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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS SECCION DE POSGRADO MUTACIONES ESPECIFICAS EN HEMOFILIA A TESINA QUE PARA OBTENER EL DIPLOMA DE: ESPECIALIZACIÓN EN HEMATOPATOLOGÍA PRESENTA QFB. ALMA ROSA LUNA GASPAR Director de tesina: M en C. Martha Lilia Cassani Galindo CONTENIDO INDICE DE TABLAS INDICE DE FIGURAS ABREVIATURAS RESUMEN OBJETIVO Y JUSTIFICACION I. INTRODUCCION 1.1 Descripción general de la hemofilia 1.2 Antecedentes históricos de la hemofilia 1.3 Herencia 1.4 Clasificación de la hemofilia 1.5 Incidencia 1.6 Manifestaciones clínicas 1.7 Inhibidores 1.8 Estructura de la proteína del Factor VIII 1.9 Síntesis del Factor VIII 1.10 Características bioquímicas y moleculares del gen del Factor VIII 1.11 1.12 1.13 1.14 II. Activación del Factor VIII Fisiología de la hemostasia secundaria Modelo actual de la coagulación Fisiología de la hemofilia MUTACIONES MAS FRECUENTES EN EL GEN DEL FACTOR VIII III. MUTACIONES ASOCIADAS CON HEMOFIL IA A SEVERA IV. METODOS DE PCR PARA DIAGNOSTICAR MUTACIONES RELACIONADAS CON HEMOFILIA 4.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR 4.2 Técnicas de Southern Blot V. CONCLUSIONES VI. BIBLIOGRAFIA i ii iii 1 2 2 2 4 4 4 5 6 7 8 8 9 10 10 11 13 19 21 21 23 25 26 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Base de datos de mutaciones puntuales 21 Tabla 2. Base de datos de mutaciones en el gen del VIII relacionadas con el grado de severidad y desarrollo de inhibidores. 23 i INDICE DE FIGURAS Páginas Figura 1. Transmisión la hemofilia 4 Figura 2. Sitios más frecuentes de hemorragias en el enfermo Hemofílico 6 8 Figura 3. Unidad funcional del factor VIII. 9 Figura 4. Estructura del gen del Factor VIII 10 Figura 5. Fisiología de le hemostasia secundaria 11 Figura 6. Esquema del mecanismo de la coagulación 12 Figura 7. Generación de macrodosis de trombina Figura 8. Esquema de la inversión 22 en el gen de FVIII. 20 Figura 9. Esquema de los pasos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa 23 ii OBJETIVO GENERAL Revisar los aspectos generales asociados con la hemofilia, así como las mutaciones más frecuentes relacionadas con el gen del FVIII. JUSTIFICACION: En México, la hemofilia representa un problema de salud pública importante, la gravedad de éste padecimiento está altamente relacionada con el tipo de mutación presente en el gen del FVIII. Por lo que se hace necesario hacer una revisión más amplia de las mutaciones asociadas a la hemofilia A. iii RESUMEN La hemofilia constituye una enfermedad hemorrágica hereditaria, caracterizada por la deficiencia funcional o cuantitativa del factor VIII coagulante (FVIII:C), causante de la hemofilia A y factor IX coagulante (FIX:C), causante de la hemofilia B. La hemofilia se presenta debido a un defecto en el gen del factor VIII o del factor IX, ambos se localizan en el brazo largo del cromosoma X. Clínicamente se manifiesta por episodios hemorrágicos recurrentes especialmente en músculo y articulaciones, de intensidad variable de acuerdo con la concentración circulante del factor afectado. La localización de las hemorragias otorga a la hemofilia un patrón clínico particular que potencialmente puede producir discapacidad. En México la Federación Mexicana de Hemofilia tienen registrados aproximadamente 3000 casos de hemofilia. El gen del FVIII presenta una tasa de mutación del orden de 1 X10 -5. Se caracteriza por presentar mutaciones con una gran variedad en el tipo y distribución a lo largo del gen, por lo que se considera altamente heterogéneo. Se han descrito alteraciones en los 26 exones y en algunos intrones de éste gen. Las mutaciones puntuales son los defectos más comunes, hasta Enero de 2007 se han reportado 1221 de éstas alteraciones, de los cuales 48% son mutaciones de cambio de sentido,11% son mutaciones sin sentido, 16% y 11% corresponden a pequeñas y grandes deleciones, respectivamente, 8% son mutaciones en sitios de empalme y 7% son inserciones. El exón 14 es el que presenta el mayor número de alteraciones (104/14%) y esta altamente relacionado con hemofilia severa. 1 I. INTRODUCCION 1.1 Descripción general de la hemofilia La hemofilia es una coagulopatía hereditaria de carácter recesivo ligada al cromosoma X, se caracteriza por la deficiencia funcional o cuantitativa del FVIII:C o FIX:C de la coagulación. Se trata de una enfermedad crónica que persiste a lo largo de toda la vida del enfermo (Bello, 2001). Un paciente hemofílico no tiene la cantidad suficiente del factor VIII o IX en el plasma circulante, lo que impide una adecuada coagulación de la sangre. Estos enfermos manifiestan hemorragias prolongadas, particularmente en las articulaciones y músculos, donde por la repetición de los procesos hemorrágicos, produce lesiones irreversibles e invalidez debido a las artropatías (Martínez y col, 1996). 1.2 Antecedentes históricos de la hemofilia La hemofilia probablemente existe desde que aparecieron las primeras generaciones del hombre y se cree que fue ocasionada por una mutación de novo, que progresivamente se fue difundiendo (Ljung y col, 1995). En el siglo II A.C. en la obra sagrada de la ley judaica, el Talmud, de Babilonia, los rabinos Rabbi Judah y Rabbi Simon ben Gameliet, mencionan la ocurrencia de una hemorragia mortal, de origen hereditario después de practicada la circuncisión en los hijos varones (Ayalew, 2001). En 1803, un médico norteamericano llamado John Conrad Otto, demostró que la enfermedad estaba ligada al cromosoma X, quedando limitada a los varones, siendo las mujeres las portadoras (Beutler y col, 2001). En 1853, nace Leopoldo el primer hijo hemofílico de la Reina Victoria de Inglaterra, quien sufre una mutación de novo. La reina Victoria transmite la enfermedad a gran parte de la realeza europea, de ahí deriva el término de “enfermedad de reyes”. Leopoldo muere a los 31 años de edad por una hemorragia cerebral después de una caída (Ingram, 1976). En 1936, los profesores Patek y Taylor en Harvard, demostraron que el defecto en la hemofilia se debía a la deficiencia de un factor denominado antihemofílico. (Ljung, 1995). 2 En 1952, el profesor Armando J Quick y col; definieron a la hemofilia como una enfermedad hemorrágica ligada al cromosoma X. La anomalía se debía a una deficiencia de globulina antihemofílica (López y col, 1992). En 1952, la Dra. Rose Mary Biggs y los profesores Douglas y Macfarlane en Oxford, descubrieron la enfermedad de Christmas o hemofilia B (Bigss, 1952). En 1965, la Dra. Judith Graham Pool, norteamericana, descubrió los crioprecipitados que revolucionaron el tratamiento de la hemofilia (Pool, 1975). En 1984, después de estudiar el gen del FVIII, diversos grupos de investigadores, como los de Gitschier, Toole y Word, en diferentes estudios han reportado algunas de las mutaciones que dan origen a la hemofilia en sus tres variedades de presentación: leve, moderada y grave ( Gitschier y col, 1985; Harper, 1984; Whyte, 1987). 1.2 Herencia Los genes que codifican para los factores VIII y IX se encuentran localizados en el brazo largo, en la región q28 del cromosoma X. Se trata de un trastorno ligado al sexo, por lo tanto, el varón quien es hemicigoto (X hY) manifiesta la enfermedad y las mujeres (XhX) son las portadoras, sin embargo, en casos raros se pueden presentar mujeres hemofílicas. (Bello, 2001). Las madres de los hemofílicos son portadoras en la mayoría de los casos, excepto cuando aparecen mutaciones de novo lo cual se presenta en el 30% de los casos. Los hijos de una mujer portadora tienen el 50% de probabilidad de ser sano y el 50% de ser hemofílicos, mientras que la probabilidad de heredar el estado de sano o de portadora será del 50% .31 (López y col, 1992). También se han descrito casos aislados en los que las mujeres han desarrollado la enfermedad.35 (Martínez y col, 2008). Por su parte los padres hemofílicos transmitirán el trastorno a todas sus hijas pero sus hijos serán sanos (Naylor y col, 1991). (Fig.1) 3 XXY=Varón hemofílico XX= Mujer sana XY= Varón sano XXX= Mujer portadora Figura 1. Transmisión la hemofilia (tomado de http/www.wfh.org) 1.3 Clasificación de la hemofilia La hemofilia se clasifica en dos tipos clínicamente indistinguibles: la hemofilia A o hemofilia clásica, caracterizada por la deficiencia funcional o cuantitativa de la globulina antihemofílica denominada FVIII:C y la hemofilia B o enfermedad de Christmas, que se caracteriza por la deficiencia funcional o cuantitativa del FIX:C (Butler y col, 2001). 1.4 Incidencia La hemofilia A se presenta en 80% de todos los casos, mientras que la hemofilia B en 20% (Martínez, 2000). Esta enfermedad es de distribución mundial. La hemofilia A afecta al varón con una incidencia global de 1 a 2 casos por 10 000 varones, mientras que la hemofilia B ocurre en 1 de cada 25,000 varones (Hoyer, 1994). La Federación Mundial de Hemofilia, cuyas siglas en inglés son WFH, hasta Agosto del 2000 informa 105,000 casos de hemofílicos en 77 países, sin embargo se estima que deben existir 400,000 hemofílicos en todo el mundo. 35, 52 (Martínez y col, 2008; http/www.wfg.org). La Federación de Hemofilia de la República Mexicana A.C; tiene registrados a 3000, hemofílicos en el país, sin embargo, se debe de considerar que de acuerdo a la incidencia mundial, deben existir aproximadamente entre 4000 y 5000 enfermos con hemofilia A y entre 1000 y 1250 enfermos con hemofilia B. El 45% del total de enfermos hemofílicos A y B presentan hemofilia grave (2250 y 4 2812), respectivamente aunque se estima que hay más de 6000 y que en su mayoría aún no han sido diagnosticados. (Fed de Hem Rep Mex, 2004). 1.5 Manifestaciones clínicas Las manifestaciones clínicas de la hemofilia es la hemorragia. Según el sitio donde se presente, puede ser invalidante, como el sangrado intra-articular o la hemorragia intracraneana (HIC). La frecuencia y la intensidad de la hemorragia depende del nivel plasmático del factor afectado. Los pacientes con hemofilia severa sangran espontáneamente o por un trauma mínimo. Los pacientes con hemofilia leve, sangran por procedimientos quirúrgicos o traumatismos graves. Las hemorragias intra-articulares (hemartrosis) es la manifestación más común e incapacitante del hemofílico. En la figura 2 se muestra el orden de frecuencia de las hemartrosis. Estas articulaciones son más susceptibles de sangrar porque soportan más peso, tienen mayor cantidad de tejido sinovial, carecen de músculo para recubrir la articulación y contrarresten las fuerzas rotatorias y angulares a las que se someten. La ausencia de tromboplastina tisular en el tejido sinovial impide la activación de la coagulación y resulta insuficiente para detener la hemorragia. Los niveles elevados de activador del plasminógeno (t-PA) intraarticular, incrementan la fibrinólisis y destruyen el coágulo en formación. La hemorragia muscular es el segundo tipo de hemorragia en la hemofilia severa. Las Hemorragias intracraneanas es la principal causa de muerte y sucede en un 212% (Martínez y col, 2000), Martínez y col, 2008). 5 Figura 2. Sitios más frecuentes de hemorragias en el enfermo hemofílico (Tomado de http/www.wfg.org) En función de la concentración plasmática del factor deficiente y de las manifestaciones clínicas, la hemofilia también se clasifica en: a) hemofilia de alto riesgo o grave: mantienen en la circulación < del 1% de actividad del factor afectado, b) hemofilia moderada: hay de 1-5% y c) hemofilia leve: hay de 6-30% (Ayalew, 2001) ,(Bello, 2001),( Beutler y col, 2001). 1.6 Inhibidores Los inhibidores son inmunoglobulinas de clase IgG4, éstas van a neutralizar la actividad procoagulante del FVIII y/o FIX. Están dirigidos contra epitopes de la cadena ligera en los dominios A2, A3 y C2 y en los dominios A1 y A2 de la región acídica de la molécula de estos factores coagulantes (Van den Brink, 2000; Scandella y col, 2002). Los factores de riesgo que predisponen para desarrollar inhibidores en el hemofílico son: a) hemofílicos cuya deficiencia del factor afectado es menor del 1% de actividad y desarrollan inhibidores en 5 - 30% de los casos con hemofilia A, y del 1-3% en los casos con hemofilia B, b) número de exposiciones a los concentrados terapéuticos y c) tipo de mutación del gen del factor afectado, siendo las mutaciones con grandes deleciones y las mutaciones sinsentido las más susceptibles de desarrollar inhibidores (Lusher,2000),(Schwaab y col, 1995). Los hemofílicos que desarrollan inhibidores se clasifican como: a) con baja respuesta, los cuales presentan de 0.6 – 5 Unidades Bethesda (UB) y b) con alta respuesta si tienen >5 UB (Mervina, 2000). 6 Se sospecha de la presencia del inhibidor cuando el enfermo no responde a las dosis habituales de los concentrados transfundidos, y si el reporte de TTPa no se corrige con plasmas normales (Deitcher y col, 2002). Aunque el desarrollo de inhibidores en los pacientes con hemofilia no incrementa la frecuencia de sus hemorragias, si representa un problema importante en el manejo terapéutico de las hemorragias, aunque suprimir estos factores deficientes con la terapia de reemplazo, representa un reto para el médico hematólogo tratante (Prowse, 1995). La presencia del inhibidor puede ser confirmada en el laboratorio por diferentes métodos, Oxford, Bethesda y Nijmegen (Alistair y col, 1998). Bethesda es el más utilizado en diferentes países de EEUU, Europa y Latinoamérica. Este método se considera como el “estándar de oro”, por ser un método sencillo, rápido, confiable y poco costoso (Verbruggen y col, 1995) 1.7 Estructura de la proteína del Factor VIII El factor VIII es una glicoproteína de cadena única, tiene un peso molecular (PM) de 280 kilodaltons (Kd). La estructura del polipéptido del FVIII presenta tres unidades peptídicas funcionales A, B,C, con aproximadamente 330, 980 y 150 aa, respectivamente, los cuales están en el orden siguiente: NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2COOH., A1-A2-B constituyen la cadena pesada, su PM es de 210,000 kd y A3-C1C2 que constituyen la cadena ligera cuyo PM es de 80 kd (Vehar y col., 1984). Presenta una homología aminoacídica de alrededor del 40% con 5 de las 6 unidades funcionales polipeptídicas de que también consta el FV de la coagulación, y cuya disposición también es similar. Sin embargo, la unidad polipeptídica funcional parece no estar relacionado (Mosesson y col, 1990). (Fig. 3). Gran parte del FVIII circula unido al factor de von Willebrand (FvW) en forma de dos cadenas, la pesada y la ligera, ambas cadenas unidas de forma no covalente mediante la interacción de iones Ca2+ y Cu2+ (http://www.hemobase.com/Molecular_Hemofilia/Index.htm) 7 CADENA PESADA NH2 A1 REGION DE UNION A2 B CADENA LIGERA A3 C1 11 1 C2 COOH Figura 3. Unidad funcional del factor VIII. (Tomado de Mosesson MW y col y1990) 1.8 Síntesis del Factor VIII La determinación del lugar de biosíntesis de FVIII en el organismo ha sido un tema especialmente controvertido. Se ha demostrado la presencia de RNAm del FVIII en diversos órganos tales como bazo, páncreas y riñón (Wion y cols., 1985). Sin embargo, el hígado es el órgano productor de FVIII por excelencia, más concretamente las células sinusoidales y en menor medida los hepatocitos (Hollestelle y cols.,2001). A pesar de que el bazo y el riñón expresan cantidades similares de RNAm por gramo de tejido, el gran tamaño del hígado lo convierte en la principal fuente de FVIII (Wion y cols., 1985). Una clara demostración se encuentra en el hecho de que los pacientes hemofílicos sometidos a transplante hepático recuperan los niveles normales de FVIII (Wood y cols., 1984). 1.9 Características bioquímicas y moleculares del gen de Factor VIII El gen de FVIII (F8) que codifica para el factor VIII de la coagulación, representa el 0.1% de la longitud total del cromosoma X. Se localiza en un extremo del brazo largo del cromosoma X, en la banda q28, a una distancia de 1Mb del telómero. Consta de 26 exones y 25 intrones que se extienden a lo largo de 186 Kb en el genoma humano y da lugar a un RNAm de 9Kb, la secuencia codificadora tiene 7053 nucleótidos. Veinticuatro de los exones tienen un tamaño que varía entre 69 y 262 pb, mientras que los exones 14 y 26, contienen 3106 y 1958pb respectivamente. La mayor parte del exon 26 corresponde a secuencias transcritas y no traducidas. Algunos de los intrones son extremadamente largos: los intrones 1,6,13,14 y 25 constan de 14 a 23 Kb y el intrón 22 tiene 32 Kb. El intron 22 contiene dos genes transcritos intragénicos “anidados” dentro del mismo gen del F8 conocidos cono F8A y F8B que no parecen tener ninguna vinculación fisiológica con el gen huésped. El F8B se transcribe en la misma dirección que el gen F8 y da lugar a un RNAm de 2.5 Kb que incluye un exón propio y los exones 8 23 a 26 del gen FVIII. Por su parte el gen de F8A no contiene intrones y se transcribe en sentido opuesto. A 4000 Kb del telómero distal del gen F8 se encuentran dos copias homologas al 100 % del gen F8A, cuya presencia es la responsable de casi el 50% de las hemofilias A graves (Gitchier y cols., 1995),(Martínez y col.,2008). (Fig. 4). Figura 4. Estructura del gen del Factor VIII (imagen tomada de: http://www.hemobase.com/Molecular_Hemofilia/Index.htm) 1.10 Activación del Factor VIII La activación proteolítica del FVIII es necesaria para la generación del complejo de activación del FX en el sistema de coagulación in vitro. El FVIII puede ser activado por el FXa (factor X activado) y por la trombina. La activación por trombina se asocia a una ruptura en la cadena pesada en el residuo Arginina (Arg) 372, así como en la posición Arg 740 (a nivel de la unión A2B) que libera al dominio B. En la cadena ligera a nivel de la Arg 1689 existe otra ruptura que contribuye a incrementar su actividad de cofactor y a liberar el FVIII del Factor de von Willebrand (FvW). La actividad del cofactor en el complejo Xasa se obtiene por la ruptura en Arg 372. Las rupturas específicas para generar el FVIIIa (Factor VIII activado) son a nivel de Arg 740 y 372. (Gaucher C y col., 1989),( Whyte y col., 1987). El factor VIII presenta una vida media de 8-12 horas, se sintetiza principalmente en las células endoteliales de los hepatocitos, bazo, ganglios linfáticos y riñón. Circula normalmente en el plasma como un gran complejo unido al factor de von Willebrand a una concentración de 0.1 mg/mL. (Beutler E y cols.,2005) 9 1.11 Fisiología de la hemostasia secundaria El sistema de la coagulación o hemostasia secundaria es la primera línea de defensa contra traumas del sistema vascular. En una herida la coagulación sanguínea rápidamente forma un coágulo sanguíneo cesando la hemorragia en un tiempo promedio de 2-5 minutos sí el sistema está funcionando correctamente. Las propiedades de la coagulación sanguínea tienen como características que los componentes de las reacciones sean localizadas, amplificadas y moduladas. Actualmente se conoce la importancia que tienen las superficies celulares (plaquetas, células endoteliales, fibroblastos, monocitos, remanentes celulares o micropartículas) en la interacción y acoplamiento molecular que dan lugar a la coagulación sanguínea. La vasoconstricción inicial, la función de las células endoteliales y la formación del coágulo plaquetario, juegan un papel importante en la hemostasia primaria, sin embargo, la formación del coágulo de fibrina a través de una serie de reacciones bioquímicas en el que se involucran enzimas, cofactores y superficies celulares, son esenciales para la formación de un coágulo insoluble en la hemostasia secundaria (Martínez y col., 2008). (Fig. 5) Figura 5. Fisiología de la hemostasia secundaria (Tomado de Martínez MC y cols, 2000) 1.12 Modelo actual de la coagulacion El modelo actual de la coagulación consiste en una serie de mecanismos que inicia cuando existe la lesión vascular. La exposición del FT en la sangre y la unión del factor VII (FVII) son los iniciadores del sistema de hemostasia secundaria. Primero se expresa el FT de fuentes extravasculares, de células inflamatorias o del endotelio, esta exposición del FT tiene dos funciones principales; 1. Activación del factor X (FX) y 2. Activación del factor IX (FIX). El 10 FX a su vez activa al FV y el complejo formado por FXa/FVa genera pequeñas cantidades de trombina. El inhibidor de la vía del FT (IVFT) inhibe el complejo FT/VIIa/Xa, evitando que se formen grandes cantidades de trombina. Sin embargo con la pequeña dosis de trombina (1%) (fase de iniciación), es suficiente para activar plaquetas, FVIII; quien se disocia de factor de von Willebrand (FvW), (proteína que lo protege de la degradación enzimática), FV y FXI. Por otro lado el complejo FT/FVIIa activa también al FIX (FIXa), una vez activado se une a su cofactor el FVIIIa, formando el complejo FVIIIa/FIXa, quien es 10 5- 106 más activo que el FIXa solo y 50 veces más eficiente que el complejo FT/VIIa para activar al FX, por lo tanto, la mayor parte del FXa es producido por el complejo FVIIIa/FIXa. El FXa se une a su cofactor FVa sobre la superficie de la plaqueta, formando el complejo protrombinasa (IIasa), generando grandes cantidades de trombina (99%) ( fase de amplificación ). El complejo protrombinasa es 300 000 veces mas activo en catalizar la activación de la protrombina que el FXa (Martínez y cols., 1996), (Martínez y col., 1998) ( (Fig. 6). Figura 6. Esquema del mecanismo de la coagulación 1.13 Fisiología de la hemofilia La deficiencia cuantitativa o funcional del FVIII:C o FIX:C se traduce como un defecto en el mecanismo de activación de la coagulación. Cuando existe una 11 lesión vascular se expone al FT extravascular, que se une inmediatamente al FVII formándose el complejo FVII:C/FT y activará al FX:C y FIX:C, ambos factores participan en la fase de sostén y mantenimiento de la coagulación, sin embargo, el complejo FVII:C/FT tiene predilección por la activación del FX:C, también llamado complejo Xasa. Los hemofílicos sangran porque el complejo FVII:C/FT que activa al FXC es cuantitativamente insuficiente para proporcionar la hemostasia in vivo, debido a que al formarse el complejo FVII:C/FT inmediatamente se libera un inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT), que inhibe al FT y degrada la pequeña cantidad de trombina generada, por lo que resulta insuficiente sostener la hemostasia. Se requiere la acción de de la vía complementaria que activa al FXI (FXIa), quien activará al FIX (FIXa), que junto con el FVIII formará el complejo FVIIIa/FIXa, formándose cantidades suficientes de trombina; contribuyendo a la amplificación y propagación de la formación del coágulo de fibrina. La deficiencia de los factores VIII:C y IX:C se traduce en un retardo en la formación del coágulo, considerando que la fase inicial de la activación de la coagulación dependiente del complejo FVII/FT, se encuentra bloqueado por el inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT), esto provoca que la formación del polímero de fibrina se realice de manera tardía y, clínicamente predisponga al enfermo a hemorragias. En el paciente hemofílico se encuentra dañada la amplificación y propagación de la coagulación al afectarse el complejo Xasa y generar poca cantidad de trombina (Martínez y cols., 2000), ( Martínez y col., 1996),(Martínez y col., 2008). Figura 7. Importancia de la vía alterna formada por FVIIIa, FIXa y FIXa en la generación de macrodosis de trombina. (Martínez M. C y col, 2000). 12 II. MUTACIONES MÁS FRECUENTES EN EL GEN DEL FVIII El gen del FVIII presenta una tasa de mutación del orden de 1 X10-5 por gameto/generación considerada en el rango de mutación altas en genes eucarióticos. Se caracteriza por presentar mutaciones con gran heterogeneidad alélica, es decir, una gran variedad en el tipo y distribución de las mutaciones a lo largo del gen. Se han encontrado regiones donde se concentra la incidencia de mutaciones, denominada sitios calientes “hot spot”. (Guizar, 2001) A partir de la clonación del gen del FVIII en 1984, diversos grupos iniciaron la búsqueda de mutaciones responsables de la hemofilia A moderada y leve (Higuchi y col., 1991). Naylor en 1992, basándose en RT-PCR a partir de sangre periférica, obtuvo amplificaciones de los exones 1 al 22 y 23 al 26, pero no pudo obtener amplificaciones de los exones 22 y 23. Más tarde Lakich y col., 1993, y Naylor y col., 1993 mediante técnicas de Southern Blot comprobaron que el patrón de bandas del intrón 22 se comportaba diferente con respecto a las bandas encontradas en el resto de los exones del gen de FVIII. Las mutaciones puntuales son las más comunes de los defectos en el gen del factor VIII. Éstas se agrupan de acuerdo, a la presencia o no de sitios CG, en el que ocurre una transición, se conoce que son sitios ampliamente mutables cambiándose el nucleótido T por C y A por G. El 30% de las mutaciones están relacionadas con alteraciones en los sitios CG y están asociadas a hemofilia moderada, el 70% restante no esta relacionado con los sitios CG (Naylor y cols., 1992). Las mutaciones puntuales relacionadas con la hemofilia son: a) deleciones (en la secuencia de nucleótidos hay pérdida de uno o mas nucleótidos en el gen). Se dividen en grandes deleciones (pérdida >50pb) y pequeñas deleciones (pérdida <50pb), b) inserciones (en la secuencia de nucleótidos se añaden uno o más nucleótidos en el gen), tanto en las deleciones como en las inserciones tienen como consecuencia la formación de proteínas no funcionales y c) rearreglos como inversiones, éstos se han encontrado tanto en genes del factor VIII como genes de factor IX (www.hemobase.com/molecular hemophilia/Index.htm) Tuddenham y col, 1991 y 1994 publican la primera base de datos relacionada con las mutaciones en el gen del FVIII asociadas a hemofilias 13 severas, moderadas y leves. Describe que están relacionadas principalmente con mutaciones puntuales tales como sustituciones, deleciones e inserciones (http:pubmedcentral.nhi.gov/articlerender.fcgi?artid=328775) Actualmente Kemball CG, Tuddenham G.D, han recopilado y actualizado una base de datos en línea web, conocida como Haemophilia A mutations, Search, Test and Resource Site (HAMTeRS) en donde se reportan todas la mutaciones encontradas relacionadas con hemofilia A severa, moderada y leve (http://www.genomic.unimel.edu.au/mdi/mutnomen), (http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/25/1/128). En el cuadro 1, se muestra una resumen de la base de datos descrita por HAMTeRS, hasta Enero de 2007, de un total de 1221 mutaciones puntuales encontradas en el gen del FVIII. En 135(11%) corresponde a grandes deleciones con la pérdida de 1kb a 210 kb, lo que provocará una recombinación nucleotídica no homóloga. Se ha reportado que 5% de los casos de hemofilia A severa, es debida a esta causa (Woods-Samuels y col, 1991). Algunos reportes de hemofilia moderada están relacionados con alteraciones en el empalme del RNAm por deleciones en el exón 22 (Youssoufian y col, 1987), exón 23-24 (Wehnert y col, 1989; Lavergne y col, 1992) provocando baja actividad del FVIII debido a la carencia del aminoácido. Con relación a las pequeñas deleciones, se ha encontrado que 197(16%) corresponden a éstas con la pérdida desde 1pb hasta 86pb, y están asociadas a hemofilia severa debido a la ausencia de expresión de la proteína del FVIII. Con respecto a las inserciones, se distinguen 80 diferentes inserciones que corresponden a un 6%, éstas abarcan desde 1pb a 2.1Kb y 3.8Kb en la que se ve involucrada la familia LINE (Kazazian y col, 1988). La mayoría de las inserciones de un solo tipo de base, la cual llega a repetirse 8 veces, por ejemplo, una inserción con 8 nucleótido de A. El grupo de Higuchi y col, 1991; Pineman y col, 1995; y Miller y col, 1994; estudiaron a 164 pacientes hemofílicos A severos, 69 (42%) se relacionan con inversiones, el 90% de éstas ocurrieron en la zona distal y proximal del gen del FVIII. Tizzano y col, 1994., reporto 39% de inversiones en 92 pacientes estudiados; 36% desarrollaron inhibidores. Goodeve y col,. 1994., reportó 48% de inversiones en 23 pacientes estudiados. Collins y col, 1994., y Ljung, 1994 encontraron el 45% de inversiones en 85 pacientes y 46% en 41 pacientes (http//www.hemobase.com/Molecular hemophilia(Index.htm). 14 respectivamente En las mutaciones de cambio de sentido: se produce un codón alterado que conlleva a codificar para un aminoácido diferente, que puede alterar las propiedades de la proteína, o incluso convertirla en no funcional. La severidad de la hemofilia va a depender en gran parte de la modificación que sufra el tipo de aminoácido con respecto al original tomando en consideración aspectos tan importantes como la estructura, polaridad o hidrofobicidad, así como la ubicación de éste. Si el aminoácido modificado, no esta afectado de manera importante con relación a las características antes citadas, la hemofilia se presentará menos severa, mientras que en los casos en que la región alterada del aminoácido sea estructural y funcionalmente diferente, entonces se producirá una proteína modificada de forma importante e inestable estructuralmente dando como resultado una hemofilia moderada o severa. (Bowen y cols., 2002). En la tabla 1se reportan 583(48%) de mutaciones con cambio de sentido. En las mutaciones sin sentido: el cambio del nucleótido sucede con un codón de terminación de la cadena, se afecta de manera importante la información de los exones, con la interrupción de la síntesis de la proteína, por lo tanto el producto será una proteína incompleta y no funcional, provocando hemofilia severa. El mecanismo de intercambio de CG es el mismo que se explicó en el párrafo anterior (Bowen y cols., 2002. En el cuadro 1 se presentan 131(11%) de mutaciones sin sentido. Cambios en los sitios de empalme en el RNAm: se eliminan o alteran sitios de empalme en RNAm, esto es debido a la transcripción y procesamiento incorrecto del RNAm, afectándose de manera importante fragmentos grandes en regiones de exones en los sitios de empalme del RNAm del FVIII, alterando la proteína y dando lugar a hemofilia severa. (http://europium.csc.mrc.ac.uk/WebPages/PublicFiles/SmallDeletions.htm ), (http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutnomen/), (Tavassoli y cols., 1998) 15 En la tabla 1 se presentan 95(8%) de éste tipo de mutaciones. También se muestra en este cuadro que todos los exones del gen de FVIII presentan alguna o varias alteraciones. Además se puede observar que las mutaciones con cambio de sentido predominan 583(48%), con respecto a las mutaciones sin sentido 131(11%), mutaciones en sitios de empalme 95(8%), pequeñas deleciones 197(16%), grandes deleciones 135(11%) e inserciones 80(6.55%). El exón 14 presenta el mayor número de alteraciones: 43 mutaciones de cambio de sentido, 52 mutaciones sin sentido, 6 en sitios de empalme, 77 pequeñas deleciones y 39 inserciones. Tabla 1. Base de datos de mutaciones puntuales registradas hasta Enero de 2007, publicada por HAMTeRS. Exón 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Total Mutaciones con cambio de sentido 15 10 25 35 13 11 38 27 27 10 36 20 32 43 19 26 28 34 16 8 9 19 30 13 13 26 583 Mutaciones sin sentido 2 1 0 7 1 2 5 6 3 3 1 5 3 52 2 7 3 5 1 1 5 5 1 5 2 3 131 Mutaciones puntuales Mutaciones Pequeñas en sitios de deleciones empalme 4 2 5 8 6 5 4 1 10 4 6 4 4 8 1 8 5 7 3 5 4 2 4 2 2 7 6 77 3 4 2 7 2 6 1 5 8 4 0 2 1 0 4 3 4 7 4 3 2 7 0 9 95 197 Grandes deleciones Inserciones Na Na Na Na Na Na Na Na Na Na Na Na Na Na Na Na na Na Na Na Na Na Na Na Na Na 135 1 4 0 1 1 2 1 1 3 0 1 1 3 39 0 0 5 4 4 2 1 1 0 2 3 0 80 En la tabla 2 también se observa que el exón 14 es el que presenta mayores alteraciones (104/14%) del total (751), observamos que éste mismo exón 16 esta altamente asociado a hemofilia A severa (18.4%) y los exones 5 y 20 son los menos relacionados (4 casos). El exón 8 esta altamente relacionado con el desarrollo de inhibidores (27%), en los exones 2,4,5,6,14,15 y 25 el desarrollo de inhibidores sucede en 1% , mientras que en los exones 1,4,6, y 20 no hay evidencias que estén asociados al desarrollo de inhibidores. Con respecto a los intrones se observa que son muy poco afectados, están poco relacionados con hemofilia severa y poco relacionados con el desarrollo de inhibidores, solo en el intrón 14 se ha reportado un caso con inhibidor. 17 Tabla 2. Base de datos de las mutaciones encontradas en el gen del FVIII y los casos reportados relacionado con el grado de severidad y el desarrollo de inhibidores. Exón o Intrón afectado No. de alteraciones en el exón/intrón Tipo de mutaciones puntuales Promotor Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intrón 2 Exón 3 Exón 4 Intrón 4 Exón 5 Intrón 5 Exón 6 Intrón 6 Exón 7 Exón 8 1 18 1 12 0 30 47 2 14 2 13 2 44 34 Cambio de sentido 16 NA 11 NA 30 40 NA 13 NA 11 2 39 28 Exón 9 Intrón 9 Exón 10 Exón 11 Intrón 11 Exón 12 Intrón 12 Exón 13 Exón 14 Intrón 14 Exón 15 Intrón 15 Exón 16 Exón 17 Exón 18 Exón 19 Exón 20 Exón 21 Exón 22 Exón 23 Exón 24 Exón 25 Intrón 25 Exón 26 31 1 16 39 1 27 2 39 103 1 27 1 38 34 45 19 9 15 24 35 18 20 1 30 28 NA 0 38 NA 21 NA 36 43 NA 24 NA 29 30 40 17 8 9 19 32 15 18 NA 27 Codón de terminación polimorfismo Grados de severidad de Hemofilia A Inhibidor Sever a modera da Leve NR Si No 2 NA 1 NA 0 7 NA 1 NA 2 0 5 6 10 0 9 1 15 24 1 4 1 8 1 17 19 3 1 2 0 7 11 0 3 0 2 1 8 5 1 5 0 0 0 6 11 1 7 0 1 0 16 7 0 0 0 0 0 2 1 0 0 1 2 0 3 3 0 0 0 0 1 1 0 2 0 0 0 1 26 15 3 NA 0 1 NA 6 NA 3 58 NA 3 NA 9 3 5 2 1 6 5 3 3 3 NA 3 15 ¿ 5 12 ¿ 18 0 15 66 1 12 1 18 20 14 8 4 7 12 11 6 8 1 14 5 ¿ 4 11 ¿ 2 1 9 7 0 4 0 8 5 9 2 1 3 4 8 4 2 0 7 10 ¿ 5 13 ¿ 4 1 14 15 0 10 0 12 7 20 7 4 2 7 14 5 7 0 7 1 1 2 3 ¿ 3 0 1 15 4 ¿ 1 2 ¿ 2 ¿ 3 12 1 2 ¿ 6 3 5 4 0 1 4 4 4 3 0 5 23 ¿ 11 27 ¿ 25 ¿ 28 66 0 20 ¿ 24 0 30 12 5 10 13 24 9 8 1 20 2 1 18 1 0 0 2 2 2 3 1 2 3 3 0 2 10 1 19 40 2 6 1 11 1 33 3 NR ¿ 3 ¿ 2 0 10 6 6 1 2 1 10 5 4 ¿ 4 10 ¿ 10 ¿ 8 25 0 5 ¿ 8 6 10 3 4 4 7 7 5 9 0 5 III. MUTACIONES ASOCIADAS CON HEMOFILIA A SEVERA. Una alteración genética de gran relevancia en la hemofilia A es la presencia de la inversión 22 dentro del gen del FVIII responsable de 40-50% de casos de hemofilia severa. El primer paso en el diagnóstico molecular directo de la hemofilia A severa consistió en el análisis de la presencia de la inversión 22 del gen del FVIII.23 Naylor y col., 1992, utilizando en técnicas de RT-PCR sugirieron la existencia de una alteración poco común entre los exones 22 y 23. Años antes Gitschier y col., 1985, habían hallado, en individuos sanos, en el interior del intrón 22 a 32 kb, dos genes que denominaron F8A y F8B, en aquellos momentos éstos autores pensaron que éstos genes dentro del intrón 22 eran los primeros descubiertos en el genoma humano. El F8A presentaba además dos copias altamente homólogas en la porción telomérica distal a unas 400 Kb del gen de FVIII, a los que denominaron F8A´ y F8A´´, ambos genes tienen un tamaño de 9Kb y una homología cercana al 100%. Naylor y Gitschier presentaron como hipótesis la posibilidad de que se hubiera producido una recombinación homóloga desigual entre el gen del F8A y sus genes F8A´ y F8A´´, que era causante de más de 40% de la hemofilia severa y cuya mutación no había podido ser identificada. Si esto ocurría, el gen de FVIII quedaría dividido en dos mitades muy distanciadas una de la otra, orientadas en sentido opuesto y explicaría los transcritos inconexos que había encontrado Naylor. En 1993 Lakich y col., y Naylor y col., empleando técnicas de Souther Blot, la digestión de DNA genómico con BclI y su posterior transferencia e hibridación utilizando una sonda marcada correspondiente a una región del intrón 22 del gen FVIII, da lugar a un patrón de bandas que permite discriminar entre ausencia/ presencia del reordenamiento (Lakich y cols., 1993), Comprobaron que, efectivamente, el patrón de bandas era diferente en los individuos problema con respecto a los individuos sanos control (Prowse y cols, 1995) El proceso que da lugar a la inversión en el intrón 22 requiere que se lleve a cabo la torsión del extremo del brazo largo del cromosoma X, para permitir el encuentro de las regiones homólogas y que se pueda producir la recombinación de material génico. La frecuencia estimada para que esto suceda es de 4X10-6. Cuando la recombinación involucra al gen del F8A´, el producto se llama 19 inversión proximal o de tipo 1 y sucede en el 78% de los casos. Si la recombinación implica al gen F8A´´, la inversión será distal o de tipo 2 y sucede en el 19%. Se ha descubierto una tercera variante minoritaria (3% de los casos), que ocurre en individuos portadores de tres copias extragénicas del gen F8A (Rossiter y col., 1994). Los efectos fenotípicos de los tres tipos de inversiones son, idénticos (Prowse y cols., 1995), Rossiter y cols, 1994). En la figura 7 se muestra en forma esquemática el proceso que da lugar a la inversión del intrón 22. Figura 8. Esquema de la inversión 22 en el gen de FVIII. (Imagén tomada de: http://www.hemobase.com/Molecular_Hemofilia/Index.htm) A partir de que fue posible caracterizar el defecto genético del gen de la hemofilia, varios investigadores se han dado a la tarea de realizar estudios moleculares para detectar las diferentes alteraciones en el gen del FVIII. Jenkins y col., 1994, con él método de Southern Blot, estudió a 85 pacientes con hemofilia severa, 47% presentaron inversión 22, 80% fueron de tipo distal. Deutz-Terlow y col., 1995 con técnicas de hibridación estudió 177 pacientes Italianos con hemofilia A, 57% presentaron la inversión 22 y fueron hemofílicos severos, el resto fueron hemofílicos moderados y leves. El 85% de las inversiones son distales, mientras que el 15% restante son proximales. Ljung R y col., 1995, con método de Souther Blot estudió 49 pacientes suizos con hemofilia A, 22(45%) 20 presentaron la inversión 22. Gaucher C. y col., 1995, con método de Souther Blot estudió 98 pacientes franceses con hemofilia A, 38 (48%) presentaron la inversión 22 y fueron hemofílicos A severos, 79% fueron de tipo distal y el resto fueron proximales. Jayandharan G y col., 2005 con PCR multiplex, de 109 pcientes Indúes estudiados, 51% presentaron el intrón 22 y 2% el intrón 1. Mantilla Capacho JM y col, 2007 analizaron 138 pacientes Mexicanos, 94 pacientes provenientes de 65 familias fueron analizados para detectar la inversión 1 y no se encontró ningún caso con ésta alteración, de 44 pacientes provenientes de 33 familias con hemofilia severa, 14 (45%) fueron positivos para la inversión 22. De 31 pacientes 28 de ellos con inversión 22 se les buscó la presencia de inhibidores, resultando que 8(29%) fueron positivos. Abu Amero KK y col., 2008 estudió 20 pacientes Árabes, 11(55%) presentaron la inversión 22 (Abu Mero KK y cols.,1998) IV. METODOS DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE MUTACIONES RELACIONADAS CON LA HEMOFILIA. El diagnóstico molecular de la hemofilia fue posible a partir de la clonación y caracterización del los genes de la hemofilia. Gracias al diagnóstico molecular del gen del FVIII se ha logrado identificar una gran variedad de mutaciones relacionadas con hemofilia severa, moderada y leve. Se han empleado diferentes métodos de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) para identificar las mutaciones descritas en los párrafos anteriores.´ 4.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La PCR es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis. Este método tiene como objetivo amplificar un fragmento de DNA. El proceso de PCR común por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperaturas llamados ciclos; cada ciclo suele involucrar 23 pasos de temperatura. Los ciclos de la PCR a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado “zonas calientes” ) a alta temperatura (>90 oC), seguido de otro hold al final del proceso para la extensión del producto final. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo depende de factores como: el tipo de enzima utilizada para la síntesis de DNA, la concentración de 21 iones divalentes, tipo de dNTPs en la reacción y de la temperatura de unión de los iniciadores o cebadores. La reacción de PCR consiste en los siguientes pasos: a) inicialización: se lleva la reacción hasta una temperatura de 94o·-96 o ·C (ó 98oC si se usa una polimerasa termoestable extrema) b) desnaturalización: consiste en separar las dos hebras de DNA a temperaturas de 94o - 95 o C, la temperatura para la desnaturalización dependerá de factores como: la concentración de G+C que tenga la hebra de DNA y del largo de la misma. Para la desnaturalización suelen emplearse sales o agentes químicos, c) alineación o unión del cebador: se producirá la hibridación del cebador, es decir, este se unirá a su secuencia complementaria en el DNA molde. Para ello se baja la temperatura a 50o -65o C durante 20-40 segundos, permitiendo así la alineación. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador empieza a sintetizar DNA. Los cebadores indicarán la terminación de la síntesis de DNA que va a ser amplificada, d) extensión o elongación de la cadena: la polimerasa sintetiza una nueva hebra de DNA complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP´s complementarios en dirección 5´→3´, uniendo el grupo 5´-fosfato de los dNTP´s con el grupo 3´-hidroxilo del final de la hebra de DNA que se esta extendiendo. La temperatura para este paso depende de la DNA polimerasa que se use. Para la taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad es de 75o-80oC (comúnmente 72 oC). El tiempo de extensión depende de la DNA polimerasa empleada y de la longitud del fragmento de DNA que se quiere amplificar, e) elongación final: se lleva a cabo a 70-74·C de temperatura, durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ello se asegura que cualquier DNA de cadena simple restante sea totalmente amplificado, f) conservación: este paso generalmente se lleva a cabo a 4o -15oC, para conservar la reacción a corto plazo. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de interés se emplea la electroforesis: que separa los fragmentos de DNA producidos dependiendo de la carga iónica, de la longitud y del tamaño del fragmento amplificado. Los geles de agarosa son más comúnmente usados para separar fragmentos grandes y los geles de poliacrilamida se usan para fragmentos más pequeños. El tamaño de los productos de la PCR están determinados por un marcador de peso molecular de DNA de tamaño conocido, que se corre en el gel junto con los productos de PCR problema (Fig. 8). 22 Figura 9. Esquema de los pasos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa 4.2 Transcriptasa reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT PCR) RT-PCR: Consiste en usar un molde inicial de RNA utilizando una enzima transcriptasa inversa, para realizar la conversión de RNA (tanto RNAm como RNA total) a DNA llamado DNAc (DNA complementario). 4.2 Técnica de Souther Blot Esta técnica fue desarrollada por Edward M Souther en el año 1975 .Es una técnica que permite la identificación (presencia o ausencia), y localización de secuencias específicas de una mezcla DNA de diferentes fuentes, con éste método se identifica el tamaño del fragmento de restricción que contiene la secuencia. Consta de los siguientes pasos. 1) digestión: se digiere el DNA con una o mas enzimas de restricción, las cuales cortan en puntos específicos de la secuencia, generando fragmento de DNA de varios tamaños, 2) electroforesis: los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa, los de menor tamaño migran mas rápido que los de mayor tamaño. Una vez terminada la electroforesis, los fragmentos de DNA se 23 trasfieren a una membrana de nitrocelulosa o de naylon. Este paso de transferencia es esencial y muy importante en la técnica, 3) marcado de sondas: para detectar el fragmento de interés en la membrana se utiliza otro fragmento de DNA o RNA, llamadas sondas, que contienen la secuencia complementaria del fragmento de DNA o RNA que queremos identificar y que estarán marcadas con un isótopo radiactivo, se incuban por varias horas tanto la membrana con la muestra problema y la sonda marcada, se adhiere al fragmento de DNA a través del reconocimiento de secuencias complementarias. Para detectar la posición de la marca radiactiva, la membrana de nitrocelulosa se cubre con una película fotográfica o de rayos x. Después del revelado, la posición de las sondas marcadas son visibles. La cantidad de DNA necesaria para la técnica depende del tamaño y actividad específica de la muestra. Las muestras cortas tienden a ser más específicas. 24 V. CONCLUSIONES Las mutaciones relacionadas con hemofilia A son las mutaciones puntuales tales como: pequeñas y grandes deleciones, inserciones (inversiones), mutaciones con cambio de sentido, mutaciones sin sentido, mutaciones en los sitios de empalme Se ha encontrado que en los 26 y solo en algunos intrones como el 2, 4, 5, 6, 9, 11, 12, 14, 15 y 25 presentan algún tipo de alteración en el gen. El exón y el intrón14 es el que presenta mayor número de alteraciones (mutaciones de cambio de sentido 43, mutaciones sin sentido 52, en sitios de empalme 6, pequeñas deleciones 77 e inserciones 39). presenta sin sentido. El exón 8 y 14 son los que están más relacionados con el desarrollo de inhibidores. La inversión en el intrón 22, esta relacionado con la hemofilia A severa en un 45-50% y con el desarrollo de inhibidores hasta en un 12%. 25 VI. BIBLIOGRAFIA 1. Alistair R M, Alaine King, Gary Moore. 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