lograr
una condición corporal 2,5 al parto para que ésta no resulte inferior a 2 en el
momento de la transferencia (14). Luego, el nivel energético debe seguir siendo
correcto, sin llegar al exceso, y debe continuar hasta que la nidación del
embrión haya finalizado, resultando determinante entre los días 21 y 45 de
gestación (83,105).
Mapletoft y col. (57), obtuvieron mayor porcentaje de preñez con
receptoras de condición corporal entre 2 y 3, que con aquellas de ≤ 1 o ≥ 4
(Tabla 4).
Tabla 4. Efecto de la condición corporal de la receptora sobre el porcentaje de
preñez después de la transferencia no quirúrgica (57).
Receptoras transferidas
n
porcentaje de preñez
230
44a
460
53b
633
55b
175
47a
Condición corporal
≤1
2
3
≥4
a, b diferencias significativas (p< 0,05)
3. 4. Empleo reiterado
Cuando se diagrama un programa de transferencia embrionaria surge el
interrogante sobre cuántas veces puede repetirse la transferencia a una misma
receptora. Se ha observado que la tasa de preñez no es afectada hasta la
tercera transferencia y que luego tiende a disminuir progresivamente
(18,27,36,52). Esto ocurre con vaquillonas y vacas (18) y con embriones
producidos in vivo e in vitro. En base a esta información se ha establecido un
criterio donde se señala que cada receptora podrá tener tres oportunidades de
quedar preñada, luego de haber sido transferida correctamente con un embrión
de buena calidad (3).
- 11 -
En la Tabla 5 se presentan resultados obtenidos por distintos autores
luego de efectuar transferencias sucesivas.
Tabla 5. Porcentajes de preñez obtenidos por distintos autores luego de
efectuar transferencias sucesivas.
Autores
Donaldson (27)
Hasler y col. (36)
Liebrich (52)*
1º
58,8
73
56
Transferencias
2º
3º
52,6
56,4
72
67
46
37
4º
50,2
50
-
*Embriones producidos in vitro.
3. 5. Calidad del cuerpo lúteo y nivel de progesterona
Considerar la calidad del cuerpo lúteo a partir de su
consistencia, como un factor asociado al éxito en la selección de las
parece razonable; sin embargo, como se aprecia en la Tabla 6, no
establecer una relación entre la calidad del cuerpo lúteo y
(8,14,20,27,36,47,52,55,82).
tamaño y
receptoras
es posible
la preñez
Tabla 6. Efecto de la calidad del cuerpo lúteo, estimada en función de su
tamaño y consistencia a la palpación, sobre la tasa de preñez después
de la transferencia embrionaria.
Autores
Donaldson (27)
Hasler y col. (36)
Liebrich (52)*
Bó y col. (8)**
Lagomarsino y col. (47)***
Calidad
Excelente
Buena
Regular
Dudosa
1
2
3
Muy buena
Buena
Regular y mala
1
2
1
2
Receptoras
n
1193
348
58
155
78
98
107
220
378
196
Preñez
n
911
251
46
76
40
51
55
112
183
110
%
62,5
59,2
61,3
47,7
76,4
72,1
79,3
49,0
51,3
52,0
51,4
50,9
48,4
56,1
Referencias: - (No consignado), * Embriones producidos in vitro, ** Embriones frescos +
congelados, *** Embriones congelados.
Actualmente, es aceptado que existen factores más importantes a tener
en cuenta para descartar o seleccionar una receptora. Entre ellos, haber
- 12 -
observado el celo y comprobado la presencia de un cuerpo lúteo funcional,
cualquiera fuese su calidad (8,16,18,36,47). Probablemente, el empleo de la
ecografía y el análisis computarizado de imágenes aportarán en un futuro
próximo nuevas herramientas para mejorar la clasificación del cuerpo lúteo
(47).
La progesterona es indispensable para el establecimiento y el
mantenimiento de la preñez. No obstante, fueron infructuosos los intentos de
seleccionar a las receptoras en base al nivel de dicha hormona al momento de
la transferencia dado que éste, no se correlacionó con el porcentaje de preñez
(32,82,84,105). Además, se ha observado en las receptoras que la repetibilidad
de los niveles de progesterona en el día 7 del ciclo estral es baja (89).
3. 6. Sincronismo donante-receptora
El sincronismo que se establece entre la donante y la receptora
condiciona el éxito de la transferencia, pues para la nutrición del embrión
resulta necesario que el ambiente uterino de ambas sea similar (43).
Debido a la diversidad de criterios existente en la bibliografía, en cuanto
al sincronismo entre la donante y la receptora, en el presente trabajo se asume
como asincronismo positivo (+) a aquél en donde la receptora se presenta en
celo antes que la donante. Por el contrario, se considera un asincronismo
negativo (-) cuando la receptora presenta celo después que la donante.
Se ha llegado a tolerar hasta un
ha observado que no se producen
asincronismos de hasta ±36 hs., no
obtención de buenos resultados no
asincronismo (16,59,82).
asincronismo de ±48 hs.
grandes diferencias de
obstante, se considera
se debe superar las
(53,58), y se
preñez con
que para la
±24 hs. de
Cuando la donante y las receptoras presentaron celo simultáneamente
se obtuvieron las tasas de preñez más elevadas en varios trabajos
(28,74,77,94,100,102), sin embargo, generalmente se considera que es más
probable obtener mejores resultados transfiriendo a receptoras con
asincronismo positivo (13,20,23,36,43,116). Si bien la causa es desconocida,
es probable que los embriones de vacas superovuladas estén levemente más
avanzados en el desarrollo que aquellos provenientes de un animal no
superovulado, de allí que tengan mayor posibilidad de implantarse en una
receptora con un ciclo estral más avanzado.
En la Tabla 7 se presentan resultados de preñez obtenidos luego de
evaluar el efecto del sincronismo donante-receptora.
- 13 -
Tabla 7. Efecto del sincronismo donante-receptora sobre la tasa de preñez
post-transferencia.
Autor
Rowson y col. (94)
Sreenan y Beehan (104)
Newcomb y Rowson (74)
Sreenan y col. (102)
Hansen (35)
Shea y col. (100)
Kunkel y Stricklin (46)
Nelson y col. (72)
Newcomb (77)
Schneider y col. (98)
Wright (116)
Lindner y Wright (53)
Donaldson (28)
De Armas y col. (23)
Munar y col. (67)
Porcentaje de preñez
Asincronismo positivo (hs)
Asincronismo negativo (hs)
+48 +36
+24 +12
0
-12
-24
-36
-48
40
57
91
52
30
92
71
60
73
58
67
82
62
55
51
55
65
59
62
49
47
59
59
54
38
54
57
58
61
57
52
50
50
62
38
66
67
61
59
61
68
59
61
58
41
38
50
42
50
39
35,3 40,9 45,6 49,8 52,5 50,6 47,7 37,9 33,3
50
40,9
31,6
38,5 55,0 59,6 69,3 68,3 65,4 63,2 52,1 50,0
Asincronismo positivo: La receptora presenta celo antes que la donante.
Asincronismo negativo: La receptora presenta celo después que la donante.
El sincronismo donante -receptora no debe ser analizado como un factor
que en forma aislada pueda afectar el porcentaje de preñez. Hasler y col. (36),
transfirieron embriones de distintos grados de calidad a receptoras con
sincronismo y con asincronismo (+) y (-). Obtuvieron buenos porcentajes de
preñez con embriones de calidad buena y receptoras con y sin sincronismo.
Por el contrario, cuando los embriones transferidos fueron de calidad pobre, los
mayores porcentajes de preñez se obtuvieron en receptoras con asincronismo
negativo. Esto puede estar relacionado con el hecho que en los embriones de
calidad pobre, el desarrollo embrionario retardado es frecuente, resultando un
mejor ambiente uterino para este tipo de embrión, el proporcionado por una
receptora con asincronismo negativo.
3. 7. Sincronismo embrión-receptora
Si tenemos en cuenta que en un animal superovulado los folículos
pueden ovular en un periodo largo y que además el desarrollo del embrión se
acelera, el sincronismo entre la donante y la receptora puede no ser el mejor
indicador a tener en cuenta en el momento de decidir qué embrión transferir en
una determinada receptora. Es por ello que, en el momento de efectuar la
transferencia, debe ser considerado también el sincronismo embrión-receptora.
Por ejemplo, si la recolección se lleva a cabo en el día 7 y contamos con
receptoras disponibles entre los días 6-8 del ciclo estral, las mórulas deben ser
transferidas a las de día 6, las mórulas compactas y blastocistos tempranos a
las de día 7 y los blastocistos expandidos a las de día 8 (95). Esta
- 14 -
recomendación se basa en trabajos en los que se observó que la
transferencias de embriones en estadios más avanzados (blastocistos
expandidos y protruidos) a receptoras con asincronismo negativo, resultó en
una disminución del porcentaje de preñez (13,36).
Cuando se transfieren embriones congelados, las receptoras deben
estar en sincronismo con el estadio de desarrollo del embrión al momento de la
congelación (58). No obstante, según Wright (116), la tasa de preñez depende
de la capacidad de los distintos estadios de desarrollo embrionario para
implantarse y no del sincronismo donante-receptora, cuando éste no supera
las ± 36 hs. Por su parte, Donaldson (28), observó que las mórulas tempranas
toleraron mejor el asincronismo que cualquier otro estadio y que los embriones
de calidad regular y mala, toleraron mejor el asincronismo que los de calidad
excelente o buena.
Cuando se emplean embriones producidos in vitro puede generarse
confusión con respecto al sincronismo embrión-receptora dado que, en los
sistemas de producción in vitro, se considera como día 0 al de la fecundación y
en las receptoras el día 0 corresponde al estro. Hasler y col. (37), encontraron
que la tasa de preñez no se vio afectada cuando se transfirieron embriones
producidos in vitro frescos en receptoras que se encontraban en el día 7 u 8 del
ciclo estral y que presentaban un asincronismo de ± 36 hs.
4. Transferencia no quirúrgica
Los factores más importantes relacionados con la transferencia
propiamente dicha que pueden influir en el resultado del programa son:
ubicación del embrión en el útero, experiencia del operador, protección del
instrumental de transferencia y la utilización de sedantes, relajantes uterinos
y/o anestesia epidural.
4. 1. Ubicación del embrión en el útero y experiencia del operador
Estos factores son analizados en conjunto, dado que existe estrecha
relación entre ambos. Rowe y col. (93), demostraron que el tiempo que insume
atravesar el cervix y colocar el embrión en el cuerno uterino se correlaciona
negativamente con el porcentaje de preñez. La velocidad con la que el
operador realiza dicha maniobra depende principalmente del grado de dificultad
que encuentra para atravesar el cervix. En esas circunstancias, la experiencia
resulta de vital importancia; observándose que cuando el pasaje a través del
cervix se realiza sin dificultad, los porcentajes de preñez son mayores (9,10).
Del mismo modo, operadores con experiencia pueden lograr buenos
porcentajes de preñez (50%) aún cuando deben transferir los embriones a
receptoras que presentan un cuello uterino tortuoso, difícil de enhebrar (116).
Munar y col. (69), reportaron que el grado de dificultad al atravesar el cervix
con el instrumental y la dificultad para depositar el embrión en el sitio deseado
del útero, afectaban significativamente la tasa de abortos.
- 15 -
En la Tabla 8 se presentan resultados de trabajos de transferencia
embrionaria no quirúrgica, en los que se compararon los porcentajes de preñez
obtenidos por operadores con o sin experiencia. Sólo en el trabajo de Rowe y
col. (93) se especifica claramente qué criterio se utilizó para calificar a los
operadores; el A había realizado 56 transferencias y el B ninguna, pese a que
contaba con experiencia en palpación transrectal, inseminación artificial y
recolección no quirúrgica de embriones. En la mayoría de estos trabajos,
realizados hace más de 20 años se observaron diferencias entre operadores
pese a que los porcentajes de preñez que se registraban en ese momento eran
relativamente bajos. Por entonces, el método no quirúrgico estaba siendo
puesto a punto y era común que, a causa de la maniobra, se produjera
luteólisis y por consiguiente mortalidad embrionaria.
Tabla 8. Comparación de los porcentajes de preñez obtenidos por distintos
operadores utilizando el método no quirúrgico.
Autores
Bowen y col. (10)
Halley y col. (34)
Rowe y col. (93)
Schneider y col. (98)
A
27,0
46,0 a
57,5 a
53,1 a
Operador
B
13,0
22,6 b
35,0 b
47,7 a
C
18,0
28,0 b
a, b diferencias significativas (p< 0,05)
En diferentes trabajos quedó claramente demostrado que el embrión
debe ser transferido al cuerno uterino ipsilateral al ovario con cuerpo lúteo
(75,76,103,109). Teniendo en cuenta que la migración transuterina rara vez
ocurre en bovinos (109), dicha ubicación favorece el reconocimiento materno
de gestación (43). En cambio, no resulta tan claro el lugar preciso donde el
embrión debe ser depositado dentro del cuerno uterino. En un principio, basado
en la experiencia con la transferencia quirúrgica, se indicaba que el embrión
debía ser colocado en el tercio anterior del cuerno uterino. Rowe y col. (93), no
encontraron diferencias en el porcentaje de preñez entre los tercios anterior y
medio, mientras que Callesen y col. (16), en un estudio que involucró más de
2000 transferencias, observaron mejores resultados transfiriendo en el tercio
anterior, con respecto al medio y especialmente al posterior. Sreenan y Diskin
(105) sostienen que el intento de transferir embriones por delante del tercio
medio con un cateter rígido puede lesionar el endometrio y en consecuencia,
causar mortalidad embrionaria.
Por otra parte, Wright (116) comparó los porcentajes de preñez de
transferencias efectuadas al cuerno derecho con las realizadas al izquierdo sin
encontrar diferencias.
- 16 -
4. 2. Protección del instrumental de transferencia
La transferencia del embrión se efectúa cuando la receptora se
encuentra en fase luteal. Esto es cuando su útero es susceptible a las
infecciones. Sobre este aspecto hay que prestar especial atención, evitando
que las bacterias presentes en los genitales externos y la vagina puedan
ingresar al útero.
Takahashi y col. (1982), citado por Kanagawa (43), observaron que la
protección del instrumental de transferencia con una vaina estéril durante su
pasaje por la vagina, incrementa de manera significativa el porcentaje de
preñez. Mapletoft y col. (57), en cambio no corroboraron tales diferencias
(Tabla 9).
Tabla 9. Porcentajes de preñez obtenidos con la protección o no del
instrumental de transferencia con una vaina descartable estéril.
Autores
Kanagawa (43)
Mapletoft y col. (57)
Modalidad
Con vaina protectora
Sin vaina protectora
Con vaina protectora
Sin vaina protectora
Receptoras
Transferidas
Preñadas
n
n
%
22
18
63,6 a
24
8
33,3 b
116
62
53,4 a
140
79
56,4 a
a, b diferencias significativas (p< 0,05).
4. 3. Utilización de sedantes, anestesia epidural y/o relajantes uterinos
Broadbent y col. (14), sostienen que pese a que la utilización de
sedantes y anestesia epidural no es imprescindible, resulta conveniente para
que el animal esté tranquilo y el operador pueda trabajar con comodidad. El
costo de administrar estas drogas es bajo con relación a los beneficios
potenciales, especialmente cuando la transferencia es efectuada por
operadores sin demasiada experiencia.
Con respecto a los relajantes uterinos, la administración de 300 µg de
clorhidrato de clembuterol, 15-180 minutos antes de la transferencia, no
produjo mejoras en el porcentaje de preñez (4,57,115).
5. Alternativas utilizadas con el fin de incrementar los porcentajes de
preñez
Las alternativas utilizadas para incrementar los porcentajes de preñez
han sido muy variadas. Una de ellas es el empleo de vesículas trofoblásticas,
las cuales se transfieren conjuntamente con el embrión, con la finalidad de
contribuir al mantenimiento de la fase luteal en la receptora, y mejorar la
intensidad y la calidad de las señales embrionarias. Heyman y col. (39)
- 17 -
transfirieron un embrión congelado y dos vesículas trofoblásticas congeladas
simultáneamente. A los 45 días de gestación, la tasa de preñez de estas
receptoras (73%) fue mayor que la del grupo control (43%). Las diferencias
entre ambos grupos dejaron de ser significativas al día 90, siendo de 57% y
40%, respectivamente. En el primer grupo, las pérdidas se produjeron
principalmente entre los días 45 y 60 de gestación, en cambio en el grupo
control ocurrieron entre los días 21 y 45.
Por otra parte se ha intentado modificar el estado fisiológico del útero por
medio de una terapia suplementaria con progesterona. Crhistie y col. (21),
emplearon 100 mg de progesterona entre los días 13 y 35 del ciclo de
receptoras que habían recibido un embrión en el día 7, sin encontrar efecto
alguno sobre el porcentaje de preñez.
También se ha empleado en receptoras luego de ser transferidas,
gonadotrofina coriónica humana (HCG) por su efecto luteotrófico. Se llevaron a
cabo distintos estudios donde las dosis empleadas variaron entre 1000 y 5000
UI, administradas en un solo momento o en un período comprendido entre el
día 7 (momento de la transferencia) y el día 35. En estos estudios no se
lograron mejorar los porcentajes de preñez (33,55,61,82,105).
Con la misma finalidad se ha empleado la hormona liberadora de
gonadotrofinas (GnRH) o alguno de sus análogos. Ellington y col. (32),
administraron 8 µg de buserelina al momento de la transferencia o entre los
días 4 y 7 pos transferencia. Los porcentajes de preñez logrados 72% y 66%,
respectivamente no difirieron del grupo control, 68%.
6. Conclusiones
- La calidad embrionaria es el único factor relacionado directamente con
el embrión que influye claramente en el resultado de la transferencia.
- Los porcentajes de preñez que se obtienen actualmente con embriones
congelados son inferiores a los que se logran con embriones frescos. Las
diferencias no son sustanciales, por lo tanto se compensan con las ventajas
que la congelación trae aparejada.
- La viabilidad pos transferencia de los embriones producidos in vitro y/o
micromanipulados es marcadamente inferior a la de los embriones producidos
in vivo. Tal diferencia se acrecienta cuando dichos embriones son
criopreservados.
- En la selección de receptoras son más importantes las condiciones de
crianza, el manejo sanitario y el estado nutricional de las mismas que su raza o
categoría.
- 18 -
- Las receptoras que han sido transferidas sin dificultad con embriones
de buena calidad en tres oportunidades y no han quedado preñadas, deben ser
eliminadas del programa de transferencia.
- En la elección de la receptora es importante haber observado el celo y
comprobado la presencia del cuerpo lúteo, independientemente de su calidad y
del nivel de progesterona.
- El asincronismo donante-receptora no debe ser mayor de ±48 hs,
resultando conveniente que no supere ±24 hs. Además, es recomendable
relacionar el estadio de desarrollo embrionario con el día del ciclo de la
receptora al momento de la transferencia.
- La experiencia del operario en el manejo del tracto genital y la
comodidad con que efectúa la maniobra condicionan el éxito de la transferencia
embrionaria, por ello es recomendable utilizar anestesia epidural y sedantes,
dependiendo del temperamento de la receptora.
- Las distintas alternativas utilizadas para aumentar los porcentajes de
preñez luego de la transferencia embrionaria no han arrojado resultados que
justifiquen su aplicación.
7. Bibliografía
1.
Agca, Y., Monson, R.L., Northey, D.L., Abas Mazni, O., and Rutledge, J.J. 1994. Post-thaw
survival and pregnancy rates of in vitro produced bovine embryos after vitrification.
Theriogenology, 41:154.
2. Agca, Y., Monson, R.L., Northey, D.L., Abas Mazni, O., Schaefer, D.M. and Rutledge, J.J.
1998. Transfer of fresh and cryopreserved IVP bovine embryos: normal calving, birth weight
and gestation lengths. Theriogenology, 50:147-162.
3. Alberio, R.H. Manejo de donantes y receptoras. En G. A. Palma & G. Brem Transferencia
de embriones y biotecnología de la reproducción en la especie bovina.. Editorial hemisferio
sur. Buenos Aires, Argentina. 1ra. Edición 1993, 25-31.
4. Almeida, A.P. 1989. Nonsurgical embryo transfer in cattle: The effect of clenbuterol on
pregnancy rates. Theriogenology, 31:166.
5. Aller, J.F., Alberio, R.H. y Alberio, R. 1998. Producción de mellizos en bovinos por medio
de la transferencia de embriones producidos in vitro. Therios, 27:39-46.
6. Arreseigor, C.J., Sisul, A., Arreseigor, A.E. and Stahringer, R.C. 1998. Effect of
cryoprotectant, thawing method, embryo grade and breed on pregnancy rates of
cryopreserved bovine embryos. Theriogenology, 49:160.
7. Beal, W.E., Hinshaw, R.H. and Whitman, S.S. 1998. Evaluating embryo freezing method
and the site of embryo deposition on pregnancy rate in bovine embryo transfer.
Theriogenology, 49:241.
8. Bó, G.A., Cutaia, L., Tríbulo, R., Moreno, D., Caccia, M. y Tríbulo, H. 1999. Efecto de la
calidad del cuerpo lúteo a la palpación rectal sobre el porcentaje de preñez de embriones
frescos y congelados. ΙΙΙ Simposio Internacional de Reproducción Animal, pg. 207.
9. Boland, M.P., Crosby, T.F. and Gordon, I. 1976. Birth of twin calves following a single
transcervical non-surgical egg transfer technique. Vet. Rec., 99: 274-275.
10. Bowen, J.M., Elsden, R.P. and Sidel, G.E., Jr. 1978. Non surgical embryo transfer in cow.
Theriogenology, 10: 89-96.
11. Bredbacka, P. 1998. Recent developments in embryo sexing and its field application.
Reprod. Nutr. Dev., 38:605-613.
12. Brem, G. 1986. Micromanipulación en embriones bovinos y su aplicación en mejoramiento
animal. Hemisferio Sur, Argentina, 1-209.
- 19 -
13. Breuel, K.F., Baker, R.D., Butcher, R.L., Townsend, E.C., Inskeep, E.K., Dailey, R.A. and
Lerner, S.P. 1991. Effects of breed, age of donor and dosage of follicle stimulating hormone
on the superovulatory response of beef cows. Theriogenology, 36:241-255.
14. Broadbent, P.J., Stewart, M. and Dolman, D.F. 1991. Recipient management and embryo
transfer. Theriogenology, 35:125-139.
15. Cabodevila, J. 1997. Transferencia de embriones y biotécnicas derivadas. Therios,
suplemento especial, Reproducción en bovinos, 35-40.
16. Callesen, H., Bax, A. and Greve, T. 1994. Embryo recipients: Dairy cows or heifers? Proc.
th
of the 10 Scientific Meeting of the Association Eur. Transf Emb., September 1994, Lyon,
France. Fondation Merieux, Lyon, pp. 125-135.
17. Callesen, H., Lovendahl, P., Bak, A. and Greve, T. 1995. Factors affecting the
developmental stage of embryos recovered on day 7 from superovulated dairy cattle. J.
Anim. Sci., 73:1539-1543.
18. Callesen, H., Liboriussen, T. and Greve, T. 1996. Practical aspects of multiple ovulationembryo transfer in cattle. Anim. Reprod. Sci., 42:215-226.
19. Chesne, P., Heyman, Y., Chupin, D., Procureur, R. and Menezo, Y. 1987. Freezing cattle
demi-embryos: influence of period of culture between splitting and freezing on survival.
Theriogenology, 27:218.
20. Coleman, D.A., Dailey, R.A., Leffel, R.E. and Baker, R.D. 1987. Estrous synchronization
and establishment of pregnancy in bovine embryo transfer recipients. J. Dairy Sci., 70:858866.
21. Crhistie, W.B., Newcomb, R. and Rowson, L.E.A. 1979. Embryo survival in heifers after
transfer of an egg to the uterine horn contralateal to the corpus luteum and the effect of
treatment with progesterone or hcg on pregnancy rates. J. Reprod. Fert. 56:701-706.
22. Cutini, A., Teruel, M. y Cabodevila, J. 1999. Criopreservación de embriones de especies de
interés pecuario. Rev. Arg. Prod. Anim., 19:447-469.
23. De Armas, R., Solano, R. y Caral, J. 1986. Transferencia no quirúrgica de embriones en el
bovino por un método transcervical. Revista Cubana de Producción Animal, 12:103-112.
24. De Leeuw, A.M., den Daas, J.H., Kruip, T.A. and Rall, W.F. 1992. The relative efficacy of
bovine embryo cryopreservation by vitrification and conventional slow freezing. In:
Proceedings 12th International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination.
The Hague, The Netherlands, pp. 1505-1507.
25. Dobrinsky, J.R. 1996. Cellular approach to cryopreservation of embryos. Theriogenology,
45:17-26.
26. Dochi, O., Yamamoto, Y., Saga, H., Yoshiba, N., Kano, N., Maeda, J., Miyata, K.,
Yamauchi, A., Tominaga, K., Oda, Y., Nakashima, T. and Inohane, S. 1998. Direct transfer
of bovine embryos frozen-thawed in the presence of propylene glycol or ethylene glycol
under on-farm conditions in an integrated embryo transfer program. Theriogenology,
49:1051-1058.
27. Donaldson, L.E. 1985. Recipients as a source of variation in cattle embryo transfer.
Theriogenology, 23:188.
28. Donaldson, L.E. 1985. Matching of embryo stage and grades with recipients oestrus
synchrony in bovine embryo transfer. Vet. Rec., 117:489-491.
29. Donaldson, L.E. 1986. Day of embryo collection, quality and pregnancy rates in cattle. Vet.
Rec., 118:661-663.
30. Dunne, L.D., Diskin, M.G. and Sreenan, J.M. 2000. Embryo and foetal loss in beef heifers
between day 14 of gestation and full term. Anim. Reprod. Sci., 58:39-44.
31. Elsden, R.P and Seidel, G.E. 1990. En: Evaluation of embryos. Procedures for recovery,
bisection, freezing and transfer of bovine embryos. Animal Reproduction and Biotechnology
Laboratory. Colorado State University, 13-16.
32. 32. Ellington, J.E., Foote, R.H., Farrell, P.B., Hasler, J.F., Webb, J., Henderson, W.B. and
McGrath, A.B. 1991. Pregnancy rates after the use of a gonafdotropin releasing hormone
agonist in bovine embryo transfer recipients. Theriogenology,
36:1035-1042.
33. Greve, T. and Lehn-Jensen, H. 1982. The effect of hCG administration on pregnancy rate
following non-surgical transfer of viable bovine embryos. Theriogenology, 17:91.
34. Halley, S.M., Rhodes, R.C., MsKellar, L.D. and Randel, R.D. 1979. Successful
superovulation, nonsurgical collection and transfer of embryos from Brahaman cows.
Theriogenology, 12: 97-108.
- 20 -
35. Hansen, H.B. 1976. Pregnancy rate in cattle in relation to oestrus synchronization cell
stages. Egg Transfer in Cattle. ed. Rowson, L.E.A., 223-227. Commission of the European
Communites. Luxembourg.
36. Hasler, J.F., McCauley, A.D., Lathrop, W.F. and Foote, R.H. 1987. Effect of donor-embryorecipient interactions on pregnancy rate in a large-scale bovine embryo transfer program.
Theriogenology, 27:139-168.
37. Hasler, J.F., Henderson, W.B., Hurtgen, P.J., Jin, Z.Q., McCauley, A.D., Mower, S.A.,
Neely, B., Shuey, L.S., Stokes, J.E. and Trimmer, S.A. 1995. Production, freezing and
transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results. Theriogenology, 43:141153.
38. Heyman, Y. and Chesné, P. 1984. Freezing bovine embryos: survival after cervical transfer
of one half, one or two blastocysts frozen in straws. Theriogenology, 21:240.
39. Heyman, Y., Chesné, P., Chupin, D. and Ménézo Y. 1987. Improvement of survival rate of
frozen cattle blastocysts after transfer with trophoblastic vesicles. Theriogenology, 27:477484.
40. Hill, B.R. 1996. Ensayos a campo con embriones congelados con glicerol vs etilenglicol.
CABIA 27:30-33.
41. Humblot, P., Perrin, J., Jeanguyot, N., Nibart, M. and Thibier, M. 1987. Effects of age and
quality of thawed embryos, synchronization and corpus luteum function on pregnancy rates
of bovine embryo recipients. Theriogenology, 27:240.
42. Kajihara, Y., Kometani, N., Shitanaka, Y., Saito, S., Yamaguchi, Y., Hishiyama, K. and
Endo, M. 1992. Pregnancy rates and births after the direct transfer of frozen-thawed bovine
IVF embryos. Theriogenology, 37:233.
43. Kanawaga, H. 1993. Bovine Embryo Transfer. Published by Japan International
Cooperation Agency (JICA). Second printing, pp. 168.
44. King, K.K., Seidel, G.E.Jr. and Elsden, R.P. 1985. Bovine embryo transfer pregnancies. I.
Abortion rates and characteristics of calves. Journal of Animal Science, 61:747-757.
45. Kippax, I.S., Christie, W.B. and Rowan, T.G. 1991. Effects of method of splitting, stage of
development and presence or absence of zona pellucida on foetal survival in commercial
bovine embryo transfer of bisected embryos. Theriogenology, 35:25-35.
46. Kunkel, R.N. and Stricklin, W.R. 1978. Donor-recipient asynchrony stage of embryo
development and the post-transfer survival of bovine embryos. Theriogenology, 9:96.
47. Lagomarsino, H.R., Castro, T y Visca, H. 1999. Calidad del cuerpo lúteo a la palpación
rectal y preñez en un programa comercial de transferencia de embriones congelados. ΙΙΙ
Simposio Internacional de Reproducción Animal, pp. 217.
48. Lee, E.S., Okamoto, Y., Yamashina, H. and Fukui, Y. 1997. Pregnancy rates after transfer
of fresh or frozen bovine blastocysts developed from serum-free or protein-free media.
Theriogenology, 47:350.
49. Lehn-Jensen, H. and Willadsen, S.M. 1983. Deep-freezing of cow half and quarter embryos.
Theriogenology, 19:49-54.
50. Leibo, S.P. 1986. Commercial production of pregnancies from one-step diluted frozenthawed bovine embryos. Theriogenology, 25:166.
51. Leibo, S.P. and Rall, W.R. 1987. Increase in production of pregnancies by bisection of
bovine embryos. Theriogenology, 27:245.
52. Liebrich, J. 1991. Untersuchung zur in-vitro weiterentwicklungskapazität nach transfer
produzierter rinderembryonen. Diss. München, 1-129.
53. Lindner, G.M. and Wright, R.W. 1983. Bovine embryo morphology and evaluation.
Theriogenology, 20:407-416.
54. Ling, Z.J., Shi, D.S., Huang, H.M., Wei, Y.M., Jiang, R.M. and Lu, K.H. 1995. Pregnancy
rate following transfer of IVF bovine embryos at different developmental stages.
Theriogenology, 43:266.
55. Looney, C.R., Oden, A.J., Massey, J.M., Jhonson, C.A. and Godke, R.A. 1984. Pregnancy
rates following HCG administration at the time of transfer in embryo-recipient cattle.
Theriogenology, 21:246.
56. Lucas-Hahn, A. and Niemann, H. 1991. In vitro survival of fresh and frozen/thawed bovine
demi-embryos. Theriogenology, 36:619-627.
- 21 -
57. Mapletoft, R.J., Lindsell, C.E. and Pawlyshyn, V. 1986. Effects of Clenbuterol, body
condition and non-surgical embryo transfer equipment on pregnancy rates in bovine
recipients. Theriogenology, 25:172.
58. Mapletoft, R.J., García, A. y González A. 1988. La transferencia de embriones en la vaca.
CADIA, 11:41-50.
ra.
59. Mapletoft, R.J. 1989. La tecnología de la transferencia embrionaria 1 Parte. Revista
CABIA, 17:45-65.
60. Markette, K.L., Seidel, G.E.Jr. and Elsden, R.P. 1985. Estimation of embryonic losses in
bovine embryo transfer recipients from progesterone profiles and returns to estrus.
Theriogenology, 23:45-62.
61. Massey, J.M., Oden, A.J., Voelkel, S.A. and Godke, R.A. 1983. Pregnancy rate following
HCG treatment of bovine embryo transfer recipients. Theriogenology, 19:140.
62. Massip, A., Mermillod, P., Van Langendonckt, A. and Dessy, F. 1994. Veaux issus
d`embryons produits in vitro, non congelés ou congelés. Ann. Med. Vét., 138:333-338.
63. Massip, A., Mermillod, P. and Dinnyes, A. 1995. Morphology and biochemistry of in-vitro
produced bovine embryos: implications for their cryopreservation. Human Reprod.,
10:3004-3011.
64. Mc Evoy, T.G. and Sreenan, J.M. 1990. Effect of embryo quality and stage of development
on the survival of the zona pellucida-free demi-embryos. Theriogenology, 33:1245-1253.
65. Macmillan, W.H. and Donninson, M.J. 1999. Understanding maternal contribution to fertility
in recipient cattle: Development of herds with contrasting pregnancy rates. Anim. Reprod.
Sci., 57:127-140.
66. Munar, C.J. y Nigro, M.A. 1985. Transferencias embrionarias no quirúrgicas en condiciones
de campo en la República Argentina. CADIA, 2:38-47.
67. Munar, C.J., Nigro, M.A., Burry, E.R. y Vautier, R.A. 1988. Sincronización de celos en
receptoras. CADIA, 12:54-59.
68. Munar, C.J. and Hasler, J.F. 1989. Results of the first frozen bovine embryos exported from
the USA to Argentina. Theriogenology, 31:230.
69. Munar, C.J., Nigro, M.A., Burry, E.R., Vautier, R.A. and Argerich, C. 1990. Quality control in
a large-scale embryo transfer program under farm condition in the Argentine Republic.
Theriogenology, 33:5-8.
70. Munar, C., Valdez, A.M. y Crespo, P.J. 1998. Transferencia de embriones bovinos
er
criopreservados con etilenglicol y con glicerol. 1 Simposio Internacional de Biotecnologías
Aplicadas en Reproducción Animal, 12 - 13 y 14 de Agosto de 1998, Facultad de Ciencias
Agrarias, Universidad Nacional de Lomas de Zamora, Buenos Aires, pp. 108-114.
71. Mutter, L.R., Graden, A.P. and Olds, D. 1964. Successful non-surgical bovine embryo
transfer. A.J. Digest, 12:1150.
72. Nelson, L.D., Seidel, G.E., Jr., Elsden, R.P. and Bower, R.A. 1979. Superovulation of cows
using follicle stimulating hormone and prostaglandin F2α. Theriogenology, 11:104.
73. Neumann, C., Schönmuth, G and Neumann, K. 1995. Factors influencing the result of
embryo transfer in cattle. Anim. Res. Dev., 41:91-100.
74. Newcomb, R and Rowson, L.E.A. 1975. Conception rate after uterine transfer of cow eggs
in relation to synchronization of oestrus and age of eggs. J. Reprod. Fertil., 43:539-541.
75. Newcomb, R. and Rowson, L.E.A. 1976. Aspects of the non-surgical transfer of bovine egg.
th
Proc. 8 Int. Congr. Anim. Reprod. A.I., 3:262-265.
76. Newcomb, R., Christie, W.B. and Rowson, L.E.A. 1978. Comparison of the fetal survival
rate in heifers after the transfer of an embryo surgically to one uterine horn and nonsurgically to the other. J. Reprod. Fert., 52:395-397.
77. Newcomb, R. 1979. Surgical and nonsurgical transfer of bovine embryos. Vet. Rec.,
105:432-434.
78. Newcomb, R. and Rowson, L. E. 1980. Investigation of physiological factors affecting nonsurgical transfer. Theriogenology, 13:41-49.
79. Nibart, M. and Humblot, P. 1997. Le tranfer direct des embryons bovine congelés. M. Elev.
Et Insem. Fev., 2:3-11.
80. Niemann, H., Brem, G., Sacher, B., Smidt, D. and Krausslich, H. 1986. An approach to
successful freezing of demi-embryos derived from day-7 bovine embryos. Theriogenology,
25:519-524.
- 22 -
81. Overstrom, E.W., Duby, R.T., Dobrinsky, J.R., Robl, J.M., Baguisi, A., Lonergan, P., Duffy, P.,
Walsh, J.H., Roche, J.F. and Boland, M.P. 1993. Cytoskeletal damage in vitrified and frozen
embryos. Theriogenology, 39:276.
82. Palma, G.A. Transferencia de los embriones. En G.A. Palma & G. Brem Transferencia de
embriones y biotecnología de la reproducción en la especie bovina. Ed. Hemisferio Sur.
Buenos Aires, Argentina. 1ra. Edición 1993, 143-161.
83. Pampillo, F. 1988. Siembra de embriones bovinos. Revista CABIA, 13:37-44.
84. Payas, A.J., Broadbent, P.J., Dolman, D.F. and Christie, W.B. 1989. Factors affecting
pregnancy rate in embryo transfer recipients with reference to plasma progesterone.
Theriogenology, 31:238.
85. Pettit, W. 1985. Commercial freezing of bovine embryos in glass ampules. Theriogenology,
23:13-16.
86. Picard, L., Schneider, U., Betteridge, K. and King, W. 1988. Effect of the zona pellucida,
agar embedding, and culture on the survival of micromanipulated bovine embryos after
freezing and thawing. J. In vitro Fert. Embryo Transfer, 5:268-274.
87. Pollard, J.W. and Leibo, S.P. 1994. Chilling sensitivity of mammalian embryos.
Theriogenology, 41:101-106.
88. Rall, W. F. 1992. Cryopreservation of oocytes and embryos: Methods and applications. Anim.
Reprod. Sci., 28:237-245.
89. Reed, M.L., Roussel, J.D. and Seybt, S.H. 1985. Repeatibility of blood serum progesterone
levels in dairy heifers on day 7 of the estrous cycle. Theriogenology, 24:643-646.
90. Reinchenbach, H.D., Liebrich, J., Berg, U. and Brem, G. 1991. Pregnancy results following
transfer of frozen-thawed in vitro produced bovine embryos to recipients. In Fondation
th
M.Mérieux (ed.), Proceedings of the 7 Scientific Meeting of the European Embryo Transfer
Association, Cambridge, pp. 198.
91. Reinchenbach, H.D., Liebrich, J., Berg, U. and Brem, G. 1992. Pregnancy rates and births
after unilateral or bilateral transfer of bovine embryos produced in vitro. J. Reprod. Fertil.,
95:363-370.
92. Rorie, R.W., Pendleton, R.J., Youngs, C.R. and Godky, R.A. 1986. Viability of demiembryos produced before and after deep freezing. Theriogenology, 25:192.
93. Rowe, R.F., Del Campo, M.R., Critser, J.K. and Ginther, O.J. 1980. Embryo transfer in
cattle: Nonsurgical transfer. Am. J. Vet. Res., 41:1024-1028.
94. Rowson, L.E.A., Tervit, R. and Brand, A. 1972. The use of prostaglandins for
synchronization of oestrus in cattle. J. Reprod. Fertil., 29:145.
95. Saito, N. 1994. Chapter V. Transfer of embryos. Manual of embryo transfer & in vitro
fertilization in cattle. ed. Saito, N., 36-46. National Livestock Breeding Center, MAFF,
Japan.
96. Schmidt, M., Avery, B., Smith, S.D., Purwantara, B. and Greve, T. 1992. The freezability of
biopsied bovine embryos. Theriogenology, 38:615-621.
97. Schmidt, M., Smith, S.D., Avery, B., Purwantara, B. and Greve, T. 1992. Coculture of
bovine demiembryos prior to freezing. Acta Vet. Scand., 33:237-243.
98. Schneider, H.J.Jr., Castleberry, R.S. and Griffin, J.L. 1980. Commercial aspects of bovine
embryo transfer. Theriogenology, 13:73-85.
99. Seike, N., Sakai, M. and Kanagawa, H. 1991. Development of frozen-thawed demi-embryos
and production of identical twin calves of different ages. J. Vet. Med. Sci., 53:37-42.
100.
Shea, B.F., Hines, D.G., Lightfoot, D.E. Ollis, G.W. and Olsen, S.M. 1976. The transfer
of bovine embryos. In: Egg Transfer in Cattle. ed. Rowson, L.E.A. 145-152. Commission of
the European Communites. Luxembourg.
101.
Shea, B.F. 1981. Evaluating the bovine embryo. Theriogenology, 15:31-42.
102.
Sreenan, J.M., Behaan, D. and Mulvehill, P. 1975. Egg transfer in cow: Factors affecting
pregnancy and twinning rates following bilateral transfer. J. Reprod. Fertil., 44:77-85.
th
103.
Sreenan, J. M. 1976. Egg transfer in the cow : Effect of site of transfer. Proc. 8 Int.
Congr. Anim. Reprod. A.I., III: 269-272.
104.
Sreenan, J.M. and Beehan, D. 1976. Methods of induction of superovulation in the cow
and transfer results. Egg transfer in cattle. ed. Rowsonn, L.E.A. 19-34. Commission of the
European Communites. Luxembourg.
105.
Sreenan, J.M. and Diskin, M.G. 1987. Factors affecting pregnancy rate following
embryo transfer in cow. Theriogenology, 27:99-113.
- 23 -
106.
Suzuki, T., Saha, S., Sumantri, C., Takagi, M. and Boediono, A. 1995. The influence of
polyvinylpyrrolidone on freezing of bovine IVF blastocysts following biopsy. Cryobiology,
32:505-510.
107.
Tachikawa, S., Otoi, T., Kondo, S., Machida, T. and Kasai, M. 1993. Successful vitrification
of bovine blastocysts, derived by in vitro maturation and fertilization. Mol. Reprod. Dev.,
34:266-271.
108.
Takeda, T., Hallowell, S.V., McCauley, A.D. and Hasler, J.F. 1986. Pregnancy rates
with intact and split bovine embryos transferred surgically and nonsurgically.
Theriogenology, 25:204.
109.
Tervit, H. R., Havik, P.G. and Smith J.F. 1977. Egg transfer in cattle: Pregnancy rate
following transfer to the uterine horn ipsilateral or contralateral to the functional corpus
luteum. Theriogenology, 7: 3-10
110.
Thibier, M. and Nibart, M. 1995. The sexing of bovine embryos in the field.
Theriogenology, 43:71-80.
111.
Touati, K. and Ectors, F. 1991. Congélation de demi-embryons par la méthode au
glicérol-sucrose et transfert direct: premiers resultats. Ann. Méd. Vét., 135:287-289.
112.
Van Soom, A. Mijten, P., Van Vlaenderen, I., Van den Branden, J., Mahmoudzadeh,
A.R. and de Kruif, A. 1994. Birth of double-muscled Belgian Blue calves after transfer of in
vitro produced embryos into dairy cattle. Theriogenology, 41:855-867.
113.
Van Wagtendonk -de Leeuw, A.M., den Daas, J.H.G. and Rall, W.F. 1994. Pregnancy
rates in a comparative field trial of vitrification and one-step dilution or conventional slow
freezing and three-step dilution of bovine embryos are similar. Theriogenology, 41:326.
114.
Van Wagtendonk-de Leeuw, A.M., den Daas, J.H.G. and Rall, W.F. 1997. Field trial to
compare pregnancy rates of bovine embryo cryopreservation methods: vitrification and onestep dilution versus slow freezing and three-step dilution. Theriogenology, 48:1071-1084.
115.
Wenkoff, M. 1986. The effect of Clenbuterol on pregnancy rates in bovine recipients
after nonsurgical transfer. Theriogenology, 25:214.
116.
Wright, J.M. 1981. Non-surgical embryo transfer in cattle embryo-recipient interactions.
Theriogenology, 15:43-56.
117.
Wright, J.M. 1985. Commercial freezing of bovine embryos in straws. Theriogenology,
23:17-29.
118.
Wurth, Y.A., Reinders, J.M.C. Rall, and Kruip, T.A.M. 1994. Developmental potential of
in vitro produced bovine embryos following cryopreservation and single-embryo transfer.
Theriogenology, 42:1275-1284.
119. Xu, X.X., Burton, J.R., Burton, L.J. and Macmillan, K.L. 1995. Reproductive performance of
synchronised lactating dairy cows. Proc. N.Z. Soc. Anim. Prod., 55:242-243.
- 24 -