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ANÁLISIS DE PROTEÍNAS EN GRÁNULOS Y HOJAS DE Acacia hindsii Y EN HORMIGAS DE LA REGIÓN DE IRAPUATO Ramírez Ramírez, G.(1); Heil, M.(2); Orona Tamayo, D. (2); Adame Álvarez R. M.(2); Ramírez Ramírez, D.T.(3); Durán Flores, F.D.(1) (1) Facultad de Química Universidad Autónoma de Querétaro (2) Departamento de Ingeniería Genética Centro de Investigación y Estudios Avanzados, Campus Guanajuato (3) Facultad Ciencias Químicas Universidad de Guanajuato RESUMEN Se extrajeron proteínas de hojas, gránulos de Acacia hindsii y hormigas de la región por dos métodos (fenol y TCA/Acetona) posteriormente se corrió un gel SDS-PAGE al 13% para evaluar la calidad de las extracciones. El método TCA/Acetona fue el que presento mayor limpieza y mejor calidad de proteína. Se corrieron geles en dos dimensiones (2DE) para gránulos con gradiente de pH 3-10 y 4-7, de los perfiles obtenidos, a las proteínas se les asigno función e identidad por medio de búsquedas bioinformaticas en donde se uso como referencia el frijol soya (Glycine max), encontrando proteínas de reserva que contienen aminoácidos esenciales para insectos, con lo que podemos presuntivamente decir que esto ayuda a la interacción planta-hormiga. INTRODUCCIÓN Algunas plantas para defenderse cuentan con sistemas especializados como las espinas, producción de gomas otras son venenosas o demasiados altas para los depredadores, a este tipo de defensa se le conoce como Defensa Directa, sin embargo existen a su vez las llamadas Defensas Indirectas, “el termino se introdujo en la literatura hace 20 años según resume Heil, M. (2008) de Dicke y Sabelis, (1988). En la Defensa Indirecta la planta utiliza insectos para ahuyentar herbívoros o vegetación competitiva que pueda ser dañina para esta, a su vez proporciona al insecto algún tipo de recompensa, lo cual nos lleva a un mutualismo planta-insecto. En México una de las plantas estudiadas que utiliza defensa indirecta es Acacia hindsii. Las Acacias son arboles o arbustos espinosos; son plantas mirmecofílicas (relación planta-insecto, en este caso hormiga), a su vez existen Acacias mirmecofílicas que pueden ser mirmecofíticas que son aquellas en la que existe un mutualismo planta-hormiga permanente (la planta proporciona alimento y casa y la hormiga a su vez defiende a la planta) o no mirmecofítica aquellas en las que el mutualismo se da solamente cuando la planta es atacada. Acacia hindsii es una planta mirmecofítica, la planta se encarga de proporcionar a la hormiga casa (espinas) y alimento (gránulos y néctar extrafloral), y a cambio la hormiga defiende a la planta contra herbívoros y vegetación competitiva. Los gránulos (Food Bodies) son un tipo de hoja modificada que utilizan las hormigas para alimentarse, se encuentran en la punta de la hoja (Fig. 1). “Los gránulos de Acacia contienen todos los aminoacidos y ácidos grasos que son esenciales para los insectos; el contenido de lipidos y proteinas es mayor que en las hojas (Heil, M. y col. 2004)” por Fig. 1. Gránulos en Acacia hindsii lo que las hormigas prefieren este tipo de hoja modificada en lugar de la hoja normal. Para abordar esta idea, nos dimos a la tarea de 1 separar extractos proteicos de granulos de A. hindsii por medio de 2-DE e identificar aquellas proteinas por medio de analisis bioinformatico y relacionar si existen proteinas con alguna relacion importante entre la interaccion planta-hormiga. PARTE EXPERIMENTAL Extracción de proteina. El material fresco fue molido en un mortero en presencia de nitrógeno líquido, se pesaron 15 mg de gránulos, 97 mg de hojas tomadas de A.hindsii cultivada en invernadero y 13 mg hormiga y se resuspendieron en 1 ml de buffer de extracción frío (0.7 M de sucrosa; 0.1 M KCl; 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 y 50 mM EDTA, β-mercaptoetanol al 2% y 1% de inhibidores de proteasas) y se adiciono un volumen igual de fenol saturado con Tris-HCl, pH7.5, se agito por 30 min a 4°C y se centrifugaron a 7000 rpm por 30 min a 4°C. A la fase superior se le adiciono un volumen igual de buffer de extracción y se repitieron los pasos anteriores dos veces. Las proteínas precipitaron con 5 volúmenes de acetato de amonio en metanol 0.1 M frío, y se almacenaron a -20°C. se centrifugó por 30 minutos a 7000 rpm a 4°C, la pastilla se lavo con 2 volúmenes de metanol frío dos veces y se centrifugaron 10 minutos a 7000 rpm a 4°C. Para el método TCA/Acetona, el mismo peso de cada tejido fue extraído con el mismo buffer de extracción (como arriba), se agito 30 min y se centrifugaron a 14000 rpm por 30 min a 4°C, se colectaron los sobrenadantes y fueron precipitados com 1 ml de TCA/Acetona 10% y se incubo por toda la noche a -20°C, se volvieron a centrifugar a 14000 rpm en frio, las pastillas fueron lavadas 5 veces con acetona/DTT (0.1%) y se corrieron en un SDS-PAGE al 13% . Electroforesis en dos dimensiones. Aproximadamente 90-120 μg de proteína fueron solubilizadas en 125 μL de buffer de rehidratación (Urea 7M, Thiourea 2 M, CHAPS 2%, IPG Buffer 2%, Azul de bromofenol 0.0002%), la mezcla se coloco en una tira de 7 cm con gradiente de pH de 3-10 y 4-7 y se rehidrataron por 16 h continuas, después de este tiempo, se corrió el IEF a 12kVh. Para el SDS-PAGE, las tiras fueron equilibradas 15 min con Buffer de equilibrio (6 M urea, 75 mM Tris-HCl pH 8.8, 29.3% glicerol, 2% SDS, 0.002% azul de bromofenol y DTT 64 mM) y otros 15 min con el mismo buffer pero ahora con iodoacetamida 18.4 mM, posterior a esto, las tiras fueron corridas en un SDS-PAGE al 13%. RESULTADOS Fig.2. Comparación de los dos métodos de extracción de proteínas de gránulos (FB´s), hojas (L) y hormiga(A) en un SDS-PAGE al 13%. Carriles: 1(FB´s), 3(L) y 5(A) proteínas extraídas con fenol y 2(FB´s), 4(L), 6(A) extraídas con TCA/Acetona. 2 Gy Fig.3. Gel de 2-DE de gránulos con gradiente pH 4-7. Gy1 Fig. 4. Gel de 2-DE de gránulos con gradiente pH 3-10 mostrando proteínas de reserva (almacenamiento). Fig. 5. Categorización funcional de proteínas de gránulos de A. hindsii DISCUSIÓN DE RESULTADOS A. hindsii es una planta mirmecofítica y con altos componentes recalcitrantes en sus diferentes tejidos, por lo tanto en nuestra investigación, utilizamos dos métodos para la extracción de proteínas de hojas y gránulos de la misma planta y de hormiga, como se puede observar en la figura 2, la comparación de los extractos de proteínas obtenidos con el método con fenol, no fue viable, debido a que no pudimos apreciar patrones de bandeo en ninguno de los tejidos (carriles 1, 3 y 5), por otro lado, con el método de TCA/Acetona, obtuvimos patrones de bandeo de buena calidad, cantidad y limpieza (carriles 2, 4 y 6). Nuestros resultados no son sorprendentes, debido a que Saravanan y col. (2004) extrajeron proteínas con el método de fenol de tejidos altamente recalcitrantes como jitomate, plátanos, naranjas y uvas, y obtuvieron buena calidad en la proteína analizada, por lo tanto esto nos puede indicar que A. hindsii es una planta con mayores componentes recalcitrantes (polisacáridos, sales, lípidos, compuestos fenólicos etc.) que las plantas mencionadas. Hasta la fecha, no se había realizado un análisis de proteínas en A. hindsii, por lo que nos dimos a la tarea de separar los extractos obtenidos por medio de 2-DE (figuras 3 y 4), donde obtuvimos perfil y buena 3 separación electroforética de las proteínas de gránulos de A. hindsii, sin embargo, las muestras separadas con pH de 3-10, fue imposible realizar un análisis debido a la gran cantidad de proteínas encontradas, para solucionar esto, las proteínas fueron separadas por un gradiente de pH de 4-7, obteniéndose manchas individuales de proteínas lo que nos ayudo para realizar la búsqueda bioinformatica de las proteínas más abundantes, con esta búsqueda pudimos asignar la identidad y la categorización de las proteínas de los gránulos (Figura 5) por medio de la base de datos de ExPASY, observando proteínas involucradas en diferentes procesos celulares, resaltando aquellas proteínas que son de almacenamiento, las cuales se creen que contienen los principales aminoácidos y que concuerda con lo reportado por Heil, M. y col.(2004), que los gránulos contienen aminoácidos esenciales para los insectos, sin embargo, se necesitan hacer mas estudios para apoyar completamente esta especulación. CONCLUSIONES Es importante que en la proteómica comparativa puedan utilizarse protocolos que sean los idóneos para la extracción de proteínas, por lo tanto cuando utilizamos el método de extracción por fenol y TCA/Acetona, el método TCA/Acetona fue el más efectivo para eliminar contaminantes, como lípidos, componentes fenólicos, pigmentos, polisacáridos etc, y obtener una proteína de calidad. Una segunda conclusión es que el protocolo de extracción genero una buena separación electroforética de proteínas en 2-DE y por ultimo existen circuitos bioquímicos que interaccionan propiamente en la producción de proteínas de reserva de los gránulos de A. hindsii y que son aprovechadas por las hormigas para su alimentación. BIBLIOGRAFÍA Artículos: Heil, M., y col. “Main nutrient compounds in food bodies of Mexican Acacia antplants”, Chemoecology, 14, 45-52, 2004 Heil, M., “Indirect defence via tritrophic interactions”, New Phytologist, Vol. 178, Num.1, 4161(21), 2008. Saravanan, R. S. and Rose, J.K.C., “A crititical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues”, Proteomics 4:2522-2532, 2004. Internet: Base de datos ExPASY. http://ca.expasy.org/cgi-bin/tagident0.pl Manuales: Humana Press, “Handbook of Proteomics Methods”. 409-416. 2003 GE Healthcare, Handbook 80-6429-60AC,“2-D Electrophoresis, Principles and Methods”, 2004 4