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ANÁLISIS DE PROTEÍNAS EN GRÁNULOS Y HOJAS DE Acacia hindsii Y EN
HORMIGAS DE LA REGIÓN DE IRAPUATO
Ramírez Ramírez, G.(1); Heil, M.(2); Orona Tamayo, D. (2); Adame Álvarez R.
M.(2); Ramírez Ramírez, D.T.(3); Durán Flores, F.D.(1)
(1)
Facultad de Química
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Departamento de Ingeniería Genética
Centro de Investigación y Estudios Avanzados, Campus Guanajuato
(3)
Facultad Ciencias Químicas
Universidad de Guanajuato
RESUMEN
Se extrajeron proteínas de hojas, gránulos de Acacia hindsii y hormigas de la región por
dos métodos (fenol y TCA/Acetona) posteriormente se corrió un gel SDS-PAGE al 13%
para evaluar la calidad de las extracciones. El método TCA/Acetona fue el que presento
mayor limpieza y mejor calidad de proteína. Se corrieron geles en dos dimensiones (2DE) para gránulos con gradiente de pH 3-10 y 4-7, de los perfiles obtenidos, a las
proteínas se les asigno función e identidad por medio de búsquedas bioinformaticas en
donde se uso como referencia el frijol soya (Glycine max), encontrando proteínas de
reserva que contienen aminoácidos esenciales para insectos, con lo que podemos
presuntivamente decir que esto ayuda a la interacción planta-hormiga.
INTRODUCCIÓN
Algunas plantas para defenderse cuentan con sistemas especializados como las espinas,
producción de gomas otras son venenosas o demasiados altas para los depredadores, a
este tipo de defensa se le conoce como Defensa Directa, sin embargo existen a su vez
las llamadas Defensas Indirectas, “el termino se introdujo en la literatura hace 20 años
según resume Heil, M. (2008) de Dicke y Sabelis, (1988). En la Defensa Indirecta la
planta utiliza insectos para ahuyentar herbívoros o vegetación competitiva que pueda ser
dañina para esta, a su vez proporciona al insecto algún tipo de recompensa, lo cual nos
lleva a un mutualismo planta-insecto. En México una de las plantas estudiadas que
utiliza defensa indirecta es Acacia hindsii. Las Acacias son arboles o arbustos
espinosos; son plantas mirmecofílicas (relación planta-insecto, en este caso hormiga), a
su vez existen Acacias mirmecofílicas que pueden ser mirmecofíticas que son aquellas
en la que existe un mutualismo planta-hormiga permanente (la planta proporciona
alimento y casa y la hormiga a su vez defiende a la planta) o no mirmecofítica aquellas
en las que el mutualismo se da solamente cuando la planta es atacada.
Acacia hindsii es una planta mirmecofítica, la planta se encarga de proporcionar a la
hormiga casa (espinas) y alimento (gránulos y néctar extrafloral), y a cambio la hormiga
defiende a la planta contra herbívoros y vegetación
competitiva.
Los gránulos (Food Bodies) son un tipo de hoja
modificada que utilizan las hormigas para
alimentarse, se encuentran en la punta de la hoja
(Fig. 1). “Los gránulos de Acacia contienen todos los
aminoacidos y ácidos grasos que son esenciales para
los insectos; el contenido de lipidos y proteinas es
mayor que en las hojas (Heil, M. y col. 2004)” por Fig. 1. Gránulos en Acacia hindsii
lo que las hormigas prefieren este tipo de hoja
modificada en lugar de la hoja normal. Para abordar esta idea, nos dimos a la tarea de
1
separar extractos proteicos de granulos de A. hindsii por medio de 2-DE e identificar
aquellas proteinas por medio de analisis bioinformatico y relacionar si existen proteinas
con alguna relacion importante entre la interaccion planta-hormiga.
PARTE EXPERIMENTAL
Extracción de proteina. El material fresco fue molido en un mortero en presencia de
nitrógeno líquido, se pesaron 15 mg de gránulos, 97 mg de hojas tomadas de A.hindsii
cultivada en invernadero y 13 mg hormiga y se resuspendieron en 1 ml de buffer de
extracción frío (0.7 M de sucrosa; 0.1 M KCl; 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 y 50 mM EDTA,
β-mercaptoetanol al 2% y 1% de inhibidores de proteasas) y se adiciono un volumen
igual de fenol saturado con Tris-HCl, pH7.5, se agito por 30 min a 4°C y se
centrifugaron a 7000 rpm por 30 min a 4°C. A la fase superior se le adiciono un
volumen igual de buffer de extracción y se repitieron los pasos anteriores dos veces. Las
proteínas precipitaron con 5 volúmenes de acetato de amonio en metanol 0.1 M frío, y
se almacenaron a -20°C. se centrifugó por 30 minutos a 7000 rpm a 4°C, la pastilla se
lavo con 2 volúmenes de metanol frío dos veces y se centrifugaron 10 minutos a 7000
rpm a 4°C. Para el método TCA/Acetona, el mismo peso de cada tejido fue extraído con
el mismo buffer de extracción (como arriba), se agito 30 min y se centrifugaron a
14000 rpm por 30 min a 4°C, se colectaron los sobrenadantes y fueron precipitados com
1 ml de TCA/Acetona 10% y se incubo por toda la noche a -20°C, se volvieron a
centrifugar a 14000 rpm en frio, las pastillas fueron lavadas 5 veces con acetona/DTT
(0.1%) y se corrieron en un SDS-PAGE al 13% .
Electroforesis en dos dimensiones. Aproximadamente 90-120 μg de proteína fueron
solubilizadas en 125 μL de buffer de rehidratación (Urea 7M, Thiourea 2 M, CHAPS
2%, IPG Buffer 2%, Azul de bromofenol 0.0002%), la mezcla se coloco en una tira de 7
cm con gradiente de pH de 3-10 y 4-7 y se rehidrataron por 16 h continuas, después de
este tiempo, se corrió el IEF a 12kVh. Para el SDS-PAGE, las tiras fueron equilibradas
15 min con Buffer de equilibrio (6 M urea, 75 mM Tris-HCl pH 8.8, 29.3% glicerol, 2%
SDS, 0.002% azul de bromofenol y DTT 64 mM) y otros 15 min con el mismo buffer
pero ahora con iodoacetamida 18.4 mM, posterior a esto, las tiras fueron corridas en un
SDS-PAGE al 13%.
RESULTADOS
Fig.2. Comparación de los dos métodos de extracción de proteínas de gránulos (FB´s), hojas (L)
y hormiga(A) en un SDS-PAGE al 13%. Carriles: 1(FB´s), 3(L) y 5(A) proteínas extraídas con
fenol y 2(FB´s), 4(L), 6(A) extraídas con TCA/Acetona.
2
Gy
Fig.3. Gel de 2-DE de gránulos con gradiente pH
4-7.
Gy1
Fig. 4. Gel de 2-DE de gránulos con gradiente
pH 3-10 mostrando proteínas de reserva
(almacenamiento).
Fig. 5. Categorización funcional de proteínas de gránulos de A.
hindsii
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
A. hindsii es una planta mirmecofítica y con altos componentes recalcitrantes en sus
diferentes tejidos, por lo tanto en nuestra investigación, utilizamos dos métodos para la
extracción de proteínas de hojas y gránulos de la misma planta y de hormiga, como se
puede observar en la figura 2, la comparación de los extractos de proteínas obtenidos
con el método con fenol, no fue viable, debido a que no pudimos apreciar patrones de
bandeo en ninguno de los tejidos (carriles 1, 3 y 5), por otro lado, con el método de
TCA/Acetona, obtuvimos patrones de bandeo de buena calidad, cantidad y limpieza
(carriles 2, 4 y 6). Nuestros resultados no son sorprendentes, debido a que Saravanan y
col. (2004) extrajeron proteínas con el método de fenol de tejidos altamente
recalcitrantes como jitomate, plátanos, naranjas y uvas, y obtuvieron buena calidad en la
proteína analizada, por lo tanto esto nos puede indicar que A. hindsii es una planta con
mayores componentes recalcitrantes (polisacáridos, sales, lípidos, compuestos fenólicos
etc.) que las plantas mencionadas. Hasta la fecha, no se había realizado un análisis de
proteínas en A. hindsii, por lo que nos dimos a la tarea de separar los extractos
obtenidos por medio de 2-DE (figuras 3 y 4), donde obtuvimos perfil y buena
3
separación electroforética de las proteínas de gránulos de A. hindsii, sin embargo, las
muestras separadas con pH de 3-10, fue imposible realizar un análisis debido a la gran
cantidad de proteínas encontradas, para solucionar esto, las proteínas fueron separadas
por un gradiente de pH de 4-7, obteniéndose manchas individuales de proteínas lo que
nos ayudo para realizar la búsqueda bioinformatica de las proteínas más abundantes,
con esta búsqueda pudimos asignar la identidad y la categorización de las proteínas de
los gránulos (Figura 5) por medio de la base de datos de ExPASY, observando proteínas
involucradas en diferentes procesos celulares, resaltando aquellas proteínas que son de
almacenamiento, las cuales se creen que contienen los principales aminoácidos y que
concuerda con lo reportado por Heil, M. y col.(2004), que los gránulos contienen
aminoácidos esenciales para los insectos, sin embargo, se necesitan hacer mas estudios
para apoyar completamente esta especulación.
CONCLUSIONES
Es importante que en la proteómica comparativa puedan utilizarse protocolos que sean
los idóneos para la extracción de proteínas, por lo tanto cuando utilizamos el método de
extracción por fenol y TCA/Acetona, el método TCA/Acetona fue el más efectivo para
eliminar contaminantes, como lípidos, componentes fenólicos, pigmentos, polisacáridos
etc, y obtener una proteína de calidad. Una segunda conclusión es que el protocolo de
extracción genero una buena separación electroforética de proteínas en 2-DE y por
ultimo existen circuitos bioquímicos que interaccionan propiamente en la producción de
proteínas de reserva de los gránulos de A. hindsii y que son aprovechadas por las
hormigas para su alimentación.
BIBLIOGRAFÍA
Artículos:
Heil, M., y col. “Main nutrient compounds in food bodies of Mexican Acacia antplants”, Chemoecology, 14, 45-52, 2004
Heil, M., “Indirect defence via tritrophic interactions”, New Phytologist, Vol. 178, Num.1, 4161(21), 2008.
Saravanan, R. S. and Rose, J.K.C., “A crititical evaluation of sample extraction
techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues”, Proteomics
4:2522-2532, 2004.
Internet:
Base de datos ExPASY. http://ca.expasy.org/cgi-bin/tagident0.pl
Manuales:
Humana Press, “Handbook of Proteomics Methods”. 409-416. 2003
GE Healthcare, Handbook 80-6429-60AC,“2-D Electrophoresis, Principles and
Methods”, 2004
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