Download obtención del perfil electroforetico y evaluación de la actividad

OBTENCIÓN DEL PERFIL ELECTROFORETICO Y EVALUACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS PROTEICOS ACUOSOS
A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Conyza trihecatactis (Fam. Asteraceae)
ANTE LAS CEPAS DE Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis sp. y Colletotrichum sp.
AUTOR
JULIANA MARCELA VÁSQUEZ TIBOCHA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C
2012
OBTENCIÓN DEL PERFIL ELECTROFORETICO Y EVALUACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS PROTEICOS ACUOSOS
A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Conyza trihecatactis (Fam. Asteraceae)
ANTE LAS CEPAS DE Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis cinerea y Colletotrichum sp.
AUTOR
JULIANA MARCELA VÁSQUEZ TIBOCHA
__________________________
Dra. Ingrid Schuler García
Decana Académica Facultad de Ciencias
________________________
Dr. Gerardo Moreno
Director Programa Académico
OBTENCIÓN DEL PERFIL ELECTROFORETICO Y EVALUACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS PROTEICOS ACUOSOS
A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Conyza trihecatactis (Fam. Asteraceae)
ANTE LAS CEPAS DE Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis cinerea y Colletotrichum sp.
AUTOR
JULIANA MARCELA VÁSQUEZ TIBOCHA
_____________________________
Dr. Ricardo Vera Bravo
Director
____________________________
Dr. Jorge Robles
Evaluador
3
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946.
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de grado. Solo velara por qué no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que la tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la verdad y la justicia”
4
AGRADECIMIENTOS:
En primera instancia quiero agradecer a Dios por permitirme terminar
satisfactoriamente el proyecto, a mis padres, mi hermano, familiares y amigos
quienes me brindaron apoyo moral y ayuda en los momentos que más necesitaba.
Agradezco al Grupo de Biomoléculas conformado por Diana Gómez, Max Martínez
y Lina López, al Profesor Alexander Rodríguez, mi Tutor el Dr. Ricardo Vera Bravo
y mi jurado el Dr. Jorge Robles quienes con su apoyo, colaboración y dedicación
hicieron posible la culminación y el cumplimiento de los objetivos planteados. A la
Profesora Ana Karina Carrascal y la Doctora Ofelia Díaz por su ayuda y
cooperación y a la Pontificia Universidad Javeriana que facilitó las instalaciones
para desarrollar y finalizar el proyecto.
5
NOTA:
Este trabajo de grado se encuentra financiado bajo el proyecto de investigación de
convocatoria interna titulado “Evaluación de la actividad antimicrobiana y
antifúngica de las fracciones proteicas de los extractos polares de hojas y semillas
de las especies Pentacalia nitida, Pentacalia ledifolia, Conyza trihecatactis y
Conyza bonariensis nativas de los páramos colombianos”. Dirigido por el profesor
Ricardo Vera, perteneciente al grupo GIFUJ del Departamento de Química de la
Pontificia Universidad Javeriana.
6
INDICE DE CONTENIDO:
Lista de Abreviaturas
Resumen
1. Introducción
2. Justificación y Planteamiento del Problema
3. Marco Teórico
3.1 Péptidos Antimicrobianos
3.2 Microorganismos
3.3 Conyza trihecatactis
3.4 Precipitación de Proteínas
3.5 Electroforesis SDS-PAGE 12%
3.6 Electroforesis Tricina-SDS-PAGE
3.7 Cromatografía de Intercambio Iónico
4. Objetivo General
4.1 Objetivos Específicos
5. Metodología
5.1 Recolección del material vegetal
5.2 Microorganismos
5.3 Extracción de Proteínas
5.4 Precipitación de Proteínas
5.5 Cromatografía de Intercambio Iónico
5.6 Electroforesis
5.7 Actividad antimicrobiana
5.7.1 Actividad antibacteriana
5.7.2 Actividad antifúngica
6. Resultados y Discusión
6.1 Recolección y selección del material vegetal
6.2 Microorganismos
6.2.1 Escherichia coli
6.2.2 Staphylococcus aureus
6.2.3 Listeria monocytogenes
6.2.4 Fusarium oxysporum
6.2.5 Colletotrichum sp.
6.2.6 Botrytis sp.
6.3 Extracción de Proteínas
6.4 Precipitación de Proteínas
6.5 Cromatografía de Intercambio Iónico
6.6 Electroforesis Tricina SDS-PAGE
6.7 Actividad antimicrobiana
Pág.
9
10
11
12
13
13
15
16
17
18
18
18
19
19
20
20
20
20
21
22
23
23
23
23
25
25
25
25
25
25
25
26
26
26
28
33
34
35
7
7. Conclusiones
8. Recomendaciones
9. Anexos
9.1 Recolección y selección del material vegetal
9.2 Microorganismos
9.3 Cromatografía de Intercambio Aniónico
9.4 Actividad antimicrobiana
9.4.1 Actividad antibacteriana
9.4.1.1 Ensayo difusión en agar
9.4.1.2 Ensayo en microdilución
9.4.2 Actividad antifúngica
10. Bibliografía
35
36
37
37
38
41
42
42
42
45
46
48
8
LISTA DE ABREVIATURAS
AW: Actividad de agua
BCA: Ácido Bicinconinico
Caldo BHI: Caldo Infusión cerebro corazón
EDTA: Ácido etilendiaminotetracético
HCl: Ácido clorhídrico
HEPES: Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-pipetazinaetanosulfonico
LTP: Proteínas de transferencia de lípidos
PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida
PDA: Agar Papa Dextrosa
PVPP: Polivinilpolipirrolidona
SDS: Dodecilsulfato sódico
TCA: Ácido tricloroacético
Tris: Hidroximetilamonimetano
TSA: Agar Tripticasa de Soya
TTC: Trifenil tetrazolium cloruro
9
RESUMEN
En la actualidad se han identificado más de 1340 plantas con sustancias
antimicrobianas aisladas de sus extractos metabólicos, primarios o secundarios, lo
cual promete ser una alternativa al uso de compuestos sintetizados químicamente.
Algunas plantas del género Conyza
han sido ampliamente estudiadas y
catalogadas como una posible fuente de compuestos antimicrobianos, sin
embargo en el caso de Conyza trihecatactis, nativa de los páramos de Colombia,
no se han reportado estudios que demuestren una caracterización del perfil
electroforético y la actividad antimicrobiana de sus extractos proteicos, por lo tanto
se obtuvo el perfil electroforético y se evaluó la actividad antimicrobiana de hojas y
semillas de C. trihecatactis frente a las cepas de Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporum, Botrytis sp y Colletotrichum
sp. En primer lugar se estableció el porcentaje de saturación de sulfato de amonio
(30, 50, 70 y 90%) al cual se recuperaba una mayor cantidad de proteína,
obteniendo como resultado un porcentaje del 70% tanto en hojas como en
semillas. Posteriormente fueron evaluados tres buffers de extracción: HEPES,
Tris-HCl y Fosfato 0,1M y pH 7,5 cada uno, obteniendo la mayor concentración
con Fosfato. Adicionalmente tres métodos de obtención de proteínas se
ensayaron: TCA/acetona, Fenol-Tris y Sulfato de amonio (70%) con el fin de
obtener una resolución del perfil electroforético de mayor calidad. Después de la
precipitación con sulfato de amonio al 70% se realizó Cromatografía de
intercambio iónico en una columna de Sepharosa (para hojas) y se obtuvo un gel
de Tricina-SDS-PAGE con el propósito de observar proteínas de bajo peso
molecular. Finalmente, en la actividad antibacteriana se emplearon dos métodos,
difusión en agar por pozos y microdilución con TTC, resultando más sensible la
técnica de microdilución y se obtuvo actividad antibacteriana del extracto crudo de
hojas frente a L. monocytogenes y E.coli. No obstante, en hongos solo se realizó
el ensayo de difusión en agar por pozos, sin evidencia de actividad antifúngica.
10
1. INTRODUCCION
Desde la antigüedad se tiene conocimiento de que las plantas contienen un gran
número de sustancias con actividad inhibitoria frente a levaduras, bacterias y
hongos filamentosos; se han reportado más de 1340 plantas como fuente de estos
compuestos por lo tanto prometen ser una nueva alternativa al uso de productos
antimicrobianos sintetizados químicamente, a los cuales microorganismos
patógenos ya han creado resistencia principalmente por alteraciones y mutaciones
en la pared celular o genes transportados por plásmidos (1).
Algunas sustancias de plantas del género Conyza se les atribuye actividad
antimicrobiana, aisladas principalmente de metabolitos secundarios (2). Este
género es uno de los más complejos dentro de la familia Asteraceae, no solo por
su carácter cosmopolita sino por la cantidad de especies que lo forman (3) y se
encuentra ampliamente distribuido en las zonas tropicales y subtropicales, con
cerca de 100 especies. Dentro de este género se encuentra la planta Conyza
trihecatactis, más conocida como venadillo (4), sobre la cual se realizó el estudio.
Fue recolectada vía al Páramo de Sumapaz que se encuentra ubicado en el
Departamento de Cundinamarca entre 3700-4000 M.S.N.M con un área de 46.000
ha, considerado el segundo centro biogeográfico de importancia en la cordillera
Oriental Colombiana con más de 200 géneros de plantas vasculares y endémicas
(5). C. trihecatactis es una hierba que se caracteriza porque crece hasta 150 cm,
su tallo es erguido, ramificado en la parte superior, presenta numerosas hojas
simples y alternas, las flores están dispuestas en capítulos pequeños agrupados
en una inflorescencia terminal, las lígulas son blanquecinas, muy cortas y el fruto
es un aquenio piloso (6). Puesto que esta planta ha sido poco estudiada
representa una posible fuente de compuestos antimicrobianos.
Este estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Macromoléculas de la Pontificia
Universidad Javeriana y pretende complementar los conocimientos que se tienen
de esta especie sobre sustancias metabólicas secundarias no proteicas aisladas
de las hojas y semillas de Conyza trihecatactis (7).
11
2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:
La producción
de antimicrobianos sintéticos genera gran cantidad de
subproductos que causan daños al ambiente y afectan la salud de las personas,
además de la resistencia que ciertos microorganismos patógenos han creado
contra estas sustancias (8), por lo tanto se han realizado estudios sobre algunos
metabolitos secundarios de origen vegetal para comprobar su actividad
antimicrobiana y su posible aplicación farmacéutica. Sin embargo, en Colombia se
han realizado pocas investigaciones en las que se busque este tipo de actividad
en extractos proteicos acuosos vegetales por tal razón, en este estudio preliminar
se quiso extraer y evaluar la presencia de este tipo de compuestos con
características antimicrobianas a partir de las hojas y las semillas de Conyza
trihecatactis como una fuente renovable no contaminante, los cuales tienen interés
tanto en el ámbito de la salud como en alimentos y biotecnología para reemplazar
aquellos compuestos sintetizados químicamente. Por otra parte se obtuvo el perfil
electroforético de la planta con el fin de analizar las diferentes proteínas presentes
en el extracto y adicionalmente se empleo de manera indirecta como un control de
la cantidad de proteína aislada en semillas y hojas.
De acuerdo a lo anterior se evaluó si los extractos proteicos acuosos de hojas y
semillas de Conyza trihecatactis tienen algún efecto inhibidor sobre el crecimiento
de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium
oxysporum, Botrytis sp. y Colletotrichum sp. y establecer el método que permita
obtener una resolución de mejor calidad del perfil electroforético.
12
3. MARCO TEORICO
Conyza trihecatactis es una planta nativa de Colombia localizada principalmente
en el Páramo de Sumapaz. Se han realizado estudios sobre el tipo de metabolitos
secundarios encontrados en hojas tales como diterpenos tipo labdanos y
diterpenos xilosidos, ent-esclareol (7) sin embargo no se han reportado
investigaciones que demuestren la actividad antimicrobiana de metabolitos
primarios proteicos en hojas y semillas. No obstante se han llevado a cabo
estudios con otras especies que han mostrado actividad antimicrobiana,
específicamente péptidos, los cuales han sido ampliamente estudiados en hojas,
flores y raíces (9). A continuación se presenta una breve explicación acerca de las
diferentes clases de péptidos con actividad antimicrobiana y el mecanismo de
acción aislados de otras plantas.
3.1 Péptidos antimicrobianos:
Alrededor de 106-107 Células/cm2 de microorganismos, principalmente bacterias,
están situados en la filosfera de las plantas, específicamente en las hojas, los
cuales hacen parte de la ecología vegetal estableciéndose un equilibrio que se
altera principalmente por colonización de un microorganismo patógeno causando
enfermedades infecciosas a la planta (10), por lo tanto con la evolución han
generado numerosos mecanismos de defensa para minimizar los efectos de estos
ataques. Además de compuestos fenólicos, alcaloides y metabolitos secundarios
los péptidos antimicrobianos desempeñan un papel clave en la defensa contra
microorganismos patógenos, empleando diferentes mecanismos de acción, los
cuales hacen parte de la respuesta innata de las plantas, es decir corresponden a
metabolitos primarios. Estos metabolitos primarios proteicos tienen un gran
potencial en el ámbito clínico puesto que pueden ser empleados en tratamientos
de enfermedades bacterianas en humanos, en la industria de alimentos como
biopreservativos, bioinsecticidas y el desarrollo de plantas genéticamente
modificadas que tengan mayor resistencia contra fitopatógenos. Diferentes
proteínas de bajo peso molecular han sido ampliamente estudiadas desde un
principio en tejidos de plantas tales como raíces, hojas, semillas y flores, y se han
podido identificar diferentes péptidos con capacidad antimicrobiana de los cuales
los más estudiados son las defensinas, proteínas de transferencia de lípidos
(LTP), heveinas, proteínas de unión a la mirosinasa y tioninas (9)(11).
Defensinas: Más conocidas como alfa tioninas son unos de los péptidos
antimicrobianos más importantes, ampliamente estudiados y fue aislado a partir
del trigo. Tienen un peso molecular aproximadamente de 5 KDa y han sido
reportadas con actividad antifúngica, antibacteriana e insecticida. Tienen un patrón
13
de plegamiento tridimensional estabilizado por cuatro puentes disulfuro que
incorporan cisteínas. El mecanismo de acción de estos péptidos se basa en
interacciones no covalentes entre los péptidos y los esfingolípidos o
glicosilceramidas de las membranas celulares de los insectos, inhibe el
crecimiento de los hongos por interacciones electrostáticas que conduce a una
desestabilización por la inducción de absorción de Ca+ y K+ (9,11).
Proteínas de transferencia de lípidos (LTPs): Son péptidos solubles y
catiónicos, encontrados en varias especies de plantas como cebada, vid, trigo,
espinaca y cebolla, principalmente en flores y hojas. Están subdivididas en LTP1s
y LTP2s, las cuales presentan pesos moleculares de 9 y 7 KDa respectivamente,
son llamadas así porque están implicados en el transporte de lípidos y
esfingolípidos a través de la membrana celular, asociados con la biosíntesis de
cutina y moléculas de señalización en la respuesta inmune. Al igual que las
defensinas en su estructura presentan ocho cisteínas formando cuatro puentes
disulfuro y parecen tener un papel importante durante el ataque de patógenos,
estrés salino y cambios bruscos de temperatura (9, 11).
Heveinas: Son pequeños péptidos que se unen a la quitina, se encuentran
principalmente en flores, constan de 43 residuos de aminoácidos, fueron aislados
en un principio de la planta del latex de caucho y contienen ocho puentes
disulfuro. El modo de acción consiste en la penetración a las hifas, por su afinidad
a la quitina, que conduce a la ruptura de las células (9).
Proteínas de unión a la mirosinasa (MBPs): Son catiónicas, tienen dos puentes
disulfuro, están involucradas en el desarrollo de la planta y en actividades de
defensa, principalmente contra insectos y otros patógenos. El mecanismo de
acción ha sido poco estudiado pero se cree que actúan como ionoforos a través
de la membrana microbiana (9).
Tioninas: Tienen un peso molecular de 5 KDa, generalmente son básicas ricas en
cisteínas y fueron aisladas de cereales. Se encuentran generalmente en hojas y
su principal característica es su actividad antifúngica y antibacteriana similar a las
defensinas puesto que conducen a la permeabilización de las membranas
celulares (11).
En resumen, el mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos se basa
principalmente en su naturaleza catiónica que interactúan inicialmente con los
lípidos cargados negativamente en la membrana bacteriana. Debido a sus carga
catiónicas, son atraídos electrostáticamente a la superficie microbiana debido al
contenido de lipopolisacaridos en Gram negativas y ácidos teicoicos y teicuronicos
14
en bacterias Gram positivas. Una vez el péptido atraviesa la pared celular e
ingresa a la membrana citoplasmática interactúa con los grupos cargados
negativamente del interior. En esta etapa el péptido asume una conformación
anfipática donde el extremo hidrófilo interactúa con la cabeza fosfolipídica
mientras que el extremo hidrobófico se inserta en el centro de la bicapa. Estas
interacciones pueden causar daños estructurales a la membrana y ser resultado
de varios mecanismos tales como: Las moléculas peptídicas se acumulan en la
superficie afectando la membrana de manera similar a un detergente y formación
de poros (12).
Puesto que los microorganismos patógenos están creando resistencia contra los
antimicrobianos tradicionales obtenidos de manera sintética, el uso de plantas
como fuente de nuevas moléculas biológicamente activas está siendo investigado
en los últimos años, principalmente proteínas. La información disponible hasta la
fecha demuestra que los diferentes antimicrobianos de origen vegetal pueden
reducir efectivamente o inhibir el microorganismo patógeno, por lo tanto tienen un
potencial para convertirse en una buena alternativa a los antibióticos sintéticos
(13).
3.2 Microorganismos: En los últimos 7 años han sido reportados algunos
estudios en los cuales se observa un incremento en la tasa de resistencia a
antimicrobianos por parte de algunos microorganismos patógenos (14). Esta
resistencia puede ser generada por la transferencia de información genética
mediante plásmidos, transposones, genes y en el caso de Escherichia coli la
alteración en la regulación del locus mar (15).
3.2.1 Escherichia coli:
Es una bacteria de forma bacilar Gram negativa
perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, es facultativa por lo tanto tiene la
capacidad de crecer y colonizar diferentes reservorios, ya sea libre en el ambiente
o en el tracto gastrointestinal de mamíferos y aves. En su respiración anaerobia
compuestos como citrato, NO3, y NO2 reemplazan al oxigeno como aceptor final
de electrones. Es un microorganismo mesofílico el cual se replica en un amplio
rango de temperaturas 7-45°C siendo el óptimo 37°C, crece a un pH entre 4-10 y
un AW de 0,95; es decir la cantidad de agua libre en el alimento. Al ingerir
alimentos contaminados con E. Coli puede generar diarrea crónica, síndrome de
disentería, diarrea con sangre, entre otros (14).
3.2.2 Staphylococcus aureus: Es un coco Gram positivo perteneciente a la familia
Micrococcaceae catalasa positivo y no motil, crece a temperaturas entre 6 y 48°C
siendo la óptima 37°C, es facultativo crece a pH entre 4,2 y 9,3, con un óptimo de
7 a 7,5. Algunos estudios han reportado la capacidad de crecer a AW tan bajos
15
como 0,83. Se encuentra principalmente en la piel de humanos y animales (14).
Este microorganismo produce exfoliatina tipo A y B que causan dermatitis
exfoliativa estafilococica, Toxina TSS 1 y enterotoxina estafilocócica A-C que
causan el síndrome de shock tóxico (16).
3.2.3 Listeria monocytogenes: Es un bacilo Gram positivo no esporulado motil a
22 °C, catalasa positiva y oxidasa negativa, es capaz de hidrolizar la esculina y
genera
ᵦ-hemolisis.
Su temperatura óptima de crecimiento es 30 a 37°C, pero
puede crecer de -0,4 hasta 45°C. El rango óptimo de pH para el crecimiento es de
6 a 8, aunque se ha reportado que crece entre pH de 4,4 y 9,6. Es capaz de
sobrevivir en AW 0,91. Este es un microorganismo altamente patógeno puesto que
su consumo en alimentos contaminados causa listeriosis tanto a niños como
adultos, pero principalmente en mujeres embarazadas debido a que provoca
abortos (14).
3.2.4 Fusarium oxysporum: Es un hongo filamentoso saprófito, con alta
especificidad, capaz de crecer y sobrevivir por largos periodos de tiempo en
materia orgánica, suelos y en la rizosfera de las plantas. Este microorganismo
penetra las raíces e induce la pudrición de la raíz o traqueomicosis cuando
invaden el sistema vascular de la planta, lo cual genera grandes pérdidas
económicas en cultivos de tomate, tabaco, cebada, entre otros (17).
3.2.5 Colletotrichum sp.: Es un hongo fitopatógeno que ataca hojas, frutas y flores.
Causa antracnosis que afecta diversos cultivos en todo el mundo tales como fresa,
judías arbustivas y guayaba (18). Esta enfermedad genera grandes pérdidas
económicas anuales y se caracteriza por generar lesiones hundidas de color
naranja en los frutos jóvenes, que por lo general se marchitan y mueren, y
permanecen en el árbol. Las hojas infectadas muestran lesiones acuosas,
amarillamiento, marchitez y una posterior necrosis marginal (19).
3.2.6 Botrytis sp.: Este hongo fitopatógeno conocido como el moho gris, produce
una gama de toxinas, compuestos de bajo peso molecular como el acido oxálico y
enzimas que degradan la pared celular del hospedero, causando pérdidas en más
de 200 cultivos en todo el mundo. Este microorganismo genera podredumbre
blanda y ataca a flores, tallos, hojas y frutos (20).
3.3 Conyza trihecatactis: Esta especie es nativa de los páramos Colombianos,
no ha sido ampliamente estudiado por lo tanto no se tiene información en cuanto a
la actividad antimicrobiana de sus metabolitos primarios proteicos. Esta planta
pertenece a la familia Asteraceae en la cual se encuentran principalmente hierbas,
16
algunas especies son arbustos como en este caso, sus hojas son principalmente
alternas, simples o compuestas, su fruto es un aquenio piloso (21).
3.4 Precipitación de proteínas: La solubilidad de una proteína es el resultado de
interacciones polares y apolares con el solvente, interacciones iónicas con sales e
interacciones de repulsión electrostática entre moléculas con la misma carga. A
continuación se presentan los métodos de precipitación de proteínas empleados
en la investigación (22).
3.4.1 TCA/acetona: las proteínas pueden ser precipitadas por la adición de
solventes orgánicos miscibles en agua tales como etanol y acetona. Este
mecanismo se basa en la disminución del poder hidrofílico del agua por la adición
de altas concentraciones del solvente orgánico (acetona). El efecto en las
proteínas solubles en agua y proteínas citoplasmáticas es una disminución en la
solubilidad generando una agregación y precipitación proteica por el
desplazamiento del agua alrededor de la proteína lo cual promueve interacciones
electrostáticas interproteína. Este tipo de precipitaciones se lleva a cabo
generalmente a temperaturas por debajo de 0°C puesto que la adición del solvente
a la mezcla genera calor. Se reporta que para obtener la mayor cantidad de
proteína precipitada se usa del 20 al 50% acetona en la solución. No obstante, la
adición de ácido tricloroacético además de contribuir a la precipitación por
denaturalización de la proteína remueve sales interferentes así como algunos
contaminantes no dializables (22).
3.4.2 Fenol-Tris: este método de extracción y precipitación de proteínas es un
protocolo alternativo al de TCA acetona. Fue reportado por primera en 1986 por
Hurkman and Tanaka para estudios de proteómica, quienes enfatizan la eficiencia
de este método en
la remoción de ácidos nucleícos. Este método fue
implementado en un principio para la purificación de carbohidratos y ácidos
nucleícos. El fenol es el alcohol mas sencillo aromático que contiene un hidroxilo
unido a un grupo benceno e interactúa con las proteínas principalmente a través
de puentes de hidrógeno y provoca su denaturalización, las hace solubles en la
fase orgánica y por lo tanto las proteínas se encontraran en el fenol. Actúa como
un agente disociante y disminuye la interacción molecular entre las proteínas y
otros compuestos Este protocolo se usa principalmente en plantas recalcitrantes.
Los principales inconvenientes de este método es la toxicidad del fenol y metanol
y requiere al menos seis horas. Finalmente muestra una recuperación de
proteínas eficiente y remueve componentes no proteicos tales como polisacáridos,
lípidos y compuestos fenólicos (23).
17
3.4.3 Sulfato de amonio: El sulfato de amonio deshidrata el microambiente de la
molécula de la proteína. En solución un gran número de moléculas de agua son
enlazadas al ion sulfato, reduciendo la cantidad de agua disponible para
interactuar con la molécula de la proteína. La solubilidad del sulfato de amonio es
constante entre 0 y 30°C, pH neutros entre 6 y 7,5 (22).
3.5 Electroforesis SDS-PAGE 12%: La electroforesis es una técnica de
separación de moléculas en una mezcla a través de un campo eléctrico. Estas
moléculas migran a una velocidad que está determinada por su relación cargamasa. Esta electroforesis se realiza bajo condiciones denaturantes puesto que el
SDS, un detergente aniónico, rompe los enlaces que mantienen la conformación
nativa de la proteína y brinda carga negativa (24).
3.6 Electroforesis Tricina-SDS-PAGE: Es comúnmente usado para separar
proteínas con pesos moleculares entre 1 y 100 KDa y específicamente para
obtener una mejor resolución y separación de proteínas con pesos moleculares
menores a 30 KDa. En este sistema electroforético se emplean concentraciones
de acrilamida menores a los otros sistemas, lo cual facilita la electrotransferencia,
que es crucial para proteínas hidrobóficas (25).
3.7 Cromatografía de Intercambio Iónico: Es un tipo de cromatografía liquida,
en la cual las proteínas se separan por la carga dada entorno al pH del buffer en el
que se encuentran. Cuando dichas proteínas pasan por la columna de Sepharosa,
cargada positivamente, solo las de carga negativa van a ser retenidas en la
matriz, por lo tanto aquellas cargadas positivamente van a eluir junto con la fase
móvil que en este caso es buffer fosfato 0,05M pH 7,5. No obstante las proteínas
retenidas van a ser eluidas con un gradiente de concentración de sal, la cual va a
desplazar a las proteínas retenidas débil y fuertemente a la columna (24).
18
4. OBJETIVO GENERAL
Establecer el perfil electroforético y evaluar la actividad antimicrobiana del extracto
proteico acuoso a partir de semillas y hojas de Conyza trihecatactis frente a las
cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,
Fusarium oxysporum, Botrytis sp y Colletotrichum sp.
4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Seleccionar el método que permita la mejor extracción de proteínas del
extracto acuoso a partir de las hojas y semillas de Conyza trihecatactis.
 Definir la concentración de sulfato de amonio que permita una mayor
precipitación de proteínas en el extracto acuoso.
 Obtener el perfil electroforético de la fracción proteica acuosa de las
semillas y hojas de la planta.
 Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos frente a
las cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Fusarium oxysporum, Botrytis sp. y Colletotrichum sp.
19
5. METODOLOGIA:
Para cumplir con los objetivos planteados se realizaron los siguientes
procedimientos y actividades.
5.1 Recolección del material vegetal:
La planta Conyza trihecatactis fue recolectada vía al Páramo de Sumapaz en el
Departamento de Cundinamarca e identificada en el herbario de la Pontificia
Universidad Javeriana. Se realizó la selección, clasificación del material vegetal
(hojas y semillas) y se almacenaron a -20°C hasta su uso.
5.2 Microorganismos:
Los microorganismos empleados en la investigación fueron obtenidos del cepario
de la Pontificia Universidad Javeriana. Las cepas son: Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes a partir de las cuales se realizó
un Banco de cepas bacteriano con una concentración de 10 8 UFC/ml y se
almacenó a -20°C. Las cepas de hongos son: Fusarium oxysporum, Botrytis sp. y
Colletotrichum sp., los cuales fueron repicados en agar PDA suplementado con
cloranfenicol al 0,02% con frecuencia para conservar su viabilidad y pureza.
Se evaluaron las características morfológicas de los microorganismos para
confirmar su pureza y género, adicionalmente se realizó un microcultivo de los
hongos con el fin de observar estructuras microscópicas sensibles al montaje de la
técnica azul de lactofenol y así confirmar el microorganismo.
5.3 Extracción de Proteínas:
Con el fin de establecer un protocolo que permita la mayor recuperación de
proteínas del extracto acuoso de hojas de C. trihecatactis se evaluaron diferentes
buffers de extracción.
A partir de 1 g de hojas macerado con Nitrógeno líquido a -80°C fueron pesados
0.3 g del material vegetal y se distribuyeron en tres tubos eppendorf con 0,1 g
cada uno. A cada tubo se le realizaron tres lavados con acetona fría, centrifugando
a 10000 g por 3 minutos a 4°C entre cada lavado. La muestra fue secada en
cámara de vacio a temperatura ambiente toda la noche y se evaluaron tres
soluciones de extracción: HEPES, Tris-HCl y Fosfato (26, 27, 28), adicionando 1ml
de cada solución a pH 7,5 luego de la extracción por dos horas a 4°C con
agitaciones periódicas en vortex. Posteriormente las muestras fueron
centrifugadas a 10000 g por 10 minutos a 4°C. El sobrenadante fue separado y
20
saturado al 70% con sulfato de amonio (0,41g de sulfato de amonio) y almacenado
a 4°C toda la noche. Una vez precipitadas las proteínas se centrifugó nuevamente
a 10000 g por 10 minutos a 4°C. El sobrenádate fue descartado y el precipitado
resuspendido en 100 µl de la solución de extracción correspondiente, se
dializaron las muestras y se realizó electroforesis SDS-PAGE 12% para evaluar la
presencia de proteínas y cuantificación con BCA (28).
5.4 Precipitación de proteínas:
Para obtener la mejor resolución de bandas en el gel de electroforesis SDS-PAGE
12% y la mayor precipitación de proteínas del extracto acuoso fueron evaluados
tres protocolos diferentes: TCA-acetona, Fenol-Tris y Sulfato de amonio. Para este
ultimo método, fueron ensayados 4 porcentajes diferentes de saturación (30, 50,
70 y 90%).
5.4.1 Protocolo TCA/acetona: A 1 g de material vegetal (hojas y semillas)
macerado con nitrógeno líquido se añadieron 0,0025g de polivinilpolipirrolidona
(PVPP), a partir del cual fueron tomados 0,2 g del macerado, distribuidos en dos
tubos eppendorf (0,1g en cada tubo) y lavados tres veces con 1ml de acetona fría,
centrifugando a 10000 g por 3 minutos a 4°C. Se adicionó 1 ml de buffer de
extracción (1,5% PVPP, 0,1M Buffer fosfato, 10mM KCl y 2 mM EDTA, pH 7,5) y
se dejó extrayendo por 2 horas a 4°C. Pasado este tiempo la muestra fue
centrifugada a 12000 g por 20 minutos a 4°C, el sobrenadante se transfiere a un
nuevo tubo con la solución de precipitación que consiste en 10% de TCA (ácido
tricloroacético),
0,07%
de
ᵦ-mercaptoetanol
en
2
ml
de
acetona
fría,
posteriormente la muestra es sonicada por 30 minutos y se deja precipitar toda la
noche a -20°C (29, 30). Nuevamente se centrifuga a 12000 g por 20 minutos a 4
°C, el sobrenadante es descartado y el precipitado se lava tres veces con 400 µL
de acetona fría centrifugando a 10000 g por 5 minutos a 4°C entre cada lavado.
Finalmente el remanente de acetona se deja secar y el pellet es resuspendido en
70 µL de buffer fosfato 0,1M pH 7,5. A partir de este volumen se realiza la
electroforesis SDS-PAGE 12% y cuantificación por BCA.
5.4.2 Fenol-Tris: al igual que en el protocolo con TCA/acetona, se realizó un pretratamiento con 1 g de material vegetal macerado con nitrógeno líquido, se añadió
2,5% de PVPP, fueron tomados 0,2 g del material macerado y distribuidos en dos
tubos eppendorf, cada uno con 0,1 g. Igualmente se realizaron tres lavados con
1ml de acetona fría, centrifugando a las mismas condiciones mencionadas en el
protocolo anterior. Posteriormente se añade el buffer de extracción que consta de
500mM de Tris-HCl, 50mM de EDTA, 700mM de sucrosa, 100mM de KCl, 2% de
21
ᵦ-mercaptoetanol y 4mM de pefabloc, ajustado a un pH 8.0. Se agita la muestra
por 5 minutos en hielo y son adicionados 0,2 ml de buffer Tris saturado con fenol,
agitando 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugando a 10000 g durante
10 minutos a 4°C. Se recupera la fase fenólica, es decir la fase superior, y se
añaden 0,2 ml de buffer de extracción, es agitado por 3 minutos y nuevamente se
centrifugado a 10000 g por 10 minutos a 4°C. Se recupera la fase fenólica y se
adicionan 4 volúmenes de la solución de precipitación que contiene acetato de
amonio 0,1M en metanol puro frío. Las proteínas son precipitadas toda la noche a
-20°C. Finalmente centrifugar a 10000 g por 10 minutos a 4°C y realizar tres
lavados con 30 µL de solución de precipitación y otro lavado con 30 µL de acetona
fría, centrifugando a las mismas condiciones (23). Posteriormente se resuspendió
en 70 µL de buffer Fosfato 0,1 M pH 7,5, se realizo electroforesis SDS-PAGE 12%
y cuantificación de las proteínas del extracto crudo por BCA.
5.4.3 Sulfato de amonio: a partir de 1 g de material macerado con nitrógeno líquido
se tomaron 0,2 g y fueron distribuidos en dos tubos eppendorf con 0,1 g cada uno.
Se realizaron 3 lavados con 1 ml de acetona fría centrifugando entre cada lavado
a 10000 g por 3 minutos a 4°C. Posteriormente se dejó evaporar los residuos de
acetona impregnados en el material vegetal en cámara de vacío a temperatura
ambiente toda la noche. Se añadió 1 ml de la solución de extracción que contiene
1,5% PVPP, 10mM KCl y 2 mM EDTA en Buffer fosfato 0,1 M pH 7,5, extrayendo r
a 4°C por 2 horas. Pasado este tiempo las muestras fueron centrifugadas a 10000
g por 10 minutos a 4°C, se separó el sobrenadante del material vegetal precipitado
y el extracto acuoso fue saturado con sulfato de amonio al 30, 50, 70 y 90% (31,
32, 33). Se almacenó a 4°C toda la noche. Nuevamente se centrifugó a 10000 g
por 10 minutos a 4°C. El sobrenádate es descartado y el precipitado fue
resuspendido en 100 µL de buffer fosfato 0,1M pH 7,5. Posteriormente se dializó la
muestra en 500 ml de buffer fosfato y filtrada (tamaño del poro 0,45 µm). Se
realizó cuantificación con BCA y electroforesis SDS-PAGE 12% al extracto con
mayor concentración de proteína, tanto para hojas como para semillas.
5.5 Cromatografía de intercambio iónico:
A partir de 20 g de Hojas maceradas con nitrógeno líquido de C. trihecatactis se
realizó la extracción y precipitación de proteínas por el método de saturación con
sulfato de amonio al 70% descrito en el numeral 4.3. La cromatografía fue
realizada en una columna de sepharosa de 5 ml a un flujo de 4,5 ml/min, se uso
como eluyente buffer fosfato 0,05M pH 7,5 y buffer fosfato 0,05M pH 7,5 con
500mM de NaCl (34). La muestra fue eluida al 0, 50 y 100% de Buffer con NaCl y
22
se recolectaron 60 fracciones, las cuales fueron cuantificadas por el método de
BCA. Adicionalmente se evaluó actividad antibacteriana en microdilución a las
fracciones que presentaron mayor concentración.
5.6 Electroforesis:
Se realizó electroforesis SDS-PAGE 12% (35) según el método de Laemmli (36) a
los extractos obtenidos con diferentes buffers de extracción (numeral 3.1) y a los
extractos obtenidos en los métodos de precipitación evaluados (numeral 4.1, 4.2,
y 4.3). Se uso un voltaje de 120 voltios, se tiñeron con azul de Commassie y plata
(37). Por otra parte se realizó electroforesis Tricina-SDS-PAGE con el extracto
crudo obtenido por el método del sulfato a partir de los 20 g de hojas y semillas.
Se realizó de acuerdo al protocolo establecido por Schagger, 2006, con algunas
modificaciones (25). A este gel también se le realizó doble tinción (Azul de
Commassie y plata) (37).
5.7 Actividad antimicrobiana:
5.7.1 Actividad antibacteriana: La actividad antibacteriana del extracto proteico
acuoso de hojas y semillas de C. trihecatactis se evaluó por el método de difusión
en agar, para el cual se sirvieron 17 ml de agar TSA y agar TSA suplementado
con 0,6% de extracto de levadura, se dejó gelificar y se adicionaron 7 ml de agar
TSA fundido con S.aureus y E.coli y agar TSA suplementado con 0,6% de extracto
de levadura con L.monocytogenes respectivamente. Se homogenizó y se
adicionaron 50 µl del extracto proteico, buffer fosfato como control negativo y
cloranfenicol (1mg/ml) (antibacteriano de amplio espectro) como control positivo a
los pozos previamente realizados una vez solidificado el agar. Se incubaron a
37°C durante 4 días, todos los ensayos se realizaron por triplicado (37).
Para corroborar el resultado obtenido por este método se realizó el ensayo en
microdilución. Se tomaron 50 µl de la suspensión bacteriana, 50 µl del extracto
crudo o de las fracciones y 100 µl de caldo BHI y se añadieron en un pozo. Este
ensayo se realizó por triplicado y se establecieron cinco controles: caldo BHI,
bacteria y cloranfenicol (1mg/ml); caldo BHI y extracto crudo de hojas; caldo BHI y
extracto crudo de semillas; caldo BHI y buffer fosfato; Caldo BHI y bacteria.
Posterior a la siembra se incubó a 37°C por 24 horas. Pasado este tiempo se
adicionaron 20 µl de TTC (cloruro de trifenil tetrazolium) 20mg/ml (38), se agitó y
se incubó a 37°C por 1 hora.
5.7.2 Actividad antifúngica: Se realizó con el extracto crudo de hojas y semillas de
la planta frente a Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum y Botrytis sp., para lo
23
cual se sembraron los hongos en Agar PDA suplementado con cloranfenicol al
0,02% por punción central, se incubaron por 5 días a 28°C y se adicionaron 50 µl
del extracto en los pozos realizados previamente alrededor de la colonia del
hongo. Se empleó como control positivo terbinafina 2,5mg/ml puesto que es un
antifungico de amplio espectro y como control negativo buffer fosfato 0,1M pH 7,5
el cual no tiene ningún efecto sobre el crecimiento y desarrollo de los
microorganismos. Se incubaron por 3 días a 28°C y se realizó por triplicado (37).
24
6. RESULTADOS Y DISCUSION:
6.1 Recolección y selección del material vegetal:
Se seleccionaron plantas pertenecientes al género C. trihecatactis con las
siguientes características: arbusto de 150 cm de altura aproximadamente,
numerosas hojas simples y alternas, lígulas blanquecinas y aquenios pilosos. (6)
(ver Anexo 9.1). Adicionalmente fueron identificadas en el herbario de la Pontificia
Universidad Javeriana donde se encuentra registrada bajo el número 27543.
6.2 Microorganismos:
Se evaluaron las características macroscópicas y microscópicas de los
microorganismos empleados en la investigación mediante la coloración de Gram
para bacterias y tinción con azul de lactofenol para hongos.
6.2.1 Escherichia coli: Este microorganismo se observó como un bacilo Gram
negativo corto no esporulado de crecimiento rápido con colonias grandes de color
blanco y bordes irregulares. Su temperatura óptima es de 37°C, es capaz de
fermentar la glucosa a piruvato, el cual es metabolizado hasta ácidos orgánicos
como láctico, acético y fórmico, por lo tanto hay una disminución del pH del medio
(38) (ver anexo 9.2 Figura 1).
6.2.2 Staphylococcus aureus: Se observaron cocos Gram positivos agrupados en
diplococos, tétrada y estafilococos (racimos). Sus colonias son cremosas blancas
pequeñas y con bordes regulares (16) (ver anexo 9.2 Figura 2).
6.2.3 Listeria monocytogenes: Es una bacteria en forma de bacilo Gram positiva,
no esporuladas, es motil a 22°C, sus colonias son blancas muy pequeñas con
bordes regulares y es considerado un microorganismo altamente peligroso en
mujeres en estado de embarazo que estén en el segundo o tercer trimestre de
gestación puesto que provoca abortos (39) (ver anexo 9.2 Figura3).
6.2.4 Fusarium oxysporum: Se observaron colonias rosadas claras con bordes
blancos en el anverso, con una textura algodonosa y pigmento difusible al medio.
Microscopicamente se identificaron macroconidios hialinos, alargados y septados,
microconidios hialinos, cortos y no septados, hifas delgadas, hialinas y septadas.
El color anverso de la colonia varia con respecto a la especie, se ha reportado que
puede ser desde blanca hasta un violeta pálido con producción de esclerocios (40)
(ver anexo 9.2 Figura 4).
25
6.2.5 Colletotrichum sp: Las colonias son de color café verdoso claro en el
anverso, café oscuro en el reverso, son de textura algodonosa y no producen
pigmento difusible al medio. Al realizar la tinción con azul de lactofenol se
observaron conidios ovalados, alargados, hialinos y septados, hifas delgadas
hialinas y septadas (41) (ver anexo 9.2 Figura 5).
6.2.6 Botrytis sp: se observaron colonias blancas tanto en el anverso como en el
reverso, textura algodonosa con abundante micelio aéreo, sin producción de
pigmento difusible al medio. En cuanto a las características microscópicas se
observaron hifas demateaceas gruesas y septadas, algunas hialinas por ser hifas
más jóvenes, conidios redondos hialinos originados en los ápices y conidióforos
con ramificaciones (42) (ver anexo 9.2 Figura 5).
6.3 Extracción de proteínas:
Para recuperar la mayor cantidad de proteína del extracto acuoso se evaluaron
cuatro porcentajes de saturación con sulfato de amonio (30, 50, 70 y 90%) tanto
para hojas como para semillas. De acuerdo con la información de la Tabla 1 en la
que se observan los resultados arrojados de la cuantificación de proteínas a
diferentes porcentajes de saturación de sulfato de amonio, se obtuvo una mayor
concentración de proteína con el 70% de saturación para semillas y para hojas.
Tabla 1: comparación en la concentración de diferentes porcentajes de saturación
con sulfato de amonio del extracto acuoso tanto de hojas como de semillas.
30%
50%
70%
90%
Hojas
377+/-40
µg/ml
747+/-7
µg/ml
1689+/-7
µg/ml
517+/-7
µg/ml
Semillas
1598+/-57
µg/ml
1656+/-118
µg/ml
1965 +/-10
µg/ml
1103+/-40
µg/ml
Por otra parte, con el fin obtener una mayor cantidad de proteínas a partir del
extracto acuoso de hojas y semillas de C. trihecatactis se evaluaron tres buffers de
extracción, HEPES, Tris-HCl y Fosfato, que al ser cuantificados por el método de
BCA se obtuvo una mayor concentración con buffer Tris-HCl (Tabla 2), sin
embargo, se ha reportado que este presenta interferencia a concentraciones
26
superiores de 0,1M (29), por lo tanto se empleó buffer fosfato para la extracción.
Según un estudio realizado con proteínas globulares obtenidas de las semillas de
la soya, al evaluar Tris-HCl en la extracción a pH 7,5 no se obtuvo un buen
resultado, sin embargo a pH más básicos se recupero la mayor cantidad de
proteína (27), por lo tanto el pH es otro factor determinante en la extracción y
recuperación de proteínas.
El buffer fosfato es ampliamente utilizado por su compatibilidad con cromatografía
de intercambio iónico, inhibe una gran cantidad de enzimas que pueden afectar la
estabilidad de la proteína y por su bajo costo. Así mismo al observar el perfil
electroforético en el cual se comparan los tres buffers de extracción (Figura 1) se
aprecia una mayor resolución de las bandas en el carril correspondiente al buffer
fosfato, razón por la cual se empleó el buffer fosfato en la extracción de las
proteínas. En
cuanto al buffer HEPES
((4-(2-hidroxietil) acido-1piperazinaetanosulfonico)) a pesar de estar catalogado como un buffer libre de
efectos secundarios y efectivo en la extracción de proteínas no se obtuvo una
resolución de buena calidad del perfil electroforético y además fue el buffer que
presentó la concentración más baja de proteínas al cuantificarlo con BCA (45).
Tabla 2: Comparación en la concentración de proteínas extraídas con los tres
Buffers evaluados.
Buffer de Extracción
Concentración (µg/ml)
Tris-HCl
1807+/- 11
Fosfato
1786 +/- 7
HEPES
791,7 +/- 35
27
Figura 1: SDS-PAGE 12%. Perfil electroforético del extracto crudo acuoso de
hojas extraído con los tres buffers evaluados. P: patrón de peso molecular; H:
Buffer HEPES; T: Buffer Tris-HCl; F: Buffer Fosfato.
6.4 Precipitación de proteínas:
Puesto que se pretende establecer el método que permita una mejor resolución de
las bandas en el perfil electroforético se evaluaron tres protocolos, en donde
aparentemente se establece que hay una mayor recuperación de proteína para
semillas por medio del método Fenol-Tris, sin embargo este método presenta
interferencia al momento de cuantificar con BCA como ya se había mencionado
anteriormente (39). En cuanto a hojas se obtuvo mayor concentración de proteína
por el método de Saturación con sulfato de amonio al 70% (Tabla 3), no obstante
el método TCA/Acetona es ampliamente utilizado en ensayos de proteomica por
su capacidad de inhibición de enzimas e interferentes (22), así mismo el método
Fenol-Tris (23). Estos métodos (TCA/acetona y Fenol-Tris) fueron comparados en
un estudio realizado en la extracción de proteínas de hojas de Clematis chinensis,
en el cual se obtuvo un mejor resultado por el método Fenol-Tris, sin embargo a
este protocolo le adicionaron SDS como agente denaturante (41).
28
Tabla 3: Concentración de proteínas obtenidas en el extracto crudo de Hojas y
semillas de C. trihecatactis por el método de precipitación TCA/acetona, Fenol-Tris
y Sulfato de Amonio al 70% de saturación.
TCA/Acetona
(µg/ml)
Fenol-Tris (µg/ml)
Hojas
1498+/-232
1153+/-57
Sulfato de
Amonio
(70%)(µg/ml)
3171+/-285
Semillas
1587+/-428
4085+/-299
2995+/-281
A continuación se presentan los geles obtenidos en los diferentes protocolos
evaluados tanto para hojas como para semillas.
Figura 2: Perfil electroforético del extracto crudo de hojas precipitado con
TCA/acetona. P: patrón de peso molecular; H: extracto crudo de las hojas.
29
Figura 3: Perfil electroforético del extracto crudo de semillas precipitado con
TCA/acetona. P: patrón de peso molecular; S: extracto crudo de semillas.
Como se observa en las figuras 2 y 3, el perfil electroforético de las proteínas de
hojas y semillas no presentan una buena resolución a comparación de los geles
obtenidos por el método del sulfato de amonio, así mismo la concentración de
proteína cuantificada es baja. No obstante, el protocolo de precipitación con
TCA/Acetona es uno de los más usados en proteomica por su capacidad de
remover y eliminar compuestos interferentes tales como lípidos, carbohidratos,
ácidos nucleícos, fenoles, pigmentos y sales e inhibe enzimas proteolíticas que
pueden afectar la estabilidad de la proteína. No obstante, existen algunas teorías
las cuales afirman que las fuerzas intermoleculares del TCA toman el H2O de la
proteína insolubilizándola y precipitándola, y que dicha precipitación no depende
únicamente del pH (45).
Por otra parte se han propuesto nuevas metodologías que incorporan tanto el
protocolo con TCA/acetona como el de Fenol-Tris con el fin de obtener un mayor
rendimiento en la precipitación y recuperación de proteína para análisis de
proteomica. Este estudio fue realizado a partir de hojas de Orthosiphon aristatus
(46). Estos métodos al ser altamente denaturantes no se recomiendan para
30
realizar actividad antimicrobiana, ya que alteran la estructura nativa de la proteína
y por consiguiente se pierde su actividad biológica.
Figura 4: Perfil electroforético del extracto crudo de hojas y semillas obtenidos por
el método de precipitación con Fenol-Tris. P: patrón de peso molecular; H: extracto
crudo de hojas; S: extracto crudo de semillas
31
Figura 5: Perfil electroforético del extracto crudo de hojas obtenido por el método
de precipitación con Sulfato de Amonio. P: patrón de peso molecular; H: extracto
crudo de hojas.
32
Figura 6: Perfil electroforético del extracto crudo de hojas obtenido por el método
de precipitación con Sulfato de Amonio. P: patrón de peso molecular; S: extracto
crudo de semillas
En otras investigación recomiendan emplear dos porcentajes de saturación con
sulfato de amonio diferentes, tal es el caso de Ogras, T. et al. (2005), quienes para
precipitar las proteínas del extracto acuoso de semillas de Robinia pseudoacasia
emplearon concentraciones al 30 y 70% de sulfato de amonio, obteniendo un alto
rendimiento de proteína (47).
6.5 Cromatografía de Intercambio iónico: esta técnica de separación se basa
en el tipo de carga de las moléculas o proteínas que pasan a través de ella, las
cuales se van adherir a la matriz de Sepharosa de carga positiva (48), por lo tanto,
dependiendo del pH del buffer y del punto isoeléctrico de la proteína, van adquirir
una carga positiva o negativa. Se espera que las proteínas cargadas
positivamente eluyan con la fase móvil sin someterlo a un gradiente de sal, es
decir son las proteínas que no se adhieren a la matriz. Por otra parte aquellas que
33
estén débilmente o fuertemente unidas van a ser separadas o retiradas de la
columna al pasar un buffer con diferentes concentraciones de NaCl. Como se
observa en la grafica 1 del anexo 10,3 se obtuvieron tres picos, con un total de 60
fracciones, de los cuales presentan mayor absorbancia las proteínas que se
adhieren débilmente a la columna, es decir hay más cantidad de proteínas con
grupos aromáticos en este pico (ver anexo 9.3).
6.6 Electroforesis Tricina-SDS-PAGE:
Figura 7: Perfil electroforético por el método Tricina-SDS-PAGE del extracto crudo
de hojas y semillas, precipitado con sulfato de amonio al 70%.
34
Como se observa en la figura 7, se obtuvieron péptidos con pesos moleculares
entre 8 y 10 KDa en el extracto de hojas, este sistema de electroforesis TricinaSDS-PAGE es específico para proteínas de bajo peso molecular y ha sido
empleado en diferentes estudios. Uno de ellos fue la evaluación de un péptido
antifúngico de 5.9 KDa aproximadamente aislado de las semillas de la col en
China (49).
6.7 Actividad antimicrobiana:
Tal y como se observa en las figuras 1, 2, 3 del anexo 9.4 se evidenció
crecimiento de las bacterias alrededor de los pozos, por lo tanto los extractos y la
fracciones evaluadas no presentan actividad. Este resultado también fue
observado en el ensayo realizado con hongos en el cual únicamente se aprecia
una restricción en el crecimiento del hongo en el pozo del control positivo (figura 1,
2, 3) (Ver anexo 9. 4.2).
No obstante se quiso corroborar el resultado obtenido en el ensayo contra
bacterias empleando la técnica microdilución mas TTC (2,3,5-trifeniltetrazolium
cloruro), (figura 4) (ver anexo 9.4) en la cual se obtuvieron resultados satisfactorios
con el extracto de hojas frente a E. coli y L. monocytogenes, por lo tanto se
estableció que el método en microdilución tiene mayor sensibilidad que por
difusión en agar. Para este tipo de actividad se emplea el método Kirby Bauer en
el cual se usa papel de filtro impregnado con el extracto, sin embargo este método
demuestra ser menos sensible que el método por difusión en pozos (31).
Por otra parte el objetivo de usar el reactivo TTC es poder estimar la viabilidad
celular, el cual fue adaptado por Steponkus y Lanphear en 1967 y se basa
principalmente en la reducción del TTC, por la actividad mitocondrial de las células
vivas, a trifenilformazan, un compuesto rojo e insoluble en agua (51).
7. CONCLUSIONES:
•
•
El buffer de extracción que permitió la mayor recuperación de proteínas
acuosas tanto para hojas como para semillas fue el buffer Fosfato a una
concentración de 0,1M pH 7,5 a partir de 0,1 g de material vegetal
El mayor contenido de proteína a partir de hojas y semillas de
C.trihecatactis fue de 3171+/-285 µg/ml y 2968+/-305 µg/ml
respectivamente, a partir de 0,2 g de material vegetal con el método de
precipitación de sulfato de amonio saturado al 70% con buffer fosfato como
solución de extracción.
35
•
•
•
•
La mejor resolución del perfil electroforético se obtuvo con el protocolo de
precipitación con sulfato de amonio tanto para hojas como para semillas.
El extracto proteico acuoso de Hojas de C.trihecatactis tiene actividad
antibacteriana frente a las cepas de Escherichia coli y Listeria
monocytogenes de acuerdo al método en microdilución con TTC.
No se evidencio actividad antifúngica de los extractos proteicos acuosos de
hojas y semillas de C. trihecatactis.
El pretratamiento realizado con acetona fría a los protocolos de obtención
de proteína TCA/acetona, sulfato de amonio y Fenol-Tris fue efectivo
puesto que se logró visualizar una mejor resolución del perfil electroforético
de hojas y semillas de C. trihecatactis.
8. RECOMENDACIONES:
 Para complementar la información acerca de la actividad antibacteriana del
extracto proteico acuoso de las hojas de C. trihecatactis se recomienda
hacer pruebas cuantitativas al ensayo de microdilución con TTC con el fin
de evaluar el porcentaje de inhibición que tiene el extracto frente a las
cepas bacterianas.
 Puesto que el ensayo en microdilución es más sensible que el método en
difusión en agar se recomienda realizar este ensayo para evaluar la
actividad antifúngica de los extractos proteicos acuosos midiendo
absorbancia.
36
9. ANEXOS
9.1 Recolección y selección del material vegetal:
Figura 1: Conyza trihecatactis. (A) Semillas y flores; (B) Flores; (C) Planta
completa.
37
9.2 Microorganismos:
Figura 1: Microscopía con Tinción de Gram de Escherichia coli.
Figura 2: Microscopía con Tinción de Gram de Staphylococcus aureus.
38
Figura 3: Microscopía con Tinción de Gram de Listeria monocytogenes
Figura 4: Características Macroscopicas y Microscopicas de Fusarium oxysporum.
(A) Anverso; (B) Reverso; (C) Microscopia y (D) Microcultivo.
39
Figura 5: Características Macroscopicas y Microscopicas de Colletotrichum sp. (A)
Anverso; (B) Reverso; (C) Microscopia y (D) Microcultivo.
40
Figura 7: Características Macroscopicas y Microscopicas de Botrytis sp. (A)
Anverso; (B) Reverso; (C) Microscopia y (D) Microcultivo.
9.3 Cromatografía de intercambio aniónico:
Grafica 1: Perfil cromatografico del Extracto crudo de Hojas de C.trihecatactis.
Tabla 1: Cuantificación de las fracciones del extracto crudo de hojas por BCA
obtenidas por cromatografía de intercambio iónico
Fracción Concentración Fracción
µg/ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9
-48,143
-25,286
-3,143
-3,143
-24,571
-6,714
-18,143
-34,571
-40,286
Concentración
µg/ml
21
22
23
24
25
26
27
28
29
-33,857
-28,857
-6,714
-31
-45,286
-35,286
-46
-48,857
-43,143
Fracción
Concentración
µg/ml
41
42
43
44
45
46
47
48
49
-21,714
-37,429
-23,143
-21
-10,286
-16,714
-6,714
-35,286
-33,143
41
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
-38,143
-28,857
-1,714
-26
-38,857
-51
-62,429
-50,286
-38,857
-27,429
-31,714
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
-31
-29,571
3,286
-48,857
-46,714
-38,857
-38,143
-44,571
-36,714
-42,429
-35,286
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
-38,143
-35,286
-32,429
11,143
-8,143
-24,571
-29,571
-31,714
-28,143
-29,571
-30,286
9.4 Actividad antimicrobiana
9.4.1 Actividad antibacteriana
9.4.1.1 Ensayo difusión en agar
Figura 1: Prueba de actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli por Difusión
en agar. (A) Extracto proteico acuoso de hojas; (B) Extracto proteico acuoso de
semillas E: Extracto crudo; (+): Control positivo cloranfenicol 0,02%; (-): Control
negativo buffer fosfato; 32 y 53: Fracciones 32 y 53 del extracto crudo de hojas
obtenidas por cromatografía de intercambio anionico.
42
Figura 2: Prueba de actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus por
Difusión en agar. (A) Extracto proteico acuoso de hojas; (B) Extracto proteico
acuoso de semillas E: Extracto crudo; (+): Control positivo cloranfenicol 0,02%; (-):
Control negativo buffer fosfato; 32 y 53: Fracciones 32 y 53 del extracto crudo de
hojas obtenidas por cromatografía de intercambio anionico.
43
Figura 3: Prueba de actividad antimicrobiana frente a Listeria monocytogenes por
Difusión en agar. (A) Extracto proteico acuoso de hojas; (B) Extracto proteico
acuoso de semillas E: Extracto crudo; (+): Control positivo cloranfenicol 0,02%; (-):
Control negativo buffer fosfato; 32 y 53: Fracciones 32 y 53 del extracto crudo de
hojas obtenidas por cromatografía de intercambio anionico.
44
9.4.1.2 Ensayo en microdilución:
Figura 4: Prueba de actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli,
Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes por Ensayo en microdilución.
F32, F53, F4, F23 y F12: Fracciones 32, 53, 4, 23 y 12 del extracto crudo de hojas
obtenidas por cromatografía de intercambio anionico; C+: Control positivo:
cloranfenicol 0,02%, Caldo BHI y Bacteria; C1: Caldo BHI y Staphylococcus
aureus; C2: Caldo BHI y Escherichia coli; C3: Caldo BHI y Listeria
monocytogenes; C4: Caldo BHI y Extracto Crudo de Hojas; C5: Caldo BHI,
Extracto Crudo de Hojas y Staphylococcus aureus; C6: Caldo BHI, Extracto Crudo
de Semillas y Staphylococcus aureus; C7: Caldo BHI, Extracto Crudo de Hojas y
Escherichia coli; C8: Caldo BHI, Extracto Crudo de Semillas y Escherichia coli; C9:
Caldo BHI y Buffer Fosfato; C10: Caldo BHI, Extracto Crudo de Hojas y Listeria
monocytogenes; C11: Caldo BHI, Extracto Crudo de Semillas y Listeria
monocytogenes; C12: Caldo BHI y Extracto Crudo de Semillas.
45
9.4.2 Actividad antifúngica:
Figura 1: Prueba de Actividad Antifungica frente a Fusarium oxysporum. (A)
Anverso, (B) Reverso. (+): Control positivo Terbinafrina 2,5 mg/ml; (-): Control
negativo buffer fosfato; S: Extracto Crudo de Semillas; H: Extracto Crudo de
Hojas.
Figura 2: Prueba de Actividad Antifungica frente a Colletotrichum sp. (A) Anverso,
(B) Reverso. C+: Control positivo Terbinafrina 2,5 mg/ml; C-: Control negativo
buffer fosfato; S: Extracto Crudo de Semillas; H: Extracto Crudo de Hojas.
46
Figura 3: Prueba de Actividad Antifungica frente a Botrytis sp. (A) Anverso, (B)
Reverso. C+: Control positivo Terbinafrina 2,5 mg/ml; C-: Control negativo buffer
fosfato; S: Extracto Crudo de Semillas; H: Extracto Crudo de Hojas.
47
10. BIBLIOGRAFIA:
1. Velluti A, Sanchis V, Ramos A, Egido J, Marin S. Inhibitory effect of
cinnamon, clove, lemongrass, oregano and palmarose essential oils on
growth and fumonisin B1 production by Fusarium proliferatum in maize
grain. International Journal of Food Microbiology.2003; 89, 145-154.
2. Lopez A, Hudson B, Towers G. Antiviral and antimicrobial activities of
Colombian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology. 2001; 77, 189196
3. Díaz S, Correa A. Dos especies nuevas de Conyza (Asteraceae, Astereae)
originarias
de
Colombia. Revista de
la
Academia
Colombiana
de Ciencias Exactas. 2001; 25 (95): 179-182.
4. Bernal R, Rodriguez A, Galeano G, Sarmiento H, Gutiérrez M. Nombres
comunes
de
las
Plantas
de
Colombia.
[En
línea]
http://www.biovirtual.unal.edu.co/nombrescomunes/buscador/bnc_plants/vie
w/4372. consultado el 10 de mayo de 2012.
5. Peñalosa P, Betancur J, Franco P. Chisacá, un recorrido por los Paramos
Andinos. Segunda edición. Instituto de Ciencias Naturales e Instituto de
Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt. Bogotá,
Colombia. 2005, 65p.
6. Instituto de Ciencias Naturales. COL000066647 - Conyza trihecatactis (S.F.
Blake)
Cuatrec.
–
Asteraceae.
[En
línea]
http://www.biovirtual.unal.edu.co/ICN/?controlador=ShowObject&accion=sh
ow&id=174552. Consultado el 23 de septiembre de 2011.
7. Torrenegra R, Robles J, Waibel R, Löwell M, Achenbach H. Diterpenes and
diterpene xylosides from Conyza trihecatactis. The international journal of
plant biochemistry.1993; 35: 195-199.
8. Tafur J, Torres J, Villegas M. Mecanismos de resistencia a los antibióticos
en bacterias Gram negativas. Asociación colombiana de infectología. 2008;
12: 217-226.
9. Tavares L, Santos M, Viccini L, Morira J, Miller R, Franco O.
Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers. Peptides.
2008; 29, 1842-1851.
10. Domingo D, López M. Plantas con acción antimicrobiana. Revista Española
de quimioterapia. 2003; 16 (4): 385-393.
11. Sels J, Mathys J, Coninck B, Cammue B, Bolle M. Plant pathogenesisrelated (PR) proteins: A focus on Pr peptides. Plant Physiology and
Biochemistry. 2008; 46, 941-950
12. Rotem S, Mor A. Antimicrobial peptide mimics for improved therapeutic
properties. Biochimica et Biophysica Acta. 2009; 1788, 1582-1592
48
13. Singh P. Plant extracts for the control of bacterial growth:Efficacy, stability
and safety issues for food application. International Journal of Food
Microbiology. 2012; 156, 7-17.
14. Juneja V, Sofos J. Pathogens and Toxins in Foods: challenges and
interventions. ASM Press. Washington, Estados Unidos. 2010, 7171,95,119-122, 333 p.
15. Saenz Y, Briñas L, Dominguez E, Ruiz J, Zarazaga M, Vila J, Torres C.
Mechanisms of Resistance in Multiple-Antibiotic-Resistant Escherichia coli
Strains of Human, Animal, and Food Origins. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 2004; 48 (10): 3996-4001.
16. Wolff K, Goldsmith L, Katz S, Gilchrest B, Paller A, Leffell D. Fitzpatrick
Dermatologia en Medicina General. Séptima edición. Panamericana.
Madrid, España. 2009, 1710 p.
17. Fravel D, Olivain C, Alabouvette C. Fusarium oxysporum and its biocontrol.
New phytologist. 2003; 157 (3): 493-502.
18. Gutierrez O, Nieto D, Gutierrez J. Caracteristicas Morfológicas, Culturales y
Patogenicidad de Aislamientos de Coletotrichum spp. Obtenidos de frutos
de Guayaba (Psidium guajava L.). Mexical Journal of Phytopatology. 2002;
20 (1): 24-30.
19. McKay S, Freeman S, Minz D, Maymon M. Morphological, Genetic, and
Pathogenic Characterization of Colletotrichum acuatum, the cause of
Anthracnose of Almond in Australia. Ecology and Epidemiology. 2009; 99
(8): 985-995.
20. Williamson B, Tudzynski B, Tudzynski P, Van Kan J. Botrytis cinerea: the
cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology. 2007; 8 (5): 561580.
21. Cano J, Marroquin J, Taxonomia de plantas superiores. primera edición.
TRILLAS. México D.F, México. 1994, 305 p.
22. Rosenberg I. Protein analysis and Purification. Segunda edición. Birkhäuser.
Boston, Estados Unidos. 1996, 143-149 p.
23. Thiellement H, Zivy M, Damerval C, Mechin V. Plant Proteomics: methods
and protocols. Humana Press. New Jersey. 2007, 9-13 p.
24. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser C, Krieger M, Scott M, Zipursky L,
Darnell J. Biologia Celular y Molecular. Quinta edición. Panamericana.
Argentina. 2005, 87p.
25. Schagger H. Protocol Tricine-SDS-PAGE.Nature Protocols.2006; 1 (1): 1622.
26. Heiss S, Wachter A, Bogs J, Cobbett C, Rausch T. Phytochelatin synthase
(PCS) protein is induced in Brassica juncea leaves after prolonged Cd
exposure. Journal of Experimental Botany. 2003; 54 (389): 1833-1839.
49
27. Liu C, Wang H, Cui Z, He X, Wang X, Zeng X, Ma H. Optimization of
extraction and isolation for 11S and 7S globulins of soybean seed storage
protein. Food Chemistry. 2007; 102, 1310-1316.
28. Ribeiro S, Agizzio A, Machado O, Neves A, Oliveira M, Fernandes K,
Carvalho A, Perales J, Gomes V. A new peptide of melon seeds shows
sequence homology with vicilin: Partial characterization and antifungal
activity. Scientia Horticulture. 2007; 111, 399-405.
29. Walker J. Plant pathology. Segunda edición. OMEGA. Barcelona, España.
1973, 292-297p
30. Xiang X, Ning S, Jian X, Gong X, Zhu R, Wei D. Protein Extraction Methods
for Two-Dimensional Electrophoresis from
Baphicacanthus cusia
(Ness)Bremek Leaves –A Medicinal Plant with High Contents of Interfering
Compounds. Agricultural Sciences. 2010, 9 (10):1530-1537.
31. Michail M, Vasiliadou M, Zotos A. Partial purification and comparison of
precipitation techniques of proteolytic enzymes from trout (Salmo gairdnerii)
heads. Food Chemistry. 2006; 97, 50-55.
32. Osborn R, Samblanx G, Thevissen K, Goderis I, Torrekens S, Leuven F,
Attenborough, Rees S, Broekaert W. Isolation and characterization of plant
defensins from seeds of Asteraceae Fabaceae, Hippocastanaceae and
Saxifragaceae. FEBS Letters.1995, 368; 257-262.
33. Arcan I, Yemenicioglu A. Antioxidant activity of protein extracsts from heattreated or thermally processed chickpeas and white beans. Food Chemistry.
2007; 103, 301-312.
34. Haq A, Lobo P, Al-Tufail M, Rama N, Al-sedairy S. Immunomodulatory effect
of Nigeria sativa proteins fractionated by ion exchange chromatography.
International Journal of Immunopharmacology. 1999, 21, 283-295.
35. Kelemu S, Cardona C, Segura C. Antimicrobial and insecticidal protein
isolated from seeds of Clitoria ternatea, a tropical forage legume. Plant
Physiology and Biochemistry. 2004; 42, 867-873.
36. Awotunde O, Sugjska E, Zolnierowicz S, Musynska G. Characterization of
two portein phsophate 2ª holoenzymes from maize seedlings. Biochimica et
Biophysica Acta. 200; 1480, 65-76.
37. Laemmli U, Claeavage of Structural Proteins during the Assembly of the
Head of Bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (15): 680-685.
38. Rojas J, Garcia A, López A. Evaluación de dos metodologías para
determinar la actividad antimicrobiana de plantas medicinales. Boletín
Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas 2005; 4:
28-32.
39. KlanČnik A, Piskernik S, Jersek B, Mozina S. Evaluation of diffusion and
dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts.
Journal of Microbiological Methods. 2010, 81, 121-126.
50
40. Sussman M. Escherichia coli. Mechanism of virulence. Cambridge
University Press. United Kingdom. 1997, 3-4p.
41. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schrenckenberger P,
Woods G. Koneman. Diagnostico Microbiológico; Texto y Atlas en color.
Sexta edicion. Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2008, 731p.
42. Cui Y, Yi D, Bai X, Sun B, Zhao Y, Zhang Y. Ginkgolide B produced
endophytic fungus (Fusarium oxysporum) isolated from Ginkgo biloa.
Fitoterapia. 2012, doi:10.1016/j.fitote.2012.04.009.
43. Lopez S, Munaut F, Stappen V, Scheldeman X, Damme V. Diversity studies
in the interaction between Colletotrichum gloesporioides and its host plant
Stylosanthes spp. In Mexico. Technical report of Biodiversity International.
Roma, Italia. 2007, 7-8p.
44. Thermo Scientific. Pierce Microplate BCA Protein Assay Kit-Reducing Agent
Compatible.
45. Hafiz A. Principles and Reactions of protein extraction purification, and
characterization. CRC Press. Washington, USA. 1959, 4p
46. Ishtiaq M, Mumtaz , Wang Y, Yiyu C, Mehmood T, Ashraf M. Proteins a
Biomarkers for Taxonomic Identification of Traditional Chienese Medicines
(TCMs) from Subsection Rectae Genus Clematis from China. World Applied
Science Journal. 2010, 8, 62-70.
47. Rajalingam D, Loftis C, Xu J, Kumar K. Trichloroacetic acid-induced protein
precipitation involves the reversible association of a stable partially
structured intermediate. Protein science. 2009, 18, 980-993.
48. Lin P, Bun T. A novel and exploitable antifungal peptide from lake (Brassica
alboglabra) seeds. Peptides. 2008,29,1664-1671.
49. Koay S, Gam L. Methods development for analysis of proteins extracted
from the leaves of Orthosiphon aristatus. Journal Chromatography B. 2011,
879, 2179-2183.
50. Ogras T, Ipeckci Z, Bajrovic K, Gozukirmizi N. Antibacterial activity of seed
proteins of Robinia pseudoacacia. Fitoterapia. 2005, 76, 67-72.
51. Roca W, Mroginski L. Cultivo de Tejidos en la Agricultura. Fundamentos y
Aplicaciones.CIAT. Cali, Colombia. 1993, 724p.
51