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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
JULIO CÉSAR TOVAR CASTAÑO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogotà D.C
2008
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
JULIO CÉSAR TOVAR CASTAÑO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de
Microbiòlogo Agrìcola y Veterinario
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogotà D.C
Enero 2008
NOTA DE ADVERTENCIA
Artìculo 23 de la Resoluciòn No 13 de Julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velarà por que no se publique nada
contrario al dogma, y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se ve en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia.”
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
JULIO CÉSAR TOVAR CASTAÑO
_____________________________
JOSE SALVADOR MONTAÑA MSc.
DIRECTOR.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogotà D.C
Enero 2008
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
JULIO CÉSAR TOVAR CASTAÑO
______________________________
________________________
Gerardo Moreno Durán MSc.
Luis David Gomez MSc.
JURADO
JURADO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogotà D.C
Enero 2008
“A dios por darme la libertad de vivir, A mi madre Mery quien con
su hermoso ejemplo de honestidad y fortaleza alienta siempre mi
corazòn, por su amor de madre y comprensión infinita, a mi padre
Julio Cèsar, por su incondicional apoyo, por sus invaluables
consejos que fortalecieron mi alma y encaminaron mi vida, y a
Angèlica Maria y Jairo Humberto por su aliento de hermanos y por
el hermoso regalo de existir en mi vida “.
AGRADECIMIENTOS
A Jose salvador Montaña por su calidad humana y enseñanzas, por su apoyo y
orientación constante e incondicional, por su comprensión y por la confianza
brindada para culminar exitosamente este proyecto de mi vida.
Al Doctor Gerardo Moreno por su orientación y consejos en la realización de los
ensayos de la investigación en la Estaciòn experimental de la Pontificia
Universidad Javeriana.
Al Laboratorio de Microbiologìa ambiental y de suelos por el suministro del
aislamiento T3 y por la colaboración durante la realización de esta
investigación.
Al CIIA por el suministro del hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani para el
desarrollo de la investigación.
Al LESYHT por el suministro del hongo nativo de Trichoderma T235 para el
desarrollo de la investigación.
A flor América por el suministro de los esquejes de clavel enraizados y el
aislamiento Trichoderma Tsp5, Tv1, Tc1 y Ti1.
A Claudia Patricia por su aliento y apoyo incondicional.
RESUMEN
Trichoderma es un hongo de gran importancia a nivel agrícola gracias a las
diversas ventajas que ofrece como agente de control biológico, para la
protección de plantas frente al ataque de
fitopatògenos causantes de
enfermedades de importancia económica, como es el caso de los cultivos
hortícolas.
En el presente estudio se evaluò la capacidad antagonista de 6 aislamientos de
Trichoderma (T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1 y T235), frente a Rhizoctonia. solani, un
fitopatògeno causante de muchas enfermedades en plantas. Se empleo para
ello la técnica de cultivo dual, donde los aislamientos T235 Y T3 mostraron los
mayores valores de crecimiento libre desde las 24h y los mas altos porcentajes
de inhibición micelial PIM Curiosamente el aislamiento comercial Tc1 presento
la menor tasas de crecimiento.
Con el fin de confirmar la capacidad antagonista “in vivo” de los 6 aislamientos
de Trichoderma, se realizaron ensayos en esquejes enraizados de clavel de la
variedad everest susceptibles a R. solani bajo condiciones de invernadero,
Confirmando los resultados obtenidos en los ensayos de antagonismo “in vitro”,
se observo que el tratamiento silvestre T235 resultò tener la mejor capacidad
antagonista, reflejado en mayores valores de crecimiento de la parte aérea, raiz
y peso de los esquejes de clavel, además de una mejor apariencia de los
mismos y ausencia de signos o síntomas de la enfermedad.
Contrario a lo observado en el ensayo in vitro, donde el aislamiento Tc1 mostro
tasas de crecimiento libre y porcentajes de inhibición micelial bajos, en los
ensayos de invernadero este aislamiento presento una buena capacidad
antagonista
y
promocion
del
crecimiento
vegetal
indicando
que
no
necesariamente la capacidad antagonista de un aislamiento observada in Vitro
sea un indicativo de cómo se va a comportar en condiciones de invernadero o
campo
INDICE GENERAL
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………...…….. 1
2. MARCO TEÒRICO Y ESTADO DEL ARTE …………………………………… 3
2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma ……………………………………………….. 5
2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma……………………………….. 6
2.2.1. Biocontrol por competencia………………………………………………. 7
2.2.2 Competencia por nutrientes……………………………………………… 8
2.2.3 Antibiosis……………………………………………………………………..8
2.2.4 Micoparasitismo…………………………………………………………….. 9
2.2.5 Sinergismo……………………..…………………………………….…......10
2.2.6 Biofertilización y mecanismos de defensa en plantas……………….. 10
2.2.7 Modificación de la rizosfera . …………………………………………… 10
2.3 Trichoderma en el biocontrol…………………………………………….….13
2.4 Trichoderma como biofertilizante………………………………….………. 15
2.5 Rhizoctonia solana……………………………………………………….…..16
2.5.1 BIOLOGÌA de Rhizoctonia solani……………………………………….. 17
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN……………...………20
4. OBJETIVOS………………………………………………………………………..22
4.1. Objetivo General……………………………………………………………. 22
4.2 Objetivos específicos……………………………………………………….. 22
5. MATERIALES Y METODOS……………………………………………………. 23
5.1 Diseño de la investigación………………………………………………….. 23
5.1.1 Ubicación…………………………………………………………………….23
5.1.2 Microorganismos……………………………………………………………23
5.1.3. Material vegetal …………………………………………………………... 24
5.1.4. Elaboración del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma... 24
5.1.5 Preparación del inoculo de aislamientos de Trichoderma …..……….. 25
5.1.6 Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani………..……………….. 25
5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro …………………..…………………….. 26
5.1.8 Elaboración de la prueba de antagonismo…….……………………… .26
5.2 Evaluación de la capacidad antagonista “in vivo”……….……………….. 27
5.3 Diseño experimental ……….……………………………………………….. 28
5.4 Variables de estudio…………………………………………………. ..…… 29
6. RESULTADOS Y DISCUSIÒN………………………………………………….30
6.1 Evaluaciòn Macro y Microscòpica de aislamientos de Trichoderma ….. 31
6.2 Crecimiento libre de aislamientos de Trichoderma……………………... 33
6.3 Evaluaciòn de crecimiento del patógeno R. solani ……………………… 34
6.4 Actividad antagonista de las cepas de estudio ………………………….. 35
6.5 Evaluaciòn del antagonismo in vivo de aislamientos de Trichoderma …38
7. CONCLUSIONES ……………………………………………………………...…59
8. BIBLIOGRAFIA ……………………………………………………………….…. 61
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Crecimiento en placa de los Aislamientos de Trichoderma T3,
TSP5, Tv1, Tc1, Ti1, y T235 en agar PDA durante 48 horas a 30°C………....31
Figura 2. Porcentajes de crecimiento libre evaluado a las 24,36,48 y 60 horas
para 6 aislamiento de Trichoderma……………………………………………….34
Figura 3. Curva de Crecimiento de Rhizoctonia solani……………………..… 34
Figura 4. Técnica de enfrentamiento: A la derecha de cada caja, aislamientos
T3, Tsp5, Tc1, Ti1, Tv1, y T235 de Trichoderma a la izquierda Rhizoctonia
solani. Fotografía tomada 72 horas después del inicio de la prueba…………36
Figura 5. Porcentaje de inhibición micelial de los 6 aislamientos de
Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas………………………………………….…..37
Figura 6. Aspecto del material vegetal previo a la inoculación con el Hongo
Rhizoctonia solani…………………………………………………………….…… 39
Figura 7. Aspecto del material vegetal luego de la inoculación en campo con
el patógeno ………………………………………………………………………... 40
Figura 8. Aspecto del material vegetal 7 días después de la inoculación con
el patógeno …………………………………… ………………………………… 40
Figura 9. Aspecto del material vegetal 11 días después de la inoculación
con el patógeno …………………………………………………………………... 41
Figura 10. Aspecto del material vegetal 15 días después de la inoculación
con el patógeno ……………………………………………………………………..42
Figura 11 Evaluaciòn de la longitud de la parte aérea de esquejes de clavel
En respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con
R. solani………………………………………………………………………….…. 42
Figura 12. Síntomas iniciales visibles en Tsp5 y Control Rhizoctonia solani...43
Figura 13. Aspecto del material vegetal 19 días después de la inoculación
con el patógeno …………………………………………………………………….. 44
Figura 14. Evaluación de la longitud foliar de esquejes de clavel en respuesta
a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani………44
Figura 15 Evaluación del peso fresco de esquejes de clavel en respuesta
a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani…….46
Figura 16. Aspecto del material vegetal 23 días después de la inoculación
con el patógeno ……………………………………………………………………...48
Figura 17. Evaluación del peso seco aéreo de esquejes de clavel en
respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R.
solani ………………………………………………………………………………… 49
Figura 18 Evaluación del peso seco raíz de esquejes de clavel en respuesta
a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani……50
Figura 19. Sintomas visibles de la enfermedad en el material vegetal………. 51
Figura 20. Evaluación del peso seco total de esquejes de clavel en respuesta
a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani…... 52
Figura 21. Incidencia de Muerte de esqujes de clavel en los tratamientos
por acción patogénica de R. solani ……………………………………………….52
Figura 22. Evaluaciòn de las raíces en los diferentes tratamientos
durante el desarrollo del ensayo …………………………………………………. 54
Figura 23. Evaluación de la longitud de raiz de esquejes de clavel en
respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R.
solani ………………………………………………………………………………... 55
Figura 24. Aspecto del material vegetal 27 días después de la inoculación
con el patógeno…………………………………………………………………….. 56
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tratamientos para la evaluación de antagonismos “in vivo” ……… 28
Tabla 2. Evaluación macroscópica de los 6 Aislamientos de Trichoderma … 31
Tabla 3. Resultados obtenidos al evaluar el crecimiento libre de
Trichoderma a las 24, 36, 48 y 60 horas……………………………………….. 32
Tabla 4. Resultados obtenidos al evaluar el porcentaje de inhibición
micelial de los 6 aislamientos de Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas …….. 37
INTRODUCCIÓN
El aumento de la población mundial, el deterioro del medio ambiente y calidad
de vida del hombre, son sólo algunos de los tantos factores que han motivado
al ser humano a buscar nuevos procesos de producción agrícola que permitan
cubrir la demanda, cada vez más creciente, de alimento y materias primas a
través de procesos donde se aprovechen los recursos naturales de manera
sostenible e integrando así los conceptos de conservación y desarrollo para la
plena satisfacción de las necesidades humanas. No obstante las actividades
agrícolas extensivas y la ampliación de sus fronteras han traído consigo
problemas fitosanitarios en los sistemas naturales, especialmente en el suelo,
que es considerado el soporte principal de la agricultura.
Uno de los aspectos importantes en la producción agrícola es el control de
plagas y enfermedades; medidas fitosanitarias que minimicen las perdidas
económicas ocasionadas por diferentes efectos como son los agentes químicos
o biológicos.
La utilización extensiva de compuestos químicos para el control de
enfermedades, la emergencia de patógenos resistentes a fungicidas, y el
deterioro en la salud de productores y consumidores, han promovido la
búsqueda de alternativa viables que garanticen una mayor sostenibilidad en la
producción agrícola, minimizando el impacto sobre el medio ambiente.
Desde 1980 Rhizhobacterias y hongos biocontroladores han sido investigados
como posible alternativa de producción limpia. El empleo de agentes de control
biológico (BCAs) ha permitido una reducción en la aplicación de fungicidas
químicos y por lo tanto un control más eficiente de patógenos causantes de
enfermedades, al ser incorporados a los programas de manejo integrado.
El hongo Trichoderma sp es un eficiente controlador biológico que está siendo
ampliamente usado en agricultura como agente de biocontrol debido a su
habilidad para colonizar sustratos rápidamente, inducir resistencia sistémica
adquirida en plantas, promover el crecimiento vegetal y poseer actividad
antagonista contra un amplio rango de hongos patógenos. El efecto inhibitorio
de sus antibióticos y la degradación de componentes de la pared celular de
patógenos de plantas, es citado como aspecto importante de su actividad
antagonista.
Las especies de Trichoderma tienen una gran actividad antagonista sobre
patógenos como Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Pythium ultimum y
Fusarium oxisporum, causantes de enfermedades importantes en cultivos de
rábano, clavel, crisantemo, fríjol, cafeto, haba, tomate y cítricos entre otros.
Durante los últimos años, varios investigadores y algunas empresas han
mostrado gran interés en estudiar el potencial de Trichoderma como
controlador biológico de patógenos de suelo.
En este contexto, el presente trabajo evaluó bajo condiciones de invernadero,
la capacidad antagonista de aislamientos nativos y comerciales de Trichoderma
spp frente al hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani. Los resultados de esta
investigación ayudaron en la obtención de información tanto en laboratorio
como en campo sobre la acción potencial biocontroladora de este género.
2. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE
El control biológico de enfermedades en plantas o insectos con agentes
microbianos es una posibilidad atractiva, si se tiene en cuenta que los costos
respecto al uso de otras prácticas de control tradicionales pueden resultar
menores y de mayor eficiencia, pues, aunque los antagonistas pueden actuar
en forma más lenta y en menor escala, su acción puede ser más estable y
duradera que el control químico (Papavizas y Lewis, et al.1984).
El conocimiento concerniente al comportamiento de algunos hongos como
antagonistas es esencial para su efectivo uso, debido a que pueden actuar
contra organismos blanco de varias formas constituyéndose en una alternativa
biológica al empleo de compuestos químicos convencionales, considerados
nocivos para el medio ambiente (Jeffries y Young, 1994).
Mediante el uso de hongos y bacterias antagonistas se han podido conocer
estrategias con mayor potencial para el control de enfermedades ocasionadas
por patógenos del suelo (Cook y Baker, 1983). Muchas especies saprofitas
como Trichoderma harzianum., Gliocladium spp., y Verticillium lecanii son
antagonistas de varios organismos plaga, incluyendo patógenos de plantas,
malezas e insectos (González et al., 1998). De otra parte sobreviven durante
periodos
relativamente
largos
como
formas
de
resistencia,
haciendo
innecesaria la reinfección continua con el agente biocontrolador (Wainwright et
al., 1995)
Las especies de Trichoderma han sido investigadas como agentes de control
biológico (BCAs) de enfermedades fúngicas por cerca de 70 años (Hjeljord y
Tronsmo, 1998), pero es solo recientemente que las cepas han comenzado ha
ser comercialmente aprovechables. El éxito de las cepas de Trichoderma como
(BCAs) es debido a su alta capacidad reproductiva, habilidad para sobrevivir
bajo condiciones ambientales desfavorables, eficiencia en la utilización de
nutrientes, capacidad para modificar la rizósfera, fuerte agresividad contra
hongos fitopatógenos y eficiencia en promoción de crecimiento en plantas e
inducción de mecanismos de defensa (Benítez y Rincón 2004). Estas
propiedades han hecho que Trichoderma se presente en cualquier hábitat en
una alta proporción.
Las diferentes especies de Trichoderma se caracterizan por tener un
crecimiento micelial rápido y una abundante producción de esporas que ayuda
a la colonización de diversos sustratos y del suelo. Así mismo pueden producir
enzimas extracelulares, antibióticos antifùngicos, ser competidores contra
hongos patógenos, promover el crecimiento en plantas, e inducir resistencia
(Zimand et al., 1996) Además compiten muy bien por nutrientes, son
micoparasitos muy activos y son competidoras muy eficientes de la rizosfera
(Papavizas et al., 1985; Ahmad y Baker, 1987).
Liu y Baker en 1980 y Chet y colaboradores en 1987, demostraron que
especies
de Trichoderma harzianum y T. hamatum fueron especialmente
eficientes en el control de patógenos como Rhizoctonia solani.
Varios aislamientos de Trichoderma harzianum se han utilizado exitosamente
en el control de algunas enfermedades ocasionadas por Rhizoctonia solani
como: damping off en tomate (Rodríguez, 2002), pudriciones radiculares en
plantas de fríjol (Gutiérrez et al., 2006), podredumbre negra de la raíz en fresa
(Baldarrago,1999), pudrición del tallo en clavel ( García et al.,1998),
pudrimiento de las raíces en habichuela ( Cardoso, et al., 1987 ) y mal del
talluelo o damping off en el cafeto (Castro et al., 2005 ).
Además,
se
ha
encontrado
que
algunas
especies
de
Trichoderma,
especialmente Trichoderma harzianum tienen el potencial de aumentar el
crecimiento y desarrollo de las plantas; esto parece deberse a la inhibición de
patógenos menores y a la producción de factores que estimulan el crecimiento
de la planta y favorecen la toma de nutrientes (Widham et al., 1986; Chang et
al., 1986; Chet, 1987; Baker, 1990).
Los procedimientos por los cuáles se promueve la actividad de biocontrol
contra fitopatógenos fúngicos se fundamenta sobre la activación de múltiples
mecanismos entre los que se encuentran: la inactivación de las enzimas del
patógeno, la competencia por el espacio y nutrientes, la secreción de
metabolitos secundarios con efecto antibiótico y el ataque directo a otro hongo
o micoparasitismo. Además indirectamente Trichoderma, es capaz de proteger
a la planta del patógeno, mediante la inducción de sus sistemas de defensa (
Benitez, 2004 ).
2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma spp
Trichoderma sp, es un habitante natural del suelo, caracterizado por un
comportamiento saprófito o parásito, propiedades que benefician su actividad
antagónica. (Camargo, 2005). Es considerado un colonizador secundario dado
su frecuente aislamiento a partir de materia orgánica en descomposición,
también es aislado comúnmente a partir de la superficie de raíces de varias
plantas de madera y parasitando estructuras de diferentes hongos patógenos,
debido a la competencia por nutrientes y micoparasitismo (Camargo et al.,
2005).
Las colonias de Trichoderma presentan crecimiento rápido, que va formando
una colonia delgada de sobre la superficie del agar, debido a la conidiación que
presenta a través de su desarrollo. Las colonias al comienzo son lisas o casi
transparentes y algunas veces blancas, posteriormente se presentan penachos
blancos y algodonosos, de micelio blanco, conformando una red densa,
responsable del pigmento característico. (Barnett, y Hunter, 1982).
Las especies del género Trichoderma presentan conidióforos complejos y
altamente ramificados en forma piramidal o cónica dando origen a esterigmas,
con extremos ahusados. Al microscopio las fiàlides se observan más estrechas
en la base que en la parte superior, permitiendo una buena correlación entre el
sistema de ramificación del conidióforo y la disposición de estas. (Barnett, y
Hunter, 1982).
Microscópicamente muchas especies del género crecen rápidamente en
cultivos artificiales y produce un largo número de pequeñas conidias verdes o
blancas de células conidiogenas situadas al final de conidioforos extensamente
ramificados. Esta característica permite una relativa fácil identificación de
Trichoderma como género, pero el concepto de especies son difíciles de
interpretar, y allí hay una considerable confusión sobre la aplicación de
nombres específicos. Rifai dividió el género Trichoderma en nueve especies
sobre la base de características morfológicas. Bisset, revisó el género y
además incluyó algunas Hypocrea anamorfas en el género, resultando en el
establecimiento de cinco nuevas secciones (Hermosa et al., 2000).
La abundancia de Trichoderma spp en varios suelos, junto con su habilidad
para degradar varios sustratos orgánicos, su versatilidad metabólica y su
resistencia a inhibidores microbianos, sugiere que este hongo puede poseer la
habilidad para sobrevivir en varios nichos ecológicos, dependiendo de las
condiciones que prevalezcan y sobre las especies involucradas. (Riegel y
Nielsen, 1996).
Trichoderma spp se encuentra clasificado según Alexopulus et al., 1996 como:
División: Eumycota
Subdivisión: Deuteromycotina
Clase: Hypomicetes
Orden: Hyphales
Familia: Monilaceae
Género: Trichoderma
Especie: Harzianum, hamatum, viride, longibranchiatum, entre otras.
2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma
El entendimiento de la diversidad genética de cada cepa dentro de las especies
de Trichoderma y sus mecanismos de biocontrol ha permitido mejorar la
aplicación de las diferentes cepas. Estos mecanismos son diversos, complejos
y pueden actuar sinergicamente para lograr el control de enfermedades
(Howell et al., 2003).
Las diferentes especies de Trichoderma ejercen el biocontrol de una manera
indirecta bien sea por competencia por nutrientes o espacio, antibiosis
(producción de metabolitos), modificando las condiciones ambientales o
mediante la producción de sustancias promotoras del crecimiento vegetal y de
una forma directa por micoparasitismo (Benítez, 2004).
Algunas especies del género Trichoderma son muy comunes en diversos
suelos, principalmente en suelos ácidos y ricos en materia orgánica. Estas
especies son fáciles de aislar, de cultivar y de propagar en diversos sustratos y
la mayoría presentan un buen micoparasitismo (Benítez, 2004).
A pesar de la cantidad creciente de investigaciones dedicadas a estudiar la
actividad antimicrobial de Trichoderma spp ” in vitro“, el conocimiento de los
mecanismos exactos responsables de la reducción en la incidencia de las
enfermedades, después de la aplicación de Trichoderma spp. es aún
insuficiente. (Yedidia et al., 1999).
2.2.1. Biocontrol por competencia
Fungistasis. Un buen antagonista es capaz de superar el efecto fungistático
que resulta de la presencia de diferentes metabolitos producidos por otras
especies, incluyendo plantas, y sobrevive bajo condiciones adversas o
competitivas (Benítez, 2004).
Las cepas de Trichoderma crecen rápidamente cuando se inoculan en suelo ya
que son naturalmente resistentes a muchos compuestos tóxicos incluyendo
herbicidas, fungicidas y pesticidas tales como DDT, y compuestos fenólicos
(Chet,1997) además recuperan muy rápidamente después de la adición de
dosis subletales de algunos de estos compuestos.
La resistencia a compuestos tóxicos puede estar asociada con la presencia en
cepas de Trichoderma de sistemas de transporte ABC (Harman et al., 2004).
Por esta razón son muy eficientes en el control de muchos patógenos como R.
solani, Pythium ultimum o Sclerotium rolfsii, cuando se aplica en combinación
con fungicidas químicos como el bromuro de metilo, benomyl, captan u otros
químicos (Vyas et al., 1995).
2.2.2 Competencia por nutrientes
La inanición es la causa mas común de muerte para microorganismos, la
competencia por nutrientes limitantes, resulta en un control biológico de hongos
fitopatògenos, antagonistas y micoparasitos (Chet et al., 1997).
Un ejemplo claro de este mecanismo de acción se encuentra representado en
hongos filamentosos, donde la toma de hierro es esencial para la viabilidad de
los mismos. Bajo condiciones de deficiencias de hierro, el hongo excreta
agentes quelantes específicos de bajo peso molecular llamados sideroforos,
que le permiten tomar el hierro en forma reducida (Eisendle et al., 2004), citado
por (Chávez, 2004).
2.2.3 Antibiosis
La antibiosis ocurre durante la interacción de los compuestos difusibles de bajo
peso molecular o antibióticos producidos por cepas de Trichoderma que
inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Además las cepas de
Trichoderma producen metabolitos tóxicos volátiles y no volátiles que impiden
colonización por microorgansimos antagonizados; entre estos metabolitos, la
producción de ácido harzianico, alameticinas, tricholinas, peptaiboiles,
antibióticos, 6-penthyl
pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperonas,
ácido heptéldico y otros están siendo descritos (Howell et al., 1998).
2.2.4 Micoparasitismo
El ataque directo de un hongo a otro es un proceso muy complejo que involucra
eventos
secuenciales,
incluye
reconocimiento,
ataque
y
penetración
subsecuente y muerte al huésped. Trichoderma spp puede ejercer control
directo por el rango de parasitismo de hongo, detectando otros hongos y
creciendo sobre el. (Benítez et al., 2004).
El proceso de micoparasitismo ejercido por Trichoderma se produce en varias
etapas sucesivas. Comienza por el crecimiento quimiotrófico de Trichoderma
hacia el hospedador, estimulado por moléculas procedentes del mismo, de
naturaleza desconocida. Las únicas que se han detectado hasta ahora son
aminoácidos y azúcares, por lo que no cabe esperar que la inducción sea
específica del hospedador (Chet et al., 1981).
Los hongos del género Trichoderma se adhieren con carbohidratos unidos a
lectinas en la pared celular del patógeno. Una vez Trichoderma es adherido se
enrosca alrededor del patógeno y forma el apresorio (Howell, 2003). El paso
siguiente consiste de la producción de CWDE´s, peptaiboles y enzimas
hidrolíticas CWDE´s (Howell, 2003), lo cual facilita la entrada de la hifa de
Trichoderma dentro del lumen del hongo parasitado y la asimilación del
contenido de la pared celular. (Benítez et al., 2004).
Degradación de la pared celular: La lisis es el mecanismo en el cual
intervienen las enzimas hidrolíticas producidas por los microorganismos
antagonistas
como
factores
biocontroladores.
Se
ha
observado
que
Trichoderma spp, produce celulasas, glucanasas y quitinasas que degradan “in
vitro “la celulosa de las paredes celulares de microorganismos oomycetes y la
quitina y B-1,3 glucanos de las paredes celulares de microorganismos
Deuteromycetes como Gliocladium spp (Elad et al., 1982).
El sistema quitinolìtico de Trichoderma comprende muchas enzimas y la lista
de estos componentes inicia con la actualización de nuevas enzimas y genes
reportados.
Las
quitinasas
son
divididas
dentro
de
1,4- -
acetylglucosaminidasas (glucanasas ), endoquitinasas y exoquitinasas. De
igual forma las (glucanasas) -1,3-glucanasas, así como las quitinasas actúan
sinérgicamente, e inhiben la germinación de la espora y el crecimiento de
algunos patógenos (Benítez, 1998; El-Katatny, 2001).
Se ha mostrado que 1,3 – glucanasas inhiben la germinación de esporas o el
crecimiento de patógenos en cooperación sinérgica con quitinasas (Benítez, et
al., 1998) y antibióticos (Harman et al., 2004).
2.2.5 Sinergismo
El sinergismo entre la actividad de enzimas líticas y antibióticos, es la mejor
estrategia para ser un buen controlador, además de abrir el campo para
posibles cepas transformantes que puedan producir las diferentes enzimas
logrando un sinergismo que sea relevante (Benítez, 2004).
2.2.6 Biofertilización y mecanismos de defensa en plantas
2.2.7 Modificación de la rizosfera
La habilidad para desarrollarse sobre o amplios rangos de condiciones
externas de pH es un importante componente del complejo conjunto de
características que Trichoderma, mejor adaptado a suelos ácidos, encuentra
durante esta interacción con otros organismos. (Benítez et al., 2004).
Algunas cepas de Trichoderma harzianum controlan estrictamente su pH
externo, asegurando valores óptimos para su propias enzimas secretadas
(Benítez et al., 2004). Así mismo Diferentes proteínas extracelulares son
sintetizadas a diferentes valores de pH.
Las cepas de Trichoderma están siempre asociadas con raíces de plantas y
ecosistemas de raíces. Algunos autores han definido las cepas de Trichoderma
como plantas simbiontes oportunistas, organismos avirulentos, capaces de
colonizar raíces de plantas por mecanismos similares a los de los hongos
micorrizales y
producir compuestos que estimulan el crecimiento como
citoquininas, zeatinas y giberilinas (GA3) ó relacionadas con GA3; así como
promover mecanismos de defensa en plantas. (Harman et al., 2004).
La colonización implica la habilidad para adherirse y reconocer raíces, penetrar
y resistir metabolitos tóxicos producidos en respuesta a la invasión de
organismos extraños, sean o no patógenos. (Benítez, et al., 2004). Así mismo
Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de raíces y su
desarrollo, productividad del cultivo, resistencia a estrés abiótico y la toma y
uso de nutrientes (Arora y Elander, 1992) citado por Benítez 2004). La
productividad de cultivos en campo puede incrementarse cerca del 300%
después de la adición de Trichoderma hamatum o Trichoderma koningii
(Benítez, 2004).
Se ha observado que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir
resistencia sistémica en las plantas, ya que aplicadas en la rizosfera, producen
protección contra patógenos del suelo o foliares. Esta resistencia viene
acompañada en muchos casos de un aumento de actividades peroxidasa y
quitinasas en zonas distantes de la raíz (Yedidia et al., 1999).
Las cepas de Trichoderma son generalmente más resistentes a compuestos
como fitoalexinas, flavonoides y terpenoides, derivados fenólicos, agliconas
que muchos hongos: sin embargo su habilidad a colonizar fuertemente raíces
de plantas depende de la capacidad de cada cepa a tolerar estos. Esta
resistencia es considerada un requerimiento esencial para la colonización de
plantas, siendo asociada con la presencia de sistemas de transporte ABC en
cepas de Trichoderma (Harman et al., 2004).
Algunas especies de Trichoderma han sido reportadas como estimuladoras de
crecimiento en especies tales como clavel, crisantemo, pepino, berenjena,
arveja,
rábano, tabaco, tomate, lechuga, zanahoria, papa, algodón, fríjol y
pastos ornamentales (www.soil-fertility.com ).
Algunos autores han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y
desarrollo de las plantas por parte de Trichoderma spp., es así como (Yossen
et al.2003), citado por (Castro y Rivillas 2006), demostraron que al incorporar T.
harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, además de reducir el daño
causado por R. solani, el antagonista promovió el crecimiento de las plantas.
Igualmente, (Inbar, et al 1994), citado por ( Castro y Rivillas 2006), observaron
que aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentón se
incrementó significativamente el crecimiento de las plántulas, comparadas con
aquellas que no recibieron la adición del hongo antagonista. Estos trabajos
muestran el beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, desde la etapa de
germinador para obtener plantas vigorosas y sanas.
De la misma forma Se han realizado algunos estudios preliminares con
Trichoderma para la estimulación del crecimiento sobre plantas de fríjol, donde
los aislamientos seleccionados estimularon la germinación y presentaron un
aumento en la altura de las plantas entre el 70 y 80%, y una ganancia en peso
de un 60% aproximadamente, lo que supone un incremento en los
rendimientos de este cultivo. Un ensayo similar realizado sobre pasto Estrella
demostró que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos es cercana
al 23%, en longitud de las raíces y de estolones este incremento fue de un
30%. (www.soil-fertility.com ).
Se han evaluado parámetros de crecimiento y desarrollo del control de la
enfermedad de R. solani por parte de Trichoderma spp. Estudios desarrollados
(Rincón et al., 1991) demostraron el efecto antagónico de Trichoderma sobre
R. solani en semilleros de café, obteniendo una reducción de 55% en la
incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el hongo
antagonista (Trichoderma 1644).
2.3 Trichoderma en el biocontrol
El biocontrol por parte de trichoderma en el manejo integrado de enfermedades
en campo, causadas por hongos fitopatógenos, ha sido demostrada en su
capacidad antagónica frente a agentes causales de pudriciones radiculares y
marchitamientos como Rhizoctonia solani, Sarocladium sp y Sclerotinia sp en
Arroz, Flores, Papa, Hortalizas, Frutales y Fríjol, Fusarium oxysporum en
Clavel, Botrytis cinerea en Flores, Colletotrichum gloesporioides, causante de
Antracnosis en Tomate de Árbol, Fresa, Fríjol y Flores; así como la reducción
en la incidencia de la enfermedad llamada “pata prieta “, ocasionada por
Phytopthora nicotianae var. nicotianae.
En 1990, Lewis, reportó que bajo condiciones de invernadero y de campo T.
viride ejercía un control biológico promisorio sobre
Rhizoctonia solani en
cultivos de tomate.
Por su parte, Salmando en 1996, reportó que la técnica de pregerminación
controlada de semillas de Tomate Variedad chonto, en presencia de T. koningii,
es una alternativa promisoria para contrarestar el efecto de R. solani en
condiciones de semillero, mostrando porcentajes de protección del 70 %,
mientras que el tratamiento que consistía en semillas no pregerminadas y
tratadas con T. koningii presentó sólo un 15 % de protección.
Así mismo Ochoa en 1996 determinó en condiciones de invernadero que la
utilización
individual
y
combinada
de
T.
hamatum,
P.fluorescens
y
Sterptomyces coelicolor, ofrecía un alto nivel de protección a claveles variedad
Nora. Barlo contra Fusarium oxysporum.
Trichoderma probablemente sea el hongo beneficioso, más versátil y
polifacético que abunda en los suelos. No se conoce que dicho microorganismo
sea patógeno de ninguna planta. Puede desarrollarse en una amplia gama de
sustratos, lo cual facilita su producción masiva para uso en la agricultura. Su
gran tolerancia a condiciones ambientales extremas y hábitat, donde los
hongos son causantes de diversas enfermedades, le permiten ser eficiente
agente de control; de igual forma pueden sobrevivir en medios con contenidos
significativos de pesticidas y otros químicos. Además su gran variabilidad se
constituye en un reservorio de posibilidades de control biológico bajo diferentes
sistemas de producción y cultivos ( www.infojardin.com/foro/showthread.php).
Cuando se aplica Trichoderma en campo se deben tener en cuanta varios
aspectos importantes que permitan su adecuada expresión, que se relacionan
con la interacción planta hospedante – fitopatógeno susceptible – ambiente
favorable (Temperatura del suelo, humedad, presencia de oxigeno, pH),
Condiciones del suelo (estructura, contenido de materia orgánica y nutrientes) y
tiempo ( Villegas, 2005).
Asi mismo existen algunos principios básicos de vital importancia para el éxito
del control biológico con ciertos hongos como Trichoderma. Esto incluye la
importancia de un propágalo efectivo ( jóven, hifa de activo crecimiento ) en
tenencia a una base de alimento, edad de la preparación, habilidad de los
hongos de biocontrol a invadir y tener una base de alimento ocupada por el
patógeno; la consideración de la cantidad de preparación y el tiempo de
aplicación, y prevalencia de las condiciones ambientales, durante y después de
la aplicación. ( Lewis and Papavizas
).
Varios Autores han realizado estudios
tendientes a evaluar la capacidad antagonista in vivo de Trichoderma frente a
R. solani. Rodriguez, en 2002 evaluó la eficiente acción inhibitoria de la
utilización de cepas de Trichoderma
y Pseudomonas Como antagonistas
contra R.solani, mediante pruebas in vitro y comparadas con su capacidad
biocontroladora en un cultivo de tomate en invernadero.
La adición de hongos tales como Trichoderma y gliocladium antes de realizar la
siembra, en suelos infestados por R. solani, disminuye de manera considerable
la incidencia y severidad de las enfermedades que ocasiona este patógeno en
la mayoría de los cultivos como la zanahoria, el frijol, el tomate, el clavel y la
papa, en los cuales se ha intentado controlar el hongo. Al parecer el método da
buenos resultados en el aumento de las poblaciones de Trichoderma y otros
microorganismos que son antagonistas de Rhizoctonia solani y, quizá la
liberación de algunos compuestos químicos fungitóxicos ( Agrios G, et
al.,1998). De la misma manera Cook y Baker distinguen varias especies de
Trichoderma: T hamatum, T viride, T harzianum, T. koningue y T. polyspermun,
en el control de hongos fitopatógenos ( Chet I, et al.,1980).
2.4 Trichoderma como biofertilizante
En Colombia se han realizado algunos estudios enfocados a la optimización de
parámetros para la producción de Trichoderma. Chávez, (2006) evaluó la
producción de este hongo mediante fermentación sólida, líquida o bifásica
empleando diferentes sustratos como arroz, avena, soya, trigo, cebada, entre
otros y diferentes condiciones de temperatura y fotoperíodo. Los resultados
indicaron que el proceso de fermentación sólida empleando como sustrato
arroz–agua destilada a 25ºC y la exposición constante a la luz permitió mayor
recuperación (45x1018 conidios/mL), con 88 y 96% de germinación a las 18 y
24 horas respectivamente y una pureza estimada de 92.1%.
Este proceso representa una alternativa viable para producción tanto industrial
como artesanal de un inoculante biológico de buena calidad a base del
Trichoderma; con buenos resultados en campo. Estudios preliminares indican
que al aplicar este hongo a las semillas, sustrato en vivero, plantas en vivero,
recién transplantadas o plantas establecidas, produce efectos positivos en el
crecimiento y desarrollo de las mismas.
Algunas industrias agrícolas y biológicas en Colombia como: agrobiológicos del
campo Ltda, biológicos y ecológicos de Colombia y Orius biotecnología entre
otros, han desarrollado productos biológicos para el agro, como biofertilizantes
y biocontroladores de organismos fitopatógenos. Cepas específicas a base de
hongos como Trichoderma harzianum (exporaxx wp) desarrollada por Orius
Biotecnología, así como (Fitoripen wp) a base del hongo Trichoderma spp
como agente microbial, desarrollado por saber agrobiológicos y Trichode wp de
Orius biotecnología, han permitido la activación de mecanismos antagonistas
frente a hongos fitopatógenos que afectan los cultivos de importancia agrícola.
Ahora bien, el conocimiento de estos nuevos biofertilizantes a base de
concentración de esporas a partir del hongo Trichoderma spp ha permitido el
desarrollo de estudios “in vivo” para la inducción de respuesta en plantas e
incremento en la producción de cultivos.
Brunner y Zeilinger, en 2005), en estudios “in vivo”, demostraron los progresos
del hongo de biocontrol Trichoderma atroviridae para la inducción de
respuestas de defensa en plantas de fríjol, frente al patógeno foliar B. cinerea,
conteniendo 1x108 esporas/ml tipo salvaje.
Reynoso y colaboradores (2006), demostraron en estudios de biocontrol bajo
condiciones de cultivo, que la aplicación de diferentes concentraciones de
inóculo de T. harzianum (102 y 106), produjo un notable incremento en la
cosecha de maní. Se encontró un incremento en el porcentaje de 45 a 76% en
zonas naturalmente infestadas y de 57 a 95% en suelos artificialmente
infestados, cuando las semillas fueron tratadas con T. harzianum 106.
2.5 Rhizoctonia solani
Es uno de los hongos más importantes reconocido como patógeno de plantas.
Por lo general causa enfermedades en una amplia gama de hospederos,
afectando tanto partes aéreas como subterráneas. Usualmente se le conoce
como hongo estéril, debido a que durante muchos años se pensó que era
incapaz de producir algún tipo de espora, ya fuera sexual o asexual.
Actualmente se sabe que Rhizoctonia solani produce basidiosporas que hacen
que esta especie sea un basidiomiceto al que se le denominó Thanatephorus
cucumeris (Agrios, 2004). Un considerable número de aislamientos de
Rhizoctonia son saprótrofos, aunque otros son micorrizales sobre orquídeas u
otras plantas.
2.5.1 Biología de Rhizoctonia solani
Rhizoctonia solani según Agrios (2004) ha sido clasificado como:
Hongo superior
Subdivisión: Deuteromycotina
Clase: Agonomycetes
Orden: Agonomycetales (Myceliales)
Género: Rhizoctonia
La especie R solani, fue definida por Candolle (1815), Sobre la base de la
producción de esclerocios de textura uniforme con hilos hifales emanantes de
estos, y la asociación del micelio con raíces de plantas vivas. (Sneh, et al,
1991). Es la especie más conocida dentro del género Rhizoctonia sp. Fue
originalmente descrito en 1858 por Julis Kuhn (Barnett y Hunter 1982).
Dentro de las características que permiten clasificar taxonomicamente
aislamientos de R.solani son: tendencia de pigmentación hifal café, ramificación
próxima al septo distal de células en hifas vegetativas jóvenes, estrechamiento
de hifa y formación de septos a una distancia corta del punto de origen a la
ramificación hifal, Septo dolípora y células multinucleadas en hifa vegetativa
joven (Parmeter y Whitney, 1970).
El anamorfo es denominado Rhizoctonia solani y su teleomorfo Thanatephorus
cucumeris, es un basidiomiceto no productor de esporas asexuales (conidios) y
productor ocasional de basidiosporas (esporas sexuales). En la naturaleza se
reproduce asexualmente y se encuentra en forma de micelio vegetativo y/o
esclerocios (Agrios, 2004). Macroscópicamente las colonias jóvenes de
Rhizoctonia solani se caracterizan por ser incoloras, algodonosas y planas
aunque dependiendo de la especie, pueden llegar a tornarse cremosas o
amarillentas. Al producirse la maduración, la colonia toma una coloración
marrón (Ceresini et al., 1999).
Microscópicamente el micelio está constituido de hifas fraccionadas en células
individuales polinucleadas y comunicadas entre si a través de un poro septal
que permite el movimiento del citoplasma, las mitocondrias y los núcleos de
una célula a otra (Ceresini et al., 1999). Características tales como células
moniliales, esclerocio, hifas más grandes a 5 um en diámetro, rápida tasa de
crecimiento y patogenicidad están usualmente presentes. Aunque puedan estar
ausentes en algunos aislamientos.
Este hongo, parasiticamente no especializado forma escleorcios en el suelo
sobrevive por largos periodos de tiempo en ausencia de hospederos, mediante
tales estructuras o por medio de hifas de pared gruesa sobre residuos de
plantas; al conservar estas características de patógeno no especializado, es un
buen competidor saprofítico, puede colonizar muchos sustratos y puede tolerar
cambios amplios de ambiente; esta condición le favorece tanto para su
supervivencia como para su acción patogénica sobre tejidos juveniles o en
stress fisiológico inadecuado (González et al., 1989 ; Contreras et al., 1996).
La especie fitopatógena Rhizoctonia solani ocasiona perdidas importantes, en
la mayoría de plantas perennes y anuales, incluyendo casi todos los cultivos
hortícolas que se desarrollan dentro o sobre el suelo. Entre las enfermedades
más comunes causadas por este fitopatógeno está el llamado damping-off o
caída de las plántulas, como consecuencia del estrangulamiento y necrosis del
tallo a nivel de cuello en plántulas recién emergidas. Produce una reducción
Significativa del vigor de las plantas y de la producción de tubérculos en
cultivos de papa (Cedeño, 2001).
En clavel el marchitamiento lento fungoso causado por una raza de R. solani
produce una enfermedad que se caracteriza por la reducción en el crecimiento
de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales se amarillan
posteriormente y la planta se marchita y muere. Al hacer un corte del tallo, se
observa a nivel vascular una coloración marrón.
Para entender la relación que se establece entre patògenos y antagonistas, es
necesario realizar estudios “in vivo e “in Vitro “, que permitan por una lado
conocer a fondo los aspectos biológicos, bioquímicos y ecológicos de la
interacción y por otro
lado monitorear la actividad de los microorganismos
biocontroladores en campo para enfocar de manera más precisa el control y
manejo de la enfermedad.
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema
El incremento de enfermedades en plantas, causadas por un gran número de
hongos fitopatógenos ha obligado a los agricultores a la aplicación de grandes
cantidades de fungicidas e insecticidas químicos durante décadas. Este uso
plantea una grave amenaza para la salud de los humanos y el medio ambiente,
provocando la aparición de organismos resistentes a estos productos. La
acción nociva de fungicidas químicos sobre los cultivos agrícolas ha originado
entre otros problemas resistencias de plagas y patógenos, contaminación de
los suelos y aguas de riego, de los animales y de los mismos seres humanos.
3.2 Justificación
La utilización de fungicidas químicos durante décadas para el control de
enfermedades en cultivos agrícolas ha hecho inminente la búsqueda de
alternativas amigables, que contribuyan a minimizar el impacto negativo sobre
el medio ambiente. Este deterioro ambiental en el tiempo ha llevado al hombre
a buscar metodologías de control, que contribuyan en la prevención o
reducción de los efectos a corto o a mediano plazo de estos compuestos frente
al daño ambiental.
El desarrollo basado en la conservación, debe proteger la estructura, función y
la diversidad biológica de los sistemas naturales agrícolas, buscando mantener
un equilibrio y un control de nuestro medio ambiente y los recursos naturales.
Uno de estos recursos es el suelo que se constituye en el principal soporte de
la agricultura. El manejo biológico y controlado de los cultivos, se presenta
como una alternativa ecológica y eficaz frente a los numerosos y crecientes
problemas causados por microorganismos patógenos presentes en nuestro
agro ecosistema.
Los hongos biocontroladores como Trichoderma spp ofrecen buenas
posibilidades como antagonista de hongos patógenos de plantas, actuando
como hiperparasitos competitivos, de la misma manera debido a su ubicuidad,
facilidad de aislamiento y cultivo, crecimiento rápido en gran número de
sustratos esta presente en todos los suelos agrícolas; sumado a la resistencia y
persistencia de estos hongos en cultivos y cosechas, promueve una continua y
progresiva investigación y análisis en estudios de control biológico de
enfermedades en plantas.
En este contexto el presente trabajo evaluó la capacidad biocontroladora de
algunos aislamientos nativos y comerciales de Trichodema spp. Frente al
hongo fitopatógeno R. solani bajo condiciones de invernadero. Los resultados
del presente estudio permitirán apoyar los programas de manejo integrado de
plagas empleando tecnologías limpias y amigables con el medio ambiente.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Evaluar la capacidad antagonista “in vivo” de 6 aislamientos Trichoderma
frente al hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani
4.2 Objetivos específicos
Confirmar la patogenicidad de un aislamiento de R solani sobre plantas de
clavel.
Obtener inóculos de 6 aislamientos de Trichoderma y confirmar su viabilidad y
pureza
Verificar la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma sobre el
fitopatógeno R solani bajo condiciones “in vitro”
Evaluar en condiciones de invernadero la capacidad antagonista de 6
aislamientos de Trichoderma sobre el hongo patógeno Rhizoctonia solani.
Comparar los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo “in vivo” con
resultados obtenidos en condiciones “in vitro”
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Diseño de la investigación:
5.1.1 Ubicación
Este proyecto se desarrolló en la estación experimental San Francisco Javier
ubicada en la vereda el Mortiño, municipio de Cogua Cundinamarca 61 Km al
norte de la ciudad de Bogotá y las instalaciones del laboratorio de Microbiología
ambiental y de suelos del Departamento de Microbiología de la Pontificia
Universidad Javeriana.
5.1.2 Microorganismos
Se utilizó un aislamiento nativo de Trichoderma ( T3 )aislado en trabajo previo
el cual fue suministrado por el cepario de micologìa del Departamento de
Microbiología
de
la
Pontificia
Universidad
Javeriana,
4
aislamientos
provenientes de suelo de cultivos de flores de la sabana de Bogotá ( Tsp5
Tc1,Tv1,Ti1, y un aislamiento nativo procedente de bosque alto andino,
suministrado por la Doctora Amanda Varela del Laboratorio de Ecología Suelos
y Hongos Tropicales (LESYHT).del departamento de biología
Para las pruebas de antagonismo se evaluaron aislamientos del patógeno
Rhizoctonia solani suministrados por el laboratorio de fitopatología del Centro
de Investigaciones Agroindustriales (CIAA) de la Universidad de Bogotá Jorge
Tadeo Lozano. Se seleccionò un aislamiento por la capacidad de infectar
esquejes de clavel de la variedad Everest.
5.1.3. Material vegetal
Para el desarrollo de las pruebas de antagonismo “in vivo” se utilizaron
esquejes enraizados de clavel Dianthus caryophyllus
suministrados por la
compañía América flor.
5.1.4. Elaboración del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma
spp
Con el fin de determinar la estabilidad de las cepas durante el estudio y el
mantenimiento de las condiciones iniciales, se realizó un banco de trabajo a
partir de 6 aislamientos de Trichoderma evaluados por Cháves 2004 y que se
encuentran conservados a -70oC. A partir de los aislamientos, se realizaron
repiques sobre agar papa dextrosa (PDA).
De cada uno de los aislamientos se preparó una suspensión con una
concentración igual a 108 esporas/ml, en un volumen final de 10ml en PBS.
Esta suspensión se utilizó posteriormente como inóculo 10% para la
fermentación discontinua de 24-48 horas, 100rpm, y una temperatura de 25OC
en caldo papa dextrosa, en un volumen efectivo de trabajo de 50 ml.
La evaluación del crecimiento, viabilidad y evaluación de cada una de las
cepas, se realizó mediante cultivo en placa, tinción con azul de lactofenol, y
microcultivo de acuerdo al método propuesto por Sergey et al., 2000.
Guevara y Urcia en 2002 demostraron que se puede realizar la fermentación
discontinua, en un Erlenmeyer de 250ml conteniendo caldo papa dextrosa con
10 ml de una suspensión conidial en una concentración de 108conidias/ml. El
cultivo se incubó a una temperatura de 28°C por 48 horas con agitación a 100
rpm logrando así un volumen efectivo de trabajo de 50 ml.
5.1.5 Preparación del inoculo de aislamientos de Trichoderma.
Para evaluar el crecimiento libre de cada uno de los 6 aislamientos del
antagonista, a partir de los aislamientos crecidos en tubos de vidrio de
(16X150), se realizó un repique en cajas de PDA hasta obtener un crecimiento
radial de 90mm aproximadamente. Posteriormente se tomaron discos de 0.5cm
de diámetro de zonas de crecimiento similares y serán sembradas sobre PDA
(Cundom, 2003)
Para cada cepa de Trichoderma en estudio se tomaron por triplicado datos
sobre el crecimiento radial en mm a las 24, 48, 60 y 72h.
5.1.6 Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani
Para la preparación del inóculo de Rhizoctonia solani se tuvieron en cuenta su
crecimiento en agar papa dextrosa durante 7 días. El micelio del hongo se
resuspendió en agua destilada esterilizada, hasta obtener 103 UFC/ml en PDA.
5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro
Previo al enfrentamiento del patógeno y el antagonista Trichoderma spp, se
evaluó el crecimiento libre en el centro de la caja de petri con agar PDA del
patógeno Rhizoctonia solani y los seis aislamientos del antagonista
Trichoderma spp ( T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1, T235 ). Se inoculó por triplicado en
cada caso en el centro de la caja de petri.
5.1.8 Elaboración de la prueba de antagonismo
Para determinar la capacidad antagonista de los diferentes aislamientos de
Trichoderma, sobre el patógeno Rhizoctonia solani, se aplicó un diseño
completamente al azar, con tres repeticiones. La unidad experimental
correspondió a una caja de Petri con agar PDA.
Para las pruebas de enfrentamiento se tomarán discos de 0,5cm de diámetro
obtenidos a partir de propágulos del patógeno (crecimiento libre), y se
sembraron en la superficie de las cajas de Petri con PDA, a un centímetro del
borde de la caja (Cundom, et al., 2003).
Este procedimiento se realizó por triplicado. Después de 24 horas de
incubación a una temperatura de 28°C el patógeno Rhizoctonia solani fue
sembrado a 1cm del borde de la caja pero en posición opuesta un disco de
0,5cm de diámetro del antagonista (Cundom, et al., 2003; Holmes, et al., 2004).
5.2 Evaluación de la capacidad antagonista “in vivo”
Esta prueba se llevó a cabo bajo condiciones de invernadero en un sustrato de
Cascarilla/Turba 3.1. Se utilizaron los aislamientos Trichoderma
T3.
TrichodermaTsp5, TrichodermaTc1, TrichodermaTV1, Trichoderma Ti1 y
TrichodermaT235.
Para evaluar la capacidad antagónica de los 6 aislamientos de Trichoderma se
utilizaron esquejes enraizados de clavel. Está prueba se llevó a cabo bajo
condiciones de invernadero en materos con Cascarilla/Turba humedecida.
Los esquejes fueron inicialmente inoculados por inmersión de las raíces
lesionadas levemente en una suspensión de Rhizoctonia solani por 5 minutos.
Posteriormente cada uno de los esquejes de clavel infectados con el patógeno,
fueron colocados individualmente en materos con la mezcla de cascarilla:
turba.
Una vez inoculado el patógeno, después de 48 h, se realizó la aplicación al
suelo con una suspensión de 108 conidias/ml de cada uno de los aislamientos
de Trichoderma spp. (Tabla 1).
La concentración de conidias se ajustó
utilizando la cámara de Neubauer.
Luego de ser inoculado el material vegetal con el patógeno y el sustrato con el
antagonista, cada cuatro días se realizaron registros de: altura de la planta,
incidencia de la enfermedad (% de plantas vivas), longitud de la raíz, peso seco
de la parte aèrea y de raìz, número de hojas, color y apariencia de las plantas.
El peso seco total, de la parte aérea y de raíz del material previamente medidio,
se determinó mediante secado en un horno sin flujo de aire a 55Oc durante 48
horas.
La humedad del suelo fue mantenida en el 60 % de la capacidad de campo,
durante todo el ensayo.
5.3 Diseño experimental
El ensayo de antagonismo “in Vitro” se realizó por triplicado para cada uno de
los tratamientos.
El ensayo de antagonismo in vivo se desarrolló empleando esquejes de clavel
(Dianthus caryophyllus) La metodología del ensayo se desarrollará con un diseño
completamente al azar con 3 repeticiones para cada tratamiento.
Cada tratamiento constará de 24 plantas de clavel para cada uno de los 9
tratamientos.
Tratamiento nomenclatura
Controlador
Patógeno
1
T3
Aislamiento nativo (PUJ)
R. solani
2
Tsp5
Cultivo de Flores
R. solani
3
Tv1
Cultivo de Flores
R. solani
4
Tc1
Cultivo de Flores
R. solani
5
Ti1
Cultivo de Flores
R. solani
6
T-235
Aislamiento nativo ( LESYHT)
R. solani
Control
7
infecciòn
--------------------
R. solani
Control
8
Trichoderma
Trichoderma Tsp
-------------
9
control Ccto
--------------------
------------
5.4 VARIABLES DE ESTUDIO
Con el fin de evaluar la capacidad antagonista de los 6 aislamientos de
Trichoderma frente a R. Solani en plantas de clavel, se tomaron cada 4 dìas
registros de:
Altura de la planta
Longitud parte aérea
Longitud raíz
Incidencia de la enfermedad (% plantas vivas)
Síntomas: Amarillamiento, marchitamiento, necrosis de tejidos.
Peso fresco total
Peso seco parte aérea
Peso seco de raíz
Peso seco total
Los tratamientos control corresponden a:
Control de infección: Plantas con el patógeno Rhizoctonia solani
Control de crecimiento: Plantas sin patógeno ni antagonista
Control Trichoderma: Plantas con el aislamiento T235
Con los valores obtenidos durante el estudio para las variables medibles se
llevó a cabo un análisis de varianza ANOVA y la comparación entre los
tratamientos mediante la prueba de tukey, tanto para los análisis “ in Vitro
como para los “ in vivo “.
! "
%
&
'"
#$
(
La expresión de necrosis (muerte del tejido) sugiere la presencia de
metabolitos difusibles y altamente tóxicos de carácter enzimático (Celulasas,
Quitinasas y Proteasas) acompañados por otros compuestos encargados de la
inhibición del crecimiento como acido harzianico, alamenticinas, peptaiboles,
antibióticos, 6-pentil- -pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperinas,
acido hepteldico y otros (Benitez, et al., 2004; Harman, et al., 2004; Limón, et
al., 2004; Rey, et al., 2000; Cook y Baker, 1983 ; Cundom, 2003),afirman que la
velocidad de crecimiento presentadas por las especies de Trichoderma son
motivos para la utilización de este microorganismo como antagonista, para el
control de fitopatógenos.
)
"+ +,!'"
(
*
AISLAMIENTO
24 HORAS
48 HORAS
72 HORAS
T3
TSP5
TV1
TC1
Ti1
T235
15,33
14,00
12,00
11,00
14,33
24,00
56,33
36,33
27,67
30,33
33,67
61,67
62,33
48,67
42,00
40,00
41,00
63,67
)
"+ +,!'"
(
*
&
Estos resultados muestran el alto grado de patogenicidad que puede ejercer
este hongo fitopatógeno cuando encuentra acción directa sobre ó sin la
eficiente acción biocontroladora por parte de hongos antagonistas ( Figura 13).
Barrera et al.,1997, afirman que la aparición de los primero síntomas, se ve
influenciado por la agresividad del aislamiento del patógeno.
Durante la tercera semana de evaluacion se presentaron diferencias significativas
entre los tratamientos: control de crecimiento. control de infeccion y control con
Trichoderma. Las plantas de clavel en el control de crecimiento presentaron un
crecimiento a nivel radicular y de la parte aérea progresivo en el tiempo y mayor
al control de infeccion (Figura 13I), sin embargo el crecimiento de las plantas fue
menor, en comparación con todos los tratamientos de Trichoderma excepto para
el tratamiento con Tsp5 ( Figuras 13 y14).
-
.&
$
(
!/
Por otra parte, la acción positiva ejercida por el hongo antagonista, se ve
reflejada en el control Trichoderma, donde se observa una mejor apariencia y
calidad en los esquejes, así como un mayor crecimiento total, al ser
comparada con los controles ( Figuras 13H y 14). A su vez, el control de
infeccion presentó los menores niveles de crecimiento, (Figura 13G),
amarillamiento y marchitamiento progresivo en los esquejes.
Los tratamientos con el aislamiento T3 y el Control Trichoderma, mostraron los
mejores resultados en cuanto al crecimiento total y apariencia de las raíces de
las plantas evaluadas al final de la tercera semana, si se compara con los
demás tratamientos de Trichoderma y controles de crecimiento e infeccion
(Figuras 13ª y 13H). Esto confirma además los resultados obtenidos al evaluar
el crecimiento libre in vitro donde se observó que los aislamientos T3 y T235
tuvieron un mayor crecimiento y un alto PIM sobre el patógeno R.solani (Tabla
3, Figura 3).
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En general todos los tratamientos con Trichoderma, a excepción de Tsp5,
muestran una buena apariencia, calidad en los esquejes, un mayor crecimiento
aéreo y radicular, así como ausencia de signos o síntomas de la enfermedad
por R .solani. Estos resultados confirman los obtenidos en las pruebas de
antagonismo in vitro ( Figura 4-5), que demuestran la excelente actividad
antagonista ejercida por las especies de Trichoderma sobre el hongo R.solani.
Estos son indicativos favorables de la actividad del hongo como promotor del
crecimiento y agente antagonista en campo, sobre R.solani en esquejes de
clavel variedad Everest. El aumento de vigor observado en las plantas
inoculadas con Trichoderma, se ve reflejado en el crecimiento de la parte aérea y
radicular en el control con Trichoderma, el cual muestrà un crecimiento de 16,1
cms y 6,1 cms respectivamente, si se compara con los obtenidos con el control
con el patógeno el cual mostrò para estas mismas variables, resultados de 15,3
cm y 4,9 cms respectivamente ( Figura 13 -14) ( Anexo 1). Estos resultados
coinciden con los descritos por López et al., 1999, el cual establece que
Trichoderma produce sustancias estimuladoras del crecimiento y desarrollo de las
plantas, que actúan como catalizadores o aceleradores de los tejidos
meristemáticos primarios ( los que tienen potencial de formar nuevas raíces) en
las partes jóvenes de éstas, acelerando su reproducción celular, logrando que las
plantas alcancen un desarrollo más rápido que aquellas plantas que no han sido
tratadas con dicho microorganismo.
De la misma forma que lo observado al día 15, en el día 19, la patogenicidad
del hongo se mantiene en las plantas con los tratamientos Control R. solani y
Tsp5. Esto fue evidenciado por una apariencia débil de los esquejes y una
menor
tasa
de
crecimiento,
además
se
presentó
amarillamiento,
marchitamiento progresivo, necrosis de tejidos y muerte en plantas ( Figura 19).
Estas observaciones concuerdan con los resultados obtenidos para este
tiempo, respecto a la longitud de la parte aérea, ( Figura 10), donde se
manifiesta que la acción patógenica sobre el control R.solani y Tsp5 , queda
reflejada en el menor valor de crecimiento de los esquejes (Figura 13B-13G ).
Los síntomas observados en las plantas de clavel en el día 19, han sido
reportados anteriormente por otros investigadores como Garibaldi et al.,1978,
quien define que la enfermedad causada por Rhizoctonia solani incluye el
marchitamiento lento fungoso que se caracteriza por la reducción en el
crecimiento de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales
se amarillan posteriormente, causando que la planta se marchite y muera.
En la figura 15 se muestran los efectos de la aplicación de los diferentes
aislamientos de Trichoderma sobre el peso fresco de los esquejes de clavel,
así como de la acción antagonista ejercida por los diferentes tratamientos
frente al hongo fitopatógeno R.solani. Las plantas con el tratamiento T3 y el
control con Trichoderma T235 presentaron diferencias significativas 8 p<0.05)
con relación al control de infección.
-
$
Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma presentaron los
mayores valores de longitud de la parte aérea, longitud total y peso fresco total
(Figuras 10 y 13 y 15) así como altos valores en cuanto a la longitud radicular
(Anexos 1A, 1B y 1C) estos resultados se ven reflejados en esquejes con
mejor
apariencia y crecimiento, follaje abundante y una mayor biomasa
radicular (Figuras 13 y 18). Por otra parte el tratamiento con el aislamiento Tc1,
presentó valores significativamente altos para las variables de peso fresco (
Figura 15)(Anexo 1C ). Varios autores han demostrado que la adición de
aislamientos específicos de Trichoderma en la rizósfera pueden resultar en
promoción de crecimiento en plantas ; Bailey et al., 1998; Bjorkman et al., 1998;
Yedidia et al., 1999; Harman, 2000; Naseby et al., 2000; Rojo, et al., 2006). Es
interesante anotar que a partir de la tercera semana se observa un crecimiento
significativo en la longitud y el peso de las plantas de clavel con el tratamiento
TC1, logrando alcanzar niveles similares para los observados en el control
Trichoderma y el aislamiento T3 (Figura 15). Al parecer la acción promotora del
crecimiento de Tc1 sobre los esquejes de clavel es un poco más lenta en el
tiempo, si se compara con las demás cepas de Trichoderma utilizadas, ya que
solo a partir de la segunda a tercera semana se evidencia una real actividad de
crecimiento de los esquejes de clavel, Estos resultados difieren notablemente
de los obtenidos in vitro, donde se estableció que la menor tasa de crecimiento
libre de las sps de Trichoderma cultivadas en el tiempo perteneció a la cepa
TC1 (Figura 2, Tabla 3). Se confirma lo observado por otros autores (McLeod et
al., 1995; Smith et al., 1990) respecto a que la selección previa de antagonistas
mediante cultivos duales es útil, pero no garantiza el comportamiento de éstos en
invernadero.
En la cuarta semana se confirma la capacidad antagonista in vivo en los
tratamientos con Trichoderma donde se observó un desarrollo normal de las
plantas, con hojas, tallos y raíces saludables (Figura 16). Los esquejes de
clavel en los tratamientos T235 y control Trichoderma siguen presentando el
mayor índice de crecimiento (Figura 16E-16F), reflejado en mayores valores de
peso seco de raíz y parte aérea (Figuras 17,18 ). Yedidia, et al., en 1999, en
trabajo con Trichoderma harzianum afirman que esto es debido posiblemente a
que Trichoderma penetra y se desarrolla en la epidermis exterior, estimulando
el sistema de defensa de la planta por cambios metabólicos. por otra parte,
Arora et al. en 1992, afirma que la colonización de raíz por cepas de
Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de raíz en muchos
cultivos de plantas bajo condiciones de invernadero.
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Vale la pena resaltar que entre los días 19 y 23, se encuentran los resultados
de mayor relevancia respecto al aumento en el crecimiento. Se observa que
para los tratamientos Control Trichoderma, T3 y T235, se encontraron
aumentos cercanos al 43%, 40% y 39% respectivamente (Anexo 1C), mucho
mayores al encontrado en el control del patógeno que mostró un rendimiento
negativo a nivel de crecimiento para este tiempo. Estos resultados son
concordantes a los encontrados para la variable de peso fresco, que mostraron
aumentos de 35,7%, 32% y 34% para el control con Trichoderma, T3 Y T235
respectivamente. Por otra parte los resultados obtenidos para peso fresco en
el Control de crecimiento y control R.solani 20% y 11.7% respectivamente,
fueron mucho menores a los encontrados en los aislamientos con el hongo de
Trichoderma. Estos resultados confirman aún más la acción promotora del
crecimiento vegetal en esquejes de clavel por parte de las diferentes
aislamientos de Trichoderma, así como el efecto antagonista ejercido por el
hongo, sobre el fitopatógeno R .solani. Benitez et al., 2004; Sunil et al., 2005,
determinan que la productividad de cultivos en campo puede incrementarse
cerca del 300% después de la adición de Trichoderma hamatum o Trichoderma
koningii.
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El peso seco de la parte aérea y de las raíces de las plantas inoculadas con
Tc1 y el control con Trichoderma, se diferenció claramente de las inoculadas
sólo con el patógeno, observándose un desarrollo significativo de raíces y parte
aérea en presencia de estos tratamientos( Figuras 17-18) ( Anexo 1,Tabla 1E1F). Harman et al., en 1998, determina que la promoción del crecimiento
vegetal por parte de Trichoderma se manifiesta como una potenciación de la
germinación de las semillas, una floración más abundante y temprana y
aumentos de altura y peso de las plantas ( Vhang y Baker, et al.,1986).
Por otra parte el Control con R.solani evidenció la presencia activa del
patógeno sobre la base del tallo, asi como procesos de amarillamiento,
marchitamiento y valores de mortalidad alta sobre los esquejes de clavel
( Figura 19-21).
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En los tratamientos con el control con Trichoderma, asi como con los
aislamientos T3 Y T235 se obtuvo una mayor respuesta en cuanto a niveles de
crecimiento de la parte aérea y radicular de los esquejes de clavel, comparado
con el control de crecimiento y con el control de infecciòn ( Figura 9 ) ( Figura
23). Se pudo evidenciar entonces, el alto grado de biocontrol ejercido por parte
de las cepas de Trichoderma sobre el hongo R. solani, excepto el aislamiento
Tsp5. Esto se confirmò por la apariencia saludable de las plantas, ausencia de
síntomas de la enfermedad y valores superiores de las variables de longitud de
la parte aérea y peso evaluadas, con relación a los tratamientos control de
crecimiento y control de infección hacia el dìa 23 del ensayo. Algunos autores
han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y desarrollo de las plantas
por parte de Trichoderma spp., es así como Yossen et al.,en 2003 demostraron
que al incorporar T. harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, además
de reducir el daño causado por R. solani, el antagonista promovió el
crecimiento de las plantas. Igualmente Inbar et al., en 1994., observaron que
aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentón se incrementó
significativamente el crecimiento de las plántulas, comparadas con aquellas
que no recibieron la adición del hongo antagonista. Estos trabajos muestran el
beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, para obtener plantas vigorosas
y sanas ( Castro 2005).
.
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La apariencia y calidad de los esquejes, síntomas visibles de amarillamiento, y
marchitamiento, así como tejidos necrosados, la disminución en la calidad y
cantidad de las raíces y muerte en los esquejes de clavel (Figura 19- 21),
confirma la actividad del hongo fitopatógeno , durante los ensayos en
invernadero, para los tratamientos con el control R.solani (Figura 19 A y B) y el
Tratamiento con el aislamiento Tsp5 ( Figura 19 CyD). Benitez et al., 2004,
establece que las cepas de Trichoderma pueden colonizar raíces de plantas en
crecimiento y proteger contra infecciones. La colonización implica la habilidad
para adherirse y reconocer raíces de plantas, penetrar la planta y resistir
metabolitos tóxicos producidos por las plantas en respuesta a la invasión de
organismos extraños, sean o no patógenos.
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Se pudo determinar que las plantas con mayor peso seco fueron aquellas que
crecieron en los diferentes aislamientos con Trichoderma, especialmente con
el control de Trichoderma y T235 (Figura 20) ( Anexo 1G). Ahora bien, La
evaluación del nivel de daño radical, mostró que este fue menor en presencia
de los tratamientos con el hongo antagonista, que en el tratamiento con el
control de infecciòn (Figura 20-22). Un ensayo realizado sobre pasto Estrella
demostró que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos de
Trichoderma es cercana al 23%, en longitud de las raíces y de estolones este
incremento fue de un 30% ( www.infojardin.com/foro/showthread.php).
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La buena actividad biocontroladora ejercida por parte del hongo Trichoderma
sobre el fitopatògeno R. solani (Figura 21, 24), quedó demostrado con la
ausencia de sìngos y síntomas de la enfermedad, asi como la baja incidencia
de muerte de los esquejes bajo la acción de las diferentes especies de
Trichoderma a través del tiempo, a excepción de Tsp5, que a lo largo del
ensayo demostró una baja acción antagonsita sobre R .solani
( Figura
19C,19D- 21). Tal y como lo establece Meera et al ., en 1994, quien determina
que la acción de biocontrol ejercida por el hongo antagonista, puede ser debido
a que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir resistencia
sistémica de plantas, ya que aplicadas en la rizosfera producen protección
contra patógenos del suelo o foliares.
No obstante al excelente antagonismo ejercido por Trichoderma, se pudo
determinar una clara actividad patogènica del hongo R. solani en los esquejes
de clavel, cuando este se aplico como tratamiento control ( Figura 19A,19B21). Castro y Osorio en 2005, demostraron el efecto antagónico de
Trichoderma sobre R. solani en semilleros de café, obteniendo una reducción
de 55% en la incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el
hongo antagonista (T1664).
Es interesante notar que los resultados obtenidos durante la experiencia para el
desarrollo radicular de los esquejes de clavel muestran que existió una
actividad directa de Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en los
esquejes de clavel y del aumento de la zona rizosfèrica ( Figura 22-23-24). La
habilidad de cepas de Trichoderma para proteger plantas contra patógenos de
raíces esta siendo atribuido a su efecto antagónico contra patógenos invasivos,
Sin embargo esta asociación hongo-raíz además estimula mecanismos de
defensa en plantas. ( Benitez., et al 2004)
T3
Tv1
Control Trichoderma
TSP5
Ti1
Control R. solani
Tc1
T235
Control de crecimiento
Figura 22 Apariencia de las raíces en los diferentes tratamientos.
De igual manera se observò que los tratamientos con el aislamiento T235 y el
control Trichoderma ( Figuras 22E, 22G y 23) mostraron los mayores valores
de longitud de raìz, además de una excelente apariencia de sus raíces. Así
mismo el tratamiento Tc1 mostro valores significativos a nivel radicular durante
las ultimas dos semanas de evaluacion. El mayor tamaño de raíces influye de
manera directa en el crecimiento aéreo de la planta, tal y como quedo en el
crecimiento de los esquejes con el control de Trichoderma demostrado en
diferencias mayores al 25% respecto al control de crecimiento y del 75%
aproximadamente para el control con R. solani (Figuras 22C,D y E y Figura 23)
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Benitez et al., 2004 en estudios con Trichoderma demostraron que la
colonización de raíces por este hongo frecuentemente incrementa el
crecimiento y desarrollo de raíces, productividad de cultivos, resistencia a
estrés abióticos y la toma y uso de nutrientes. De igual forma Bjorkman et al.,
en 1998 estableció una hipótesis en la que propone que Trichoderma es capaz
de limitar el efecto del daño oxidativo en la raíz.
Para el dia 27 despuès de la aplicación del antagonista se confirmó el efecto
ejercido por Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en plantas y
antagonista del hongo fitopatogeno R .solani ( Figura 24). Se observa una
excelente apariencia y calidad de los esquejes, así como un gran desarrollo de la
parte aérea y radicular. Por otra parte para la última semana se hace mas
evidente la acción patogénica de R. solani, sobre las plantas, evidenciado por el
aumento en el número de marchitamientos y necrosamiento de tejidos, así como
la muerte de esquejes ( Figura 19 y 21).
No obstante estos síntomas estuvieron ausentes durante el desarrollo del ensayo
en las plantas bajo la acción del hongo Trichoderma, a excepción del aislamiento
Tsp5
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.
Benitez et al., 2004, Yedidia et al., 2000 establecen que el rápido desarrollo y
colonización de Trichoderma de las zonas adecuadas para la infección, como
áreas de necrosis, heridas o partes concretas de la planta, impiden físicamente
el acceso y establecimiento del patógeno en su hospedador.
Es claro que a pesar de la inoculación del hongo patógeno Rhizoctonia solani
sobre los esquejes de clavel, el antagonista ejerció un biocontrol efectivo sobre
el hongo fitopatógeno en condiciones de invernadero a lo largo del la
investigación. Se encontrò que el tratamiento con el control con Trichoderma,
mostró los mejores resultados respecto a crecimiento de la parte aérea y
radicular (Figura 22)(Anexos1A-1B), evidenciado por un mayor crecimiento y un
aumento en el crecimiento total de cerca del 46% respecto al control de
crecimiento ( Figura 14) ( Anexo 1C); de igual manera reflejados en las
mayores rendimientos en peso fresco y peso seco total frente a los controles
del patógeno y de crecimiento ( Figura 15 y 20). Por otra se pudo confirmar que
los mejores resultados en todas las variables evaluadas se obtuvieron en los
aislamientos de Trichoderma ( T235 y T3). Estos resultados son consistentes
con los obtenidos en los estudios in vitro (
Figura 2) ( Tabla 3), que
demostraron que los aislamientos T235 y T3 presentaron las más altas tasas
de crecimiento libre
en el tiempo, del mismo modo el aislamiento T235
presentó el mayor PIM en las pruebas de antagonismo in vitro frente al hongo
fitopatogeno R .solani. Vale la pena resaltar que el aislamiento con Tc1 mostró
una buena actividad bajo condiciones de invernadero a partir de la segunda
semana, convirtiéndose junto al control con Trichoderma, T235 y el T3 en los
mejores aislamientos. No obstante a los buenos resultados obtenidos en
campo para el aislamiento Tc1, estos difieren notablemente a los desarrollados
in vitro ( Figura 2) ( Tabla 3), donde Tc1 mostrò los menores valores de
crecimiento libre en el tiempo. Estos resultados confirman lo dicho por Macleod,
quien establece que los resultados in vitro de especies de Trichoderma no
garantiza plenamente su actividad y antagonismo sobre hongos fitopatógenos
en condiciones de campo o invernadero. Por otra parte se puede inferir que el
que el tratamiento Tsp5 no ejerció un biocontrol efectivo en esquejes de clavel
para el control de enfermedades ocasionadas por el hongo fitopatógeno R.
solani ( Figura 19,21); Siendo Tsp5 un hongo utilizado en cultivos de flores en
la sabana de Bogotá, debería ejercer una acción efectiva sobre el fitopatógeno
en cultivos de clavel, situación por la cual es evidente buscar alternativas
tendientes a mejores rendimientos en pro del control de organismos
fitopatógenos tales como R. solani, y que pudieran encontrar solución en el
aislamiento nativo T235, el cual mostró los resultados más relevantes para el
control del hongo patógeno en condiciones de invernadero y en la promoción
del crecimiento vegetal en esquejes de clavel variedad Everest.
Los resultados demuestran, la
actividad antagonista diferencial de los
aislamientos de Trichoderma estudiados frente a la acción patog`+enica
ejercida por el hongo fitopatògeno R. solani, y su acciòn en la promoción en el
crecimiento vegetal en esquejes de clavel variedad Everest .
En este trabajo de investigación se demostró que 5 de los 6 aislamientos de
Trichoderma aplicados en la rizòsfera de esquejes de clavel de la variedad
Everest en condiciones de invernadero ejercen una buena acción antagonista
frente al fitopatògeno R. solani.
Los aislamientos (Control Trichoderma, T3 y T235) además de mostrar una
excelente capacidad de biocontrol, confirmaron los mayores valores en cuanto
a todas las variables evaluadas en el ensayo, asi como la mejor apariencia de
las plantas comparada con los controles. Estos resultados corroboran los
obtenidos por varios autores con relación a la habilidad de Trichoderma para
promover el crecimiento vegetal.
CONCLUSIONES
Se logró evaluar la capacidad antagonista in vitro de seis aislamientos de
Trichoderma frente al fitopatógeno Rhizoctonia solana. Donde el aislamiento
nativo T235 mostró los mayores valores de crecimiento libre y porcentaje de
inhibición micelial ( PIM).
Bajo las condiciones evaluadas, los aislamientos control Trichoderma, asi como
T235 y T3 pueden ser considerados los de mayor importancia en la promoción
del crecimiento vegetal y en pro del control biològico del hongo fitopatógeno R
.solani y la reducción de los síntomas de la enfermedad en esquejes de clavel
variedad Everest en condiciones de invernadero.
Los resultados obtenidos en condiciones de invernadero fueron consistentes a
los obtenidos en condiciones in vitro para los aislamientos que demostraron
tener una mayor tasas de crecimiento y un mayor PIM, tal y como quedo
demostrado con los aislamientos T235 Y T3.
Los resultados presentados a través de la presente investigación sugieren que
la utilización de especies de Trichoderma para el control de R. solani en
esquejes de clavel es una estrategia promisoria para el manejo de las
enfermedades en condiciones de invernadero. Esta afirmación esta soportada
por el factor de que todos los aislamientos de Trichoderma spp evaluados, a
excepción de Tsp5, redujeron la severidad de la enfermedad en plantas. Tales
reducciones fueron evidentes debido al bajo número de plantas afectadas por
R. solani cuando se enfrentaron al hongo Trichoderma y a la baja aparición de
signos y síntomas de la enfermedad sobre los esquejes de clavel evaluados.
RECOMENDACIONES
Para futuros estudios seria indicado la utilización de un mayor número de
especies de Trichoderma en esquejes de clavel en
condiciones de
invernadero.
Serìa importante el uso de camas de enraizamiento para el desarrollo de
futuros estudios con especies de Trichoderma para el control biológico de
hongos fitopatógenos, con el fin de asegurar la confiiablidad de la investigación.
Uno de los objetivos a futuro será el de combinar bacterias y hongos
antagonistas como una alternativa promisoria en el control biológico, de
patógenos con alta versatilidad ecológica en condiciones de invernadero, tal y
como es el caso de Rhizctonia solani..
Las grandes posibilidades de uso del microorganismo en el control de
enfermedades en cultivos hortícolas, estimula las investigaciones al respecto.
Sin embargo orienta a la selección de un mayor número de especies de
Trichoderma o de lineas más eficientes de los organismos antagónicos;
además de la alteración del medio ambiente de manera que el, o los
antagonistas resulten favorecidos; el aprovechamiento de las sustancias
antibióticas que producen y la aplicación precisa de ellos de acuerdo al ciclo de
la enfermedad del fitopatógeno que se desea controlar son variables de
importancia para la mayor efectividad y confiabilidad de las especies de
Trichoderma investigadas.
Realizar pruebas entre las especies del hongo Trichoderma con otros
fitopatógenos
de
importancia
interacciones y antagonismos.
agrícola,
para
identificar
las
posibles
ANEXOS
ANEXO 1
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ANEXO 2
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ANEXO 3.
ANALISIS ESTADISTICO
ANALISIS DE VARIANZA PARA LAS VARIABLES DE CRECIMIENTO
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2
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