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Universidad Nacional de San Martín Instituto de Investigaciones Biotecnológicas-INTECH-CONICET La familia de las proteínas proteolipídicas: estrés crónico y plasticidad neuronal Lic. María Eugenia Fernández Director: Dr. Alberto Carlos C. Frasch Tesis para optar al título de Doctora en Biología Molecular y Biotecnología Octubre de 2008 Resumen RESUMEN La exposición crónica al estrés puede afectar severamente el funcionamiento del sistema nervioso confiriendo, además, susceptibilidad a enfermedades psiquiátricas tales como la depresión. El hipocampo es una estructura cerebral con una gran plasticidad neuronal que resulta particularmente sensible al estrés. En distintos modelos animales se ha visto que el estrés crónico produce alteraciones morfológicas en el hipocampo que incluyen la retracción de las dendritas apicales de las neuronas de la zona CA3 así como la reorganización de las terminales de las fibras musgosas. Además, el estrés crónico produce la retracción de espinas y la pérdida de sinapsis en las neuronas de la zona CA3. Resulta interesante destacar que el tratamiento con antidepresivos revierte los efectos del estrés sobre el hipocampo. Los mecanismos moleculares involucrados en las alteraciones estructurales encontradas en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico así como los procesos implicados en la acción terapéutica de los antidepresivos no han sido aún identificados. Estudios previos de nuestro laboratorio revelaron que la expresión de la glicoproteína de membrana 6a (M6a) en el hipocampo se encuentra modulada por la exposición al estrés crónico y el tratamiento con antidepresivos. Por lo tanto, el primer objetivo del presente trabajo de tesis consistió en caracterizar funcionalmente a M6a. Mediante ensayos de ganancia y pérdida de función en cultivos primarios de neuronas de hipocampo, se determinó que M6a juega un rol clave en la extensión de neuritas y en la formación de filopodios/espinas pudiendo estar, además, involucrada en el establecimiento de sinapsis. Además, se estableció que la capacidad de M6a de inducir la formación de filopodios no se encuentra restringida a cultivos primarios de neuronas de hipocampo, sino que se extiende a líneas neuronales como neuroblastoma 2a (N2a) y feocromocitoma 12 (PC12), y no neuronales como COS-7. M6a pertenece a la familia de las proteínas proteolipídicas (PLPs). En mamíferos, esta familia está integrada por M6a, la glicoproteína de membrana 6b (M6b), PLP y su variante de splicing DM20. Al analizar los otros miembros de la familia de las PLPs, se determinó que la expresión de la glicoproteína de membrana 6b (M6b) y DM20 en el hipocampo también se encuentra regulada por la exposición al estrés crónico por confinamiento en ratones. Asimismo, se vio que M6b y DM20 comparten con M6a la capacidad de inducir la formación de filopodios en cultivos primarios de neuronas hipocampales y en células N2a y COS-7. Por el contrario, la expresión de PLP no se encontró 1 Resumen afectada en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico. Además, la sobreexpresión de esta proteína no induce la formación de filopodios en cultivos primarios de neuronas de hipocampo. Dado que la expresión de M6a se encuentra regulada por el estrés crónico y los antidepresivos, y debido a su rol en plasticidad sináptica, el gen que codifica para la proteína M6a (GPM6A) representa un candidato a tener en cuenta en relación a neuropatologías tales como la depresión. Es por ello que durante esta tesis inició el estudio de polimorfismos en el gen GPM6A en muestras de pacientes con depresión. Los resultados descriptos en esta tesis sugieren que la disminución en la expresión de M6a y M6b podría ser, en parte, responsable de las alteraciones estructurales encontradas en el hipocampo de animales sometidos estrés crónico y que las proteínas proteolipídicas deberían ser consideradas en enfermedades relacionadas al estrés tales como la depresión. 2 Summary SUMMARY Prolonged exposure to stressful situations can bring severe consequences for the brain, conferring susceptibility to certain psychiatric disorders such as depression. The hippocampal formation, which possesses a remarkable degree of plasticity, is particularly sensitive to stress. Morphological alterations have been described in the hippocampus of different animal models of chronic stress which include a reduction of apical dendritic branching and total dendritic length in CA3 pyramidal neurons, as well as reorganization within the mossy fiber terminals. Chronic stress has been also found to induce retraction of thorny excrescences and loss of synapses in CA3 neurons. It is worth noting that antidepressant treatment can prevent most of the described stress effects. The molecular pathways underlying the plastic alteration found in the hippocampus of chronically stressed animals as well as the mechanisms involved in the therapeutic effect of antidepressants remain largely unknown. Previous studies in our lab revealed that the expression of membrane glycoprotein 6a (M6a) in the hippocampus is modulated by chronic stress and antidepressant treatment. Therefore, the first aim of the present work was to study possible biological functions for M6a. Through gain and loss of function approaches in cultured hippocampal neurons, we found that M6a is a key modulator for neurite outgrowth and filopodium/spine formation and it may also be involved in the establishment of synapses. In addition, the capacity of M6a to induce filopodium formation was not confined to primary cultures of hippocampal neurons but was conserved in neuronal (N2a and PC12) and non-neuronal (COS-7) cell lines. M6a belongs to the family of proteolipid proteins. In mammals, other members of this family include membrane glycoprotein 6b (M6b), PLP and its splice variant DM20. Then, we analyzed other members of the proteolipid protein family we found that the expression of membrane glycoprotein 6b (M6b) and DM20 in the hippocampus is also regulated by chronic restraint stress in mice. In addition, we showed that M6b and DM20 can also induce filopodium formation in hippocampal neurons, N2a and COS-7 cells. On the other hand, PLP expression was not found to be altered in the hippocampus of chronically stressed animals. Moreover, PLP overexpression does not induce filopodium formation in hippocampal neurons. Given M6a expression regulation by chronic stress and antidepressants, and due to its role in neuroplasticity, the gene coding for M6a (GPM6A) represents a candidate to be taken into account in neuropathologies such as depression. For this reason, in this work we 3 Summary also started analyzing polymorphisms in GPM6A in samples of patients suffering from depression. Our results reveal that the down-regulation in the expression of M6a and M6b may be in part responsible for the plastic alterations found in the hippocampus of chronically stressed animals and that proteolipid proteins should be considered in stress related disorders such as depression. 4 Publicaciones PUBLICACIONES Parte de los resultados obtenidos en esta tesis han sido incluidos en los siguientes artículos: • “The stress-regulated protein M6a is a key modulator for neurite outgrowth and filopodium/spine formation”. J. Alfonso*, ME. Fernández*, B. Cooper, G. Flugge, AC. Frasch. Proc Natl Acad Sci USA 2005 Nov 22; 102(47):17196-201. • “Conserved cellular function and stress-mediated regulation among members of the proteolipid protein family”. ME. Fernández, J. Alfonso, AC. Frasch. Manuscrito en preparación. *Contribución ecuánime 5 Abreviaturas ABREVIATURAS ACTH: hormona corticotrópica ADN: ácido desoxirribonucleico ADNc: ácido desoxirribonucleico copia ARN: ácido ribonucleico ARNm: ARN mensajero BDNF: factor neurotrófico derivado del cerebro CA: Cornu Ammonis CDS: región codificante CK2: proteína quinasa CK2 CRF: factor liberador de la corticotrofina GFP: proteína verde fluorescente HPA: eje hipotalámico-pituitario-adrenal LTD: depresión a largo plazo LTP: potenciación a largo plazo M6a: glicoproteína de membrana 6a M6b: glicoproteína de membrana 6b N2a: neuroblastoma 2a PCR: reacción en cadena de la polimerasa PLP: proteína proteolipídica PC12: feocromocitoma 12 PKC: proteína quinasa C PVN: núcleo paraventricular del hipotálamo RT: retrotranscripción SEM: error estándar de la media SNC: sistema nervioso central TM: transmembrana 6 Índice ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 10 1.1 El estrés crónico 10 1.2 Modelos animales de estrés crónico 13 1.3 Efectos del estrés crónico sobre el hipocampo 14 1.4 Genes regulados por el estrés y los antidepresivos 18 1.5 La glicoproteína de membrana 6 (M6a) y la familia de las proteínas proteolipídicas (PLPs) 19 1.6 Plasticidad neuronal 21 2. OBJETIVOS 26 3. RESULTADOS 27 3.1 ESTUDIO FUNCIONAL DE LA GLICOPROTEÍNA M6a CUYA EXPRESIÓN EN EL HIPOCAMPO ES REGULADA POR EL ESTRÉS 27 3.1.1 Localización de la proteína M6a en cultivos primarios de neuronas de hipocampo 27 3.1.2 La sobreexpresión de M6a induce la formación de neuritas y de filopodios/espinas 29 3.1.3 La reducción en los niveles de M6a produce una disminución en la densidad de filopodios/espinas y en el número de puntos de sinaptofisina 3.1.4 Efectos de la sobreexpresión de M6a en líneas neuronales y no neuronales 33 36 3.1.5 La localización de M6a no depende de la integridad del citoesqueleto de actina 39 3.1.6 La formación de filopodios inducida por M6a no estaría mediada por proteínas GTPasas de la familia Rho 40 3.1.7 La palmitoilación y la fosforilación en los loops extracelulares de M6a no serían necesarias para su función en la formación de filopodios 41 7 Índice 3.2 LA FAMILIA DE LAS PROTEÍNAS PROTEOLIPÍDICAS: REGULACIÓN POR EL ESTRÉS CRÓNICO Y ROL EN LA FORMACIÓN DE FILOPODIOS 45 3.2.1 Homología entre los miembros de la familia de las PLPs 45 3.2.2 Efectos del estrés crónico sobre la expresión de los miembros de la familia de las PLPs 46 3.2.3 Isoformas de M6b 48 3.2.4 Clonado y expresión de isoformas de M6b y PLP 50 3.2.5 M6b y DM20 inducen la formación de filopodios en cultivos primarios de neuronas de hipocampo y en líneas celulares 3.3 53 ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN EL GEN QUE CODIFICA PARA LA PROTEÍNA M6a (GPM6A) EN PACIENTES CON DEPRESIÓN 4. DISCUSIÓN 59 61 4.1 M6a y M6b podrían estar involucradas en el remodelado neuronal observado en el hipocampo de animales estresados crónicamente 62 4.2 Evolución y homología funcional entre los miembros de la familia de las proteínas proteolipídicas 64 4.3 Mecanismos que subyacerían la formación de filopodios mediada por las proteínas proteolipídicas 66 4.4 M6a y la acción terapéutica de los antidepresivos 69 4.5 Polimorfismo en GPM6A asociado a síntomas de depresión 70 5. CONCLUSIONES GENERALES 73 6. PERSPECTIVAS FUTURAS 74 7. MATERIALES Y MÉTODOS 76 7.1 Cultivos celulares 76 7.2 Ensayos de inmunocitoquímica 76 7.3 Ensayos de despolimerización de la F-actina, marcación de las membranas celulares e identificación de las células viables 7.4 Construcción de los plásmidos utilizados en las transfecciones 77 77 8 Índice 7.5 ARN de interferencia 79 7.6 Transfección de los plásmidos y el ARN de interferencia 79 7.7 Cuantificación de células, procesos neuronales y puntos de sinaptofisina 79 7.8 Ensayos de activación de GTPasas 82 7.9 Tratamiento de estrés 83 7.10 Disección de los hipocampos y extracción del ARN total 83 7.11 Purificación del ARN mensajero poli A+ y síntesis del ADN copia 84 7.12 Ensayos de PCR en tiempo real 84 7.13 Análisis de polimorfismos en el gen GPM6A en pacientes con depresión 86 8. REFERENCIAS 88 AGRADECIMIENTOS 100 9 Introducción 1. INTRODUCCIÓN 1.1 El estrés crónico El estrés puede definirse como el estado en el que un organismo percibe comprometida su homeostasis. Se entiende, entonces, que la amenaza puede ser o no real y que la percepción del individuo juega un rol preponderante en la determinación del estado de estrés. Para que una situación sea considerada estresante, el individuo debe percibirla como alarmante, fuera de lo común y nociva u hostil (Kim et al. 2002). La respuesta al estrés involucra la activación de los sistemas endócrino, nervioso e inmune. Así, se producen cambios comportamentales y fisiológicos que aumentan la probabilidad del individuo de adaptarse a la situación estresante de modo tal de alcanzar nuevamente la homeostasis. Los cambios comportamentales incluyen mayor atención y euforia mientras que dentro de las alteraciones fisiológicas se distinguen el aumento en el tono cardiovascular y el ritmo respiratorio; y la supresión de los procesos de digestión, crecimiento, reproducción e inmunidad (Smith et al. 2006). La percepción del estrés y la respuesta al mismo representan una ventaja para el individuo ya que le permiten adaptarse a una situación dada. Sin embargo, la exposición a situaciones de estrés severas o prolongadas en el tiempo puede resultar dañina para el organismo. En el humano y en otros mamíferos, la activación prolongada de la respuesta al estrés produce hipertrofia adrenal, atrofia del timo y nódulos linfáticos, supresión del sistema inmune y ulceraciones (Sorrells et al. 2007). Además, el estrés crónico o severo produce daños en estructuras del sistema nervioso central como el hipocampo, la amígdala y la corteza prefrontal, con la consecuente alteración en los procesos de aprendizaje y memoria (de Kloet et al. 2005). Se cree que los efectos nocivos de la respuesta al estrés son el resultado de una desregulación de los sistemas hormonales y neuronales activados durante la misma. En los mamíferos, el eje hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA) es el principal sistema involucrado en la respuesta al estrés. Este sistema neuroendócrino -posee componentes tanto neuronales como hormonales- se encuentra representado en la figura 1. Ante la percepción de una situación de estrés, las neuronas del núcleo paraventricular (PVN) del hipotálamo sintetizan y secretan el factor liberador de la corticotrofina (CRF). Al unirse a su receptor en la adenohipófisis, el CRF induce la liberación de la hormona corticotrópica (ACTH) al sistema circulatorio la cual actúa principalmente sobre las glándulas adrenales, 10 Introducción estimulando la liberación de glucocorticoides (Smith et al. 2006). Los glucocorticoides (cortisol en humanos y corticosterona en roedores) son hormonas esteroideas que median las respuestas cardiovascular y metabólica al estrés, caracterizadas por un incremento en la presión arterial y en el ritmo cardíaco, y un aumento en la concentración de glucosa en sangre, alcanzado por medio de una movilización desde los sitios de reserva y una supresión de actividades anabólicas, lo que representa una mayor disposición de energía (Sapolsky et al. 2000). De este modo, la activación del eje HPA ante un estado de estrés le permite al individuo adaptarse a la nueva situación. Sin embargo, la hiperactivación de este sistema puede resultar perjudicial para la salud del individuo por lo que éste se encuentra finamente regulado. Se cree que la desregulación del eje HPA es responsable de los efectos nocivos de la exposición prolongada a situaciones de estrés. Hipocampo Hipocampo Amígdala Hipófisis Glucocorticoides Corteza adrenal Figura 1. Eje hipotalámico-pituitario-adrenal. Las neuronas del núcleo paraventricular (PVN) del hipotálamo integran la información relevante al estrés mediante conexiones con la amígdala y el hipocampo, que representan aferentes excitatorios e inhibitorios respectivamente. Estas neuronas secretan el factor liberador de la corticotrofina (CRF), el cual es transportado a través de los capilares del sistema circulatorio hacia la hipófisis. Las células corticotróficas de la adenohipófisis liberan adenocorticotrofina (ACTH) al torrente sanguíneo que al alcanzar la corteza de las glándulas suprarrenales, estimula la secreción de glucocorticoides. Además de otras numerosas funciones, los glucocorticoides inhiben la síntesis y liberación de CRF y ACTH, regulando su propia liberación. Niveles muy altos de glucocorticoides pueden resultar dañinos para las neuronas del hipocampo, interfiriendo con el sistema de inhibición sobre el hipotálamo, produciéndose así un estado de hipercortisolemia. Adaptado de Nestler et.al., 2002. 11 Introducción El eje HPA se encuentra regulado tanto a nivel endócrino como a nivel neuronal. En cuanto a la regulación endócrina, niveles elevados de glucocorticoides inhiben la actividad del sistema actuando sobre el hipotálamo y la hipófisis en un clásico modelo de retroalimentación negativa. A nivel neuronal, la actividad del eje HPA se encuentra regulada por distintos circuitos neuronales: proyecciones aferentes del hipocampo inhiben la liberación de CRF en el PVN mientras que las inervaciones de la amígdala la estimulan (Smith et al. 2006). La hiperactividad del eje HPA es un hallazgo frecuente en animales sometidos a estrés crónico y en pacientes con depresión (Watanabe et al. 1992; Holsboer 2001; van Kampen et al. 2002; de Kloet et al. 2005). Se cree que el hipocampo juega un rol preponderante en la desregulación de este sistema. Se ha demostrado que altos niveles de glucocorticoides pueden causar daños en las neuronas del hipocampo, lo que reduciría la inhibición que el hipocampo ejerce sobre el eje HPA. De este modo, se incrementarían los niveles de glucocorticoides, lo que aumentaría el daño en el hipocampo conformándose un circuito patológico de retroalimentación positiva (Nestler et al. 2002). Varios estudios han demostrado una relación causal entre la exposición a situaciones de estrés y el desarrollo de la depresión (Kessler 1997; Kendler et al. 1999; Paykel 2001). La depresión es un trastorno del estado anímico en el cual los sentimientos de tristeza, pérdida, ira o frustración interfieren con la vida diaria durante un período prolongado. Conocida en sus inicios con el nombre de melancolía, término empleado por Hipócrates alrededor de 400 años AC, los síntomas de la depresión aparecen descriptos en numerosos tratados médicos de la antigua Grecia (Nestler et al. 2002). En la actualidad, 121 millones de personas sufren de depresión mayor y esta enfermedad se ha convertido en la principal causa de discapacidad a nivel mundial. Además, debido a la alta incidencia de suicidios en los enfermos, se estima que para el año 2020 la depresión ocupe el segundo lugar, detrás de las enfermedades cardiovasculares, en el índice DALY (del inglés Disability Adsusted Life Years) que mide los años de vida saludables perdidos por muerte prematura o discapacidad (http://www.who.int/mental_health/management/depression/definition/en/). Los tratamientos para la depresión incluyen la administración de medicamentos antidepresivos, la psicoterapia y/o la terapia electroconvulsiva. En los últimos años se han producido pequeños avances en los tratamientos para esta enfermedad, especialmente debido a la disminución de efectos secundarios de los medicamentos de segunda 12 Introducción generación. Sin embargo, los tratamientos distan de ser satisfactorios: apenas el 50 % de los pacientes tratados con antidepresivos, solamente o en conjunto con psicoterapias, muestran remisión total a la enfermedad (Berton et al. 2006). La falta de tratamientos adecuados se debe al desconocimiento de los procesos neurobiológicos que subyacen la depresión así como a la ignorancia de los mecanismos responsables de los efectos terapéuticos de las drogas antidepresivas. Además de los factores ambientales, tales como la exposición al estrés, el origen de la depresión presenta un componente genético (Fava et al. 2000). A pesar de los grandes esfuerzos realizados, todavía no se han identificado las bases genéticas de la enfermedad. La dificultad radicaría, al igual que para otras enfermedades complejas como la esquizofrenia, en la participación de varios genes en la etiología de este trastorno (Burmeister 1999). 1.2 Modelos animales de estrés crónico Dada la relación causal encontrada entre la exposición al estrés y el desarrollo de la depresión en humanos (Kessler 1997; Kendler et al. 1999; Paykel 2001), varios modelos animales de estrés crónico han sido desarrollados. Dos modelos de estrés crónico ampliamente utilizados son el de estrés psicosocial en Tupaia belangeri, comúnmente conocida como musaraña arborícola (van Kampen et al. 2002) y el de estrés por confinamiento en roedores (Watanabe et al. 1992). Los individuos machos de la especie T. belangeri, que filogenéticamente se encuentra entre los insectívoros y los primates, poseen un fuerte instinto de territorialidad. Esta característica es utilizada en el modelo de estrés psicosocial para establecer una relación conflictiva entre dos individuos de la especie. El diseño experimental consiste en la habituación de dos machos, uno naive y otro socialmente experimentado, cada uno a un espacio dentro de una misma jaula dividida por una superficie opaca que no permite la visualización entre los mismos. Luego, la superficie divisoria es retirada y se produce una competencia por el control del nuevo territorio ampliado, estableciéndose naturalmente una relación de dominancia y subordinación entre los individuos. Los animales naive resultan ser siempre los subordinados. Una vez establecida la dominancia, la jaula se divide nuevamente con una malla metálica que permite la visualización entre los mismos. La malla metálica es removida diariamente, durante tres o cuatro semanas, por un período de sólo noventa minutos de forma tal de permitir el contacto físico entre los animales. De este modo, el animal subordinado es protegido de reiterados ataques, sin embargo, al encontrarse 13 Introducción constantemente expuesto a claves olfativas, visuales y auditivas del individuo dominante, despliega un comportamiento típico de subordinación (van Kampen et al. 2002). La validez del modelo de estrés psicosocial crónico en T. belangeri como modelo de depresión se encuentra asociada a dos características fundamentales. En primer lugar, los síntomas que presentan los individuos subordinados son similares a los que presentan los pacientes con depresión, destacándose entre ellos la pérdida de peso y apetito, disturbios en el sueño, y la reducción en la locomoción y el aseo. Además, se observa una alta concentración de cortisol en sangre indicativo de una desregulación del eje HPA. Sin embargo, cabe mencionar que los síntomas clave en el diagnóstico de la depresión, como el estado de ánimo deprimido, la pérdida del interés o los pensamientos recurrentes de muerte no son evaluables en modelos animales. En segundo lugar, el tratamiento con antidepresivos como la clomipramina revierte los síntomas observados en los animales estresados (van Kampen et al. 2002). Otro modelo de estrés crónico frecuentemente utilizado es el de inmovilización en roedores. El procedimiento, que se aplica tanto en ratones como en ratas, consiste en la inmovilización diaria del animal por confinamiento en tubos de plástico aireados por períodos de entre cuatro y seis horas durante un lapso de tres semanas. Se ha demostrado que este tratamiento produce una disminución en la ganancia de peso, un aumento en el peso de las glándulas adrenales indicativo de hipertrofia adrenal y un incremento en la concentración de corticosterona en sangre que indica la desregulación del eje HPA (Watanabe et al. 1992). 1.3 Efectos del estrés crónico sobre el hipocampo El hipocampo es una de las estructuras cerebrales más afectadas en animales sometidos a estrés crónico. La formación hipocampal juega un rol clave en la memoria declarativa y en el proceso de aprendizaje (Manns et al. 2006) por lo que se cree que las alteraciones encontradas en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico serían responsables de los problemas cognitivos que presentan los mismos (McEwen 2004). La formación hipocampal se encuentra en el lóbulo temporal medio y conforma el sistema límbico. Las neuronas del hipocampo se encuentran particularmente alineadas por lo que se pueden distinguir capas compuestas predominantemente por dendritas apicales, somas celulares, dendritas basales y axones. La formación hipocampal se encuentra dividida en regiones, denominadas las zonas Cornu Ammonis CA1-CA4, el giro dentado y el 14 Introducción subiculum. Como se muestra en la figura 2, la información fluye en el hipocampo desde el giro dentado, a través de las zonas CA3 y CA1, hacia el subiculum. La entrada de información se produce principalmente a través de la vía perforante compuesta por axones provenientes de la corteza entorrinal que atraviesan el subiculum y llegan hasta las células granulares del giro dentado donde establecen contacto sináptico. Los axones de las neuronas del giro dentado conforman las fibras musgosas haciendo sinapsis con las neuronas piramidales de la zona CA3. La información luego fluye hacia las neuronas piramidales de la zona CA1 a través de las fibras colaterales de Schaffer. Los axones de las neuronas de la zona CA1 proyectan hacia el subiculum y la corteza entorrinal constituyendo la principal vía de salida de información del hipocampo. Neuronas piramidales de la CA1 Fibras colaterales de Schaffer Neuronas piramidales de la CA3 Axones de las neuronas de la CA1 (hacia subiculum y corteza entorrinal) CA1 CA3 GD Fibras musgosas Vía perforante (axones de la corteza entorrinal) Neuronas granulares del giro dentado Figura 2. Vías sinápticas del hipocampo. La información ingresa al hipocampo a través de la vía perforante, que se origina en la corteza entorrinal y pasa por el subiculum hasta llegar a las células granulares del giro dentado (GD). Los axones de estas células proyectan hacia las dendritas de las neuronas piramidales de la zona CA3, constituyendo la vía de las fibras musgosas. Las neuronas de la zona CA3 envían colaterales excitatorios a las neuronas piramidales de la zona CA1, formando la vía de las fibras colaterales de Schaffer. Finalmente, axones de las neuronas de la zona CA1 proyectan al subiculum y las capas profundas de la corteza entorrinal, en la principal vía de salida de información del hipocampo. Existen vías secundarias de entrada y salida de información del hipocampo que no se encuentran representadas. 15 Introducción El hipocampo posee una gran plasticidad neuronal, entendiéndose por ésta la capacidad que tiene el sistema nervioso de remodelar los contactos entre neuronas y la eficiencia de sus sinapsis. Entre las bases celulares de la plasticidad neuronal en el hipocampo adulto, se encuentran los cambios en la eficiencia de las conexiones sinápticas, la formación de nuevas sinapsis así como también la eliminación de sinapsis preexistentes y la generación de nuevas neuronas (proceso conocido como neurogénesis). Estos mecanismos subyacen los procesos de aprendizaje y memoria, siendo la plasticidad neuronal de vital importancia para que el organismo responda a constantes cambios en el ambiente (McClung et al. 2008). Sin embargo, la neuroplasticidad no siempre resulta beneficiosa ya que alteraciones estructurales observadas en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico, así como en pacientes con depresión, han sido asociadas con problemas cognitivos (McEwen 2004). Entre las alteraciones más frecuentemente observadas en el hipocampo de animales estresados crónicamente se encuentra la reducción en el largo y en la ramificación de las dendritas apicales de las neuronas piramidales de la zona CA3. Este fenómeno ha sido observado tanto en individuos de la especie T. belangeri sometidos a estrés psicosocial como en ratas estresadas por inmovilización (Watanabe et al. 1992; Magarinos et al. 1996). Resulta interesante destacar que el tratamiento con drogas antidepresivas como la tianeptina previene las modificaciones estructurales mencionadas en ambos modelos animales (Watanabe et al. 1992; Magarinos et al. 1999). Otros estudios de estrés crónico en roedores revelan, además, la retracción de estructuras tipo espinas y una disminución en el número de sinapsis en la zona CA3 del hipocampo (Sousa et al. 2000; Sandi et al. 2003; Stewart et al. 2005). También se ha descripto una reorganización en las terminales de las fibras musgosas caracterizada por una reducción en su superficie y en el número de contactos sinápticos con las neuronas piramidales de la zona CA3 en el hipocampo de ratas estresadas crónicamente (Magarinos et al. 1997; Sousa et al. 2000). La neurogénesis en el giro dentado del hipocampo también se encuentra modulada por la exposición crónica al estrés y el tratamiento con antidepresivos. El estrés crónico suprime la proliferación y supervivencia de nuevas neuronas granulares en el hipocampo ratas y de machos adultos de la especie T. belangeri (Gould et al. 1997; Pham et al. 2003; Duman 2004; Heine et al. 2004). En contraste, la administración de drogas antidepresivas aumenta la neurogénesis en animales no estresados (Malberg et al. 2000; Manev et al. 2001) 16 Introducción y revierte el efecto inhibitorio observado en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico (Czeh et al. 2001). Las alteraciones observadas en el hipocampo de animales estresados crónicamente, como la retracción dendrítica y la inhibición de la neurogénesis, podrían explicar la reducción en el volumen de la formación hipocampal encontrada en individuos de la especie T. belangeri sometidos a estrés psicosocial (Ohl et al. 2000). Además, la disminución en el volumen del hipocampo observada en pacientes con depresión, la cual ha sido asociada a problemas cognitivos (MacQueen et al. 2003), también podría responder a modificaciones estructurales como las mencionadas. Se cree que las alteraciones plásticas encontradas en el hipocampo de animales estresados crónicamente son consecuencia de los elevados niveles de glucocorticoides. Diversos estudios han demostrado que la simple administración de corticosterona induce la retracción de las dendritas apicales de las neuronas piramidales de la zona CA3 e inhibe la neurogénesis en el giro dentado del hipocampo de rata (Woolley et al. 1990; Cameron et al. 1994; Magarinos et al. 1995). El hipocampo posee una alta densidad de receptores para glucocorticoides, motivo por el cual esta estructura resultaría particularmente sensible a la acción de los mismos. Se han descripto dos tipos de receptores para estas hormonas esteroideas, los cuales colocalizan en la formación hipocampal. Los receptores de tipo I o de mineralocorticoides son de alta afinidad mientras que los receptores de tipo II o de glucocorticoides son de baja afinidad. Los receptores de glucocorticoides, siendo de baja afinidad, son ocupados por las hormonas esteroideas solamente ante una alta concentración de las mismas. Por este motivo, se cree que los receptores de tipo II mediarían los efectos provocados por altos niveles de glucocorticoides. Ambos tipos de receptores poseen una localización citoplasmática, activándose y translocándose al núcleo ante la unión de sus ligandos. En el núcleo, los complejos hormona-receptor regulan la transcripción de genes por distintas vías. Homodímeros y heterodímeros de los receptores se unen a los promotores de genes que poseen secuencias GRE (del inglés glucocorticoid responsive elements) activando o inhibiendo su transcripción según la secuencia GRE y el reclutamiento de factores activadores o represores. Además, monómeros de los receptores de tipo II pueden unirse a otros factores de transcripción inhibiendo su acción reprimiendo así la expresión de genes (De Kloet et al. 1998; de Kloet et al. 2005). La alteración en la expresión génica podría 17 Introducción subyacer los mecanismos por los cuales altos niveles de glucocorticoides provocan remodelaciones estructurales en el hipocampo, como ser la retracción de dendritas o la inhibición de la neurogénesis. Se han identificado algunos genes cuya expresión en el hipocampo se encuentra regulada por glucocorticoides tales como el gen que codifica para el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, del inglés, Brain Derived Neurotrophic Factor) y la neurotrofina 3 (Smith et al. 1995), isoformas polisialidadas de la molécula de adhesión neuronal PSA-NCAM (Rodriguez et al. 1998) y la proteína quinasa dependiente de calcio y calmodulina CaMK-VI (Vreugdenhil et al. 2001). Sin embargo, los mecanismos moleculares responsables de las alteraciones plásticas mencionadas no han sido aún dilucidados. 1.4 Genes regulados por el estrés y los antidepresivos Los mecanismos implicados en las alteraciones estructurales encontradas en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico todavía no han sido esclarecidos. Asimismo, los procesos involucrados en la acción terapéutica de los antidepresivos no han sido identificados. La comprensión de estos mecanismos podría resultar de gran utilidad para el entendimiento y el tratamiento de enfermedades relacionadas al estrés como la depresión. Los avances científicos tecnológicos, y en particular en la biología molecular, permiten hoy la identificación de genes cuya expresión se encuentra modulada por la exposición al estrés y la administración de drogas antidepresivas. La identificación de estos genes es clave para entender las bases moleculares del estrés y el tratamiento con antidepresivos, motivo por el cual varios grupos de investigación, incluyendo nuestro laboratorio, se han concentrado en su identificación. Varios genes de expresión diferencial en tratamientos de estrés y antidepresivos han sido identificados. Según la función de sus productos proteicos, los genes encontrados pueden agruparse en categorías. Así, se han identificado genes relacionados al eje HPA como son los receptores de glucocorticoides de tipo I y II y CRF; genes que codifican para factores de transcripción o proteínas involucradas en la traducción de señales, por ejemplo CREB; factores de crecimiento o diferenciación neuronal como BDNF y NGF (del inglés, Nerve Growth Factor); proteínas involucradas en la sistemas de neurotransmisión tales como los receptores de serotonina; y factores clave en la formación de sinapsis y terminaciones nerviosas como la sinaptofisina y la sinaptotagmina (Alfonso et al. 2005). 18 Introducción A pesar de la gran cantidad de genes cuya expresión se encuentra modulada por el estrés y los antidepresivos identificados, las bases moleculares de las alteraciones plásticas observadas en el hipocampo de animales estresados y de la acción terapéutica de los antidepresivos, no han sido del todo esclarecidas. Los mecanismos que subyacen ambos procesos son complejos y, por consiguiente, se cree que todavía falta identificar un gran número de genes. Una vez identificados, el desafío será integrar toda la información para entender las consecuencias celulares y fisiológicas de su expresión diferencial. 1.5 La glicoproteína de membrana 6a (M6a) y la familia de las proteínas proteolipídicas (PLPs) Con el objeto de identificar genes cuya expresión se encuentra regulada por el estrés crónico, en nuestro laboratorio se utilizaron bibliotecas sustractivas que representan un método no sesgado u orientado por una pre-selección de genes. Las bibliotecas sustractivas fueron construidas con muestras de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) provenientes de hipocampos de animales de la especie T. belangeri tratados crónicamente con cortisol y animales sin tratar, utilizados como control (Alfonso et al. 2004). Luego, varios de los genes identificados en las bibliotecas sustractivas fueron evaluados en el modelo de estrés psicosocial de T. belangeri confirmándose, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, la expresión diferencial de cinco genes (Alfonso et al. 2004). Entre los genes identificados se distingue la glicoproteína de membrana 6a (M6a), cuya expresión resultó disminuida en el hipocampo de animales estresados psicosocialmente, siendo este efecto revertido por la admisitración de clomipramina (antidepresivo tricíclico que inhibe la captación neuronal de serotonina y noradrenalina). La expresión de M6a también se encontró reducida en ratones de distintas cepas y ambos sexos sometidos a estrés crónico por inmovilización. De modo similar a lo observado en individuos de la especie T. belangeri, el tratamiento con tianeptina (antidepresivo atípico que activa la recaptación de serotonina) en ratones contrarrestó los efectos del estrés sobre los niveles de expresión de M6a en el hipocampo (Alfonso et al. 2006). La proteína M6a, de alta expresión en el sistema nervioso central (SNC), ha sido identificada hace más de 20 años (Yan et al. 1993). En estadíos embrionarios, M6a se expresa en neuronas post-mitóticas del cerebro y la médula espinal, mientras que en el cerebro murino adulto, la expresión de M6a se observa en el hipocampo, la corteza cerebral y las células granulares del cerebelo (Yan et al. 1996). En el hipocampo de rata adulta, el 19 Introducción ARNm de M6a se encuentra en el soma de las neuronas granulares del giro dentado y en las neuronas piramidales de las regiones CA1 y CA3. Sin embargo, la proteína no se localiza en los cuerpos celulares, sino en regiones de alta densidad sináptica, como las terminaciones de las fibras musgosas y el hilus (Alfonso et al. 2005). En un trabajo reciente se demostró que en el cerebro de rata adulta la proteína M6a se localiza más específicamente en los axones de las neuronas del giro dentado que conforman la vía de las fibras musgosas (Cooper et al. 2008). Al momento de iniciar este trabajo de tesis era escasa la información respecto a la función de M6a. Sólo existían dos trabajos que sugerían un rol para esta proteína en la extensión de neuritas y en la diferenciación neuronal (Lagenaur et al. 1992; Mukobata et al. 2002). Mientras se realizaba esta tesis, se publicaron dos artículos sugiriendo un papel para M6a en la endocitosis y el reciclado del receptor de opioides (Wu et al. 2007; Liang et al. 2008). Por otro lado, publicaciones recientes sugieren que M6a tendría un rol clave en la diferenciación neuronal a partir de células madres embrionarias (Michibata et al. 2008) y en la extensión de neuritas en células de la retina (Zhao et al. 2008). Además, resulta interesante destacar que se ha encontrado una asociación entre un polimorfismo en el gen que codifica para la proteína M6a y un grupo de individuos con síntomas de depresión entre pacientes diagnosticados con esquizofrenia (Boks et al. 2007) M6a pertenece a la familia de las proteínas proteolipídicas (PLPs) que en mamíferos también incluye a la glicoproteína de membrana 6b (M6b), y PLP, proteína que da nombre a la familia. (Yan et al. 1993). Estas proteínas presentan una alta homología entre sí y según modelos de predicción topográfica comparten una estructura representada en la figura 3, compuesta por cuatro dominios transmembrana (TM), separados por tres loops hidrofílicos, con los extremos amino y carboxilo terminales en el citoplasma. (Popot et al. 1991; Yan et al. 1993). La estructura propuesta para los miembros de la familia PLP se asemeja a la de las proteínas pertenecientes a la gran familia de las tetraspaninas. Sin embargo, la secuencia CCG (cisteína-cisteína-glicina) presente en el loop extracelular mayor del 100 % de las tetraspaninas no se encuentra en estas proteínas y no han sido clasificadas como miembros de esta gran familia (Stipp et al. 2003). 20 Introducción EC 2 EC 1 EXTRACELULAR TM 1 TM 2 TM 3 TM 4 INTRACELULAR NH2 IC COOH Figura 3. Estructura propuesta para los miembros de la familia PLP. El esquema muestra la estructura de las PLPs según modelos de predicción topográfica. Se observan cuatro dominios transmembrana (TM1-TM4), un loop extracelular menor (EC1), un loop intracelular (IC) y un loop extracelular mayor (EC2) con los extremos amino (NH2) y carboxilo (COOH) terminales dentro del compartimiento intracelular. En el SNC, M6a sólo se expresa en neuronas, M6b tanto en neuronas como en glía y PLP sólo en glía (Yan et al. 1996). M6b fue identificada conjuntamente con M6a y varios años después, distintas isoformas de M6b fueron descriptas (Werner et al. 2001). Sin embargo, hasta el momento no se le ha asignado función alguna a M6b. Por otro lado, PLP fue identificada hace más de 50 años (Folch et al. 1951). PLP, y su variante de splicing DM20, constituyen las proteínas más abundantes en la mielina del SNC y se sabe que una de las funciones de estas proteínas es mantener la estructura y la integridad de la mielina (Duncan et al. 1987; Boison et al. 1994; Boison et al. 1995). Además, se les ha asignado a PLP y DM20 un rol en la diferenciación y supervivencia de oligodendrocitos (Yang et al. 1997; Nadon et al. 1998). Asimismo, varios trabajos sugieren una función alternativa aún no identificada, especialmente para DM20 (Knapp 1996; Nadon et al. 1997). 1.6 Plasticidad neuronal La plasticidad neuronal, también conocida como neuroplasticidad, se refiere a la capacidad del sistema nervioso de adaptarse y de cambiar a través del tiempo. Dado el rol 21 Introducción sugerido para M6a en la extensión de neuritas y diferenciación neuronal (Lagenaur et al. 1992; Mukobata et al. 2002), esta proteína podría estar involucrada en procesos de plasticidad neuronal. Durante largo tiempo el cerebro adulto ha sido considerado estable e inmodificable, excepto por la declinación inevitable que ocurre con el envejecimiento. Sin embargo, existen hoy claras evidencias de cambios estructurales en el cerebro adulto que incluyen la generación de nuevas neuronas y otras células cerebrales, así como la modificación en las conexiones entre neuronas. Se distinguen dos tipos de plasticidad neuronal. La plasticidad estructural se refiere a alteraciones en la morfología de procesos neuronales (tanto axones como dendritas y principalmente sus espinas), la formación y eliminación de sinapsis, y la generación de nuevas neuronas por el proceso denominado neurogénesis. La plasticidad sináptica, en cambio, describe las alteraciones en la transmisión sináptica a través de cambios en la eficiencia de sinapsis preexistentes. Como se mencionó anteriormente, la plasticidad neuronal resulta clave para los procesos de aprendizaje y memoria, permitiéndole al individuo adaptarse a constantes cambios en el ambiente (McClung et al. 2008). Las espinas dendríticas son pequeñas protrusiones que emergen de las dendritas neuronales y conforman el componente post sináptico de la gran mayoría de las sinapsis excitatorias en el cerebro. Estas estructuras presentan un alto grado de plasticidad estructural y tanto la aparición y desaparición de espinas dendríticas, como cambios morfológicos en las mismas, han sido repetidamente reportados en el cerebro adulto de roedores (Alvarez et al. 2007; Harms et al. 2007). La vida media de estas espinas, o sea su estabilidad, aumenta conforme avanza la edad del individuo y varía según el área del cerebro estudiada (Trachtenberg et al. 2002; Holtmaat et al. 2005; Zuo et al. 2005). Sin embargo, espinas dendríticas mótiles y transientes son frecuentemente observadas en el cerebro de animales adultos. La mayoría de estas espinas son inestables y desaparecen al corto tiempo de haber aparecido mientras que un reducido porcentaje de las mismas establece contactos sinápticos permaneciendo estables durante, al menos, varios días (Zito et al. 2004). Estudios in vivo han demostrado que la estabilidad de las espinas dendríticas puede ser alterada por la estimulación y la deprivación sensorial. Asimismo, en sistemas in vitro se ha demostrado que un aumento en la actividad sináptica resulta en alteraciones en el número y en la morfología de las espinas dendríticas (Alvarez et al. 2007; Harms et al. 22 Introducción 2007). Si bien se ha demostrado que durante el desarrollo las espinas dendríticas están involucradas en el proceso de sinaptogénesis (Ziv et al. 1996; Fiala et al. 1998), las consecuencias funcionales de esta plasticidad estructural en el cerebro adulto no han sido reveladas. Sin embargo, se especula que la plasticidad estructural en las espinas dendríticas podría participar en procesos de formación y eliminación de sinapsis. Se han identificado varios componentes moleculares que regulan la formación y la motilidad de las espinas. No resulta llamativo que la mayoría de estas moléculas actúe sobre el citoesqueleto de actina que constituye la base de la morfología y la estabilidad de la espina. En este sentido, miembros de la familias de GTPasas pequeñas (RhoA, Rac1 y Cdc42), que son reguladores clave del citoesqueleto de actina, han sido implicados en la formación y en la morfología de las espinas dendríticas (Newey et al. 2005). Asimismo, varios reguladores y efectores de estas proteínas han sido identificados (Calabrese et al. 2006). Otras moléculas involucradas en la estructura y la estabilidad de las espinas son proteínas del citoesqueleto como las profilina, cortactina, debrina y Homero (Kennedy et al. 2005) así como la neurabina y la espinofilina (Ryan et al. 2005). Además, la pérdida de la miosina Va y la miosina VI también altera el número y la longitud de las espinas (Takagishi et al. 1996; Osterweil et al. 2005). Recientemente, se ha observado plasticidad estructural en los axones de animales adultos. En este sentido, distintos tipos de alteraciones morfológicas han sido descriptas. En primer lugar, se ha observado la ramificación lateral de los axones. Además, se ha determinado la aparición y desaparición de botones sinápticos en passant en axones preexistentes. Por último, se ha observado la remodelación de botones sinápticos terminales. Al igual que sucede con la plasticidad en las espinas dendríticas, el remodelado en los axones disminuye con la edad y existe una gran variabilidad según la población neuronal estudiada. Además, la mayoría de los botones sinápticos que aparecen son transientes y desaparecen a corto plazo. El remodelado estructural de los axones podría provocar un rearreglo en los contactos sinápticos que podría subyacer procesos de aprendizaje. En concordancia, se ha observado una expansión en las terminales de las fibras musgosas en la zona CA3 del hipocampo en animales sometidos a ensayos de aprendizaje espacial (Gogolla et al. 2007). 23 Introducción La neurogénesis, es decir, la generación de nuevas neuronas ha sido observada en el cerebro adulto de varios mamíferos incluyendo al hombre. Específicamente, este fenómeno ha sido consistentemente reportado en dos regiones: en la zona sub-ventricular que proyecta hacia el bulbo olfatorio y en el giro dentado del hipocampo (van Praag et al. 2002; Carleton et al. 2003). El proceso de neurogénesis involucra la proliferación de células multipotenciales, la migración y la maduración de la neurona. En el hipocampo, la proliferación ocurre en la zona subgranular, entre la capa de células granulares y el hilus. El 50% de las células recién formadas mueren y desaparecen. Las sobrevivientes pueden transformarse en células neuronales o de la glía, según a donde migren y según la actividad en esa zona del cerebro en ese momento. En la neurogénesis hipocampal, los precursores neuronales migran hacia la capa de las células granulares donde finalmente maduran, adquiriendo las características morfológicas y fisiológicas de una neurona granular adulta. Desde el momento que nace la célula hasta que se integra funcionalmente en el cerebro transcurre más de un mes (Gage 2004). El proceso de neurogénesis se encuentra finamente regulado en sus distintas etapas. Se han identificado factores que regulan la proliferación tales como Sonic hedgehog (Mervaala et al. 2000), así como factores que influyen sobre el destino de la célula recién formada, es decir la diferenciación hacia célula neuronal o de la glía. Por ejemplo, se determinó que la proteína BMP (del inglés, bone morphogenetic protein) promueve la conversión hacia células gliares mientras que Noggin estimula la diferenciación hacia células neuronales (Lim et al. 2000). Una vez que la célula comienza a diferenciarse hacia una célula neuronal, otros factores resultan clave para su supervivencia y maduración entre los cuales se destacan los factores de crecimiento IGF (del inglés, insulin-like growth factor) y BDNF (Aberg et al. 2000; Chan et al. 2008). Los factores presentes en el nicho de maduración de los precursors neuronales resultan clave para la supervivencia y funcionalidad de las nuevas células. En concordancia, la remoción de células multipotenciales, su amplificación in vitro y transplante en el cerebro adulto sólo resulta exitosa cuando la reinserción se realiza en los sitios donde la neurogénesis ocurre normalmente en el cerebro, es decir en el hipocampo y en el bulbo olfatorio (Gage 2000). La neurogénesis en el hipocampo también se encuentra regulada por factores ambientales. El traslado de un ratón de una jaula sencilla hacia un ambiente enriquecido resulta en un incremento en el número de nuevas neuronas mediante una reducción en el número de células que mueren (Brown et al. 2003). Además, se ha visto que los animales 24 Introducción que corren en una rueda muestran un aumento en el número de células que se dividen, resultando en un mayor número de nuevas neuronas (van Praag et al. 1999). Por otro lado, como se mencionó anteriormente, la exposición crónica a situaciones de estrés disminuye la neurogénesis en el hipocampo (Duman 2004). En la actualidad, es ampliamente aceptado que toda experiencia modifica el comportamiento posterior a través de modificaciones en la transmisión sináptica. La plasticidad sináptica se refiere específicamente a la modificación en la fuerza o eficacia de la transmisión sináptica dada por la actividad de la misma. En este sentido, la potenciación a largo plazo (LTP, del inglés, Long Term Potentiation) y la depresión a largo plazo (LTD, del inglés, Long Term Depression) describen cambios en la eficiencia de la transmisión sináptica en respuesta a una estimulación dada y han sido propuestas como los mecanismos responsables de la formación de la memoria. La LTP se produce ante una activación sináptica breve e intensa. En cambio, la producción de una LTD requiere una estimulación más débil y durante un período de tiempo más prolongado. Estos fenómenos han sido ampliamente estudiados en cortes de hipocampo, principalmente en sinapsis excitatorias de la zona CA1, sin embargo, manifestaciones similares han sido observadas en sinapsis excitatorias en varias áreas del cerebro (Citri et al. 2008; McClung et al. 2008). Existe hoy extensa bibliografía describiendo los mecanismos que operan en el establecimiento de la LTP y, en menor medida, la LTD. Resulta interesante destacar que varios mecanismos moleculares son compartidos por ambos procesos (Citri et al. 2008). El factor de crecimiento BDNF ha demostrado ser clave en el establecimiento de la LTP (Hu et al. 2008). También se han identificado un gran número de genes cuya expresión mediaría los procesos de LTP y LTD (McClung et al. 2008). Además de la modulación de la transcripción mediada por factores de transcripción tales como CREB (del inglés, cAMP response elementbinding protein), FosB y NF-B, eventos de traducción local a partir de transcriptos preexistentes en sinaptosomas han sido descriptos como resultado de la actividad sináptica y podrían ser clave en el establecimiento de la LTP y la LTD (Klann et al. 2004). Si bien la mayoría de los estudios de LTP y LTD han sido realizados in vitro, recientemente se ha demostrado la LTP in vivo en el hipocampo, encontrándose además una correlación con los procesos de aprendizaje y memoria (Pastalkova et al. 2006; Whitlock et al. 2006). Asimismo, eventos de LTD han sido observados en corteza somatosensorial en respuesta a deprivación sensorial (Allen et al. 2003). 25 Objetivos 2. OBJETIVOS La identificación y caracterización de genes del hipocampo cuya expresión se encuentra modulada por el estrés crónico podría resultar clave para el establecimiento de las bases moleculares del estrés. En nuestro laboratorio se ha identificado a M6a como una proteína cuya expresión es regulada por tratamientos de estrés y antidepresivos. El objetivo general del presente trabajo fue caracterizar funcionalmente a M6a determinando, de ser posible, las consecuencias celulares, fisiológicas y funcionales de la disminución en la expresión de este gen bajo condiciones de estrés crónico. También se propuso analizar el rol de otros miembros de la familia de las PLP en relación al estrés. De este modo, se pretendió contribuir al entendimiento de los mecanismos implicados en la respuesta al estrés crónico. Los objetivos particulares del presente trabajo de tesis fueron: • Caracterizar funcionalmente a M6a, investigando la función biológica de esta proteína en neuronas del hipocampo. • Evaluar el efecto del estrés crónico sobre el nivel de expresión en el hipocampo de otros miembros de la familia de las PLPs. • Estudiar si existe una función biológica conservada entre distintos miembros de la familia de las PLPs. • Evaluar si existe una asociación entre el gen que codifica para la proteína M6a (GPM6A) y pacientes con depresión. 26 Resultados 3. RESULTADOS 3.1 ESTUDIO FUNCIONAL DE LA GLICOPROTEÍNA M6a CUYA EXPRESIÓN EN EL HIPOCAMPO ES REGULADA POR EL ESTRÉS La expresión de M6a en el hipocampo se encuentra regulada por el estrés crónico y el tratamiento con antidepresivos (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006). A pesar de su identificación hace varios años, al iniciar este trabajo de tesis la función biológica de la proteína M6a era aún desconocida (Yan et al. 1993). Dos trabajos sugerían que M6a podría estar involucrada en la extensión de neuritas y la diferenciación neuronal. Sin embargo, las evidencias resultaban indirectas ya que se basaban en ensayos realizados en líneas celulares (Mukobata et al. 2002) o mediante la utilización de anticuerpos monoclonales anti M6a como antagonistas de su función en cultivos de neuronas de cerebelo (Lagenaur et al. 1992). Nuestro objetivo fue entonces investigar la posible función biológica de M6a de forma tal de entender las consecuencias celulares y fisiológicas de la expresión diferencial de este gen bajo condiciones de estrés crónico. Para ello, dada su alta expresión en neuronas hipocampales (Yan et al. 1996; Alfonso et al. 2005), se decidió utilizar cultivos primarios de neuronas de hipocampo de embriones de rata. 3.1.1 Localización subcelular de la proteína M6a en cultivos primarios de neuronas de hipocampo En primer lugar, se determinó la localización subcelular de la proteína M6a endógena en cultivos primarios de neuronas hipocampales. Se realizaron ensayos de inmunocitoquímica con un anticuerpo monoclonal contra la proteína M6a que muestran que la proteína se localiza tanto en la membrana plasmática del soma, así como en los procesos neuronales (figura 4 A). En estos procesos, la proteína se observa en protrusiones de la membrana. La tinción de la actina con faloidina confirmó que dichas protrusiones, enriquecidas en M6a, son estructuras tipo filopodio (figura 4 B). 27 Resultados Figura 4. Localización de M6a en cultivos primarios de neuronas de hipocampo. A y B. Para determinar la localización de la proteína M6a endógena, neuronas de 5 días in vitro fueron marcadas por inmunocitoquímica con anticuerpos monoclonales anti M6a (verde) y con el marcador de F-actina faloidina (rojo). Una imagen de la célula completa revela la presencia de M6a en la membrana del soma y en los procesos neuronales (A). La magnificación de un proceso neuronal muestra la presencia de M6a en protrusiones de la membrana que contienen un citoesqueleto de actina (B). C. Para determinar la localización de la proteína de fusión, cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados con la construcción GFP::M6a. La examinación de los cultivos fijados por microscopía confocal, revela que la proteína GFP::M6a se localiza en la membrana del soma y de los procesos (a). La examinación en detalle de un proceso, revela que GFP::M6a se encuentra enriquecida en estructuras tipo filopodios/espinas (b). La marcación por inmunocitoquímica con anticuerpos anti MAP2 y anti Tau-1 revelan la presencia de GFP::M6a en dendritas y axones respectivamente (c y d). Barras = 10 m. A continuación, se determinó la localización de una proteína de fusión compuesta por GFP y M6a (GFP::M6a), que luego sería utilizada para estudiar la función celular de M6a. Para ello, se clonó la región codificante (CDS) del gen murino en un vector de expresión eucariota. El vector utilizado permite la expresión de la proteína de interés como proteína de fusión a la proteína verde fluorescente (GFP) por lo que es posible visualizar la localización de la misma. Para determinar si la localización de la proteína de fusión a GFP se corresponde con la localización de la proteína endógena, se transfectaron cultivos primarios de neuronas de hipocampo con la construcción GFP::M6a. La figura 4 C muestra que la proteína GFP::M6a se localiza principalmente en la membrana plasmática del soma y de los procesos (4 C a), encontrándose enriquecida en estructuras tipo filopodio (4 C b). Por lo tanto, la proteína de fusión presenta una localización similar a la proteína M6a endógena. Además, se realizaron ensayos de inmunocitoquímica con anticuerpos anti MAP2 y Tau-1 que son marcadores 28 Resultados específicos de dendrita y axón, respectivamente. Como se muestra en la figura 4 C, la proteína de fusión se localiza tanto en dendritas (4 C c) como en axones (4 C d). El patrón de expresión punteado observado en células que expresan GFP::M6a (figura 4 C) podría ser indicativo de una concentración de la proteína en estructuras de tipo pre o post sinápticas. Es por ello que se realizaron ensayos de inmunocitoquímica con anticuerpos dirigidos contra las proteínas sinaptofisina y espinofilina que son marcadores de vesículas pre y post sinápticas, respectivamente. La figura 5 muestra que M6a sólo colocaliza con estos marcadores pre y post sinápticos en forma ocasional. Por lo tanto, el patrón de expresión punteado de M6a no responde a una concentración de la proteína específicamente en estructuras pre o post sinápticas. A GFP::M6a B Sinaptofisina Superposición Espinofilina Figura 5. Colocalización entre GFP::M6a y marcadores pre y post sinápticos. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados con GFP::M6a después de 9-10 días in vitro. Un día después, las neuronas fueron fijadas y marcadas con anticuerpos contra la proteína pre sináptica sinaptofisina (A) o post sináptica espinofilina (B). Las flechas verdes y rojas señalan ejemplos de localización independiente entre M6a y el marcador, respectivamente. Las flechas amarillas señalan casos de colocalización entre M6a y el marcador. Barra = 10 m. 3.1.2 La sobreexpresión de M6a induce la formación de neuritas y de filopodios/espinas Con el fin de determinar la función biológica de M6a, se realizaron ensayos de sobreexpresión en cultivos primarios de neuronas de hipocampo. Estudios previos sugerían un rol para M6a en la formación de neuritas (Lagenaur et al. 1992; Mukobata et al. 2002). Por lo tanto, para determinar si efectivamente M6a está involucrada en la extensión de neuritas, se transfectaron cultivos primarios de neuronas de hipocampo durante el primer día de desarrollo in vitro con GFP::M6a o con un plásmido que sólo codifica para la expresión de GFP utilizado como control. Las células fueron fijadas y las neuritas fueron marcadas por inmunocitoquímica con anticuerpos anti tubulina, 2 ó 3 días después de la transfección. La figura 6 A muestra imágenes representativas de una neurona control transfectada con GFP y 29 Resultados una neurona que sobreexpresa M6a. El número de neuritas por célula fue luego cuantificado en ambos tipos de células. Como se observa en la figura 6 B, la sobreexpresión de M6a aumenta significativamente el número de neuritas. A B Neuritas / célula Tubulina Número de Neuritas 15 ** 10 5 0 Control Sobreexpresión M6a Control M6a Figura 6. La sobreexpresión de M6a produce un aumento en el número de neuritas. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo de 1 día in vitro fueron transfectados con GFP::M6a o GFP (control). A los 2 ó 3 días post transfección, las células fueron fijadas y las neuritas fueron marcadas con anticuerpos anti tubulina (A). El número de neuritas por célula fue cuantificado (B). El gráfico muestra la media + error estándar de la media (SEM), de entre 40 y 50 células por grupo provenientes de 3 experimentos independientes. **p<0,001 calculado con Mann Whitney U-test. Barra = 10 m. Luego, se evaluó el efecto de la sobreexpresión de M6a en cultivos primarios de neuronas de hipocampo más avanzados, entre 9 y 10 días in vitro, que corresponde a la etapa en que las neuronas inician la formación de espinas (Zhang et al. 2001). En esta etapa, las neuritas de las neuronas muestran un gran número de protrusiones de alta motilidad llamadas filopodios, así como un creciente número de protrusiones más cortas y estables llamadas espinas. En estados más avanzados de los cultivos primarios, se observa un aumento en el número de espinas y una disminución en la cantidad de filopodios. Es por eso que la teoría actual de la formación de espinas sostiene que éstas se desarrollan a partir de filopodios (Ziv et al. 1996). Para determinar el efecto de la sobreexpresión de M6a en cultivos en la etapa de formación de espinas, cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados a los 7 días in vitro con GFP::M6a o GFP. A los 2 ó 3 días de la transfección, se tiñeron las membranas con DiI y se fijaron los cultivos. En la figura 7 A se muestran imágenes representativas de una neurona que sobreexpresa GFP y una neurona que sobreexpresa GFP::M6a así como una ampliación de fragmentos de neuritas donde se observan protrusiones tipo filopodios/espinas. Luego, se cuantificó el número de protrusiones en fragmentos de 20 m de neurita. En esta etapa in vitro, resulta muy difícil diferenciar filopodios de espinas basándose en la observación de las protrusiones por 30 Resultados microscopía de fluorescencia. Es por eso que las protrusiones fueron agrupadas bajo la categoría de filopodios/espinas. Como se muestra en la figura 7 B, la sobreexpresión de M6a produce un aumento en la densidad de filopodios/espinas de alrededor de un 100%. Los resultados muestran la densidad de filopodios/espinas medidos en segmentos de neuritas a una distancia menor a 50 m del soma. Dentro de esta distancia, la distribución de filopodios/espinas resultó uniforme ya que no se observaron diferencias entre la densidad observada en segmentos de neuritas que sobreexpresan M6a a los 0 y a los 30 m del soma (9,8 ± 2,5 y 9,3 ± 2,8 respectivamente, n = 52, p = 0,49 calculado con Mann Whitney U-test). Los incrementos observados en el número de procesos y en la densidad de protrusiones en fragmentos de neuritas en neuronas que sobreexpresan M6a revelan que esta proteína estaría involucrada en la formación de neuritas y filopodios/espinas. A B Densidad de filopodios/espinas Protrusiones / 20 μm de neurita (% control) 250 ** 200 150 100 50 0 Control Sobreexpresión M6a Control M6a Figura 7. La sobreexpresión de M6a aumenta la densidad de filopodios/espinas. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados a los 7 días in vitro con GFP::M6a o GFP (control). A los 2 ó 3 días post transfección, las células fueron incubadas con el marcador de membrana DiI y fijadas (A). El número de protrusiones en fragmentos de 20 m de neurita, dentro de una distancia menor a 50 m del soma, fue cuantificado (B). El gráfico muestra la media de número de protrusiones + SEM, expresado como porcentaje del control, de entre 65 y 70 neuritas por grupo provenientes de 3 experimentos independientes. **p<0,001 calculado con Mann Whitney U-test. Barra = 10 m. Una vez establecido que la sobreexpresión de M6a producía un aumento en la densidad de protrusiones de la membrana, se procedió a la caracterización de las mismas. Para ello, se transfectaron cultivos primarios de neuronas de hipocampo a los 7 días in vitro con GFP::M6a. A los 2 ó 3 días de la transfección, las células fueron fijadas y distintas estructuras fueron marcadas por inmuncitoquímica. La marcación de la F-actina con faloidina muestra que las protrusiones poseen un citoesqueleto de actina (figura 8 A). La 31 Resultados tinción con MAP2 revela que las protrusiones se originan a partir de dendritas (figura 8 B). Además, la figura 8 C muestra que las protrusiones poseen acumulaciones de la proteína post sináptica espinofilina. La tinción de axones con anticuerpos que reconocen la proteína Tau-1 parece indicar que los axones hacen contacto con las protrusiones de la membrana inducidas por la sobreexpresión de M6a (figura 8 D). Por último, se observan acumulaciones de sinaptofisina sobre axones que harían contacto con protrusiones que sobreexpresan M6a (figuras 8 E y E´). Los sitios de contacto, donde se encuentran acumulaciones de sinaptofisina, serían sitios de sinapsis, ya que se ha establecido una correlación entre la formación de sinapsis y acumulaciones de estructuras teñidas con anticuerpos que marcan vesículas sinápticas, como sinaptofisina (Fletcher et al. 1991). En conjunto, estos resultados indican que las protrusiones dendríticas inducidas por la sobreexpresión de M6a harían contacto con axones y participarían en la formación de sinapsis. GFP::M6a Superposición A B C D E E´ Figura 8. Caracterización de las protrusiones de membrana inducidas por la sobreexpresión de M6a. A los 7 días in vitro, cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados con GFP::M6a. Las células fueron luego fijadas y marcadas por inmunocitoquímica, 2 ó 3 días después de la transfección. El citoesqueleto de F-actina fue teñido con faloidina (A) y las dendritas fueron teñidas con anticuerpos anti MAP2 (B). La tinción con anticuerpos anti espinofilina marca vesículas post sinápticas (C). Los axones fueron marcados con anticuerpos anti Tau-1 (D). Vesículas pre sinápticas fueron teñidas con anticuerpos anti sinaptofisina (E). Una ampliación muestra acumulaciones de sinaptofisina en sitios de aparente contacto con protrusiones que expresan M6a, que serían, presumiblemente, sitios de sinapsis (E´). Barra = 10 m. 32 Resultados 3.1.3 La reducción en los niveles de M6a produce una disminución en la densidad de filopodios/espinas y en el número de puntos de sinaptofisina En base a los resultados anteriores, se decidió comprobar el papel que M6a juega en la formación de filopodios/espinas por un método alternativo. Para ello, se realizaron experimentos en los que se redujeron los niveles de expresión de M6a endógena en cultivos primarios de neuronas de hipocampo mediante la técnica de ARN de interferencia. La evaluación de los efectos de una reducción en los niveles de expresión de M6a resultaba de alta relevancia ya que en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico se observa una disminución en los niveles de expresión de M6a (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006). En primer lugar, se confirmó que la utilización de pequeños oligonucleótidos de ARN de interferencia (siRNA, del inglés small interfering ribonucleic acid) resulta en una disminución en los niveles de expresión de M6a. Para ello, cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados con fragmentos de ARN de 21 pb correspondientes a un fragmento de la secuencia codificante para M6a (M6a siRNA) o con fragmentos de ARN correspondientes a otra secuencia no relacionada utilizados como control. A los 3 días de la transfección, el ARNm de los cultivos fue purificado y se cuantificaron los niveles de ARNm de M6a por ensayos de retrotranscripción (RT) seguidos de PCR en tiempo real. La figura 9 A muestra que el nivel de ARNm de M6a se encuentra reducido alrededor de un 60% en los cultivos tratados con el ARN de interferencia específico para M6a. Para determinar si los niveles de proteína también se encuentran afectados, neuronas de hipocampo fueron transfectadas con siRNA M6a o con la secuencia control cada 2 ó 3 días de cultivo durante su desarrollo in vitro. Después de 3 transfecciones, y luego de 9 días in vitro, las células fueron fijadas y sometidas a ensayos de inmunocitoquímica para la detección de M6a con anticuerpos monoclonales anti M6a. Como se muestra en la figura 9 B, la inmunorreactividad en los cultivos interferidos para M6a resultó notablemente menor a la observada en los cultivos control. Por lo tanto, en cultivos primarios de hipocampo, la utilización de ARN de interferencia provoca una disminución en los niveles de ARNm y de proteína M6a. 33 Resultados A ARNm M6a B Proteína M6a Control Nivel ARNm 100 M6a siRNA 80 60 ** 40 20 0 Control M6a siRNA Figura 9. El tratamiento con ARN de interferencia reduce los niveles de ARNm y proteína M6a. A. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados con siRNA M6a o con la secuencia control. A los 3 días post transfección, el ARNm fue purificado y los niveles de ARNm de M6a fueron determinados por RT-PCR en tiempo real. El gráfico muestra la media + SEM, de los valores de M6a normalizados con el gen de referencia b-actina, expresados como porcentaje del control, provenientes de 3 cultivos para cada grupo. **p<0.01, calculado con Mann Whitney U-test. B. Se transfectaron cultivos primarios de neuronas hipocampales a los 2, 5 y 8 días in vitro con siRNA M6a o con la secuencia control. A los 9 días in vitro, los cultivos fueron fijados y se realizaron ensayos de inmunodetección de M6a. La figura muestra imágenes obtenidas por inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales anti M6a. Barra = 10 m. La interferencia en la expresión de M6a podría afectar la viabilidad de las células. Para descartar dicho efecto, se realizaron ensayos de viabilidad por tinción con trypan blue en cultivos primarios de neuronas de hipocampo tratadas con M6a siRNA o con la secuencia control. La figura 10 A muestra que el porcentaje de células viables no se encuentra afectado por el tratamiento de interferencia para M6a. Además, imágenes de contraste de fase revelan que no existen diferencias morfológicas importantes entre cultivos tratados con M6a siRNA y con la secuencia control (figura 10 B). A % células viables Viabilidad B 100 80 60 40 20 0 Control M6a siRNA Figura 10. La viabilidad de las neuronas no es afectada por el tratamiento con ARN de interferencia para M6a. A. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados cada 2 ó 3 días con M6a siRNA o con la secuencia control. A los 9 ó 10 días in vitro, las células fueron teñidas con trypan blue y se cuantificó el porcentaje de células viables. El gráfico muestra la media + SEM de 3 experimentos. No se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos según Mann Whitney U-test. B. Imágenes de contraste de fase de cultivos de 9 días in vitro transfectados cada 2 o 3 días con M6a siRNA o con la secuencia control. Barra = 10 m. 34 Resultados Una vez determinada la eficiencia de la técnica de ARN de interferencia para reducir los niveles de expresión de M6a en cultivos primarios de neuronas de hipocampo, se prosiguió con la evaluación de los efectos de la expresión diferencial de esta proteína. Cultivos de neuronas de hipocampo fueron transfectados cada 2 ó 3 días in vitro con M6a siRNA o con la secuencia control. A los 9 ó 10 días in vitro, las membranas de las neuronas fueron teñidas con DiI y las células fueron fijadas. La figura 11 A muestra imágenes representativas de procesos neuronales tratados con M6a siRNA y con la secuencia control. Luego, el número de filopodios/espinas en fragmentos neuríticos de 20 m de extensión fue cuantificado. La figura 11 B muestra que la interferencia de la expresión de M6a resulta en una disminución de alrededor de un 40 % en la densidad de filopodios/espinas. En un segundo experimento, en el que se utilizó otro oligonucleótido de ARN de 21 pb que reconoce una secuencia de M6a distinta, se obtuvieron resultados similares: la densidad de filopodios/espinas en los cultivos interferidos para M6a resultó de un 68 ± 7 % en comparación con el control (n = 70, p < 0,005 calculado con Mann Whitney U-test). M6a siRNA B Densidad filopodios/espinas Protrusiones / 20 m (% control) A Control 100 80 ** 60 40 20 0 Control M6a siRNA Figura 11. La disminución en los niveles de M6a produce una reducción en la densidad de filopodios/espinas. Neuronas de hipocampo fueron transfectados con M6a siRNA o con la secuencia control cada 2 ó 3 días de cultivo in vitro. A los 9 ó 10 días in vitro, los cultivos fueron incubados con DiI para teñir las membranas y fijados (A). Luego, se determinó el número de filopodios/espinas en 20 m de neurita. El gráfico de la figura B muestra la media de cada grupo + SEM, expresada como porcentaje de la media del control, de entre 75 y 95 neuritas por grupo, provenientes de 3 experimentos independientes. ** p<0,001 calculado con Mann Whitney U-test. Barra = 10 m. La reducción en la densidad de filopodios/espinas podría traer aparejada una disminución en el número de sinapsis. Varios estudios han demostrado la capacidad que poseen los filopodios de participar en la sinaptogénesis (Ziv et al. 1996; Fiala et al. 1998; Goda et al. 2003). Se decidió, entonces, evaluar los efectos de la expresión reducida de M6a sobre el número de sinapsis mediante la detección de acumulaciones de sinaptofisina. Como se mencionó anteriormente, en cultivos primarios de neuronas de hipocampo existe una 35 Resultados correlación entre el número de sinapsis y las acumulaciones de estructuras teñidas con anticuerpos que marcan vesículas sinápticas (Fletcher et al. 1991). Por ello, se realizaron ensayos de inmunodetección con anticuerpos anti sinaptofisina como indicativos del número de sinapsis. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron tratados con M6a siRNA o con la secuencia control. Los cultivos fueron luego fijados y las acumulaciones de sinaptofisina fueron marcados por inmunocitoquímica (figura 12 A). El número de puntos de sinaptofisina en fragmentos de 20 m de neurita fue determinado. Como se muestra en el gráfico de la figura 12 B, la densidad de puntos de sinaptofisina es significativamente menor en los cultivos en los que la expresión de M6a fue interferida. Por lo tanto, la reducción de los niveles de expresión de M6a por ARN de interferencia produce una disminución en la densidad de filopodios/espinas y puntos de sinaptofisina, que indicarían una disminución en el número de sinapsis. Estos resultados confirman, por un método alternativo a la sobreexpresión que M6a, que esta proteína tendría un rol determinante en la formación de filopodios/espinas en neuronas de hipocampo. B Densidad de puntos de sinaptofisina sinaptofisina Puntos / 20 m de neurita (% control) A Control M6a siRNA 100 ** 80 60 40 20 0 Control M6a siRNA Figura 12. La reducción en los niveles de M6a resulta en una menor densidad de puntos de sinaptofisina. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados cada 2 ó 3 días in vitro con M6a siRNA o con la secuencia control. Los cultivos fueron fijados a los 9 ó 10 días in vitro, y las acumulaciones de sinaptofisina fueron marcadas por inmunocitoquímica (A). Se determinó el número de puntos inmunorreactivos de sinaptofisina en fragmentos de 20 m de neurita. El gráfico de la figura B muestra la media de cada grupo + SEM, expresada como porcentaje de la media del control, de al menos 55 neuritas por grupo provenientes de 3 experimentos independientes. ** p<0,001 calculado con Mann Whitney U-test. Barra = 10 m. 3.1.4 Efectos de la sobreexpresión de M6a en líneas neuronales y no neuronales Para evaluar si la capacidad de M6a de inducir la formación de filopodios se encuentra restringida a cultivos primarios de neuronas de hipocampo o si se extiende a otros cultivos celulares, se utilizaron las líneas neuronales neuroblastoma 2a (N2a) y feocromocitoma 12 (PC12), y la línea no neuronal COS-7. Cultivos de células neuronales N2a 36 Resultados y PC12 sin diferenciar y cultivos de células no neuronales COS-7, fueron transfectados con GFP::M6a. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fue teñida con faloidina. Como se observa en la figura 13 A, la proteína GFP::M6a se encuentra enriquecida en estructuras tipo filopodio que poseen un citoesqueleto de actina en los tres tipos celulares. Una vez diferenciados, los cultivos de N2a y PC12 presentan procesos con un alto número de filopodios. Sin embargo, en cultivos sin diferenciar se encuentran tanto células con filopodios como células sin filopodios. Los gráficos de la figura 13 B muestran que el porcentaje de células N2a y PC12 con filopodios es mayor entre las células transfectadas con GFP::M6a. Como control se utilizaron células no transfectadas de los mismos preparados. Estos experimentos demuestran que la sobreexpresión de M6a induce la formación de filopodios en líneas neuronales. A Control Figura 13. La sobreexpresión Sobreexpresión M6a F-actina F-actina GFP::M6a de M6a induce la formación PC12 de filopodios en células N2a, PC12 y COS-7. Cultivos de células neuronales N2a y PC12 sin diferenciar y cultivos de N2a células no neuronales COS-7 fueron transfectados con GFP::M6a. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la COS-7 transfección y la actina fue teñida con faloidina (A). Los gráficos de la figura B muestran el porcentaje de N2a 100 ** 80 60 40 20 0 Control M6a % células con filopodios % células con filopodios PC12 COS-7 100 80 ** 60 40 20 0 Control M6a % células con filopodios B células con filopodios. Como 100 80 control se utilizaron células sin ** 60 transfectar 40 del mismo preparado. Los resultados se 20 0 Control M6a encuentran expresados como media + SEM de por lo menos menos 3 preparados de experimentos independientes. ** p<0,001 calculado con la prueba T de Student. Barra = 10 m. 37 Resultados De modo similar, en la línea no neuronal COS-7 también se observa un aumento en el porcentaje de células con filopodios entre las células que sobreexpresan M6a (figura 13 B). Por lo tanto, M6a es capaz de inducir la formación de filopodios no sólo en cultivos primarios de neuronas de hipocampo y en cultivos de líneas neuronales sino también en células no neuronales. Con el fin de confirmar que la sobreexpresión de la glicoproteína M6a es responsable de la inducción de la formación de filopodios, se realizaron dos controles. En primer lugar, células N2a sin diferenciar fueron transfectadas con GFP. Las células fueron luego fijadas y la actina fue teñida con faloidina. La cuantificación reveló que no existen diferencias en el porcentaje de células con filopodios entre células transfectadas con GFP (42 ± 5 %) y células del mismo preparado sin transfectar (40 ± 7 %) utilizadas como control (los resultados se encuentran expresados como media + SEM de 2 experimentos independientes, p = 0,75 calculado con la prueba T de Student). Estos resultados demuestran que ni la transfección per se, ni la sobreexpresión de GFP, inducen la formación de filopodios. En un segundo control, se realizaron experimentos de transfección con una construcción que permite la expresión de M6a y de GFP de forma independiente (GFP+M6a). De este modo, las células transfectadas son fácilmente reconocibles ya que expresan GFP, pero la proteína de interés es expresada sin adición de una proteína reportera. Como se muestra en la figura 14 A, las células que expresan GFP resultan inmunorreactivas para M6a. Además, la marcación con anticuerpos monoclones anti M6a revela que la proteína M6a presenta la misma localización que la proteína GFP::M6a, indicando que la adición de la proteína reportera no afecta a la localización de la proteína. En las fotos de la figura 14 B se observa que, a diferencia de la célula no transfectada, la célula que expresa GFP y M6a muestra un gran número de filopodios al ser teñida con faloidina. Por último, como se muestra en el gráfico de la figura 14 C, el porcentaje de células con filopodios es mayor en las células que sobreexpresan GFP+M6a que en las células no transfectadas. Por lo tanto, M6a per se es capaz de inducir la formación de filopodios y esta función, al igual que su localización, no depende de la adición de la proteína reportera GFP. 38 Resultados A GFP M6a C Células con filopodios B GFP F-actina % células con filopodios 100 ** 80 60 40 20 0 Control M6a Figura 14. La sobreexpresión de M6a, independientemente de GFP, posee la misma localización e induce la formación de filopodios. Cultivos de células N2a sin diferenciar fueron transfectados con GFP+M6a. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y las células fueron marcadas por inmunocitoquímica con anticuerpos monoclonales anti M6a (A) o la actina fue teñida con faloidina (B). Los preparados teñidos con actina fueron utilizados para determinar el porcentaje de células con filopodios. El gráfico de la figura C muestra los resultados obtenidos. Como control se utilizaron células sin transfectar del mismo preparado. Los resultados están expresados como media + SEM de 2 experimentos independientes. ** p<0,01 calculado con la prueba T de Student. Barra = 10 m. 3.1.5 La localización de M6a no depende de la integridad del citoesqueleto de actina Ensayos de inmunocitoquímica en cultivos primarios de neuronas de hipocampo han revelado la acumulación de la proteína M6a endógena en estructuras tipo filopodio ricas en actina (figura 4 B). Asimismo, en neuronas hipocampales, en líneas neuronales (N2a y PC12) y líneas no neuronales (COS-7) se observa la misma localización para la proteína GFP::M6a (figuras 8 A y 13 A). Con el objeto de determinar si la localización de M6a en estructuras tipo filopodio depende de la integridad del citoesqueleto de actina, se trataron cultivos con drogas que despolimerizan los mircrofilamentos de actina. Como muestra la tinción con faloidina en la figura 15 A, el tratamiento de cultivos primarios de neuronas de hipocampo con latrunculina A resultó en la disrupción del citoesqueleto de actina. Sin embargo, la inmunodetección de M6a muestra que la proteína aún se localiza en estructuras tipo filopodio (figura 15 A). De modo similar, el tratamiento de cultivos de N2a con citocalasina D provocó una desestabilización del citoesqueleto de actina sin alterar la localización de la proteína GFP::M6a (figura 15 B). Por lo tanto, la localización de M6a en estructuras tipo filopodio no depende de la integridad del citoesqueleto de actina. 39 Resultados M6a F-actina GFP::M6a F-actina Lat A Control A Citocalasina D Control B Figura 15. La localización de M6a en estructuras tipo filopodio no depende del citoesqueleto de actina. A. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo de 4 días in vitro fueron tratados con latrunculina A (Lat A) para desestabilizar el citoesqueleto de actina. Los cultivos fueron luego fijados y la integridad del citoesqueleto de actina se determinó por tinción de la F-actina con faloidina (rojo) mientras que la localización de M6a se reveló por inmunocitoquímica con anticuerpos monoclonales anti M6a (verde). B. Cultivos de células N2a fueron transfectados con GFP::M6a. Al día siguiente, algunos preparados fueron incubados con el despolimerizante de actina citocalasina D. Los cultivos luego se fijaron y se tiñeron con faloidina para determinar la integridad del citoesqueleto de actina (rojo). La localización de GFP::M6a se observa por la fluorescencia emitida por GFP (verde). Barra = 10 m. 3.1.6 La formación de filopodios inducida por M6a no estaría mediada por proteínas GTPasas de la familia Rho La sobreexpresión de M6a resulta en la formación de filopodios tanto en cultivos primarios de neuronas de hipocampo y en las líneas celulares de fenotipo neuronal N2a y PC12 como en la línea no neuronal COS-7 (figuras 7 y 13). Por lo tanto, el mecanismo por el cual M6a induciría la formación de filopodios no sería exclusivo de células neuronales, sino que se encontraría presente en distintos tipo celulares. En este sentido, las proteínas GTPasas pequeñas de la familia Rho (Rho, Rac y Cdc42) han sido involucradas en la regulación del citoesqueleto de actina durante la formación de filopodios en una amplia variedad de células (Luo 2000; Ridley 2006). Es por ello que decidimos estudiar si la formación de filopodios inducida por la sobreexpresión de M6a estaría mediada por alguna de estas GTPasas pequeñas. Para ello, se analizó por Western blot la cantidad de Cdc42, Rac1 40 Resultados y RhoA activas (unidas a GTP) en cultivos que sobreexpresan M6a en comparación con cultivos control. Cultivos de células N2a fueron utilizados como control (sin transfectar) o transfectados con GFP::M6a. A las 24 hs, se purificaron las proteínas Cdc42, Rac1 y RhoA activas, es decir unidas a GTP, mediante incubación con esferas de agarosas unidas al dominio PBD de la proteína PAK que sólo une a las formas activas de Cdc42 y Rac1, o unidas al dominio RBD de la proteína Rhotekina que sólo une RhoA activa. Luego, se realizaron ensayos de Western blot con anticuerpos específicos para cada GTPasa pequeña para así determinar la cantidad de proteína activa en las distintas muestras. Como control de carga, se determinó la cantidad de tubulina en los extractos utilizados para la purificación de las proteínas GTPasas en estado activo. Como se observa en la figura 16, la cantidad de Cdc42, Rac1 y RhoA activas no varía entre cultivos control y cultivos que sobreexpresan M6a. Resultados similares fueron obtenidos en ensayos con células COS-7 (datos no mostrados). Estos ensayos indicarían que estas GTPasas pequeñas (Cdc42, Rac1 y RhoA) no mediarían los cambios morfológicos inducidos por la sobreexpresión de M6a. A B Tubulina Cdc42 activada Rac1 activada (Control de carga) (Control de carga) + M6a C C Tubulina + M6a C M6a C Tubulina RhoA activada (Control de carga) M6a C M6a C M6a C Figura 16. La sobreexpresión de M6a no produce cambios detectables en la cantidad de Cdc42, Rac1 o RhoA en estado activo. Cultivos de células N2a fueron transfectados con GFP::M6a (M6a), con Cdc42 constitutivamente activa utilizado como control positivo (+) o no transfectados y utilizados como control (C). A las 24 hs, los extractos proteicos fueron incubados con esferas de agarosa con el dominio PBD de la proteína PAK para purificar las proteínas Cdc42 y Rac1 activas (unidas a GTP) o con el dominio RBD de la proteína Rhotekina para purificar la proteína RhoA activa. Las fracciones purificadas fueron luego analizadas por Western blot con anticuerpos anti Cdc42 (A), anti Rac1 (B) o anti RhoA (C). Además, se determinó con anticuerpos anti -tubulina la cantidad de tubulina en los extractos totales utilizados para la purificación de las distintas proteínas GTPasas como control de carga. 3.1.7 La palmitoilación y la fosforilación en los loops extracelulares de M6a no serían necesarias para su función en la formación de filopodios Como se mencionó anteriormente, según modelos de predicción topográfica basados en la secuencia aminoacídica de M6a, esta proteína de 278 aminoácidos estaría compuesta por cuatro dominios transmembrana (TM) separados por tres loops hidrofílicos (dos 41 Resultados extracelulares y uno intracelular) con los extremos amino y carboxilo terminales en el citoplasma. Como se muestra en la figura 17, el extremo amino terminal posee un posible sitio de fosforilación para la proteína quinasa C (PKC) mientras que en el carboxilo terminal se encuentran dos posibles sitios de fosforilación, uno para la PKC y otro para la proteína quinasa CK2 (CK2). En el loop extracelular menor se predicen tres sitios de fosforilación para la CK2, mientras que el loop extracelular mayor posee dos posibles sitios de N-glicosilación y tres posibles sitos de fosforilación para la CK2. En los loops extracelulares menor y mayor se encuentran dos y cuatro residuos de cisteína respectivamente, que podrían establecer puentes disulfuro claves para el correcto plegamiento de la proteína. Además, en las regiones adyacentes a la cara intracelular de la membrana plasmática se encuentran siete cisteínas que podrían ser blancos de palmitoilación. 184 174 166 164 60 46 162 T C T C T C T C N T S 67 T INTRACELULAR C 21 NH2 C 18 C 17 10 T C 14 122 C N 76 C 193 195 C 44 EXTRACELULAR 192 C 125 202 208 C 246 S 256 COOH S T 267 268 Figura 17. Estructura propuesta para M6a y aminoácidos que podrían modular su función. El esquema muestra la estructura de M6a según modelos de predicción topográfica. Se observan los cuatro dominios transmembrana, los dos loops extracelulares y el loop intracelular, así como los extremos amino y carboxilo terminal dentro del compartimiento intracelular. Se muestran los posibles sitios de fosforilación para PKC () y CK2 () y los posibles sitios de N-glicosilación (). Además, se destacan los residuos de cisteína en los loops extracelulares que estabilizarían la estructura mediante la formación de puentes disulfuro () y las cisteínas intracelulares que podrían ser blancos de palmitoilación (). Los números indican la posición aminoacídica de los distintos residuos. 42 Resultados La estructura propuesta para M6a se asemeja a la de las proteínas pertenecientes a la gran familia de las tetraspaninas. M6a comparte con proteínas de esta familia el motivo Tyr-Xaa-Xaa-ø (donde ø representa un aminoácido con residuo hidrofóbico) en el extremo carboxilo terminal y la presencia de siete cisteínas en regiones yuxtapuestas a la membrana que podrían ser palmitoiladas (Stipp et al. 2003). Para varios miembros de la gran familia de las tetraspaninas (CD9, CD81, CD82 y Cd151) la palmitoilación ha resultado ser clave para su localización e interacción con otras proteínas. Además, mutaciones en los sitios de palmitoilación en distintas tetraspaninas han sido asociadas a alteraciones en la morfología celular (Hemler 2005; Schneider et al. 2005). Es por ello, que se decidió realizar un estudio mutacional, en el cual se mutaron los siete residuos de cisteína que podrían ser blanco de palmitoilación, para luego evaluar la funcionalidad de la proteína resultante en la formación de filopodios. Por otra parte, la fosforilación mediada por CK2 en residuos extracelulares de proteínas de membrana ha sido involucrada en la regulación de la morfología celular y el citoesqueleto de actina (Canton et al. 2006). Por este motivo, se estudió la capacidad de distintas mutantes de la proteína M6a, donde se sustituyeron los aminoácidos extracelulares clave para la fosforilación por CK2, de inducir la formación de filopodios. Las distintas mutantes de M6a, fueron obtenidas mediante la técnica de mutagénesis dirigida. De este modo se realizó una séptuple mutante en los posibles sitios de palmitoilación en la cual los siete residuos de cisteína de presunta localización intracelular fueron sustituidos por residuos de serina (M6a C14S C17S C18S C21S C122S C125S C246S). Por otra parte, se construyeron simples y múltiples mutantes en los sitios extracelulares de fosforilación intercambiando los residuos de treonina y serina por alaninas (M6a T60A, M6a T67A, M6a T76A, M6a T60A T67A T76A, M6a T166A, M6a T184A, M6a T193A S195A y M6a T166A T184 T193A S195A). Una vez obtenidas las distintas mutantes, se transfectaron células N2a y cultivos primarios de neuronas de hipocampo. En ningún caso se observó un cambio en la localización subcelular de la proteína. Se procedió entonces a evaluar la capacidad de las distintas proteínas de promover la formación de filopodios. Como se observa en las figuras 18 A y B la séptuple mutante en los posibles sitios de palmitoilación así como las distintas mutantes en los sitios extracelulares de fosforilación poseen la misma capacidad que M6a wild type para inducir la formación de filopodios tanto en la línea celular N2a como en cultivos primarios de neuronas de hipocampo. Por lo tanto, la palmitoilación y la fosforilación extracelular de M6a no mediarían los efectos en la formación de filopodios. 43 Resultados Células N2a con filopodios % células con filopodios A 100 ** ** ** ** ** M6a Palm M6a T60A M6a T67A M6a T76A M6a CK2 EC1 ** 80 ** ** ** ** M6a T166A M6a T184A M6a T193A S195A M6a CK2 EC2 60 40 20 0 GFP M6a Densidad de filopodios en neuronas de hipocampo Protrusiones / 20 m (% control) B 200 ** ** ** ** M6a M6a Palm M6a CK2 EC1 M6a CK2 EC2 150 100 50 0 Control Figura 18. Inducción de la formación de filopodios por mutantes de M6a en los posibles sitios de palmitoilación y fosforilación extracelular. A. Células N2a fueron transfectadas con GFP, M6a wild type o las distintas mutantes de M6a. Al día siguiente, las células fueron fijadas y la actina fue teñida con faloidina. El gráfico muestra el porcentaje de células con filopodios. Como control se utilizaron células sin transfectar del mismo preparado. Las barras blancas representan las células transfectadas con las construcciones que se indican debajo de las mismas mientras que las barras negras representan las células control sin transfectar provenientes de los mismos preparados. Los resultados están expresados como media + SEM de al menos 7 preparados de 2 experimentos independientes. ** p<0,001 calculado con la prueba T de Student. B. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados a los 3 días in vitro con GFP, M6a wild type o distintas mutantes de M6a. Al día siguiente, los cultivos fueron fijados y el número de protrusiones en fragmentos de 20 m de neurita fue cuantificado. El gráfico muestra la media + SEM, expresado como porcentaje del control (GFP), de por lo menos 60 neuritas por grupo. **p<0,01 versus GFP calculado por ANOVA de un factor seguido por la prueba de Dunnet para efectos post hoc. No se encontraron diferencias significativas entre M6a wild type y las distintas mutantes de M6a. El gráfico muestra los resultados de un experimento, representativo de 3 experimentos independientes. M6a Palm: M6a C14S C17S C18S C21S C122S C125S C246S, M6a CK2 EC1: M6a T60A T67A T76A, M6a CK2 EC2: M6a T166A T184 T193A S195A. 44 Resultados 3.2 LA FAMILIA DE LAS PROTEÍNAS PROTEOLIPÍDICAS: REGULACIÓN POR EL ESTRÉS CRÓNICO Y ROL EN LA FORMACIÓN DE FILOPODIOS La proteína M6a, cuya expresión en el hipocampo se encuentra modulada por la exposición a tratamientos de estrés crónico y la administración de drogas antidepresivas, pertenece a la familia de las proteínas proteolipídicas (PLPs). En mamíferos, esta familia está compuesta por M6a, M6b y PLP/DM20. Como se mencionó anteriormente, estas proteínas muestran una alta homología entre sí compartiendo, además, una estructura similar. Dada la similitud encontrada entre los distintos miembros que conforman la familia PLP, se decidió estudiar si la expresión de los otros miembros de la familia también se encuentra alterada en el hipocampo de animales estresados crónicamente. Asimismo, teniendo en cuenta el rol descripto para M6a en la formación de filopodios (figuras 7 y 13), se decidió investigar si esta capacidad se encuentra conservada en otros miembros de la familia PLP. 3.2.1 Homología entre los miembros de la familia de las PLPs En los mamíferos, la familia de las PLPs está constituida por M6a, M6b y PLP/DM20 (Yan et al. 1993). De acuerdo con modelos de predicción estructural, estas proteínas comparten la estructura descripta en la figura 3 compuesta por cuatro dominios transmembrana (TM) separados por tres loops hidrofílicos, con los extremos amino y carboxilo terminales en el citoplasma. (Popot et al. 1991; Yan et al. 1993). En la figura 19 se muestra la identidad aminoacídica entre M6a, M6b, PLP y DM20 en la región comprendida por los cuatro dominios TM, los loops extracelulares menor y mayor, y el loop intracelular. PLP y DM20 son distintas isoformas codificadas por un mismo gen que se generan por el splicing alternativo del exón 3b. Al analizar la región completa, M6a muestra mayor identidad con M6b que con DM20. Al poseer un dominio extra de 35 aminoácidos codificado por el exón 3b, PLP presenta menor identidad con M6a. Al analizar cada región por separado, se encuentran similitudes dispares. La identidad aminoacídica más elevada se observa en el primer dominio TM, con valores de 82% para M6b y 67% para PLP y DM20 con respecto a M6a. Mientras que en el loop intracelular y el segundo dominio TM estas proteínas aún comparten una alta identidad (con valores entre el 55 % y el 65 %), no se encuentran similitudes significativas en el loop extracelular menor y en el cuarto dominio TM. En el tercer dominio TM, solo se encuentra similitud entre M6a y M6b, mientras que en el loop extracelular mayor, sólo PLP y DM20 muestran similitud con M6a. 45 Resultados EC 1 M6a TM 1 M6b TM 1 IC EC 1 82 % SNS TM 1 67 % SNS 61 % EC 2 TM 3 65 % 65 % IC TM 2 SNS 65 % SNS EC 2 TM 3 55 % (46 %) TM 4 32 % SNS 3b SNS EC 2 TM 3 55 % (51 %) TM 4 SNS 48 % IC EC 1 67 % TM 4 IC TM 2 TM 1 PLP TM 3 TM 2 EC 1 DM20 EC 2 TM 2 SNS TM 4 32 % (38 %) SNS Figura 19. Identidad aminoacídica entre miembros de la familia de las PLPs. Esquemas que muestran la identidad aminoacídica en los dominios tansmembrana (TM), el loop extracelular menor (EC 1), el loop intracelular (IC) y el loop extracelular mayor (EC 2) de M6b, DM20 y PLP, relativa a M6a. La identidad relativa en cada dominio se muestra debajo de cada diagrama. La identidad en toda la región se muestra entre paréntesis. 3b: región codificada por el exón alternativo 3b. SNS: similitud no significativa. 3.2.2 Efectos del estrés crónico sobre la expresión de los miembros de la familia de las PLPs Con el objeto de evaluar el efecto del estrés sobre la expresión de genes de la familia de las PLPs en el hipocampo, se utilizó el modelo de estrés crónico por confinamiento en ratones. Se realizaron ensayos de inmovilización de 4 horas por día, durante 21 días, con ratones machos de la cepa C57BL/6. Durante la duración del experimento, los animales estresados mostraron un menor aumento de peso que los animales control (control = 108,44 ± 2,64; estresados = 95,84 ± 1,70, los datos indican la media ± SEM de 9 animales por grupo expresada como porcentaje del peso inicial, p < 0,01 calculado con la prueba T de Student). Estos resultados indican que el grupo de animales sujeto a inmovilización resultó realmente afectado y concuerdan con lo reportado anteriormente para animales estresados con el mismo modelo de inmovilización (Magarinos et al. 1995). Una vez terminado el tratamiento de estrés se obtuvieron muestras de ARNm de los hipocampos de los ratones estresados y control. La cuantificación de los niveles de expresión de los genes de interés se realizó por la técnica de RT-PCR en tiempo real. En concordancia con experimentos anteriores, el nivel de expresión de M6a se encontró reducido en el 46 Resultados hipocampo de los animales estresados (figura 20 A). Como se muestra en la figura 20 B, los animales sometidos a estrés crónico también mostraron una reducción en los niveles de expresión de M6b en comparación con los animales control. Como se mencionó en la introducción, y se detalla en la próxima sección, se han identificado varias isoformas de M6b (Werner et al. 2001). En la determinación de los niveles de expresión de M6b por PCR en tiempo real (figura 20 B), se utilizaron oligonucleótidos en el extremo 3´UTR (del inglés, untranslated region) que amplifican todas las isoformas de M6b descriptas (figura 21). Por lo tanto, la expresión del total de las isoformas de M6b se encuentra reducida en el hipocampo de animales estresados crónicamente. A B M6a 40 40 20 0 0 Estrés Expresión relativa ** 60 20 Control E 40 Control F DM20 40 0 0 PLP DM20 * 60 20 Estrés PLP 100 80 20 40 0 nivel ARNm nivel ARNm 60 60 Estrés 100 80 80 20 Control 100 nivel ARNm 80 nivel ARNm ** 60 nivel ARNm nivel ARNm 80 PLP / DM20 100 100 100 D C M6b 80 60 40 20 0 Control Estrés Control Estrés Figura 20. Efectos del estrés crónico sobre la expresión de genes de la familia de las PLPs en el hipocampo. Ratones macho de la cepa C57BL/6 fueron crónicamente estresados (barras blancas) o utilizados como control (barras negras). Muestras de ARNm de los hipocampos de los animales fueron cuantificadas por RT-PCR en tiempo real. Los gráficos muestran los niveles de expresión de M6a (A), M6b (B), PLP/DM20 (C), DM20 (E) and PLP (F). Los niveles de expresión para cada individuo fueron normalizados con el gen de referencia ciclofilina. Los resultados están expresados como la media de cada grupo + SEM proveniente de 9 animales por grupo y como porcentaje del grupo control. *p<0,05 y **p<0,01 calculado por la prueba T de Student. Para cuantificar la expresión relativa entre PLP y DM20 (D) se utilizó un oligonucleótido antisentido en común junto a oligonucleótidos sentido específicos para los ARNm de PLP y DM20. Los resultados están expresados como la media para cada isoforma + SEM de 9 animales control y como porcentaje de PLP. 47 Resultados En el caso de PLP y DM20, sus niveles de expresión fueron medidos, en un primer momento, con oligonucleótidos que amplificaban una región del extremo 3´UTR compartida por ambas moléculas de ARNm, no habiéndose encontrado diferencias significativas entre los animales estresados crónicamente y los animales control (figura 20 C). Al cuantificar la expresión relativa de cada transcripto, se encontró que PLP se expresa alrededor de diez veces más que DM20 en el hipocampo de ratones adultos no estresados (figure 20 D). Entonces, se decidió determinar los niveles de expresión para cada isoforma en el hipocampo de animales control y estresados. Como se muestra en la figura 20 E, la expresión de DM20 se encontró disminuida en los animales estresados. Por el contrario, la expresión de PLP no se vio afectada en forma significativa por el tratamiento de estrés (figura 20 F). Por lo tanto, el estrés crónico disminuye la expresión de M6b y DM20 en el hipocampo mientras que la expresión de PLP no se encontraría alterada. 3.2.3 Isoformas de M6b Varias isoformas han sido descriptas para la proteína M6b (Werner et al. 2001). Las distintas isoformas de M6b son el resultado de la utilización de promotores alternativos para el inicio de la transcripción en combinación con eventos alternativos de splicing (figura 21). La presencia del dominio en el extremo amino de la proteína (representado en color naranja en la figura 21 y presente en las isoformas M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD, M6b y M6b ) se encuentra determinada por el sitio de inicio de la transcripción utilizado. En tanto, el splicing alternativo es responsable de la presencia del dominio en la región amino terminal de la proteína codificado por el exón II (representado en color amarillo en la figura 21 y presente en las isoformas M6b TMD, M6b TMD y M6b ), y de la inclusión del dominio (en M6b TMD, M6b TMD y M6b TMD) o el dominio (en M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD) en el extremo carboxilo de la proteína (representados en color violeta y fucsia, respectivamente, en la figura 21). La inclusión del exón alternativo III genera ARNms que codifican para proteínas más cortas (M6b y M6b ), sin los dominios TM y con el dominio en el extremo carboxilo terminal (representado en azul en la figura 21). 48 Resultados TMD Ia IV V VI VII VIII X IV V VI VII VIII X IV V VI VII VIII X IV V VI VII VIII IX X IV V VI VII VIII IX X IV V VI VII VIII IX X III IV V VI VII VIII IX X III IV V VI VII VIII IX X TMD Ib TMD Ib II TMD Ia TMD Ib TMD Ib II Ib Ib II Figura 21. Estructura de los ARNm de M6b y sus productos proteicos. El gen de M6b da origen a distintos ARNm que codifican para 8 isoformas proteicas. Los exones se encuentran representados por rectángulos y los intrones por líneas. En colores se resaltadas las regiones codificantes. Los números romanos indican el número de exón y a la derecha de cada esquema se incluye el nombre asignado a la isoforma proteica codificada por cada ARNm. Los distintos ARNm son el resultado del uso alternativo de sitios de inicio de la transcripción (exones Ia y Ib) y eventos de splicing alternativo. Los exones IV-VIII codifican para los dominios transmembrana. Las flechas azules muestran la posición de los oligonucleótidos utilizados para determinar los niveles de expresión total de M6b por PCR en tiempo real en animales estresados y control. Las flechas rojas indican la posición de los oligonucleótidos utilizados para determinar la expresión relativa de distintas isoformas de M6b. Las flechas verdes representan la ubicación de los oligonucleótidos utilizados para amplificar las secuencias codificantes (CDS) de las distintas isoformas. Adaptado de Werner et al., 2001. Para estudiar la contribución relativa de las distintas isoformas de M6b al nivel total de expresión de M6b, se determinaron los niveles de expresión de distintas isoformas en el hipocampo de animales no estresados. Se utilizaron oligonucleótidos específicos para la amplificación de los exón Ia (presente en los transcriptos que codifican para las isoformas M6b TMD y M6b TMD) y el exón Ib (presente en los ARNms que codifican para las isoformas M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD, M6b y M6b ), que representan sitios alternativos del inicio de la transcripción; así como oligonucleótidos 49 Resultados específicos para la amplificación del exón III, que sólo se encuentra presente en los ARNm que codifican para las proteínas más cortas sin los dominios TM (M6b y M6b ). Como se muestra en la figura 22, se encontraron niveles similares de moléculas de ARNm con el exón Ia y el exón Ib, lo que podría ser indicativo de un uso similar de los promotores alternativos en el hipocampo. Por el contrario, el nivel de expresión de isoformas con el exón III resultó 8 órdenes de magnitud menor (figura 22), indicando que las isoformas de M6b sin los dominios TM (M6b y M6b ) no se expresan significativamente en el hipocampo. Expresión relativa de isoformas de M6b nivel ARNm nivel ARNm 100 100 50 0,000001 0 M6b TMD M6b TMD M6b III M6b Ia TMD M6b IB TMD M6b M6b TMD M6b TMD M6b M6b exón Ia exón Ib exón III Isoformas Primers Figura 22. Niveles de expresión relativa de isoformas de M6b en el hipocampo. Muestras de ARNm de hipocampo de ratón adulto fueron cuantificadas por RT-PCR en tiempo real utilizando oligonucleótidos que amplifican los exones Ia, Ib y III de M6b. Los resultados están expresados como la media de cada grupo + SEM proveniente de 3 animales control y como porcentaje del exón Ib. La figura muestra todas las isoformas descriptas en la literatura cuyos ARNm contienen los distintos exones (Werner et al. 2001). 3.2.4 Clonado y expresión de isoformas de M6b y PLP En las secciones anteriores se mostró que un miembro de la familia de las PLPs, la glicoproteína M6a, promueve la formación de neuritas y filopodios/espinas en cultivos primarios de neuronas de hipocampo y en diversas líneas celulares (figuras 7 y 13). Por lo tanto, se decidió evaluar la capacidad de los otros miembros de la familia PLP de inducir la 50 Resultados formación de filopodios. Para ello, se procedió con el clonado de las distintas isoformas de M6b y PLP. En el caso de M6b, de las ocho isoformas descriptas en la literatura (Werner et al. 2001), representadas en la figura 21, sólo cinco pudieron ser clonadas por RT-PCR a partir de ARNm de hipocampo de ratón adulto: M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD y M6b . Moléculas de ARNm conteniendo el exón alternativo II, que codifica para el dominio en la región citosólica N terminal de la proteína, no han podido ser amplificadas, posiblemente debido a una baja expresión en el hipocampo de ratón adulto. También se clonaron por RT-PCR las secuencias codificantes para PLP y DM20. Las secuencias codificantes para las distintas isoformas de M6b, PLP y DM20 fueron clonadas como proteínas de fusión a GFP, para poder visualizar su localización y analizar su función. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo y células N2a fueron transfectados con las distintas construcciones (figura 23). Como ha sido descripto para la proteína endógena (Werner et al. 2001), GFP::M6b TMD se observa en estructuras intracelulares y en la superficie de las neuronas (figura 23 a y b). Como se muestra en la figura 23 c, imágenes de células N2a transfectadas obtenidas por microscopía confocal sugieren una localización en la membrana plasmática para la proteína de fusión GFP::M6b TMD. Las proteínas GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD y GFP::M6b TMD presentan la misma localización que GFP::M6b TMD (figura 23 d-l). La isoforma que no posee los sitios transmembrana, GFP::M6b , se localiza en el citoplasma (figura 23 m-o). Las proteínas GFP::PLP y GFP::DM20 también presentan una localización que concuerda con lo descripto para las proteínas endógenas (Thomson et al. 1997). Ambas proteínas presentan una localización similar que incluye tanto la presencia en estructuras intracelulares como una marcada expresión en la superficie celular, muy probablemente, la membrana plasmática. (figuras 23 p-u). Por último, la proteína VSVG (del inglés, G protein of Vesicular Stomatitis Virus) ha sido utilizada como proteína control de localización en la membrana plasmática (figura 22 v-x). 51 Resultados Figura 23. Localización celular de las isoformas de M6b y PLP. Los esquemas en la parte izquierda de la figura muestran una representación de las secuencias codificantes (CDS) que se clonaron como proteínas de fusión a GFP. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo y células N2a fueron transfectados con las distintas construcciones. Imágenes obtenidas por microscopía confocal muestran la localización de las proteínas de fusión en neuronas (a, d, g, j, m, p, s, v; magnificaciones b, e, h, k, n, q, t y w) y en células N2a (c, f, i, l, o, r, u y x). VSVG: proteína de membrana utilizada como control. TMD: dominios transmembrana. 3b: exón alternativo presente en PLP y no en DM20. Barra = 10 m. 52 Resultados 3.2.5 M6b y DM20 inducen la formación de filopodios en cultivos primarios de neuronas de hipocampo y en líneas celulares Con el fin de evaluar la capacidad de M6b de promover la formación de filopodios, se decidió realizar ensayos de sobreexpresión con las distintas isoformas de M6b. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados a los 7 días in vitro con GFP (control), GFP::M6a o las construcciones de GFP fusionadas a las distintas isoformas de M6b que contienen los dominios TM. Un día después de la transfección, las neuronas fueron fijadas y la actina fue teñida con faloidina (figura 24 A). Luego, se determinó el número de protrusiones en fragmentos de 20 m de neurita. Como se muestra en la superposición de la figura 24 A, las protrusiones poseen un citoesqueleto de actina, característico de los filopodios. El gráfico de la figura 24 B muestra que las distintas isoformas de membrana de M6b inducen la formación de filopodios en forma similar a M6a. Figura 24. La sobreexpresión de isoformas A F-actina Superposición GFP de membrana de M6b aumenta la densidad de filopodios. neuronas GFP::M6a Cultivos de primarios hipocampo de fueron transfectados a los 7 días in vitro con GFP, GFP::M6a, GFP::M6b TMD, GFP::M6b GFP::M6b TMD TMD, GFP::M6b TMD y GFP::M6b TMD. Un día después, las neuronas GFP::M6b TMD fueron fijadas y la actina fue teñida con faloidina (A). El número de protrusiones en GFP::M6b TMD 20 m de neurita fue cuantificado (B). El gráfico muestra la media + SEM, expresada GFP::M6b TMD como porcentaje del control (GFP), de por lo menos 80 neuritas por grupo. **p<0,01 versus GFP calculado por ANOVA de un Protrusiones / 20 μm (% control) B Densidad de filopofios ** ** ** 200 factor seguido por la prueba de Dunnet para ** ** 150 efectos post hoc. No se encontraron 100 diferencias significativas entre M6a y las 50 distintas isoformas de M6b. El gráfico 0 Control M6a M6b TMD M6b TMD M6b M6b TMD TMD muestra los resultados de un ensayo, representativo de 2 experimentos independientes. Barra = 10 m. 53 Resultados Luego, se analizó si PLP y DM20 eran capaces de modificar la densidad de filopodios en neuronas hipocampales, con un diseño experimental similar al anterior. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo de 3 días in vitro fueron transfectados con GFP, GFP::M6b , VSVG::GFP, GFP::M6a, GFP::PLP o GFP::DM20. Al día siguiente, las células fueron fijadas y la actina fue teñida con faloidina (figura 25 A). La cuantificación del número de protrusiones en 20 m de neurita reveló que la sobreexpresión de DM20 induce la formación de filopodios, aunque en menor medida que la sobreexpresión de M6a (figura 25 B). Por el contrario, la sobreexpresión de PLP no produjo un aumento en la densidad de filopodios. Para evaluar la importancia de la localización en la membrana y/o de los dominios TM, se utilizó la construcción que codifica para la expresión de la isoforma M6b que no posee los dominios TM. La sobreexpresión de GFP::M6b no produjo un aumento en la densidad de filopodios, sugiriendo que la localización de M6b en la membrana plasmática y/o la presencia de los dominios TM es crucial para su función en la formación de filopodios. Para comprobar que la sobreexpresión de cualquier proteína de membrana no es suficiente para promover el crecimiento de filopodios, se utilizó la proteína VSVG. La sobreexpresión de VSVG::GFP no resultó en un aumento en la densidad de filopodios demostrando que el efecto es específico de las proteínas M6a, M6b y DM20. A F-actina Superposición GFP Figura 25. La sobreexpresión de DM20, pero no de PLP, induce la formación de filopodios. Después de 3 días in vitro, GFP::M6b neuronas VSVG::GFP de hipocampo transfectadas con GFP, VSVG::GFP, GFP::M6a, fueron GFP::M6b , GFP::PLP o GFP::DM20. Al día siguiente, las neuronas fueron fijadas y la actina fue teñida con GFP::M6a faloidina (A). El número de protrusiones en 20 m de neurita fue cuantificado (B). El GFP::PLP gráfico muestra la media + SEM, expresado como porcentaje del control (GFP), de por lo GFP::DM20 menos 80 neuritas por grupo. **p<0,01 versus GFP, #p<0,01 versus M6a, calculado B por ANOVA de un factor seguido por la Protrusiones / 20 μm (% control) Densidad de filopofios 200 ** prueba de Dunnet para efectos post hoc. Se # ** 150 muestran los resultados de un ensayo, representativo 100 de 3 experimentos independientes. Barra = 10 m. 50 Control M6b VSVG M6a PLP DM20 54 Resultados Para estudiar la capacidad de M6b y DM20 de inducir la formación de filopodios en otras sistemas celulares, se realizaron ensayos de sobreexpresión en la línea neuronal N2a y la línea no neuronal COS-7 (figuras 26 y 27, respectivamente). Ambos cultivos fueron transfectados con las mismas construcciones utilizadas en cultivos primarios de neuronas de hipocampo. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fue marcada con faloidina para permitir la visualización de los filopodios (figuras 26 A y 27 A). Como se muestra en los gráficos de las figuras 26 B y 27 B, la sobreexpresión de GFP no resulta en un aumento en el porcentaje de células con filopodios en la línea neuronal N2a ni en la línea no neuronal COS-7. Por el contrario, la sobreexpresión de M6a, de las isoformas de M6b que poseen dominios TM y de DM20, produjo un aumento en el porcentaje de células con filopodios. En ambas líneas celulares, las isoformas de membrana de M6b fueron capaces de inducir la formación de filopodios de un modo similar a M6a. En concordancia con lo hallado en cultivos primarios de neuronas de hipocampo, DM20 sólo indujo levemente la formación de filopodios en N2a en comparación con M6a (figura 26 B). Sin embargo, en células no neuronales COS-7, DM20 indujo la formación de filopodios notablemente, con valores similares a los obtenidos para M6a (figura 27 B). Por lo tanto, al igual que sucede para M6a, la capacidad de las isoformas de membrana de M6b y DM20 de inducir la formación de filopodios no se encuentra restringida a cultivos primarios de neuronas de hipocampo y cultivos de líneas neuronales (N2a) sino que también se observa en cultivos de células no neuronales (COS-7). De forma similar a lo realizado con la proteína M6a se construyeron vectores de expresión que codifican para la expresión de las distintas isoformas de membrana de M6b de forma separada de GFP (GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD y GFP+M6b TMD). Así, las células transfectadas expresan GFP y son fácilmente reconocibles, pero la proteína de interés es expresada sin adición de la proteína reportera, lo que podría alterar su función. Se realizaron ensayos de sobreexpresión en N2a con estas construcciones. Como se muestra en el gráfico de la figura 28, el porcentaje de células con filopodios es mayor en las células que sobreexpresan las distintas isoformas de M6b de forma independiente de GFP que en células sin transfectar. Por lo tanto, las distintas isoformas de membrana M6b son capaces de inducir la formación de filopodios por sí mismas, no estando la proteína reportera GFP involucrada en esta función. 55 Resultados A Cél. no transfectada F-actina GFP F-actina GFP::M6a F-actina GFP::M6b TMD F-actina GFP::M6b TMD F-actina GFP::M6b TMD F-actina GFP::M6b TMD F-actina GFP::DM20 F-actina B % cél. con filopodios Células N2a con filopodios 100 ** 80 ** * ** ** 60 # ** 40 20 0 GFP M6a M6b TMD M6b TMD M6b TMD M6b TMD DM20 Figura 26. Inducción de la formación de filopodios por M6b y DM20 en células N2a. Cultivos de células neuronales N2a sin diferenciar fueron transfectados con GFP (control negativo), GFP::M6a (control positivo), GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD o GFP::DM20. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fue teñida con faloidina (A). Los gráficos de la figura B muestran el porcentaje de células con filopodios. Como control se utilizaron células sin transfectar del mismo preparado. Las barras blancas representan las células transfectadas con las construcciones que se indican debajo de las mismas mientras que las barras negras representan las células control sin transfectar provenientes de los mismos preparados. Los resultados están expresados como media + SEM de un mínimo de 6 preparados de al menos 2 experimentos independientes. *p<0,05 y ** p<0,01 calculados con la prueba T de Student comparando las células transfectadas y sin transfectar dentro de cada grupo. #p<0,01 calculado con la prueba T de Student versus incremento en M6a. Barra = 10 m. 56 Resultados A Cél. no transfectada F-actina GFP F-actina GFP::M6a F-actina GFP::M6b TMD F-actina GFP::M6b TMD F-actina GFP::M6b TMD F-actina GFP::M6b TMD F-actina GFP::DM20 F-actina B % cél. con filopodios Células COS-7 con filopodios 100 ** ** ** ** M6b TMD M6b TMD M6b TMD 80 ** ** 60 40 20 0 GFP M6a M6b TMD DM20 Figura 27. La sobreexpresión de M6b y DM20 induce la formación de filopodios en células COS-7. Cultivos de células COS-7 fueron transfectados con GFP (control negativo), GFP::M6a (control positivo), GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD o GFP::DM20. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fue teñida con faloidina (A). Los gráficos de la figura B muestran el porcentaje de células con filopodios. Como control se utilizaron células sin transfectar del mismo preparado. Las barras blancas representan las células transfectadas con las construcciones que se indican debajo de las mismas mientras que las barras negras representan las células control sin transfectar provenientes de los mismos preparados. Los resultados están expresados como media + SEM de un mínimo de 6 preparados de al menos 2 experimentos independientes. **p<0,01 calculado con la prueba T de Student. Barra = 10 m. 57 Resultados % cél. con filopodios Células N2a con filopodios 100 ** 80 ** ** ** M6b TMD M6b TMD M6b TMD ** 60 40 20 0 GFP M6a M6b TMD Figura 28. La sobreexpresión de M6b, independientemente de GFP, induce la formación de filopodios. Cultivos de células N2a sin diferenciar fueron transfectados con GFP (control negativo), GFP::M6a (control positivo), GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD o GFP+M6b TMD. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fue teñida con faloidina para permitir la visualización de los filopodios. El gráfico muestra el porcentaje de células con filopodios. Como control se utilizaron células sin transfectar del mismo preparado. Las barras blancas representan las células transfectadas con las construcciones que se indican debajo de las mismas mientras que las barras negras representan las células control provenientes de los mismos preparados. Los resultados están expresados como media + SEM de un mínimo de 6 preparados de al menos 2 experimentos independientes. **p<0,01 calculado con la prueba T de Student. En conjunto, los resultados de esta sección indican que las isoformas de membrana de M6b y DM20 comparten con M6a la capacidad de inducir la formación de filopodios. Por el contrario, la proteína PLP, que constituye el único miembro de la familia de las PLPs cuya expresión no se encontró alterada por la exposición a estrés crónico, tampoco induce la formación de filopodios en cultivos primarios de neuronas de hipocampo. 58 Resultados 3.3 ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN EL GEN QUE CODIFICA PARA LA PROTEÍNA M6a (GPM6A) EN PACIENTES CON DEPRESIÓN La etiología de la depresión involucra tanto factores ambientales como genéticos (Fava et al. 2000). Los genes involucrados en la enfermedad no han sido todavía determinados. Sin embargo, se han hallado polimorfismos asociados a la patogénesis de la depresión y/o comportamientos suicidas en genes relacionados con el crecimiento de neuritas y plasticidad sináptica, y en genes cuya expresión se encuentra modulada por el estrés y el tratamiento con antidepresivos (Bellivier et al. 1998; Kunugi et al. 2004; Tadokoro et al. 2005; van West et al. 2006; Iga et al. 2007; Sarchiapone et al. 2008). Dado el rol descripto en este trabajo para M6a en la extensión de procesos y en la plasticidad neuronal, y debido a la regulación de su expresión por tratamientos de estrés y antidepresivos (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006), decidimos analizar la secuencia correspondiente al gen que codifica para la proteína M6a (GPM6A) en ADN genómico de pacientes con depresión. Muestras de ADN genómico de 28 personas (17 mujeres y 9 hombres) diagnosticadas con distintos tipos de depresión fueron utilizadas como molde en reacciones de PCR. En un principio se amplificaron las regiones correspondientes a todos los exones (secuencias presentes en el ARNm maduro) del gen GPM6A. Se analizaron estas regiones ya que una alteración en los exones es más probable que altere la función y/o la expresión de la proteína. Los productos de amplificación fueron luego secuenciados y se analizó la existencia de alteraciones. Como se muestra en la figura 29 A, se han descripto 12 polimorfismos en los exones del gen GPM6A humano. La secuenciación de nuestras muestras no reveló la existencia de ningún otro sitio polimórfico en estos exones. Mientras realizábamos estos estudios, se publicó una investigación en la que se asociaba un polimorfismo en el segundo intrón del gen GPM6A (rs10520303) con un subgrupo de pacientes con síntomas depresivos dentro de una población de individuos diagnosticados con esquizofrenia (Boks et al. 2007). Por este motivo, también amplificamos y analizamos esta región en nuestras muestras. La figura 29 B muestra una tabla con las frecuencias genotípicas y alélicas en los distintos sitios polimórficos obtenida para los pacientes con depresión y las frecuencias publicadas en la base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information) para una población de origen europeo (HapMap-CEU), ya que nuestras muestras analizadas provenían de pacientes suecos. Como se observa en la tabla de la figura 29, la mayoría de los sitios resultaron no ser polimórficos en la población estudiada. Para dos de estos sitios (polimorfismos 6 y 11 en la figura 29), la base de datos tampoco muestra polimorfismos en la población de origen 59 Resultados europeo analizada. Para los otros sitios que no resultaron ser polimórficos en nuestra muestra no existe información acerca de la frecuencia alélica ni genotípica en las bases de datos consultadas. En nuestras muestras, cinco sitios resultaron polimórficos. Para los polimorfismos 8 y 9, no se tiene información sobre la frecuencia alélica ni genotípica en bases de datos. Por otro parte, para los otros tres sitios (polimorfismos 7, 12 y 13, este último recientemente asociado a síntomas de depresión en individuos diagnosticados con esquizofrenia) se observan frecuencias genotípicas y alélicas en bases de datos que difieren de lo observado en nuestra muestra. Sin embargo, la población estudiada es muy reducida y se carecen de muestras control apropiadas para determinar estadísticamente si existe una asociación entre alguno de estos polimorfismos y la depresión. A 1 2 13 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B SNP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Identificación rs11930023 rs11545191 rs11729990 rs11545192 rs11545193 rs1049820 rs3733398 rs1049835 rs6820412 rs11545194 rs12499061 rs17061725 rs10520303 Frecuencia genotípica Frecuencia alélica Pacientes con depresión Base de datos Pacientes con depresión Base de datos 1 AA 1 CC 1 AA 1 AA 1 TT 1 GG 0,964 GG ; 0,036 GT 0,179 CC ; 0,5 CT ; 0,321 TT 0,892 AA ; 0,107 CA 1 CC 1 CC 0,892 TT ; 0,107 CT 0,821 GG ; 0,179 GC ND ND ND ND ND 1 GG 0,867 GG ; 0,1 GT ; 0,033 TT ND ND ND 1 CC 0,967 TT; 0,033 CT 0,9 GG ; 0,083 GC ; 0,017 CC 1A 1C 1A 1A 1T 1G 0,982 G ; 0,018 T 0,571 T ; 0,429 C 0,875 AA ; 0,125 AC 1 CC 1C 0,946 T ; 0,054 C 0,911 G ; 0,089 C ND ND ND ND ND 1G 0,917 G ; 0,083 T ND ND ND 1C 0,983 T ; 0,017 C 0,942 G ; 0,058 C Figura 29. Polimorfismos en el gen GPM6A humano. A. Esquema representando al gen GPM6A humano. Se destacan los exones (rectángulos), intrones (líneas punteadas) y las regiones codificantes que codifican para la proteína M6a (rectángulos gris claro). Las flechas indican la posición de los polimorfismos descriptos en los exones y un polimorfismo intrónico (rs10520303) recientemente asociado a pacientes con síntomas de depresión entre individuos diagnosticados con esquizofrenia. B. Tabla que resume las frecuencias genotípicas y alélicas determinadas en individuos suecos diagnosticados con distintos tipos de depresión (n = 28, de los cuales 21 pacientes fueron diagnosticados con depresión mayor; 3 con desorden depresivo tipo NOS, del inglés, Not Otherwise Specified; 2 con trastorno bipolar de tipo II; 1 con desorden esquizo-afectivo de tipo bipolar y 1 con distimia). También se indican las frecuencias genotípicas y alélicas para una población de origen europeo (HapMap-CEU) publicada en la base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information). Los polimorfismos cuya frecuencia genotípica y alélica en la muestra de pacientes con depresión difiere de la publicada en base de datos se encuentran enmarcados en rojo. ND: información no disponible. 60 Discusión 4. DISCUSIÓN En el presente trabajo se determinó que la proteína M6a, cuya expresión en el hipocampo se encuentra alterada por la exposición al estrés crónico, induce la formación de neuritas, filopodios/espinas y, probablemente, sinapsis. Luego, se extendió el análisis a otros miembros de la familia de las PLPs, estableciéndose que la expresión de M6b y DM20 en el hipocampo también se encuentra regulada por el estrés crónico. Además, se vio que M6b y DM20 comparten con M6a la capacidad de inducir la formación de filopodios. Finalmente se inició el estudio de polimorfismos en el gen GPM6A que podrían encontrarse asociados a la depresión. Estudios previos en nuestro laboratorio habían determinado que la expresión del gen que codifica para la proteína M6a se encontraba alterada en diversos modelos animales de estrés crónico y modulada por la administración de distintas drogas antidepresivas (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006). Sin embargo, al inicio de este trabajo de tesis, era escasa la información sobre la función biológica de la proteína M6a. Los resultados aquí mostrados indican que, en cultivos primarios de neuronas de hipocampo, la proteína M6a se encuentra en la membrana del soma y los procesos neuronales, concentrándose en estructuras ricas en actina tipo filopodios (figura 4). La sobreexpresión de M6a induce la extensión de neuritas y la formación de filopodios/espinas en neuronas hipocampales (figuras 6 y 7). Por el contrario, una reducción en los niveles de M6a, provoca una disminución en la densidad de filopodios/espinas y en el número de puntos de sinaptofisina en cultivos primarios de neuronas de hipocampo (figuras 11 y 12). Por lo tanto, se presentó sobrada evidencia experimental de que M6a tendría un rol determinante en el crecimiento de neuritas y en la formación de filopodios/espinas pudiendo estar, además, involucrada en el establecimiento de sinapsis. Además, se estableció que la capacidad de M6a de inducir la formación de filopodios no se encuentra restringida a cultivos primarios de neuronas de hipocampo, sino que se extiende a cultivos celulares neuronales como N2a y PC12, y la línea no neuronal COS-7 (figura 13). Una vez identificada una función biológica de M6a, se extendió el análisis a otros miembros de la familia de las proteínas proteolipídicas: M6b y PLP/DM20. Así, se determinó que la expresión de M6b y DM20 también se encuentra reducida en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico (figuras 20 B y 20 E). Por el contrario, la expresión de PLP, una variante de splicing de DM20, no se encuentra modulada por la exposición a estrés 61 Discusión crónico por confinamiento (figura 20 F). Al iniciar esta tesis, varias isoformas proteicas de M6b habían sido descriptas, sin embargo, ninguna función biológica les había sido asignada (Werner et al. 2001). En este trabajo se determinó que cuatro isoformas de M6b, que difieren en sus extremos amino y carboxilo terminales pero que se localizan en la membrana plasmática ya que poseen los dominios TM, promueven la formación de filopodios en cultivos primarios de neuronas de hipocampo, en células neuronales N2a y células no neuronales COS-7 (Figuras 24, 26 y 27). Por lo tanto, los extremos amino y carboxilo terminales de M6b no serían determinantes para esta función. Por otro lado, una isoforma citosólica que carece los dominios TM no induce la extensión de filopodios, demostrando que las regiones TM y/o la localización en la membrana plasmática son esenciales para la función de M6b en la formación de filopodios (figura 25). La cuantificación de la expresión de distintas isoformas de M6b reveló que en el hipocampo de ratón adulto, las isoformas que carecen los dominios TM se expresan de forma despreciable en comparación con las isoformas de membrana (figura 22). Al analizar la capacidad de PLP y DM20 de inducir la extensión de filopodios, se vio que DM20 induce la formación de filopodios, aunque en menor medida que M6a, en tanto que PLP no comparte esta función con los otros miembros de la familia (figuras 25, 26 y 27). Nuestros resultados revelan, además, que la isoforma PLP se expresa aproximadamente 10 veces más que la isoforma DM20 en el hipocampo murino adulto (figura 20 D). 4.1 M6a y M6b podrían estar involucradas en el remodelado neuronal observado en el hipocampo de animales estresados crónicamente El estrés crónico induce alteraciones plásticas en el hipocampo, caracterizadas por una disminución en la ramificación de las dendritas apicales y una reducción en el largo total de las dendritas, así como por una marcada retracción de las espinas y una reducida densidad sináptica en las neuronas piramidales de la zona CA3 (Watanabe et al. 1992; Magarinos et al. 1996; Sousa et al. 2000; Sandi et al. 2003; Stewart et al. 2005). También se ha descripto en el hipocampo de animales estresados crónicamente, una reorganización estructural en las terminaciones de las fibras musgosas, que incluye una reducción en su superficie y en el número de sinapsis con las dendritas de las neuronas piramidales de la CA3 (Magarinos et al. 1997; Sousa et al. 2000). La expresión de las glicoproteínas de membrana M6a y M6b se encuentra reducida en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico. En el presente trabajo se demostró 62 Discusión que, en cultivos primarios de neuronas hipocampales, la densidad de filopodios/espinas así como el número de puntos sinápticos se encuentran modulados por los niveles de expresión de estas proteínas. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la disminución en los niveles de expresión de M6a y M6b podría ser, en parte, responsable de las alteraciones morfológicas observadas en el hipocampo de animales estresados crónicamente. De acuerdo con esta hipótesis, M6a y M6b poseen una alta expresión en las neuronas piramidales de la zona CA3 del hipocampo y en las neuronas granulares del giro dentado de ratón adulto (Yan et al. 1996). En un trabajo reciente se demostró que, en el cerebro de rata adulta, la proteína M6a se localiza en los axones de las neuronas del giro dentado que conforman la vía de las fibras musgosas (Cooper et al. 2008). Estos axones, que constituyen la principal ruta de comunicación entre el giro dentado y la zona CA3 del hipocampo, no están mielinizados (Blackstad et al. 1961; Frotscher et al. 2006) y presentan protrusiones axonales únicas tipo filopodios (Acsady et al. 1998). Resulta interesante destacar que M6a estaría enriquecida en estas protrusiones (Cooper et al. 2008). Por lo tanto, la disminución en la expresión de M6a podría estar específicamente involucrada en la remodelación observada en las terminales de las fibras musgosas de animales sometidos a estrés crónico. Asimismo, los aferentes glutamatérgicos de las fibras musgosas mediarían la atrofia de las neuronas piramidales de la CA3 encontrada en animales estresados, ya que el daño es prevenido por el tratamiento con fenitoína, una droga que reduce la liberación de aminoácidos excitatorios (Watanabe et al. 1992), y por la administración de antagonistas de receptores de glutamato tipo NMDA (Magarinos et al. 1995). De este modo, las alteraciones en las dendritas de las neuronas piramidales de la zona CA3 también podrían responder a la expresión diferencial de M6a en el hipocampo de animales estresados. La localización subcelular de la proteína M6b no ha sido estudiada en el cerebro de animales adultos. Sin embargo, dada la expresión del transcripto tanto en neuronas del giro dentado como de la zona CA3 (Yan et al. 1996), M6b podría estar involucrada en el remodelado de las fibras musgosas así como en las modificaciones de las dendritas de las neuronas piramidales de la zona CA3 observados en el hipocampo de animales estresados. Las consecuencias celulares de la expresión reducida de DM20 en el hipocampo de animales estresados crónicamente aún deben ser evaluadas. Una relación directa entre la expresión de DM20 y las alteraciones en las neuronas del hipocampo es difícil de concebir ya que DM20 no se expresaría en células neuronales (Verity et al. 1988; Yan et al. 1993; Yan et al. 1996). 63 Discusión 4.2 Evolución y homología funcional entre los miembros de la familia de las proteínas proteolipídicas Nuestros resultados revelan que M6a, M6b y DM20 están involucradas en la formación de filopodios. La homología funcional encontrada entre estas tres proteínas podría responder a la alta identidad aminoacídica que presentan, lo que podría explicarse en términos de la evolución de los genes de la familia de las proteínas proteolipídicas. Como se muestra en la figura 30, se cree que las proteínas proteolipídicas evolucionaron a partir de un único gen ancestral presente en los bilaterados, emergiendo luego, en el linaje de los vertebrados, tres genes homólogos a M6a, M6b y PLP/DM20 de mamíferos (Schweitzer et al. 2006). Por lo tanto, estas proteínas habrían evolucionado antes que la aparición de la mielina, por lo que su función en la mielinización fue adquirida tiempo después. En concordancia, DM20 (o su homólogo DM) emergió al mismo tiempo que la mielina, mientras que el dominio exclusivo de PLP, que incrementaría la eficiencia de inserción en la mielina (Trapp et al. 1997), fue adquirido con posterioridad. La alta identidad aminoacídica entre DM20 y las proteínas neuronales M6a y M6b, podría explicar la homología funcional en la inducción de la formación de filopodios y su regulación por estrés. Homo (3) Mus (3) Mamíferos Gallus(3) Aves Xenopus (5) Danio (6) Squalus (3) Raja (3) Anfibios Teleósteos Peces cartilaginosos Ciona (2) Caenorhabditis (1) Agnatos Ascidios Nematodos Anopheles (1) Apis (1) Bombyx (1) Drosophila (1) Artrópodos Tetrapodos V IV Vertebrados con mandíbula III Vertebrados II Cordados I Bilaterados Figura 30. Evolución de los genes de la familia de las proteínas proteolipídicas. El esquema muestra la evolución propuesta para los miembros de la familia de las PLPs. Los números entre paréntesis muestran la cantidad de genes de proteínas proteolipídicas en cada género. Las flechas muestran las duplicaciones genómicas propuestas. Los números romanos indican pasos trascendentales en la evolución de los genes de las proteínas proteolipídicas. I: gen ancestral. II: duplicación del genoma en los cordados tempranos, dando como resultando 2 genes homólogos a M6a y M6b. III: emergencia del tercer gen que codifica para una proteína proteolipídica en los vertebrados (homólogo a DM20), al tiempo que aparece la mielina. IV: incorporación de proteína homóloga a DM20 a la mielina. V: emergencia del exón específico de PLP en los tetrápodos. Adaptado de Schweitzer et al., 2006. 64 Discusión Si bien los miembros de la familia de las proteínas proteolipídicas comparten una alta identidad aminoacídica, su patrón espacial y temporal de expresión en el sistema nervioso murino varía considerablemente. La expresión más temprana de M6a se observa en neuronas post mitóticas del cerebro y la médula espinal a partir del décimo día del desarrollo embrionario (E10). Luego, en el cerebro adulto, M6a se expresa exclusivamente en neuronas del hipocampo y de la corteza cerebral y en las células granulares del cerebelo (Yan et al. 1996). En contraste, durante el desarrollo embrionario, M6b se localiza en la zona ventricular de la médula espinal, encontrándose tanto en células neuronales hipocampales y corticales, así como en la glía del cerebelo y de la corteza en el animal adulto (Yan et al. 1996). Por otro lado, la expresión de PLP/DM20 se limita a oligodendrocitos (Yan et al. 1996). Algunos estudios revelan la expresión de PLP/DM20, sólo a partir del primer día post natal (P0) (Baron et al. 1993; Yan et al. 1996), mientras que otros la detectan en estadios embrionarios (Ikenaka et al. 1992; Timsit et al. 1992; Yu et al. 1994). El desarrollo de las neuronas hipocampales in vitro se inicia con la extensión de neuritas del soma celular, especializándose luego estas extensiones en dendritas y axones (Dotti et al. 1988). Aunque el mecanismo por el cual las neuritas se desarrollan no se encuentra totalmente dilucidado, estudios recientes in vivo e in vitro muestran que la formación de filopodios es un paso clave para el inicio de la neuritogénesis en neuronas corticales (Dent et al. 2007; Kwiatkowski et al. 2007). La función en la extensión de neuritas y la formación de filopodios descripta para M6a y M6b en el presente trabajo y sus patrones de expresión sugieren que estas podrían estar involucradas en el desarrollo del sistema nervioso, más específicamente en los primeros pasos de la neuritogénesis, así como en la maduración neuronal. En concordancia con nuestros resultados, estudios recientes han demostrado un rol para M6a en la extensión de neuritas en células neuronales de la retina (Zhao et al. 2008). En oligodendrocitos, la capacidad de M6b y DM20 de inducir la extensión de procesos podría ser necesaria en los primeros pasos de la mielinización, en donde el crecimiento de procesos ha sido observado (Trapp et al. 1997). Por otro lado, hace tiempo que se concibe una función alternativa para DM20, independiente a la de un componente estructural de la mielina o a la de un factor clave para la diferenciación y la supervivencia de los 65 Discusión oligodendrocitos (Knapp 1996; Nadon et al. 1997). Esta hipótesis se basa en la expresión de DM20 en células no mielinizantes como miocardiocitos, células embrionarias del sistema nervioso y neuroblastomas (Campagnoni et al. 1992; Ikenaka et al. 1992; Timsit et al. 1992). En concordancia, en el presente trabajo se describe una nueva función para la proteína DM20 en la extensión de filopodios que no se encuentra restringida a células de fenotipo neuronal, sino que también se observa en células COS-7. 4.3 Mecanismos que subyacerían la formación de filopodios mediada por las proteínas proteolipídicas Los miembros de la familia de las proteínas proteolipídicas han sido estudiados por más de 50 años (Folch et al. 1951). Originalmente, fueron asociados con la extensión de procesos hace 15 años (Lagenaur et al. 1992), y sólo han sido involucrados en la formación de filopodios recientemente en nuestro laboratorio (Alfonso et al. 2005). Los mecanismos mediante los cuales estas proteínas inducen la formación de filopodios son aún desconocidos. Sin embargo, de acuerdo con el resultado de distintas investigaciones se han generado diversas especulaciones. Todas las proteínas proteolipídicas involucradas en la extensión de procesos son proteínas de membrana que compartirían una estructura que incluye dos loops extracelulares que podrían interactuar con ligandos externos. Esta hipótesis se encuentra sustentada por la evidencia experimental que la incubación con anticuerpos anti M6a interfiere con la extensión de neuritas en cultivos neuronales (Lagenaur et al. 1992). Las proteínas proteolipídicas también podrían interactuar con otras proteínas de membrana. En este sentido, se ha descripto que PLP/DM20 forma un complejo con integrinas en oligodendrocitos (Gudz et al. 2002). Además, se ha comprobado la interacción de M6a con el receptor de opioides y se sugirió un rol para esta glicoproteína en la regulación de la endocitosis y el tránsito intracelular de receptores acoplados a proteína G (Wu et al. 2007; Liang et al. 2008). En nuestro laboratorio, actualmente se está trabajando en la identificación de proteínas que interactúan con M6a, tanto ligandos extracelulares, como proteínas de membrana y proteínas intracelulares. Las proteínas proteolipídicas podrían encontrarse asociadas a microdominios de membrana enriquecidos en lípidos (lipid rafts). De acuerdo con esta hipótesis, se ha observado la interacción de PLP/DM20 con membranas ricas en colesterol (Simons et al. 2000). Los lipid rafts han sido asociados con el transporte intracelular de membranas y la traducción de señales (Simons et al. 1997; Simons et al. 2000). En este sentido, DM20 ha 66 Discusión sido involucrada en el transporte intracelular de distintas moléculas (Nadon et al. 1998) y la expresión aberrante de PLP perturba la distribución celular del colesterol (Simons et al. 2002), lo que ha sido asociado con una interferencia en el tráfico intracelular de proteínas (Butchbach et al. 2004). La presencia de M6a en fracciones de membranas ricas en lípidos tipo lipid rafts está siendo actualmente evaluada en nuestro laboratorio. Se ha sugerido que M6a podría actuar como un canal de calcio (Mukobata et al. 2002). En concordancia, alteraciones en la concentración de calcio intracelular han sido involucradas en la regulación de la extensión de neuritas y en la actividad de filopodios y/o espinas (Lau et al. 1999; Nikonenko et al. 2002). Sin embargo, en la actualidad no existen evidencias suficientes para considerar que M6a sería un canal de calcio. Los procesos de formación y crecimiento de neuritas, filopodios y espinas, se encuentran gobernados por interacciones de adhesión celular y por las fuerzas resultantes de la polimerización del citoesqueleto de actina (Luo 2002). Se ha demostrado que proteínas involucradas en la estructura y dinámica de la actina pueden afectar la morfología de las dendritas, el crecimiento de espinas y el establecimiento de sinapsis (Nakayama et al. 2000; Zhang et al. 2001; Penzes et al. 2003; Zito et al. 2004). Si bien los estudios realizados en esta tesis muestran que M6a no interacciona directamente con los microfilamentos de actina, ya que la disrupción de los mismos no altera la localización de la proteína (figura 15), M6a podría estar interactuando con otras proteínas involucradas en la regulación del citoesqueleto de actina. La familia de proteínas Rho GTPasas constituye una vía de señalización asociada a la regulación del citoesqueleto de actina en diversos tipos celulares, incluyendo fibroblastos, células epiteliales y endoteliales, líneas neuronales y neuronas tanto de animales vertebrados como de invertebrados (Hall 1998; Luo 2002). En este sentido, las GTPasas pequeñas RhoA, Rac1 y Cdc42 han sido frecuentemente asociadas a la formación de filopodios y espinas (Luo 2000; Nakayama et al. 2000). Nuestros resultados indicarían que la formación de filopodios inducida por M6a no estaría mediada por ninguna de estas tres GTPasas pequeñas. Sin embargo, M6a podría estar actuando a través de otros miembros de la familia recientemente identificados, como Rif, RhoD, TC10 y Wrch1, que también han sido involucrados en la remodelación del citoesqueleto de actina (Ridley 2006). Con el fin de identificar aminoácidos clave de la glicoproteína M6a en la formación de filopodios, nuestro laboratorio ha realizado un análisis de diversas mutantes de esta proteína. En primer lugar, se mutaron los posibles sitios intracelulares de fosforilación, construyéndose tanto mutantes simples para cada sitio, así como una mutante múltiple en 67 Discusión donde todos los posibles sitios de fosforilación en los extremos amino y carboxilo terminales han sido sustituidos. La sobreexpresión de todas estas mutantes de fosforilación, que conservan su localización en la membrana plasmática, induce la formación de filopodios de un modo similar a M6a wild type, tanto en cultivos primarios de neuronas de hipocampo como en células N2a (Recúpero, M. resultados de nuestro laboratorio no publicados). Sin embargo, el análisis de cultivos de neuronas hipocampales vivos por microscopía de time lapse ha revelado que la motilidad de los filopodios inducidos por la mutante múltiple en los sitios intracelulares de fosforilación, es menor que la de las protrusiones promovidas por la sobreexpresión de M6a wild type (Brocco, M. resultados de nuestro laboratorio no publicados). La motilidad de los filopodios y/o espinas es clave para la plasticidad sináptica ya que ha sido asociada con la formación de nuevas sinapsis (sinaptogénesis) y con el remodelado de conexiones sinápticas preexistentes (Dunaevsky et al. 2003). Estudios de fosfoproteómica de sinaptosomas de corteza cerebral humana, comprobaron que M6a se encuentra fosforilada en el residuo S267 ubicado en el extremo carboxilo terminal (DeGiorgis et al. 2005). Según programas de predicción, este residuo sería un sitio de fosforilación para PKC. En concordancia, los sitios intracelulares de fosforilación para PKC han sido propuestos como parte de un sistema de regulación para la función de M6a, ya que el tratamiento de células PC12 con inhibidores de la PKC anula el efecto de esta proteína en el incremento de calcio intracelular inducido por NGF (Mukobata et al. 2002). Con el objeto de evaluar si la glicosilación de M6a mediaría los efectos en la inducción de filopodios, se mutaron dos posibles sitios de N-glicosilación que se encuentran localizados en el loop extracelular mayor. Estudios preliminares en cultivos de neuronas de hipocampo y cultivos de células N2a muestran que la sobreexpresión de esta doble mutante induce la formación de filopodios en niveles comparables a M6a wild type. Resultados similares fueron obtenidos al mutar los residuos de cisteína presentes en el loop extracelular menor. Estos sitios podrían resultar clave para el establecimiento de puentes disulfuro, lo que podría ser necesario para el correcto plegamiento y función de la proteína. Sin embargo, los primeros ensayos con estas proteínas revelan que estas mutantes mantienen su localización celular, son reconocidas por el anticuerpo anti M6a e inducirían la formación de filopodios en forma semejante a M6a wild type. Por otro lado, la mutante M6a C164A, modificada en el loop extracelular mayor, presenta un cambio en la localización de la proteína, que queda retenida en el retículo, probablemente por una alteración en el plegamiento de la misma. Resulta interesante destacar que la mutación de dos cisteínas 68 Discusión presentes en el loop extracelular mayor (M6a C174A C192A) da como resultado una proteína que se localiza en la membrana plasmática pero que no es reconocida por el anticuerpo anti M6a. Esta mutante es incapaz de aumentar la densidad de filopodios en neuronas hipocampales y en cultivos de N2a, sugiriendo un rol clave para la conformación del loop extracelular mayor en la formación de filopodios (Fuchsova, B. resultados de nuestro laboratorio no publicados). Como se describió en este trabajo, las mutantes en los posibles sitios de palmitoilación y fosforilación extracelulares conservan su localización celular y la capacidad de inducir la formación de filopodios, indicando que estas modificaciones post traduccionales no serían necesarias para esta función de M6a. Sin embargo, no se descarta la relevancia de estas modificaciones para otras funciones tales como la motilidad de las protrusiones inducidas, como ha sido demostrado para la mutante en los sitios de fosforilación intracelulares (Brocco, M. resultados de nuestro laboratorio no publicados), u otras propiedades aún no descriptas para M6a. Si bien representa un tema de activa investigación en nuestro laboratorio, el mecanismo por el cual las proteínas proteolipídicas inducen la formación de filopodios, no ha sido aún esclarecido. El entendimiento de los procesos involucrados en la formación de filopodios por estas proteínas, sería importante, no sólo para comprender el funcionamiento de las mismas, sino que también podría contribuir en la identificación de mecanismos moleculares responsables de las alteraciones plásticas observadas en el hipocampo de animales estresados y en la acción de drogas antidepresivas. 4.4 M6a y la acción terapéutica de los antidepresivos A pesar de investigaciones realizadas durante décadas, los mecanismos que subyacen la acción terapéutica de los antidepresivos no han sido acabadamente dilucidados. Al identificarse el mecanismo de acción agudo de los antidepresivos sobre la actividad de los neurotransmisores monoamínicos, se elaboró la teoría monoamínica de la depresión. Según esta teoría, la depresión es causada por una disfunción en las sinapsis serotoninérgicas y noradrenérgicas (Owens 2004). Sin embargo, las drogas antidepresivas deben ser suministradas por períodos superiores a dos semanas para obtener resultados, lo que indica que un aumento en la transmisión de sinapsis que involucran neurotransmisores monoamínicos per se no sería el único mecanismo por el cual estas drogas ejercen sus efectos terapéuticos. 69 Discusión En los últimos años, se han formulado varias nuevas hipótesis acerca de la acción terapéutica de las drogas antidepresivas que no resultan mutuamente excluyentes. Una hipótesis propuesta por Florian Holsboer y sus colaboradores establece la disrupción del eje HPA como causa de la depresión y atribuye la acción terapéutica de los antidepresivos a la normalización de dicho sistema (Holsboer et al. 1996; Holsboer 2000). Otros investigadores proponen que la depresión podría estar relacionada a alteraciones en la plasticidad neuronal, que resulta revertida por el tratamiento con antidepresivos (Manji et al. 2001; Fuchs et al. 2004). La neurogénesis, un caso particular de plasticidad neuronal, ha sido involucrada en la etiología de la depresión y en el mecanismo de acción de los antidepresivos en distintas publicaciones (Jacobs et al. 2000; Santarelli et al. 2003). La hipótesis neurotrófica de la depresión y la acción de los antidepresivos sostiene que las alteraciones neuroplásticas podrían ser consecuencia de una expresión diferencial de neurotrofinas (Duman et al. 1997; Duman 2004). Las nuevas hipótesis, que involucran la remodelación estructural, explicarían el retardo en la acción de los antidepresivos. Los resultados del presente trabajo concuerdan con las hipótesis que establecen a la plasticidad neuronal como base de la acción terapéutica de los antidepresivos. En concordancia, se ha demostrado que la proteína M6a, cuyos niveles de expresión se encuentra regulado por la administración de distintas drogas antidepresivas (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006), está involucrada en plasticidad neuronal ya que promueve la extensión de neuritas y la formación de filopodios/espinas (Alfonso et al. 2005). Resulta importante destacar que las hipótesis que involucran a la plasticidad neuronal en la etiología de la depresión y en la acción terapéutica de las drogas antidepresivas se basan en correlaciones observadas entre individuos con depresión y/o tratamiento con antidepresivos y remodelación neuronal. Sin embargo, todavía se desconoce si las alteraciones estructurales son la causa, la consecuencia o simplemente correlacionan con los estados de depresión y la acción de los antidepresivos. 4.5 Polimorfismo en el gen GPM6A asociado a síntomas de depresión La depresión presenta en su etiología tanto factores ambientales como genéticos (Fava et al. 2000; Lesch 2004). Entre los determinantes ambientales, se destaca la exposición a situaciones de estrés (Kessler 1997; Kendler et al. 1999; Paykel 2001). Las bases genéticas de la enfermedad aún constituyen un interrogante. Esto probablemente responda a la existencia de un gran número de genes implicados, donde cada uno aporta un pequeño 70 Discusión componente para el desarrollo de la patología (Burmeister 1999). Además, la participación de un factor ambiental, dificulta aún más la identificación del componente hereditario. Estudios de resonancia magnética han revelado una reducción selectiva del volumen del hipocampo en pacientes con depresión (Sheline et al. 1999; Bremner et al. 2000; Mervaala et al. 2000; MacQueen et al. 2003; Sheline et al. 2003). La reducción en el volumen de la formación hipocampal podría deberse, en parte, a alteraciones en la morfología celular y la plasticidad neuronal. Por ello, se han investigado alteraciones en genes involucrados en el crecimiento de neuritas y en plasticidad sináptica en relación a desórdenes depresivos. Así, se han descripto polimorfismos en el gen del receptor de neurotrofinas p75NTR (Kunugi et al. 2004), en el factor de crecimiento neuronal BDNF (Iga et al. 2007; Sarchiapone et al. 2008) y en la proteína activadora de RhoGTPasa GMIP (Tadokoro et al. 2005) asociados a la patogénesis de la depresión y/o a comportamientos suicidas. También se han examinado polimorfismos en genes cuya expresión se encuentra modulada por el estrés y el tratamiento con antidepresivos. De este modo, se hallaron polimorfismos asociados a la depresión en los genes que codifican para el transportador de serotonina 5HTT (Bellivier et al. 1998) y el receptor de glucocorticoides NR3C1 (van West et al. 2006). Dadas las características descriptas en el presente trabajo de tesis para la proteína M6a y dada la regulación de su expresión por tratamientos de estrés y antidepresivos descritos en nuestro laboratorio (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006), el gen que codifica para la proteína M6a (GPM6A) representa un candidato a tener en cuenta en estudios asociados a la depresión. De hecho, una publicación reveló la asociación entre un polimorfismo en el segundo intrón del gen GPM6A y síntomas depresivos dentro de un grupo de pacientes diagnosticados con esquizofrenia (Boks et al. 2007). De este modo se estableció, por primera vez, un vínculo de relevancia clínica entre M6a y los síntomas de la depresión que ya había sido sugerido en nuestro laboratorio en base a los resultados obtenidos durante el presente trabajo de tesis (Alfonso et al. 2005). El polimorfismo encontrado en los pacientes esquizofrénicos con síntomas de depresión podría alterar la expresión y/o la función de la proteína. Sin embargo, esto aún no ha sido estudiado. En esta tesis, se inició un estudio de polimorfismos en el gen GPM6A a partir de muestras de ADN genómico de pacientes diagnosticados con depresión. En estas muestras se han encontrado tres polimorfismos (incluyendo al descripto por Boks et al., 2007 en pacientes con esquizofrenia) cuya frecuencia genotípica y alélica difiere de la descripta en bases de datos (figura 29). Para determinar si realmente existe una asociación entre alguno de estos 71 Discusión polimorfismos y la depresión, habría que estudiar la frecuencia genotípica y alélica de los mismos en una población control adecuada y, probablemente, en una muestra más amplia de pacientes con depresión. 72 Conclusiones generales 5. CONCLUSIONES GENERALES El objetivo de este trabajo de tesis se centró en la caracterización funcional de la proteína M6a, cuya expresión en el hipocampo se encuentra modulada por la exposición al estrés crónico y la administración de drogas antidepresivas (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006), así como en el estudio de M6b y PLP/DM20, otros miembros de la familia de las PLPs a la cual M6a pertenece, de modo tal de contribuir al establecimiento de las bases moleculares del estrés. Se ha demostrado que el estrés crónico produce alteraciones estructurales en el hipocampo que pueden ser revertidas por el tratamiento con antidepresivos. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen las modificaciones neuroplásticas y la acción de las drogas antidepresivas no han sido aún dilucidados. La comprensión de estos procesos podría resultar clave para el entendimiento y el tratamiento de enfermedades relacionadas al estrés tales como la depresión. Las conclusiones del presente trabajo son: • Similar a lo descripto para M6a, la expresión de M6b y DM20 también se encuentra reducida en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico. • La proteína M6a juega un rol clave en la extensión de neuritas, la formación de filopodios/espinas, y muy probablemente en el establecimiento de sinapsis. • M6b y DM20 también inducen la formación de filopodios. • La expresión diferencial de las glicoproteínas de membrana M6a y M6b podría contribuir a las alteraciones plásticas encontradas en el hipocampo de animales estresados crónicamente. En base a los resultados obtenidos, las proteínas proteolipídicas podrían estar involucradas en enfermedades relacionadas al estrés. Es por eso que iniciamos el estudio de la existencia de polimorfismos asociados a la depresión en el gen GPM6A. Como conclusión, creemos que las proteínas proteolipídicas deberían ser consideradas en trastornos relacionados al estrés como la depresión. 73 Perspectivas futuras 6. PERSPECTIVAS FUTURAS En el presente trabajo se ha descripto un rol para las proteínas proteolipídicas en la plasticidad neuronal y se ha sugerido una relación entre estas proteínas y enfermedades relacionadas al estrés crónico tales como la depresión. El mecanismo de acción mediante el cual estas proteínas producen los efectos observados representa actualmente un tema de activa investigación en nuestro laboratorio. Por un lado, se están realizando estudios funcionales con distintas mutantes de M6a de forma tal de identificar aminoácidos clave para la función de M6a en la formación de filopodios. Además, mediante ensayos de inmunoprecipitación, se intenta identificar ligandos externos y/o internos de M6a de forma tal de establecer efectores de la formación de filopodios/espinas y las vías de traducción de señales involucradas en la función de esta proteína. Por otra parte, se está evaluando la presencia de M6a en microdominios de membranas ricos en lípidos (lipid rafts), lo que podría ser útil en la identificación de los mecanismos moleculares involucrados en la función de M6a. Asimismo, se está caracterizando más detalladamente las protrusiones inducidas por M6a, analizando su estabilidad y su rol en la formación de sinapsis. En base a los resultados obtenidos nos resulta interesante estudiar la función de M6a y M6b in vivo. Actualmente se está evaluando la capacidad de estas proteínas de inducir la formación de filopodios y/o espinas en el cerebro de ratón mediante la inyección en el hipocampo de partículas virales que median la sobreexpresión de M6a y M6b. Además, se están estudiando alteraciones fenotípicas y comportamentales en una línea hipomórfica para M6 (ortólogo a M6a) de Drosophila melanogster. Para evaluar la importancia de las proteínas proteolipídicas en el comportamiento de mamíferos sería muy útil estudiar ratones con niveles de expresión nulos o reducidos (knock out y/o knock down) de M6a y/o M6b. Dado el rol descripto para estas proteínas en la formación de filopodios/espinas, se podrían realizar ensayos de memoria y/o aprendizaje, ya que sea ha descripto que la plasticidad neuronal es vital para estos procesos. También, dada la relación encontrada entre el estrés y la expresión de estas proteínas, sería relevante realizar estudios de ansiedad y anhedonia, tanto en ratones que subexpresen como en ratones que sobreexpresen M6a y/o M6b en el hipocampo. Por último, sería interesante estudiar el efecto del estrés crónico en animales que expresen altos niveles de M6a y/o M6b. 74 Perspectivas futuras La expresión de M6a, M6b y DM20 se encuentra reducida en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico. Los factores que regulan la expresión de estos genes todavía son deconocidos. Sería relevante conocer los mecanismos involucrados en la regulación de la expresión de estos genes. Es por ello que en nuestro laboratorio se han iniciado estudios con el fin de identificar la región promotora del gen GPM6A y los factores de transcripción que regulan su expresión. Finalmente, sería importante continuar con los estudios de polimorfismos en los genes que codifican para las proteínas protelipídicas en individuos con depresión. De esta forma, se podría confirmar la existencia de una asociación entre estas proteínas y la depresión. 75 Materiales y métodos 7. MATERIALES Y MÉTODOS 7.1 Cultivos celulares Cultivos primarios de neuronas de hipocampo Hipocampos de embriones de ratas Wistar, criadas en la Facultad de Veterinaria y Agronomía de la Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina, de 18-19 días de gestación fueron removidos quirúrgicamente e incubados en solución de Hank’s con 0,25 % tripsina por 15 minutos a 37 oC. Los tejidos fueron luego disociados a través de pasajes por pipetas Pasteur afinadas, en MEM o Advanced MEM con 2 mM glutamina, 10 M piruvato de sodio, 100 U/ml penicilina y 100 g/ml estreptomicina (MEM 1X), con el agregado de 10 % (v/v) suero equino. Las células fueron plaqueadas en cubreobjetos de vidrio previamente incubados con 0,1 mg/ml poli-L-lisina hidrobromuro (Sigma, St.Louis, MO) y 20 g/l laminina (Gibco, Carlsbad, CA) a densidades de 20.000-50.000 células/cm2. Luego de 2-4 hs los medios fueron cambiados a MEM/N2 (MEM 1X con 1 g/l ovoalbúmina y suplemento B27 de Gibco). Líneas celulares Las líneas N2a y COS-7 se cultivaron en D-MEM con 10 % (v/v) suero fetal bovino, penicilina y estreptomicina. Para las células PC12, el medio indicado fue suplementado con 5 % suero de caballo y las células fueron mantenidas en placas tratadas con poli-L-lisina. Los medios fueron cambiados cada 2-4 días. Para los ensayos de cuantificación del porcentaje de células con filopodios, se utilizó 20 % (v/v) de suero fetal bovino para evitar la diferenciación de las células. 7.2 Ensayos de inmunocitoquímica Las células fueron fijadas con PFA al 4 %, sacarosa al 4 % en PBS a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego permeabilizadas con 0,1 % Triton X-100 en PBS por 2 min. Los cultivos fueron bloqueados en 3 % BSA en PBS durante por lo menos 1 hora a temperatura ambiente seguido de la incubación con el anticuerpo primario en 3 % BSA en PBS a 4 oC por 14-16 hs y la subsiguiente incubación con el anticuerpo secundario (previo lavado con PBS) a 37 oC por 1 hora. Los preparados fueron lavados con PBS y agua y montados en portaobjetos con FluorSave Reagent (Calbiochem, San Diego, CA). 76 Materiales y métodos Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti M6a IgG de rata monoclonal 1/250 (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd, Japan), faloidina conjugada a rodamina 1/1000 (Molecular Probes) anti -tubulina IgG de ratón monoclonal 1/2000 (Sigma, St Louis, MO), suero de conejo anti sinaptofisina 1/500 (Synaptic Systems, Gottingen, Germany), suero de conejo anti espinofilina 1/500 (US Biological, MA, USA), anti-MAP2 IgG de ratón monoclonal 1/200 (Sigma) y anti Tau-1 IgG de ratón monoclonal 1/500 (provisto gentilmente por L.I. Binder). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: anti IgG ratón conjugado a Alexa Fluor 488 1/1000 (Molecular Probes, Eugene, OR) o a rodamina 1/2000 (Pierce, USA), anti IgG conejo conjugado a Alexa Fluor 350 1/200, a Alexa Fluor 488 1/1000 o a Alexa Fluor 594 1/300 (Molecular Probes). 7.3 Ensayos de despolimerización de la F-actina, marcación de las membranas celulares e identificación de las células viables Para desestabilizar el citoesqueleto de actina, los cultivos primarios de neuronas fueron tratados con 2,5 M latrunculina A (Sigma) durante 18 hs, y los cultivos de N2a con citocalasina D 5 M durante 5 hs. Para visualizar las membranas, las neuronas fueron tratadas con el colorante lipofílico DiI: perclorato de 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’tetrametilendocarbocianina DiOC18 (Molecular Probes) 1/1000 en PBS a 37 oC por 5 minutos, luego lavadas en PBS, fijadas y montadas. Para identificar las células viables, los cultivos se incubaron en una solución del colorante Trypan-Blue en PBS durante 3 minutos y se contaron las células teñidas de azul y no teñidas en campos seleccionados al azar hasta 5 minutos después de la tinción. 7.4 Construcción de los plásmidos utilizados en las transfecciones Para la expresión de proteínas fusionadas a GFP se utilizó el plásmido de expresión eucariota pEGFP-C1 (Clontech). Para la construcción GFP::M6a, se realizó la amplificación de la región codificante del gen M6a (desde el primer codón ATG hasta el codón stop, en total 834 pb) utilizando como templado ADNc de hipocampo de ratón y oligonucleótidos 5’ y 3’ con el agregado de secuencias para las enzimas de restricción Apa I y Kpn I, respectivamente. El fragmento M6a amplificado se insertó en fase en los sitios Apa I – Kpn I presentes en el sitio de clonado del vector (en la zona 3’ de la secuencia que codifica para la GFP). Para las construcciones GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD y GFP::M6b se diseñaron oligonucleótidos 5’ y 3’ que amplificaban la 77 Materiales y métodos región codificante de las distintas isoformas con el agregado de secuencias para las enzimas de restricción Xho I y Bam HI, respectivamente. Los fragmentos amplificados fueron insertados en fase en los sitios Xho I y Bam HI presentes en el sitio de clonado del vector. Para las construcciones GFP::PLP y GFP::DM20, las regiones codificantes fueron amplificadas con oligonucleótidos 5’ y 3’ que amplificaban la región codificante de las distintas isoformas con el agregado de secuencias para las enzimas de restricción Xho I y Eco RI, respectivamente y clonadas en esos sitios presentes en el sitio de clonado del vector. La siguiente tabla muestra los oligonucleótidos utilizados. Nombre Secuencia M6a 5´ Kpn I 5´ GGT ACC ATG GAA GAG AAT ATG GAA GAA GGA 3´ M6a 3´ Apa I 5´ GGG CCC TTA TGT GTA TGC ATT GAG CCG 3´ M6b 5´ Xho I 5´CTC GAG CCA TGG GTT GCT TCG AAT GCT 3´ M6b 5´ Xho I 5´CTC GAG GTA TGA AGC CAG CCA TGG AAA C 3´ M6b 3´ Bam HI 5´ GGA TCC TTA AGT GTA AGA ATT GAG TTG TTC T 3´ M6b 3´ Bam HI 5´ GGA TCC TTA GAA CTT AGT GCA GCA GTC TT 3´ M6b 3´ Bam HI 5´ GGA TCC TTA GCA GTC CCA TCT TCC CA 3´ PLP/DM20 5´ Xho I 5´GTC TCG AGC TAT GGG CTT GTT AGA GTG TTG 3´ PLP/DM20 3´ Eco RI 5´ ACG AAT TCT CAG AAC TTG GTG CCT CG 3´ Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de las secuencias de interés y su clonado como proteína de fusión a GFP. Subrayadas se muestran las secuencias blanco de las enzimas de restricción. En itálica se indican los tripletes correspondientes a los codones que codifican para las metioninas iniciales y los codones de terminación de la traducción. Para la construcción VSVG::GFP, el ADNc de VSVG (gentilmente provisto por el Dr Maccioni, Universidad de Córdoba, Argentina) fue clonado en fase en los sitios Eco RI/Bam HI presentes en el sitio de clonado del vector pEGFP-N1 (Clontech). Para la expresión de proteínas de forma independiente a GFP, se utilizó el vector pEGFP-IRES2 (Clontech). Para la construcción GFP+M6a, la región codificante para la M6a previamente clonada en el vector pGEMT-easy, fue obtenida a partir de la digestión de los sitios EcoRI del vector y se insertó en los sitios Eco RI del vector. Para las construcciones GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD y GFP+M6b TMD, las secuencias previamente clonada en el vector pEGFP-C1 fueron digeridas con la enzimas Xho I y Bam HI y clonadas en esos mismos sitios presentes en el sitio de clonado del vector pEGFP-IRES2. 78 Materiales y métodos Todas las secuencias fueron confirmadas por secuenciación automática antes de realizar las transfecciones. Para la construcción de las distintas mutantes de M6a en los posibles sitios de palmitoilación y fosforilación se utilizó la siguiente estrategia: se diseñó un oligonucleótido sentido de aproximadamente 30 pb que incluía la secuencia que se deseaba mutar flanqueada por aproximadamente 15 pb en cada extremo. Además, se diseñó un oligonucleótido antisentido también de 30 pb complementario al oligonucleótido sentido a partir de la primera base río arriba de la mutación, de modo tal que este oligonucleótido no contiene la mutación ni hibrida con esa parte de la secuencia. Estos oligonucleótidos son utilizados en una PCR en donde se emplea como templado el plásmido con la secuencia que se desea mutar. Durante la PCR, se amplifica todo el plásmido. El producto de PCR es luego tratado con la enzima de restricción Dpn I que sólo digiere secuencias metiladas. Por lo tanto, el templado de la PCR que, al provenir de un cultivo bacteriano, se encuentra metilado es digerido mientras que el producto de PCR con la mutación deseada, al no encontrarse metilado, no es degradado por la incubación con Dpn I. El producto de PCR, luego de tratado con Dpn I, es utilizado para transformar bacterias. Una vez obtenidas las colonias, se purifica el ADN plasmídico y se confirma la presencia de la mutación deseada por secuenciación. La tabla a continuación muestra los oligonucleótidos utilizados. Nombre Secuencia M6A C14S F 5´ AAGGACAGACACAGAAAGGGAGCTTCGAGTGCTGCATTA 3´ M6a C14S R 5´ CCCTTTCTGTGTCTGTCCTTCTTCCATATT 3´ M6a C17S C18S F 5´ CAGAAAGGGTGCTTCGAGAGCAGCATTAAATGCCTGGGAG 3´ M6a C17S C18S R 5´ CTCGAAGCACCCTTTCTGTGTCTGTCCTTC 3´ M6a C21S F 5´ GCTTCGAGTGCTGCATTAAAAGCCTGGGAGGTATTCCCT 3´ M6a C21S R 5´ TTTAATGCAGCACTCGAAGCACCCTTTCTG 3´ M6a C122S F 5´ GACTTCAAAATCACCACCAGTGGCAGATGTGTGAGC 3´ M6a C122S R 5´ GGTGGTGATTTTGAAGTCTCCATAGAGAT 3´ M6a C125S F 5´ AAATCACCACCTGTGGCAGAAGTGTGAGCGCTTGGTT 3´ M6a C125S R 5´ TCTGCCACAGGTGGTGATTTTGAAGTCTC 3´ M6a C246S F 5´ TGGGCCTATGTGAAAGATGCCAGCCGCATGCAGAAGTAC 3´ M6a C246S R 5´ GGCATCTTTCACATAGGCCCAGTTGGCAGAC 3´ M6a T60A F 5´ TGGAACAGTCAACATTCTGCAGGCCTACTTTGAGTTGGCAAG 3´ M6a T60A R 5´ CTGCAGAATGTTGACTGTTCCAGAAAGGGCTTC 3´ M6a T67A F 5´ CTACTTTGAGTTGGCAAGGGCTGCTGGAGACACACTGGATG 3´ M6a T67A R 5´ CCTTGCCAACTCAAAGTAGGTCTGCAGAATG 3´ 79 Materiales y métodos M6a T76A F 5´ CTGGAGACACACTGGATGTTTTCGCTATGATTGACATCTTTAAGTATG 3´ M6a T76A R 5´ GAAAACATCCAGTGTGTCTCCAGCAGTCCTTGCCAAC 3´ M6a T166A F 5´ GACCATCTGCCGGAACACCGCTCTAGTGGAGGGAGCAAATC 3´ M6a T166A R 5´ GGTGTTCCGGCAGATGGTCCACACATTGAAATAC 3´ Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados para la construcción de las distintas mutantes en los posibles sitios de palmitoilación y fosforilación. Subrayadas se muestran las bases que difieren de la secuencia original. 7.5 ARN de interferencia Los ARN doble cadena de 21 pb para M6a fueron sintetizados y adquiridos en la empresa Dharmacon (CO, USA). El diseño y la elección de la secuencia se realizaron mediante el programa ofrecido por el fabricante (www.dharmacon.com). Las secuencias utilizadas fueron: 5’-AAG GAU GUG UGA AUC UAC UGA-3’ para M6a siRNA1 y 5'-AAC GGC UGC UUU CUU UGU CUA-3' para M6a siRNA2. Estas secuencias no poseen homología con ningún otro ARNm conocido. Los siRNA control correspondieron a una mezcla de ARN doble cadena de 21 pb de secuencia homóloga a la región codificante de la GFP. 7.6 Transfección de los plásmidos y el ARN de interferencia Para las transfecciones celulares se usó el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron 2-3 g de ADN plasmídico o 40 pmol de siRNA, mezclados con 1 ó 2 l de Lipofectamina, para neuronas o líneas celulares, respectivamente, para cada pocillo de 2 cm2 de superficie (placas de 24 pocillos). Para las placas de 10 cm de diámetro, utilizadas para los ensayos de activación de Rho GTPasas, se usaron 40 g de ADN plasmídico y 60 l de lipofectamina. Para los pocillos de 10 cm2 de superficie (placas de 6 pocillos) utilizadas para la cuantificación de ARNm de M6a en cultivos tratados con siRNA, se utilizaron 200 pmol de siRNA y 5 l de lipofectamina. Las células se incubaron con las mezclas de transfección durante 4-6 hs y luego se cambió el medio de cultivo. 7.7 Cuantificación de células, procesos neuronales y puntos de sinaptofisina Para calcular el número de neuritas primarias por célula, se cuantificaron las estructuras marcadas con anticuerpos anti -tubulina. Se contaron entre 40 y 50 células por grupo (transfectadas con GFP::M6a o GFP), provenientes de tres experimentos 80 Materiales y métodos independientes. Se calcularon las medias para el total de células y las diferencias fueron analizadas estadísticamente por el test no paramétrico Mann Whitney U-test, de 2 colas. En los ensayos con M6a, la densidad de filopodios/espinas (el número de protrusiones teñidas con el marcador de membrana DiI en fragmentos de 20 m de largo de neurita, seleccionados dentro de los 50 m desde el soma) se cuantificó en 65-70 procesos de diferentes neuronas por grupo, provenientes de tres experimentos independientes o en 75-95 neuronas por grupo, de dos experimentos, en el caso de la sobreexpresión o la interferencia, respectivamente. El número de puntos positivos para la marcación con el anticuerpo contra sinaptofisina, se cuantificó en fragmentos 20 m de neuritas, tomados desde el cuerpo celular. Se contaron 55-66 neuronas por grupo, provenientes de dos experimentos independientes. En todos los casos, se calcularon las medias para el total de neuritas examinadas y las diferencias fueron analizadas estadísticamente por el test no paramétrico Mann Whitney U-test, de 2 colas. En el caso de las líneas celulares, en los ensayos con GFP::M6a se clasificaron 200, 110 ó 130 células por grupo, de múltiples experimentos, para PC12, N2a o COS7, respectivamente. Las células fueron clasificadas de acuerdo a la presencia o ausencia de filopodios determinados por la tinción con faloidina y se calculó el porcentaje de células con filopodios por grupo. Como control se utilizaron células sin transfectar del mismo preparado. Se calcularon las medias de los porcentajes obtenidos en al menos tres preparados de experimentos independientes y las diferencias estadísticas se analizaron con la prueba T de Student. En los ensayos con GFP+M6a, se calcularon las medias de dos experimentos independientes y las diferencias estadísticas se analizaron con la prueba T de Student. En los ensayos en los que se utilizaron las distintas mutantes de M6a, al emplearse cultivos de la línea celular N2a, se clasificaron al menos 40 células transfectadas y 40 células sin transfectar en cada preparado en cuanto a si tenían o no filopodios, tal como lo revelaba la tinción con faloidina. Se calcularon las medias de los porcentajes obtenidos en un mínimo de 7 preparados de al menos 2 experimentos independientes y las diferencias estadísticas se analizaron con la prueba T de Student. En los cultivos primarios de neuronas de hipocampo, se cuantificó el número de protrusiones en 20 m de largo de al menos 60 neuritas por grupo. Se calcularon las medias para el total de neuritas analizadas y las diferencias fueron analizadas estadísticamente por ANOVA de un factor seguido por la prueba de Dunnet para efectos post hoc versus el control negativo GFP y versus M6a wild type. 81 Materiales y métodos En los ensayos con M6b, PLP y DM20, la densidad de filopodios/espinas (el número de protrusiones en fragmentos de 20 m de largo de neurita) se cuantificó en al menos 80 procesos de diferentes neuronas por grupo. Se calcularon las medias para el total de neuritas analizadas y las diferencias fueron analizadas estadísticamente por ANOVA de un factor seguido por la prueba de Dunnet para efectos post hoc versus el control negativo GFP y versus M6a. Finalmente, en los ensayos con M6b y DM20 en las líneas N2a y COS7, se calculó el porcentaje de células con filopodios en al menos 40 células transfectadas y 40 células sin transfectar por preparado. Las medias de los porcentajes obtenidos en un mínimo de 6 preparados de al menos 2 experimentos independientes y las diferencias estadísticas versus el control sin transfectar se analizaron con la prueba T de Student. También se comparó el incremento en el porcentaje de células con filopodios entre las células transfectadas con M6a, M6b y DM20. Todos los cálculos estadísticos se realizaron con el programa Analyse-it® de Microsoft Excel. 7.8 Ensayos de activación de GTPasas Por cada ensayo, 3 x 106 células N2a o COS-7 fueron plaqueadas en tres placas de cultivo de 10 cm de diámetro, un día antes de la transfección. A las 24 hs de la transfección, se observó la eficiencia de transfección a través de la detección de fluorescencia. Los cultivos donde por lo menos el 40% de las células mostraban señal fluorescente fueron utilizados para los ensayos de purificación y detección de Cdc42, Rac1 o RhoA activas. Siguiendo las instrucciones del fabricante (Cytoskeleton Inc., CO, USA), las células fueron lisadas en el buffer de lisis provisto, y centrifugadas 5 minutos a 8000 rpm a 4 oC. Las concentraciones proteicas de los sobrenadantes fueron cuantificadas con el reactivo de Bradford y cantidades similares de proteína total (entre 5 y 8 mg) para cada muestra, fueron incubadas por una hora a 4 oC en constante agitación con esferas de agarosa GST-PBD PAK (para cdc42 y Rac1) o RBD Rhotekin (para RhoA). Luego de la incubación, las esferas de agarosa fueron lavadas 3 veces con el buffer de lavado y resuspendidas en buffer de Laemmli. Las proteínas purificadas fueron ensayadas por Western blot con los anticuerpos comerciales primarios anti-Cdc42 en oveja 1/200, anti Rac1 en conejo 1/250 o anti-RhoA en ratón 1/250 (Cytoskeleton) y secundarios anti IgG de oveja 1/5000 (Cytoskeleton), anti IgG de conejo 1/8000 (Sigma) y anti IgG de ratón 1/8000 (Sigma) conjugados a peroxidasa. Como control 82 Materiales y métodos de carga, los extractos totales fueron ensayados por Western blot con el anticuerpo primario anti -tubulina IgG de ratón monoclonal 1/2000 (Sigma, St Louis, MO) y el anticuerpo secundario anti IgG de ratón 1/8000 (Sigma) conjugado a peroxidasa. La detección de la señal del anticuerpo secundario se llevó a cabo mediante quimioluminiscencia con el sustrato Super Signal (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce) y exposición en placas radiográficas (Kodak). 7.9 Tratamiento de estrés Se utilizaron ratones machos de la cepa C57BL/6 de entre 2 y 3 meses de edad criados en el Instituto de Investigaciones Biotecnológicas de la Universidad de San Martín (IIB-UNSAM), San Martín, Argentina. Los animales fueron mantenidos en grupo dentro de las mismas jaulas, en habitaciones con temperatura controlada, ciclos de luz/oscuridad de 12 horas y acceso libre al alimento y agua. Cada animal fue pesado antes y después de los tratamientos. Luego de 7 días sin tratamiento, los animales fueron inmovilizados 1 vez por día durante 4 horas (desde las 11 hs hasta las 15 hs) en tubos de plástico ventilados (de 2,8 cm de diámetro por 11,5 cm de largo) sin acceso a agua o alimento. El tratamiento de 21 días consistió en 6 días de estrés seguido de un día sin estrés, durante 3 semanas. Los animales control fueron mantenidos en las mismas condiciones que los grupos experimentales, pero sin recibir ningún tratamiento. 7.10 Disección de los hipocampos y extracción del ARN total Los ratones fueron sacrificados un día después de la última sesión de estrés. Los cerebros fueron extraídos y colocados en hielo para la disección de los hipocampos que fueron congelados inmediatamente y guardados en nitrógeno líquido hasta su utilización. Los tejidos congelados fueron homogeneizados en reactivo de Trizol (Life Technologies, NY, USA) usando un homogeneizador manual. El ARN total fue purificado de los homogenatos de Trizol de acuerdo a las instrucciones del fabricante y almacenado a –70 oC. Para evaluar la integridad del ARN, 2 l del ARN total fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1 % con bromuro de etidio para la detección de las bandas correspondientes a las subunidades pequeña y grande (18S y 28S) de ARN ribosomal, y descartar así su degradación. 83 Materiales y métodos 7.11 Purificación del ARN mensajero poli A+ y síntesis del ADN copia El ARNm poli A+ fue aislado del ARN total con el kit PolyATract mRNA Isolation System (Promega, Madison, USA) implementando el protocolo sugerido por el fabricante pero con cantidades 10 veces menores de ARN total (10 g) y de cada reactivo en todos los pasos. El volumen final de elución del ARNm fue de 25 l, que luego fue guardado a –70 oC. Se utilizaron 4 l de ARNm como templado para la retrotranscripción con la enzima Superscript II (InvitrogenTM Life Technologies, NY, USA). Se incubó el ARNm con oligonucleótido poliT a 90 oC por 2 min y luego se conservó en hielo hasta el agregado de la mezcla de reacción seguido de la incubación a 42 oC por 1 hora. Los reactivos y sus concentraciones finales fueron: 1X Buffer de reacción, 10 mM DTT, 0,25 mM dNTPs, 200 U enzima Superscript II, 50 ng/l Oligo dT. También se realizó un control negativo de la transcripción reversa sin enzima para descartar la presencia de ADN genómico en las muestras. 7.12 Ensayos de PCR en tiempo real Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo en un equipo GeneAmp 5700, Sequence Detection System (PE Biosystems) utilizándose el kit comercial SYBR Green PCR Core Reagents (PE Biosystems). Cada reacción (volumen total 25 ó 12,5 l) se realizó utilizando como templado 4 l de ADNc diluido (diluciones entre 1/20 y 1/30 de la reacción de transcripción reversa, según el experimento). Los reactivos se usaron en las siguientes concentraciones finales: 1X SYBR Green Reaction Buffer; 3mM MgCl; 1mM dATP; 1mM dUTP; 1mM dGTP; 1mM dCTP; 0,3 M de cada primer; 0,01 U/ml UNG-Enzyme y 0,025 U/ml Taq Gold DNA Polymerase. Las reacciones se incuban primero a 50 oC por 2 minutos para permitir la actividad uracil N’-glicosilasa de la UNG-Enzyme que inactiva cualquier templado de ADN que contenga residuos UTP, es decir, los que provienen de previas PCRs usando dUTP en vez de dTTP, y así evitar las contaminaciones por producto final. Luego se continúa con una incubación a 95 oC por 10 minutos, donde se inactiva la UNG-enzyme y se activa la polimerasa (acoplada a un inhibidor termolábil), y el ciclado se realiza 40 veces a 95 oC por 15 segundos (desnaturalización) y 60 oC por 1 minuto (hibridación y extensión de los primers). Para verificar la amplificación de un producto único de PCR, todas las reacciones se analizaron con el protocolo de disociación por temperatura luego del ciclo final de la PCR (Ririe et al. 1997). 84 Materiales y métodos Los oligonucleótidos utilizados fueron diseñados usando el programa Primer Express 1.5 (PE Biosystems). A continuación se muestran las secuencias de los mismos. Nombre Secuencia M6a sentido 5’ AAA TAA TGA TGT AGC CTG ACA AGA AAT TT 3’ M6a antisentido 5’ AAT GCA CTT ACA CTG AAG GAG GAA T 3’ M6b 3´UTR sentido 5´ AGC AGT GGA GGT GCT GTT AAG AGT 3´ M6b 3´UTR antisentido 5´ GGC TTT AGA CAC CGC CTC TTC T 3´ PLP/DM20 3´UTR sentido 5´AAT TGT TTA TCT CTT GTT TGG AGT TGT ATC 3´ PLP/DM20 3´UTR antisentido 5´AGA ATC ATC CTC CAG GTC TTT CTG 3´ PLP sentido 5´ GGC CTG AGC GCA ACG GTA 3´ DM20 sentido 5´ GGC CTG AGC GCA ACG TTT G 3´ PLP/DM20 antisentido 5´AGG AGC CAT ACA ACA GTC AG 3´ M6b exón Ia sentido 5´ TCC CGT CAG TCT CCA ACC A 3´ M6b exón Ia antisentido 5´ CCC AGA CAC TTG ATG CAG CA 3´, M6b exón Ib sentido 5´ TAT GGT CGC CTG CTC CTT G 3´ M6b exón Ib antisentido 5´ CGC TCT GCC TAC TGG TCC A 3´ M6b exón III sentido 5´ AAA TAG ATT CAG GAT GCC ACA CC 3´ M6b exón III antisentido 5´ AGT TAG CAG TCC CAT CTT CCC A 3´ Ciclofilina sentido 5’ AAG CAT ACA GGT CCT GGC ATC T 3’ Ciclofilina antisentido 5’ CAT TCA GTC TTG GCA GTG CAG 3’ G6PDH sentido 5’ TGA CCA ATT CCA TAC TCC ATG GT 3’ G6PDH antisentido 5’ ATT CTA GCT GCT GTG CTT GCC T 3’ Beta-actina sentido 5´ CAA CTT GAT GTA TGA AGG CTT TTG GT 3´ Beta-actina antisentido 5´ ACT TTT ATT GGT CTC AAG TCA GTG TAC AG 3´ Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados para las mediciones de PCR en tiempo real. G6PDH: glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa. La detección directa de los productos de PCR se monitoreó midiendo el incremento en la fluorescencia causada por la unión del colorante SYBR Green a ADN doble cadena, como se describió previamente (Wittwer et al. 1997). Todas las cuantificaciones fueron normalizadas utilizando como gen de referencia a la proteína ciclofilina, obteniéndose esencialmente los mismos resultados al normalizar con el gen de referencia a la glucosa-6fosfato deshidrogenasa (G6PDH). Cada experimento de cuantificación de RT-PCR se realizó por duplicado. Las medias de cada grupo fueron comparadas con el test T de Student, de 2 colas, para analizar si las diferencias eran significativas estadísticamente con el programa Analyse-it® para Microsoft Excel. Para la cuantificación de la expresión relativa de distintas isoformas, se utilizó la fórmula descripta por Plaffl (Pfaffl 2001). 85 Materiales y métodos 7.13 Análisis de polimorfismos en el gen GPM6A en pacientes con depresión Se utilizaron muestras de ADN genómico de 28 pacientes (19 mujeres y 7 hombres) diagnosticados con distintos tipos de depresión provistas por la Dra. Elena Jazín de la Universidad de Uppsala, Suecia. Las muestras corresponden a 21 pacientes diagnosticados con depresión mayor, 3 pacientes diagnósticos con desorden depresivo tipo NOS (del inglés, Not Otherwise Specified), 2 pacientes con trastorno bipolar de tipo II, 1 paciente con desorden esquizo-afectivo de tipo bipolar y 1 paciente con distimia. Las regiones correspondientes a los exones del gen GPM6A y una región de 300pb que flanquea el polimorfismo rs10520303 presente en el segundo intrón del gen fueron amplificadas por PCR utilizando la enzima Taq DNA polimerasa de Invitrogen®. La tabla a continuación muestra los oligonucleótidos utilizados y el tamaño de los amplicones obtenidos. Nombre Secuencia Exón 1 F 5´ATAGGGTTTTTCCTTCCAGT 3´ Exón 1 R 5´CCAAGAGAGAAACATTCATT 3´ Exon 2 F 5´TTGTATGGTTGACCTGGTAT 3´ Exón 2 R 5´CCCCTAATCATTTAACACAT 3´ Exón 3 F 5´AAAGAATCATGAGCATGTGA 3´ Exón 3 R 5´AGAAGGAAACGTTACTGTGT 3´ Exón 4 F 5´TATAATGGAGCTTTGCAGAT 3´ Exón 4 R 5´TAGAGGCAGCTATGTAGGTA 3´ Exón 5 F 5´AGATAAAATGGAACTTGCTT 3´ Exón 5 R 5´AATGAATGCTAAAATTCTGA 3´ Exón 6 F 5´CTCGCTTTTATTTAAGATGT 3´ Exón 6 R 5´TCTCTACAAGCAAATAGCTT 3´ Exón 7 CDS F 5´CGAAGACTTCTTTCGAGATA 3´ Exón 7 CDS R 5´TAATATGGCCACTGATCTTC 3´ Exón 7 UTR1 F 5´ATGACTCTTGAAATATGGAA 3´ Exón 7 UTR1 R 5´TTCCTTTGATACAGGTACTT 3´ Exón 7 UTR2 F 5´AAGTACCTGTATCAAAGGAA 3´ Exón 7 UTR2 R 5´CACACATAGGAAAGAGGAAT 3´ Intrón 2 rs10520303 F 5´GGATAAGAAGTTGCACACTTC 3´ Intrón 2 rs10320303 R 5´CATGTGGGAGCTGGCCTGA 3´ Tamaño del amplicón 1050 pb 385 pb 360 pb 309 pb 232 pb 242 pb 762 pb 739 pb 832 pb 300 pb Tabla 4. Oligonucleótidos utilizados y tamaño de los amplicones obtenidos en la amplificación de los exones y de una región intrónica conteniendo el polimorfismo rs10520303 del gen GPM6A humano. 86 Materiales y métodos Los productos de PCR fueron secuenciados automáticamente con el secuenciador de geles de poliacrilamida ABI 377 y el secuenciador de capilares ABI 3130 de Applied Biosystem®. Cada producto de PCR fue secuenciado al menos 2 veces, secuenciándose tanto la hebra sentido como la antisentido. Los cromatogramas obtenidos fueron luego analizados con el programa Sequencher 4.7 de Gene Codes Corpotation para la identificación de polimorfismos. 87 Referencias 8. REFERENCIAS Aberg, M. A., N. D. Aberg, H. Hedbacker, J. Oscarsson and P. S. Eriksson (2000). "Peripheral infusion of IGF-I selectively induces neurogenesis in the adult rat hippocampus." J Neurosci 20 (8): 2896-903. Acsady, L., A. Kamondi, A. Sik, T. Freund and G. Buzsaki (1998). 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Neuron 46 (2): 181-9. 99 Agradecimientos AGRADECIMIENTOS • A Carlos, por haberme permitido hacer el doctorado en su laboratorio, por haberme guiado pero al mismo tiempo dado libertad para trabajar y por intentar levantarme el ánimo cuando las cosas no salían. • A Juan, por haberme recomendado que siguiera este camino y por acompañarme durante todo el recorrido. • A Juli, quien me ensenó a trabajar en la mesada, pero principalmente por su actitud siempre positiva. • A Marce quien me acompañió durante todo el doctorado guiándome en todos los sentidos. • A las que ya partieron dejando un vacío en el laboratorio: a Geo por todo lo compartido, a Adri por las charlas y a Vani por lo vivido incluyendo las horas de docencia. • A Paulita, por su companñía hasta tardes horas en el lab. • A Beatus, por compartir conmigo su cultura. • A Cami, por estar siempre dispuesta a dar una mano y por cuidarme. • A Fla, por su preocupacion y buena onda. • A los chicos del lab 3: a Lau y a Gri por las charlas y Ale y Javier por ayudarme cada vez que los hinché con algo. • A Su, Marilén y Adrián, por la buena onda y por los viernes dulces. • A Oscar, por matarme las ratas. • A los Campetella: a Juancito por compartir sus conocimientos cada vez que lo consulté y a Valen, Vir y Romi por la buena onda. • A Fer, por las secuencias, el paddle y las extrañas charlas. • A Carlos Arregui por su buena predisposición siempre que acudí por algún motivo. • A Mariana, por todas las charlas y las horas compartidas en cultivo. • A Mirna, por ayudarme cada vez que le pedí algo y con la major predisposición. • A Ernesto, por su ayuda para conseguir todo el material de trabajo y su buena onda. • A Nelly y a Tere, por llenarnos las cajitas con tips, por autoclavarme todo lo que necesite y por sacarme más de una sonrisa. • A Pablo, por su ayuda con la informática. • A Zulma, por ayudarme a mantener el orden y por la buena onda. 100 Agradecimientos • A todos los del IIB que me ayudaron de una u otra forma. • A Elena Jazín y a Karolina Aberg, por las muestras y el análisis de polimorfismos. • A Ana de Genaro y a Luciana Frick, por las muestras de ARNm de animales estresados. • A Marce, Cami, Pao y Juan por ayudarme con la corrección de la tesis. • A los jurados, por aceptar ser parte de esta tesis. • Al CONICET y a la UNSAM por las becas otorgadas para realizar mi trabajo de investigación. • A Mati, por todos los papers que me mandó. • A Mary, mi amiguita de la Facu. • A Calu, por estar siempre. • Y a mi mamá, por su apoyo, por los viajes y por todos los momentos compatidos. 101