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FISIOLOGIA BACTERIANA. CLASE INAUGURAL 2017. “El papel de lo infinitamente pequeño en la naturaleza es infinitamente grande” “El azar favorece a la mente preparada” L. Pasteur “He llamado a este principio, por el cual cada pequeña variación, si útil, es preservada, con el término de Selección Natural”. C. Darwin “Nada tiene sentido en biología si no es a la luz de la evolución” T. Dobzhansky Distribución de células procariotas sobre nuestro planeta Ubicación Suelos Entornos acuáticos Subsuelo oceánico Subsuelo terrestre 28 Número (x10 ) 26 12 355 125 % del total 5 2 69 24 La Fisiología Bacteriana es una rama de la Microbiología, que es la ciencia que estudia a los microorganismos Importantes hitos históricos ??-Siglo XV: Era Oscura Siglo XV-XVI: El desarrollo del método científico. El cuestionamiento, y finalmente la refutación, de las teorías de la generación espontánea; Siglo XVII: El descubrimiento del mundo de los microbios; Siglo XIX: El siglo de Oro El rol de los microbios como transformadores químicos y causa de enfermedades, Desarrollo de los métodos modernos de la Microbiología, La teoría de la evolución de Darwin Siglo XX: Desarrollo de los métodos de Biología Molecular y ADN recombinante. Secuenciación de genomas completos de organismos procariotas y eucariotas, Siglo XXI: ?? Era Oscura. Algunos eventos históricos documentados ~5000 años: Producción de bebidas alcohólicas por fermentación de cereales, miel, uva. Epidemias, plagas, pestes. Mesopotamia, India, Egipto, China: utilización de sustancias antisépticas y antimicrobianas en el tratamiento de heridas e infecciones (jabones, miel, hongos, sales de cobre). ~350 AC: Teoría aristotélica de la generación espontánea (aceptada hasta el siglo XV): Enfermedades como castigos divinos o desbalances (los 4 jinetes del Apocalipsis), ergo la higiene o prevención son innecesarias. Occidente: Teoría patología humoral (salud: balance sangre, flema, bilis amarilla y bilis oscura); Oriente: Yin-Yang (salud: armonía). Siglo XV: Renacimiento de las Artes y las Ciencias. Cambios políticos. Cuestionamiento a las teorías de la generación espontánea. Descubrimiento del mundo microbiano Cuestionamiento de lo Antiguo (poder otorgado por la divinidad). Mayor tolerancia. F. Bacon: el conocimiento es poder. Surgimiento de Sociedades Científicas: Invisible College en Inglaterra (Newton, Boyle). Nulium in verba: Desarrollo (o invención) del método científico: El conocimiento basado en la experiencia (Experientia magister est optimum). 1540: Girolamo Francastoro. Morbo gálico o itálico (sífilis) como enfermedad transmisible (seminaria contagium). O sea, un agente causal. 1665: Francesco Redi: Omne vivum ex ovo 1673: Descubrimiento documentado del mundo microbiano: Anton Van Leeuwenhoek y sus “animáculos”. Paradójicamente el hallazgo renace las teorías de generación espontánea. Recién en 1860 L. Pasteur y J. Tyndall asestan el “golpe final”: Los microbios derivan de otros microbios. 1715: Timoni y Pilarini (Univ. Padua): Aprenden en China la variolización (inmunización contra viruela). El agente causal de la enfermedad puede ser contenido. 1796: Jenner: vacunación con “viruela de las vacas”, con menor mortalidad. El agente causal puede ser domesticado. Siglo XIX: Siglo de Oro de la Microbiología. Los microbios como agentes causantes de enfermedades y transformaciones químicas A principios del siglo XIX, la ausencia métodos de aislamiento y cultivo de bacterias en “estado puro” (a partir de un solo microbio aislado) lleva a postular que los mismos pueden variar tanto en forma como en fisiología (pleomorfismo). 1817: B. Bizio estudia al microscopio la “Sangre de Cristo”, manchas rojas sobre el pan bendecido utilizado en las misas. Describe la Serratia marcescens, a la que erróneamente cataloga como “fungus”, y que puede multiplicarse sobre polenta en condiciones de humedad y temperatura adecuadas. Los microbios pueden cultivarse. 1844: I. Semmelweis. Mortalidad por fiebre puerperal en parturientas. Concepto de antisepsis e higiene. 1848. C. Ehrenberg inocula manchas rojas de “Sangre de Cristo” sobre papas, pan, y queso suizo, utilizando recipientes de lata con atmósfera húmeda. Obtiene cultivos, a los que estudia al microscopio introduciendo el término bacteria (pequeños bastones). 1850. Hermann Hoffman experimenta con sustratos: pan y papas hervidas para esterilizarlas y luego inoculadas con levaduras 1850. Joseph Schroeter experimenta con sustratos: papas, almidón, pasta de harina, pan, albúmina de huevo, carne, para crecer bacterias cromogénicas. Encuentra que las colonias forman otras colonias de características similares. 1850: J. Lister, L. Tait (Inglaterra). Medidas de higiene en operaciones 1858. C. Darwin y A.R. Wallace. Teoría de la Evolución (Lectura presentada ante la Sociedad Linneana de Londres): “Sobre la tendencia de las especies a crear variedades, así como sobre la perpetuación de las variedades y de las especies por medio de la selección natural”. 1859: C. Darwin publica su libro “El origen de las especies mediante la selección natural, o la conservación de las razas favorecidas en la lucha por la vida” 1861: L. Pasteur formula el primer medio de cultivo líquido: 100 g agua destilada, 10 g azúcar de caña, 1 g tartrato de amonio y 1 g de cenizas de levadura (minerales, básicamente fosfato de potasio). Descubre que las levaduras usan azúcar de caña como fuente de carbono, pero no pueden emplear CO2 como las plantas. Concepto de sustratos de crecimiento. 1863-1868: C. Davaine observa “bacteridios” en sangre de enfermos de ántrax, y C. Eberth los aísla. Concepto de colonización. 1863: L. Pasteur estudia las "enfermedades del vino". Descubrimiento de la fermentación láctica y de las bacterias anaeróbicas (la vie sans l'air) que transforman glucosa en ácido butírico dando lugar a “vinos grasos” de mal gusto (ahora sabemos que se trata de Clostridium acetobutilicum). Concepto de anaerobiosis y de rutas metabólicas. 1869: L. Pasteur identifica al protozoo Nosema bombycis como agente causal de la epidemia de pebrina que afecta al gusano de seda. 1872. Oscar Brefeld, botánico alemán, desarrolla el método del cultivo sobre soporte sólido agregando gelatina sobre medio de cultivo para obtener cultivos puros. Lo utiliza para crecer hongos a partir de esporas. Un problema de la gelatina: solidifica por debajo de 25 ºC y muchos organismos pueden degradarla. 1873. Edwin Klebs desarrolla el método de dilución para obtener cultivos puros. 1870-1875: F. Cohn descubre, usando el medio de Pasteur, que el crecimiento de levaduras reduce el crecimiento de bacterias. Formula un medio mineral para crecer bacterias selectivamente quitando el azúcar: 20 g agua destilada, 0,1 g fosfato de potasio, 0,1 g sulfato de magnesio, 0,2 g de tartrato de amonio, 0,01 g fosfato de calcio. Demuestra que las bacterias pueden metabolizar otros compuestos como fuentes de carbono además del tartrato, incluyendo succinato, lactato, acetato, glucosa, glicerol, celulosa, y urea como fuente de nitrógeno en lugar de amonio. Describe las “bacterias del hierro”, que obtienen su energía de oxidar Fe(II). 1878. J. Lister produce el primer cultivo puro de Bacterium lactis de un fermento utilizado para obtener leche cultivada mediante el método de dilución, aislando una sola célula bacteriana mediante la ayuda del microscopio. 1877-1881: Robert Koch identifica al Bacillus anthracis como agente causal del ántrax. Obtiene cultivos puros del bacilo utilizando como medio de cultivo líquido ocular de buey suplementado con 10% gelatina. Identifica asimismo a la espora como forma diferenciada y resistente del bacilo. Su trabajo es rechazado por la comunidad médica y publicado en una revista de Botánica gracias a F. Cohn. Su reproducción posterior a la publicación confirma sus hallazgos y lo lleva a la fama. Postulados de Koch 1) El agente causal sospechado de una enfermedad debe ser encontrado en cada caso de la misma, 2) El agente causal debe poder ser aislado del enfermo, y cultivado en estado puro, libre de otros organismos, 3) Luego de la inoculación a un animal de experimentación, el agente causal sospechado debe reproducir la enfermedad, 4) El agente causal debe ser aislado del animal experimentalmente infectado. 1882. Fanny Eilshemius, esposa y asistente de W. Hesse en el instituto de Koch, introduce el agar-agar en lugar de la gelatina en los medios de cultivo. 1887. R. J. Petri, asistente de Koch, introduce el uso de la famosa cápsula. 1887-1890: Sergei Winogradsky descubre las “bacterias del azufre” (Beggiatoa, Thiotrix), que oxidan H2S produciendo azufre intracelular, definiendo la litotrofía. Estudia las bacterias nitrificantes y encuentra que estos litótrofos fijan CO2 para generar compuestos orgánicos, definiendo la quimioautotrofía: bacterias que obtienen su energía de la oxidación de compuestos inorgánicos (Fe(II), H2S, NH4+, NO2¯ ) y que además fijan CO2. 1886. U. Gayon (discípulo de Pasteur) y G. Dupetit reportan el aislamiento de cultivos puros de Bacillus denitrificans, los cuales reducen nitrato para generar nitrógeno. 1900. MacConkey y Hill proponen el agar glucosa peptonado con agregado de sales biliares para probar contaminación fecal en aguas. Las sales biliares inhiben el crecimiento de Grampositivos. Pronto reemplazan la glucosa por lactosa y agregan un indicador de pH (rojo neutro) para diferenciar Escherichia coli de Salmonella typhi, donde la primera forma colonias rojas por la gran producción de ácidos y la segunda no. 1902. Drigalski y Conradi, colaboradores de Koch, introducen el agregado de colorantes “antisépticos” Encuentran que el cristal violeta en muy pequeñas proporciones inhibe el crecimiento de Gram-positivos sin alterar el de E. coli. Asimismo desarrollan la famosa espátula para inocular medios sólidos con cultivos puros. (La composición del agar MacConkey hoy es: Peptona de caseína, 17 g; peptona de carne, 3 g; NaCl, 5 g; lactosa, 10 g; sales biliares, 1.5 g; rojo neutro 0.03 g; cristal violeta: 0.001 g; agaragar: 13.5 g, agua destilada csp 1000 ml). 1908. C. Eijkman describe como método que E. coli, pero no otras enterobacterias, producen gas de glucosa en medio de cultivo al ser incubadas a 46 ºC (luego se bajó a 44 ºC). El siglo XIX y principios del XX nos dejan los métodos modernos en microbiología, desarrollados por las Escuela Francesa (Pasteur), Alemana (R. Koch), los medios selectivos, enriquecidos y diferenciales (Beijerinck, Winogradsky, Würtz), los métodos de coloración (C. Gram). Se descubren los agentes microbianos causales de tuberculosis, cólera, difteria, tétanos, neumonía, meningitis, peste bubónica, sífilis, gonorrea, malaria, enfermedad del sueño, etc. Escuela de Delft: A.J. Kluyver, C.B. van Niel; Escuela de California: R. Stanier, R. Hungate, M. Doudoroff; Escuela de Kostanz: N. Pfenning. Fundación de compañías farmaceúticas-químicas dedicadas a la purificación de productos de plantas, síntesis de productos puros, y medios de cultivo estandarizados. Además, y muy importante: Desarrollo de la inmunología 1880: Pasteur experimenta la vacunación con B. anthracis, cólera, virus de la rabia. 1890: E. Behring, S. Kitasato reportan la producción y utilización de suero de animales inmunes para el tratamiento del tetános (agente causal: Clostridium tetani). 1891: Behring reporta la "antitoxina diftérica" (agente causal: Corynebacterium diphteriae, "el carnicero de los inocentes”), fabrica antisueros en caballos, y patenta el procedimiento. Los antisueros se producen masivamente a partir de 1892. Recibe en 1901 el Premio Nobel en Fisiología y Medicina. Desarrollo de la Quimioterapia y Antibioticoterapia 1874: W. Roberts (entre otros) describe propiedades antibacterianas de extractos de cultivos del hongo Penicillium glaucum 1910-1912: P. Ehrlich propone el concepto de las “balas mágicas”, hoy quimioterapia. Desarrolla los primeros agentes antisífilis: los organoarsenicales salvarsan y neosalvarsan (compuestos 606 y 914, por el número ensayado). "El éxito en ciencia se alcanza con paciencia, habilidad, dinero, y suerte". Nobel 1908 en Fisiología y Medicina. 1915-1927: El médico costarricense Clodomiro Clorito Picado Twight estudia la acción inhibitoria de los hongos del género Penicillium sobre el crecimiento de estafilococos y estreptococos. Aparentemente reporta su descubrimiento a la Academia de Ciencias de París. 1929: A. Fleming publica sus trabajos sobre la penicilina, producida por el hongo Penicillium notatum. 1935: Sulfonamidas: G. Domagk, trabajando para la compañía química L. Farbenindustrie, reporta el uso del Rojo de Prontosil para el tratamiento de septicemia estafilococcica y estreptococcica, el cual es introducido masivamente para el tratamiento sistemático de enfermedades bacterianas. Recibe en 1939 el Premio Nobel en Fisiología y Medicina. 1935: Tréfouël, Nitti, y Bouvet, del Instituto Pasteur, demuestran que el prontosil se transforma en sulfonamida en el cuerpo, y en 1940 D. Woods demuestra que la sulfonamida es un inhibidor competitivo del PABA para la dihidropteroato sintasa, inhibiendo así la síntesis de ácido fólico. (Nota: Ya en esta década se reporta resistencia bacteriana contra las sulfonamidas. Aún así, las mismas siguen utilizándose en el tratamiento de infecciones en humanos, en animales (cerdos), en piscicultura (salmónidos). 1940. H. Florey, E. Chain reportan el uso clínico de la penicilina en el tratamiento de la septicemia estafilococcica y estreptococcica. Junto con Fleming reciben el Nobel en Fisiología y Medicina en 1945. (Nota: El mismo año el grupo de Fleming reporta la presencia de enzimas bacterianas que inactivan a la penicilina). 1944: A. Schatz y S. Waksman descubren la estreptomicina, producida por Streptomyces griseus, un actinomiceto (bacteria Gram-positiva) aislado del suelo y lo utilizan para el tratamiento de Mycobacterium tuberculosis (TB, “La Gran Plaga Blanca”). (Nota: Durante el tratamiento a pacientes con TB aparecen cepas resistentes a estreptomicina). El término “antibiótico”, propuesto por Waksman, denota cualquier clase de molécula orgánica que inhibe o mata microbios interaccionando específicamente con blancos celulares microbianos. Así, tanto compuestos naturales como totalmente sintéticos pueden ser definidos como antibióticos. 1949. Dorothy Crowfoot Hodgkin determina la estructura de la penicilina mediante cristalografía de rayos X. 1950-1960: 96 antibióticos producidos por 57 especies de microbios, principalmente actinomicetos. Pero… Efectos ecológicos de la producción masiva de antimicrobianos, su utilización para el tratamiento de enfermedades y suplemento alimenticio de animales de consumo, y su vertido al medio ambiente. Desarrollo de la metodología del ADN recombinante 1928: F. Griffith descubre el "principio transformante" en el neumococo: La herencia puede aislarse físicamente de la célula 1944: O. Avery, C. McLeod, M. McCarty: el ADN es el principio transformante La herencia tiene bases químicas 1945: A. Hershey, S. Luria, M. Delbrück (Phage Group). Cold Spring Harbor. Nacimiento de la Biología Molecular. 1953: J. Watson, F. Crick: estructura del ADN La Doble Helice, el Dogma Central 1965. Linus Pauling, Premio Nobel 1954, y Emile Zuckerkandl, determinan la secuencia de aminoácidos de la hemoglobina, y postulan que el índice de divergencia entre dos secuencias de aminoácidos de una proteína que cumple la misma función en distintos organismos (o de su gen) es constante en el transcurso de la evolución. Concepto de cronómetros moleculares. 1970: Teoría neutralista de Kimura. 1970: C. Woese. El RNA ribosomal como cronómetro universal. El Gran Árbol de la Vida. Tres dominios: Eucaria, Arquea, Bacteria. 1972: P. Berg produce ADN recombinante Genes individuales pueden “clonarse” en E. coli 1973: S. Cohen, H. Boyer: primera biblioteca de genes Podemos conservar TODO el genoma de un organismo en forma de clones separados formando una “Biblioteca” de genes 1983: J. Gusella: marcador genético de enfermedades Podemos asociar enfermedades genéticas a una región del ADN 1983: K. Mullis: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Podemos “amplificar” fragmentos particulares de ADN 1990: El Proyecto Genoma Humano (HuGO), estimado completo en 2005 Podemos conocer la secuencia completa de cualquier genoma 1995: Primer Genoma completo de una bacteria: Haemophilus influenzae (2 Mb) 1996: Primer Genoma completo de un microbio eucariota unicelular: Saccharomyces cerevisiae (12 Mb) 1998: Primer Genoma completo de un eucariote pluricelular: Caenorhabditis elegans (97 Mb) 2000: Genoma completo de la mosca de la fruta: Drosophila melanogaster (180 Mb) 2000: Secuencia completa de los cromosomas 21 y 22 humanos 2000: Secuencia completa del genoma de una planta: Arabidopsis thaliana (110 Mb) 2001: Secuencia completa de un genoma humano: Homo sapiens (3400 Mb) 2002: Secuencia completa del genoma de arroz; Oriza sativa (5000 Mb) 2005: >150 genomas procariotas completos 2010: Desarrollo de metodologías de secuenciación rápida de genomas. Metagenómica 2012: Genomas de animales: rata, perro, chimpancé, cerdo, pollo, etc. Genomas de plantas: Medicago truncatula, Populus trichocarpa, Zea mays, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum, Glycine max, Lotus japonicus, etc. 2015-2017: miles de genomas procariotas casi completos, muchos “cerrados”.