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EVALUACIÓN DE SUSTRATOS FLUORIMÉTRICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEASAS
DIGESTIVAS EN LARVAS DE PECES MARINOS
Cara, J.B.; Moyano, F.J. & Alarcón, F.J.
Dpto. Biología Aplicada. Escuela Politécnica Superior. Universidad de Almería. 04120. Almería
Resumen
Se han evaluado dos tipos diferentes de sustratos fluorescentes (derivados de la metilcumarina y de la
rodamina), utilizables para la cuantificación de la actividad proteasa a partir de muestras biológicas muy
pequeñas, concretamente, larvas de peces marinos. Los experimentos realizados para determinar su
especificidad, sensibilidad y aplicabilidad muestran grandes similitudes entre ambos, así como un
potencial muy interesante para su utilización con dicho material biológico.
Justificación
El desarrollo de la función digestiva durante la etapa larvaria es uno de los aspectos claves que
condicionan la velocidad y calidad del desarrollo en peces marinos. Los estudios sobre la ontogenia de las
principales actividades (proteasa, lipasa, amilasa) son últimamente muy numerosos, pero se enfrentan
con un problema importante desde el punto de vista metodológico, dado que el empleo de los sustratos
tradicionales requiere de una cantidad de biomasa relativamente elevada, lo que limita la posibilidad de
realizar determinaciones en un número significativo de réplicas cuando se trata de muestras obtenidas de
las primeras etapas larvarias o de especies escasas y valiosas. Para soslayar el anterior inconveniente
resultan de gran utilidad los sustratos fluorimétricos, los cuales poseen en principio mucha mayor
sensibilidad. En este sentido, nuestro grupo, que ya posee una amplia experiencia en el estudio de la
bioquímica digestiva de peces marinos, ha considerado el interés de evaluar las características de
algunos de estos sustratos comerciales desde la triple perspectiva de su especificidad, sensibilidad y
aplicabilidad real al estudio de la actividad proteasa durante las etapas larvarias en organismos marinos.
Material y Métodos
Se han planteado diferentes ensayos para evaluar sustratos específicos fabricados por dos casas
comerciales para medir actividades tripsina y quimotripsina, según se detalla en la siguiente tabla:
Tipo de sustrato
Derivados de la metilcumarina
(SIGMA Chemicals)
Derivados de la rodamina
(Molecular Probes)
tripsina
N-t-Boc-Gln-Ala-Arg
7 amido-4 metilcumarina
(B-4153)
Bis-(CBZ-Ala-Arg amida)
(R6508)
quimotripsina
N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe
7 amido-4 metilcumarina
(S-9761)
Bis-(succinil-Ala-Ala-Pro-Phe)
(R22123)
Los ensayos se orientaron a evaluar:
Especificidad: Es decir, la capacidad de los sustratos de medir sólo la actividad que se pretende evaluar
y no otras similares. En este caso se evaluó la posibilidad de medir separadamente las actividades de
tripsina y quimotripsina empleando para ello los correspondientes sustratos. Para ello se prepararon
diluciones con tripsina de bacalao (SIGMA, Ref. T-9906) y quimotripsina porcina (SIGMA, Ref. G-4129) y
se emplearon para hacer dos tipos de ensayos: a) con inhibidores específicos de cada actividad y b)
cruzando los sustratos, según el siguiente diseño:
a.1. Medición de actividad tripsina con sustrato específico; comparación de medida después de añadir a la
mezcla de reacción un inhibidor específico de tripsina (TLCK a 200 µM).
a.2. Medición de actividad quimotripsina con sustrato específico; comparación de medida después de
añadir a la mezcla de reacción una mezcla de inhibidores específicos de quimotripsina (TPCK + ZPCK a
100µM y 200 µM, respectivamente)
b.1. Medición de actividad tripsina empleando el sustrato de la quimotripsina y viceversa.
Sensibilidad; Se evaluó el límite de detección de la actividad a ensayar empleando ambos sustratos
comerciales sobre un extracto progresivamente diluido preparado a partir de tripsina comercial de bacalao
(5200 Unidades BAEE/mg).
Aplicabilidad; Se evaluó la capacidad real de utilizar los sustratos indicados para medir la actividad de
tripsina en las condiciones óptimas de pH que muestra dicha enzima en peces (8.0-9.0), empleando para
ello el extracto obtenido a partir de una sola larva de dorada (Sparus aurata) de 4 días de edad (peso
seco: 30 µg). Los ensayos se llevaron a cabo en tampón fosfato (pH 8.0 y 50 mM), empleando el sustrato
a 1µM.
Resultados y Discusión
Se demostró la total especificidad de los sustratos correspondientes a cada actividad enzimática, ya que,
mientras en condiciones adecuadas (cada enzima ensayada con su sustrato) se obtuvieron medidas
homogéneas y repetibles, el resultado fue nulo cuando se inactivaron las enzimas mediante el uso de
inhibidores específicos, o bien cuando se cruzaron los sustratos, ensayando cada actividad con el
sustrato diseñado para otra.
El límite de sensibilidad para ambos tipos de sustrato encontrado al ensayar preparaciones
progresivamente diluidas de tripsina de bacalao fue de 1 mU/ml. Esta actividad es imposible de detectar
por el método tradicional de espectrometría de absorción molecular (considérese que 1 U equivale a un ∆
D.O. 0.001/min a 253 nm). La diferencia entre los dos tipos de sustrato fue una capacidad de resolución
unas 3 veces mayor para el derivado de rodamina.
Basándose en el resultado anterior, se utilizó el compuesto basado en rodamina para medir la actividad
tripsina presente en una única larva de dorada; las mediciones obtenidas entraron dentro del rango de
sensibilidad previamente determinado (2,5 mU/ml) y se obtuvo una buena repetitividad entre réplicas.
Se puede concluir que, aunque ambos tipos de sustrato reúnen las condiciones requeridas para la
determinación de las actividades de proteasas digestivas alcalinas en larvas de peces, los derivados de la
molécula de rodamina ofrecen una gran especificidad y precisión incluso al emplear cantidades de
muestra muy pequeñas.