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Pastos y Forrajes Vol. 24, No. 1, 2001
ESTUDIO DE LA INTERACCION DE Trichoderma harzianum
CON BACTERIAS DINITROFIJADORAS DE VIDA LIBRE
C.J. Bécquer1, H. Antoun2 y Danielle Prévost3
1
2
3
Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spiritus
Apdo. 2228, Zona Postal 1, Sancti Spiritus, Cuba
Departamento de Microbiología del Suelo, Facultad de Ciencias Naturales,
Universidad Laval, Québec, Canada
Soils and Crops Research and Development Centre Sainte-Foy, Agriculture and Agri-Food Canada, Québec,
Canada
Se realizó un ensayo de laboratorio con el objetivo de evaluar algunas características fundamentales de la
interacción de una cepa de Trichoderma harzianum con diferentes cepas bacterianas dinitrofijadoras de vida
libre. Para ello se utilizaron medios de cultivo específicos y el criterio de evaluación se basó en el diámetro de las
colonias de Trichoderma, así como en la presencia o ausencia de halo de inhibición en las cepas bacterianas. Se
demostró que Azospirillum brasilense fue capaz de inhibir el crecimiento de este hongo, mientras que las demás
cepas bacterianas no mostraron actividad antagónica. Se recomienda continuar profundizando en estos estudios.
Palabras clave: Azospirillum brasilense, Trichoderma harzianum
An experiment under laboratory conditions was established to evaluate some fundamental characteristics in
the interaction among a strain of Trichoderma harzianum and several strains of free dinitrofixer bacteria species.
Specific culture media for this purpose were used and the diametre of Trichoderma colonies, as well as the
presence or absence of an inhibitory halo in bacterial strains, were taken as criteria for evaluation. It was
demonstrated that Azospirillum brasilense was able to inhibite growth of the fungi while the rest of bacterial strains
showed no antagonistic activity against Trichoderma. A deeply study is recommended.
Key words: Azospirillum brasilense, Trichoderma harzianum
El suelo es el medio natural donde las comunidades microbianas encuentran condiciones favorables para su
desarrollo y es el escenario donde se llevan a cabo complejas y diversas interacciones entre los componentes
de la biota que lo habitan. Según Atlas y Bartha (1993) la interacción entre las poblaciones es una fuerza que
dirige la evolución de la estructura comunitaria microbiana; la interacción entre los hongos y las bacterias es un
clásico ejemplo de ello.
Es de considerable interés científico conocer la influencia que pudiera ejercer la interacción del hongo
Trichoderma en bacterias dinitrofijadoras de vida libre. También la aplicabilidad práctica de estos conocimientos
puede constituir un factor en el mejoramiento agrícola y en la conservación del medio ambiente. Ghisalberti y
Sivasithamparan (1991) reportan la acción antagonista de este hongo sobre bacterias gram positivas y
negativas. Sin embargo Hernández, Sirut, Nápoles y Concepción (1996) detectaron resultados altamente
positivos en la cosecha de la variedad Red Creole (cebolla) al inocularla con Trichoderma sp. y Azotobacter sp.
Otros estudios han resaltado el beneficio de la interacción de Azospirillum con otros microorganismos (Bashan
y Holguín, 1997).
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Las cepas de bacterias dinitrofijadoras de vida libre utilizadas en este experimento son representativas de
los géneros Azospirillum, Azotobacter, Bacillus y Beijerinckia, los cuales pueden colonizar la superficie radical
de las plantas, y en el caso de Azospirillum penetran hasta el cortex y se les atribuye propiedades que van más
allá de la fijación biológica del nitrógeno atmosférico (Elmerich, 1995).
Con este estudio en su primera fase, se pretende detectar algunas características de la interacción de una
cepa de Trichoderma harzianum, ampliamente utilizada en la práctica agrícola, con los representantes de
bacterias dinitrofijadoras de vida libre antes mencionados.
MATERIALES Y METODOS
Microorganismos utilizados
• Cepa de Trichoderma: Se tomó la cepa de Trichoderma harzianum, WT 206040, donada por el
Departamento de Microbiología del Suelo de la Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Laval, Québec,
Canadá.
• Cepas bacterianas: Se escogieron las cepas de bacterias donadas por Agriculture and Agri-Food Canada
para su evaluación: Azospirillum brasilense (29145), Azospirillum lipoferum (24707), Azotobacter chroococcum
(7486), Beijerinckia mobilis (35011) y Paeni-bacillus azotofixans (35681).
Los medios de cultivo empleados fueron los siguientes:
• Triptona Soya Agar (TSA) (Oxoid): Medio de cultivo utilizado para el crecimiento de P. azotofixans.
Š
Medio específico enriquecido con carbono (Difco) utilizado para el resto de los cultivos bacterianos:
(KH2PO4: 0,4 g; K2HPO4: 0,1 g; MgSO4.7H2O: 0,2 g; NaCl: 0,1 g; FeCl3: 10,0 mg; Na2Mo4.2H2O: 2,0 mg;
Malato de sodio: 5,0 g; Extracto de levadura: 50,0 mg; H2O destilada: 1,0 L; pH 7,2).
Procedimiento experimental
Siembra de Trichoderma: A partir de un cultivo en medio sólido de Trichoderma (concentración de conidios
de 3x108 células/mL) se sembró una cepa en medio PDA (Papa Dextrosa Agar) (Difco) y a los 7 días
posteriores se cortaron discos que contenían este hongo. Los discos fueron cortados a un diámetro de 5 mm
con la ayuda de un sacabocado metálico previamente flameado. Se sembraron sobre los medios de cultivo
sólidos que contenían las cepas bacterianas y se incubó a 29oC para su evaluación a los 3, 5, 7, 9 y 11 días.
Siembra de las bacterias: Se confeccionaron inóculos líquidos contenidos en tubos de ensayo con un
volumen de 10 mL, a partir de una asada de cultivos bacterianos en medio sólido. Se incubaron a 29oC en
agitación por medio de una zaranda orbital Rotatest (Francia) a 140 rpm durante 7 días con un título final de 109
células/mL para Azospirillum spp. y 107 para el resto de las bacterias (conteo por cámara de Neubauer). En el
inóculo formado se introdujo un hisopo de algodón estéril para sembrar sobre los medios de cultivo en placas
Petri. Para ello se cubrió toda la superficie del medio y se esperó por un crecimiento uniforme de las bacterias,
que varió de acuerdo con las cepas utilizadas.
Tratamientos. Se emplearon cinco tratamientos con diez réplicas:
1. A. brasilense, + T. harzianum
2. A. lipoferum + T. harzianum
3. A. chroococcum + T. harzianum
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4. B. mobilis + T. harzianum
5. P. azotofixans + T. harzianum
Cálculos bioestadísticos. Se realizó un análisis de varianza (Lerch, 1976) y las diferencias entre medias se
calcularon por la dócima de comparación (Duncan, 1955).
RESULTADOS Y DISCUSION
En las figuras 1, 2, 3 y 4 se puede observar la diferencia en el crecimiento de la cepa de Trichoderma al
interactuar con diferentes especies bacterianas y que la interacción con la cepa de A. brasilense incidió
desfavorablemente en su desarrollo. En los tratamientos 3 (A. chroococcum + T. harzianum), 4 (B. mobilis + T.
harzianum) y 5 (P. azotofixans + T. harzianum), a partir de los 5 días de siembra el hongo alcanzó un mayor
diámetro y mostró diferencias significativas (P<0,001) en comparación con los tratamientos 1 (A. brasilense + T.
harzianum) y 2 (A. lipoferum + T. harzianum) (fig. 4), por lo que se infiere que existió una fuerte acción
competitiva de Azospirillum sobre el hongo.
a
b
Halo de inhibición
Th
Th
Fig. 1. Colonias de Trichoderma harzianum (Th) crecidas sobre Paenibacillus
azotofixans (a) y Azospirillum brasilense (b) a los 3 días de sembradas.
a
b
Halo de inhibición
Th
Th
Fig. 2. Colonias de Trichoderma harzianum (Th) crecidas sobre Paenibacillus
azotofixans (a) y Azospirillum brasilense (b) a los 5 días de sembradas.
Por otra parte, se observó que a los 3 días de incubación se formó un halo de inhibición de 3 cm alrededor
del disco de T. harzianum en el medio de cultivo sembrado con A. brasilense (figs. 1 y 4), el cual se mantuvo
invariable hasta los 5 días (fig. 2) y posteriormente decreció a los 7 días, momento en que presentó un diámetro
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de 2,5 cm (fig. 4); a los 9 y 11 días disminuyó hasta 2 cm (fig. 4), lo cual presupone la influencia de
metabolitos bacterianos capaces de inhibir el crecimiento del hongo.
cm
8
6
4
2
0
3
5
7
9
11
Días
Azospirillum brasilense + Trichoderma harzianum
A. lipoferum + T. harzianum
Azotobacter chroococcum + T. harzianum
Beijerinckia mobilis + T. harzianum
Paenibacillus azotofixans + T. harzianum
Fig. 3. Diámetro de las colonias de Trichoderma harzianum al interactuar con
cepas de Azospirillum, Azotobacter, Beijerinckia y Paenibacillus.
cm
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
3
5
7
9
11
Días
Fig. 4. Diámetro del halo de inhibición en la colonia de Azospirillum brasilense al
interactuar con Trichoderma harzianum.
Resultados similares obtuvieron Bécquer, Valdivia y Arioza (1997) al estudiar T. harzianum con una cepa de
rizobio de crecimiento rápido, el cual fue capaz de formar un halo de inhibición y ser viable después de la
interacción. En el resto de los tratamientos no se observó presencia de halo de inhibición por las bacterias y se
constató la acción parasitaria de la cepa de Trichoderma al invadir completamente el medio de cultivo
sembrado con los cultivos bacterianos.
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Bécquer et al. (1997) presuponen la presencia de algún metabolito intra o extracelular que pudiera ser
segregado por la bacteria y que sea resistente a los mecanismos agresivos competitivos del hongo. Según
Tapia-Hernández, Mascarua-Esparza y Caballero-Mellado (1990); Shah, Karkhanis y Desai (1992) y Elmerich
(1995), las bacterias del género Azospirillum producen sideróforos y bacteriocinas; estas últimas pueden servir
de agentes biocontroladores en su lucha por la supervivencia con otros miembros de la microflora del suelo,
entre los que se cuentan bacterias y hongos de diversos géneros. Alcaraz-Meléndez, Real-Cosio, Amador y
Bashan (1997) encontraron que una cepa de A. lipoferum indujo mecanismos de defensa en callos de Vigna
sinensis, similares a los inducidos por cepas patógenas de Pseudomonas y Xanthomonas.
Se concluye que la cepa de T. harzianum fue inhibida en su crecimiento al interactuar con A. brasilense,
mientras que el resto de las cepas bacterianas fueron colonizadas. Es evidente el carácter antagónico entre A.
brasilense y T. harzianum, ya que la bacteria fue capaz de contrarrestar la acción competitiva del hongo.
REFERENCIAS
ALCARAZ-MELENDEZ, L.; REAL-COSIO, S.; AMADOR, A. & BASHAN, Y. 1997. Evidence for harmless and
deleterious effects of Azospirillum spp. inoculation of plants. In: Proceedings of the Fourth International
Workshop on Plant Growth-Promoting Rhizo-bacteria. Sapporo, Japan. p. 384
ATLAS, R.M. & BARTHA, R. 1993. Microbial Ecology. Fundamentals and applications. Benjamin/Cummings
Publishing Co., Inc., USA. 563 p.
BASHAN, Y. & HOLGUIN, GINA. 1997. Azospirillum-plants relationships: environmental and physiological
advances (1990-1996). Can. J. Microbiol. 43:103
BECQUER, C.J.; VALDIVIA, MIRTHA & ARIOZA, MARIA DOLORES. 1997. Antagonismo y compatibilidad entre
Trichoderma y Rhizobium (I y III: condiciones controladas). Resúmenes II Taller Internacional sobre
Colecta y Evaluación de Recursos Fitogenéticos Nativos. Sancti-Spiritus, Cuba. p. 14
ELMERICH, C. 1995. Associative symbiosis with cereals and other grasses: the case of Azospirillum. In:
Microbes, environment, biotechnology. (Eds. J.P. Aubert & P.M.W. Martin). Institut Pasteur, Paris. p. 68
GHISALBERTI, E.Z. & SIVASITHAMPARAN, K. 1991. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp. Sci.
Biol. Biochem. 11:1011
HERNANDEZ, H.N.; SIRUT, E.O.; NAPOLES, C.A & CONCEPCION, AIME. 1996. Empleo de Azotobacter
chroococcum y Trichoderma sp. en dos variedades de cebolla. Resúmenes IV Encuentro Científico
Técnico de Bioplaguicidas. Ciudad de La Habana, Cuba. p. 72
LERCH, G. 1976. La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas. Ed. Ciencia y Técnica. La Habana,
Cuba. 452 p.
SHAH, S.; KARKHANIS, V. & DESAI, A. 1992. Isolation and characterization of siderophore, with antimicrobial
activity, from Azospirillum lipoferum M. Curr. Microbiol. 25:347
TAPIA-HERNANDEZ, A.; MASCARUA-ESPARZA, M.A. & CABALLERO-MELLADO, J. 1990. Production of
bacteriocins and sidero-phorelike activity by Azospirillum brasilense. Microbios. 64:73
Recibido el 5 de abril del 2000
Aceptado el 10 de diciembre del 2000
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