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Acercamientos de Investigación Hacia una Cura
para la Distrofía Muscular Duchenne
Un reporte del estado actual de la investigación internacional para el desarrollo de
una terapia causal de la distrofía muscular Duchenne
Actualizado en Agosto del 2003
Escrito en cooperación con especialistas y científicos
para el Duchenne Parent Project de Alemania
Aktion Benni & Co
y dedicado a todos los chicos con distrofía muscular Duchenne
y sus familias alrededor de todo el mundo
por Dr. Guenter Scheuerbrandt
Este reporte ha sido escrito para familias quienes
tienen uno o más chicos con distrofia muscular
tipo Duchenne. En el se les explica algunos de
los hechos científicos básicos e informarles de
los numerosos acercamientos o enfoques con los
cuales investigaciones internacionales tratan de
encontrar un causal, por ejemplo una justificación científica, así como una terapia efectiva
para la distrofía muscular Duchenne. Debido a
que científicos en algo más de cien laboratorios
en varios países del mundo están trabajando para
encontrar una cura para esta enfermedad, solo lo
más importante de sus resultados será descrito en
gran detalle. Algunos resultados anteriores son
reportados en un formato muy abreviado.
La primera edición de este reporte en el 2001
estuvo basada en un seminario internacional
sobre investigaciones en terapia de la distrofía
muscular Duchenne en Mayo del 2000 en los
Institutos Nacionales de Salud en Bethesda cerca
de Washington en los Estados Unidos. Esta
tercera edición fue escrita en Julio y Agosto
del 2003 mayormente con información de
literatura y correspondencia con muchos de los
investigadores
Introducción
Algunos hechos científicos básicos son explicados, que genes son, como trabajan ellos, porque es
importante la distrofina, como las mutaciones causan distrofia muscular Duchenne, y como es
heredada la enfermedad.
Los genes y su función: Los Genes son las unidades funcionales del material genético de los
cromosomas en el núcleo de cada célula. Este
material es conocido como ácido desoxiribonucleico, o ADN, su estructura se parece a dos
escaleras espirales (o de caracol) entrelazadas, o
de doble hélice doble. Esta fue detectada por
James Watson y Francis Crick en 1953, hace 50
años. Las dos columnas vertebrales o los barandales de las escaleras son largas cadenas compuestas de ácido fosfórico y desoxirribosa, un
tipo de azúcar. Los peldaños consisten en cuatro
sustancias químicas diferentes, las bases o letras
genéticas: adenina, guanina, timina, y citosina
(abreviadas como A, G, T, C), dos de las cuales
siempre se enfrentan en un peldaño de la hélice.
Por razones espaciales, los peldaños solo pueden
contener un par A-T y G-C. Si la secuencia de
estos pares base o letras genéticas en una cadena
es por ejemplo:
---AGGCTTAATCGT--la secuencia de la cadena opuesta debe ser:
---TCCGAATTAGCA--Las dos cadenas son complementarias una de la
otra.
Cada una de las 100 billiones (100 x 1012) de
células del cuerpo humano contienen en su
núcleo 46 cromosomas con más de 6 mil millones de letras genéticas, agrupadas en aproximadamente 25 000 a 35 000 genes. Casi todos los
detalles de la secuencia de estas letras o nucleótidos son conocidos actualmente. Esta es la
información genética de un ser humano individual, y es pasada de generación en generación
rias más frecuentes. Aproximadamente uno de
cada 3 500 chicos, independientemente de su
origen étnico, nace con esta enfermedad, que es
causada por una mutación o daño del gen de la
distrofina con la consecuencia de que la proteína
distrofina no esta presente mas o existen solo
muy pequeñas trazas en sus células musculares.
El gen de la distrofina fue identificado en
1986 en el brazo corto del cromosoma X (Kunkel, Boston) y su estructura fue aclarada poco
después (Hoffman, Washington). Con 2,6 millones de pares de bases, este es uno de los genes
más largos alguna vez encontrados en humanos.
Sólo el 0,5 % de los pares de bases, 13 973,
pertenece a 79 exones del gene, que combinados
juntos contienen la secuencia de codificación
activa, la información para la síntesis de las diversas formas de la proteína distrofina. La transcripción de la información genética del gen de la
distrofina en ARNm esta bajo el control de al
menos cinco promotores, regiones de ADN, las
cuales gobiernan el proceso de empalme para
que un número de proteínas diferentes sean producidas. El producto principal es la distrofina de
extensión completa, una proteína muy larga con
forma de varilla que consiste de 3 685 aminoácidos.
La distrofina es parte de los costameros, los
cuales conectan los discos Z del sarcomero, las
estructuras contráctiles, con el sarcolema o la
membrana celular. Por esto es importante para la
estabilidad de las células musculares durante la
contracción muscular.
La red de la Distrofina (Complejo distrofino): La distrofina pertenece a una red o estructura de varias proteínas diferentes, de las cuales
más de 50 son conocidas. Entre ellas están la distrofina y sarcoglicanos, las sintrofinas e integrinas, distrobrevina, oxido nítrico sintetasa, y otros
componentes tales como la disferlina, sarcospan,
laminina, caveolina, telethonina, miotolina,
agrina, neurexina, desmuslina, sincoilina, fukutina, aquaporina, espectrina, colágeno, calpaina y
otros. En el futuro, mas componentes se espera
sean identificados (Campbell, Iowa City).
Cuando la distrofina esta faltante, el balance
entre las diferentes partes de este complejo distrófino (ligado a la distrofina) es perturbado.
Especialmente los distroglicanos, los sarcoglicanos y sarcospan que se muestran reducidos o
desaparecidos completamente. Cada una de las
proteínas del complejo tiene su propio gen el
con pequeños cambios o mutaciones. Estas
mutaciones las cuales son necesarias para la
evolución de la vida y todas las criaturas vivas,
pueden también tener consecuencias negativas,
por ejemplo, una enfermedad genética.
La mayor parte de los genes llevan la información para la construcción de una o más proteínas, las cuales consisten de secuencias de
aminoácidos, sus componentes básicos, de los
que hay 20 tipos diferentes. La secuencia de los
aminoácidos es importante para la función de las
proteínas como enzimas, catalizadores de reacciones químicas, o como agentes de control para
otros genes, o como material estructural.
En el núcleo de célula, donde los cromosomas
residen, la información genética es copiada o
transcrita en otra sustancia genética de una estructura similar (al ADN), el ácido ribonucleico
pre-mensajero, ARNpre-m. Los genes de los
organismos multicelulares consisten en secciones activas, los exones, y secciones inactivas, los
intrones. Después de la transcripción, los intrones, que a menudo son muchos más de largos
que los exones, son removidos del ARNpre-m, y
los exones transcritos son empalmados o unidos
entre ellos para crear un ARN mensajero,
ARNm, el cual entonces es exportado hasta los
ribosomas, la proteína que sintetiza (crea) estructuras en el citoplasma de la célula. En los ribosomas, actúan catalíticos de ARN’s, o ribozimas,
que usan la información genética del ARNm
para construir proteínas especificas a partir de
aminoácidos, los cuales son entregados a los
ribosomas por otro tipo de ARN, el ARN de
trascripción o ARNt, para transferir ARN’s o
ARNt.
Los ARN’s usan la base uracilo, U de forma
abreviada, en sustitución de la muy similar base
T del ADN. En el ARNm, tres letras genéticas
consecutivas siempre significan o se leen como
uno de los 20 diferentes aminoácidos según un
diccionario genético, el código genético. Así, la
escritura genética sólo usa cuatro letras, y sus
palabras, los codones, siempre tienen de extensión tres letras, también llamadas tripletas o
triadas. No hay espacios entre las palabras, y
pero hay tres diferentes codones de parada o de
finalización, UAA, UAG, y UGA, que significan
que la síntesis (creación) de la proteína debe
finalizarse.
Gen de la distrofina: La distrofia muscular
Duchenne es una de las enfermedades heredita2
ser dividido por tres, sin que sobre ninguna letra.
En este caso, la distrofina hecha es más larga o
más corta. Si este cambio sólo concierne a las
estructuras no esenciales de la distrofina como
por ejemplo la parte central, esta todavía puede
ser en parte funcional. Es entonces, que la forma
benigna de la distrofia, la distrofia muscular
Becker, se desarrolla.
Si la mutación cambia el marco de lectura por
una o dos bases (letras genéticas), entonces, una
cadena entera de aminoácidos incorrectos es incorporada a la proteína comenzando en el sitio
de la mutación hasta que finalmente alcanza un
nuevo y prematuro codón de parada, el cual da
por terminada la síntesis. En este caso, la distrofina incompleta no puede realizar completamente
su función normal, siendo esta degradada y desarrollándose distrofia muscular Duchenne.
Sin distrofina, las células del músculo se degeneran. Continuamente estas son regeneradas,
pero el mecanismo de regeneración finalmente
falla. Las fibras del músculo destruidas son substituidas por tejido graso y conectivo, apareciendo a la edad de dos a tres años los primeros
signos visibles de la enfermedad.
Donde los nervios motores se ponen en contacto con los músculos, se localiza otra proteína
con una estructura similar a la distrofina, la utrofina, la cual contribuye en algún grado a la estabilidad de la membrana del músculo (Davies,
Oxford). Sin la utrofina, la enfermedad podría
progresar mucho más rápido.
Herencia de la distrofia muscular Duchenne: Además de los 44 cromosomas normales, llamados autósomas, los varones tienen
dos cromosomas sexuales diferentes en cada
célula de su cuerpo, un cromosoma Y y un
cromosoma X. Si su gen de la distrofina en su
único cromosoma X es dañado por una mutación, este no puede ser compensado por un gen
intacto de un segundo cromosoma X, como es
posible para mutaciones en los autósomas, que
siempre están presentes en pares. Por lo tanto, la
distrofia Duchenne y Becker afectan sólo a
varones.
Las mujeres, sin embargo, tienen dos cromosomas X en cada célula de su cuerpo. Cuando
ellas portan un gen de la distrofina mutado en
uno de sus cromosomas-X, ellas pueden transmitir la enfermedad, por lo que son portadoras
genéticas. Como uno de los cromosomas es
inactivado de forma aleatoria (al azar), cerca de
cual también puede ser afectado por mutaciones.
Esto conduce a los 13 tipos diferentes de distrofia de cinturas y 5 distrofias musculares congénitas, así como a al menos 8 otras enfermedades
neuromusculares.
Que tan grande son las moléculas, el ADN
y la distrofina? Una persona común rara vez
tiene una idea correcta del tamaño de las estructuras moleculares con las que trabajan los científicos.
El siguiente experimento mental demuestra lo
pequeñísimo de una simple molécula. Arroje un
cuarto de litro de vino en un extremo del mar
Mediterráneo. Entonces mezcle bien el Mediterráneo, y en el otro extremo del mismo, recoja un
cuarto de litro de agua. ¿Cuantas moléculas de
alcohol podría encontrar en ese cuarto de litro de
agua? ¡Increíblemente serian 22 millones!
La doble hélice del ADN tiene un diámetro de
dos nanometros, que es una millonésima de milímetro. ¿Si alguien aumentara el diámetro normal
de la hélice a un centímetro, que tanto aumentaría la altura de alguien de 1,80 metros si se
aplicara el mismo factor de aumento anterior?
¡Aumentaría a nueve mil kilómetros, la distancia
aproximada entre Europa y Florida!
Cada núcleo celular de las de cerca de 100
billones (un 1 con 14 ceros) de células de un ser
humano adulto, contiene un material genético
completo compuesto por 6 mil milliones de pares
de bases. ¡El ADN entero de todos los cromosomas de cada único núcleo celular mide cerca de
dos metros!
Cada molécula de distrofina es de 125 nanometros de largo, por lo que se necesitan colocar
en línea 80 000 de ellas para alcanzar apenas un
centímetro.
Hay cerca de 114 mil milliones de moléculas
de distrofina y el mismo numero de proteínas del
complejo distrófino en un gramo de músculo.
Mutación y origen de la enfermedad: La
distrofia muscular Duchenne es causada por tres
clases diferentes de mutaciones en el gen de la
distrofina: las deleciones, si partes del gen faltan,
duplicaciones, si partes del gen están duplicadas,
y mutaciones puntuales, si solo una letra genética se encuentra cambiada, eliminada o agregada. Como el mecanismo de lectura en los ribosomas siempre lee las palabras del código de tres
letras una tras otra sin espaciado, una mutación
no trastorna el marco de referencia de lectura si
el número de letras faltantes o adicionales puede
3
co, debido a que la mutación nueva surgió en un
momento temprano de la formación de la célula
germinal y la célula desarrollada se transformo
en un grupo de óvulos, cada uno con la mutación. Como más de un óvulo es afectado, otro
hijo puede heredar la enfermedad también, o una
hija puede ser una portadora genética.
Como los métodos genéticos actualmente no
pueden descubrir una célula germinal de mosaico, debería ser ofrecido un diagnóstico prenatal
durante el segundo embarazo a todas las mujeres
quienes ya tienen un chico con distrofia muscular Duchenne, no sólo a las que han probado ser
portadoras genéticas (Müller-Reible, Würzburg).
Curso clínico de la distrofia muscular Duchenne: Los primeros síntomas clínicos aparecen cerca de los dos o tres años de edad, causando dificultades al caminar y especialmente al
subir escaleras. Sin una detección temprana, aun
hoy la enfermedad se diagnostica generalmente
entre los 3 y 5 años. Debido al aumento de contracturas en las articulaciones del pie, rodilla y
cadera, los pacientes pierden su capacidad para
caminar entre los 10 y 12 años. El aumento de
deformidades espinales, escoliosis, y restricción
de movimiento hace que pronto se vuelva dependiente de intensivo cuidado. La afectación de la
función respiratoria y cardiaca conduce al deceso
por insuficiencia cardiaca y respiratoria en la
edad adulta temprana. Cirugías ortopédicas tempranas para evitar contracturas y deformidades
espinales, así como ayudas respiratorias y otras
medidas pueden mejorar la calidad de vida y
prolongar significativamente las expectativas de
vida.
solo la mitad de sus células musculares en su
núcleo tienen un gen de la distrofina activo. Esto
es suficiente para causar casi ninguno o solo
leves síntomas clínicos de la enfermedad.
Aproximadamente dos terceras partes de los
chicos con Duchenne heredan la enfermedad
porque sus madres son portadoras genéticas. En
la meiosis, la división celular que conduce a los
óvulos, cada óvulo recibe sólo un cromosoma X.
La probabilidad que este sea un cromosoma X
con la mutación génica es del 50 %. Por lo tanto
el 50 % de sus hijos varones por regla general
tendrán distrofia muscular Duchenne y el 50 %
de sus hijas por regla general serán portadoras al
igual que la madre. Estos riesgos permanecen
igual para todos los niños de una familia, no son
más pequeños si la familia ya tiene un hijo con
distrofia muscular Duchenne.
Si la madre es una portadora, la mutación
surgió en las células germinales de sus padres o
de los antepasados de su madre, la abuela del
paciente. Como todas las células del cuerpo de
un portador genético tienen el gen mutado, el
defecto genético de la portadora puede ser descubierto por un análisis génico de los leucocitos,
las células o glóbulos blancos de la sangre, los
cuales contienen cromosomas.
Aproximadamente un cuarto de los casos son
causados por una mutación nueva. En estos
casos, la mutación ocurrió espontáneamente en
el óvulo de la madre que dio lugar al paciente.
Como sólo un óvulo es afectado, todos los otros
niños de estas mujeres no afrontan un mayor
riesgo que el riesgo general para la enfermedad.
Aproximadamente un décimo de los pacientes
tienen una madre con célula germinal de mosai-
Diagnostico Genético
Los métodos de diagnosis de la distrofia muscular Duchenne y Becker en un chico,
durante un embarazo cuando hay riesgo, y para determinar si una mujer es portadora.
Detección temprana.
primera revisión de estas deleciones puede ser en
cualquier parte del gen, pero son más numerosas
en algunas regiones que en otras. Generalmente,
en el primer paso, se seleccionan 19 de los 79
exones del gen de la distrofina, los cuales son
multiplicados o amplificados. Normalmente, no
son amplificados todos esos 19 exones simultáneamente, pero por medio reacciones múltiplex
se realiza en grupos de 4 a 6 exones.
Esta forma permite la detección del 98 % de
Diagnosis de la distrofia muscular Duchenne
en un chico: Para un análisis genético, una muestra de sangre con leucocitos es necesaria. Tales
glóbulos blancos, no los glóbulos rojos, tienen
un núcleo celular el cual contiene el material
hereditario o ADN. Los glóbulos blancos son
aislados y se obtiene de ellos el ADN.
Cerca del 60 % de los pacientes con distrofía
muscular Duchenne tienen deleciones en uno o
más de los exones de su gen de la distrofina, una
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miento quirúrgico menor. Sin embargo si una
biopsia muscular es necesaria, puede realizarse
mejor una biopsia por cánula o aguja bajo
anestesia de local.
Diagnosis Prenatal: Para una diagnosis prenatal de distrofía muscular Duchenne, debe
haber generalmente una razón definitiva como
que ya hay o hubo un afectado en la familia. Para
una diagnosis durante el embarazo temprano,
tejido del feto debe ser obtenido por medio de
biopsia de vellosidades coriónicas (chorionic
villi), entre la décima o decimosegunda semana
de embarazo o por técnica de amniocentesis
entre la decimotercera y decimosexta semana.
Para una biopsia de vellosidades coriónicas,
una pequeña pieza de la futura placenta es aspirada a través de una fina cánula. Si ciertas células del feto son obtenidas, ese tejido puede ser
usado para un análisis directo. El riesgo de esta
intervención es que en cerca de un 3 a 5 % puede
finalizar de forma involuntaria el embarazo.
La ventaja de la amniocentesis es el bajo riesgo de aborto, menor al 1 %. La desventaja es que
las pocas células del feto en el líquido amniótico
deben ser primero multiplicadas en el laboratorio, y esto demora más de 3 semanas, por lo que
el análisis de esas células no puede ser realizado
antes de la decimoquinta o decimoctava semana.
Si son obtenidas suficientes células del feto,
los cromosomas son investigados primero. Esto
permite saber el sexo del feto. Si es niña, entonces, en la mayoría de los casos, no son necesarios mas estudios, debido a que las consecuencias
de una portadora de distrofía muscular Duchenne
deben ser discutidas con la niña cuando ella sea
lo suficientemente mayor para entender y hacer
sus propias decisiones.
Si el feto es niño, entonces un análisis genético es realizado en la mayoría de los casos con
las mismas técnicas descritas para la diagnosis
después de nacer.
Diagnosis de una portadora: Si la mutación
de un chico con DM Duchenne en la familia es
conocida de forma precisa, alguien puede buscar
la misma mutación en la madre y mujeres emparentadas. Esto es técnicamente más dificultoso
que en los chicos con distrofía Duchenne debido
a que solo uno de los dos cromosomas-X de una
mujer puede portar la mutación. Si ella es una
portadora, la intensidad de las bandas después de
electroforesis es solo reducida a la mitad de lo
normal si uno de los exones esta delecionados o
todas las deleciones. En dos tercios de estos
casos, se puede ya deducir donde el marco de
lectura es perturbado o no, por lo que puede
predecirse si el paciente tiene una distrofia
muscular Duchenne o Becker. Para el remanente
tercio de casos, más exones deben ser amplificados.
La amplificación es realizada por la técnica
de reacción en cadena de polimerasa, o PCR,
necesitando la aplicación de primers (o cebar) a
cada exon. Los primers son cortas secuencias
sintéticas de ADN las cuales se unen por si solas
al inicio y al final de cada secuencia del exon.
Los pequeños fragmentos del gen obtenido de
esta manera son separados con técnica de electroforesis donde estos fragmentos migran diferentes distancias en un contenedor de gel y de
esta forma hacerlos visibles como bandas en
espacios desiguales escalonados dentro de una
escala. Cada banda representa uno de los 79
exones. Una deleción es detectada cuando una o
mas de esas bandas esta faltante.
Si no se encontrara ninguna deleción, es probable se trate de una mutación puntual. Para
caracterizar de forma inequívoca esta mutación,
la secuencia de bases de la mayoría de los exones deberá ser determinada. Tales determinaciones de la secuencia, no obstante, requieren trabajo muy demandante, por lo que no se ofertan
rutinariamente. En estos casos, el diagnostico
final solo puede ser realizado por un análisis de
tejido muscular obtenido por una biopsia. Es
entonces que lo que se analiza no es el gen de la
distrofina, si no la proteína distrofina misma por
una técnica llamada western blot.
En este método, después una separación electroforetica, los patrones de la proteína en las
células son calcados a otro material al oscurecerlos, donde los hacen visibles con anticuerpos. O
anticuerpos fluorescentes que se unen a la distrofina, la cual puede ser entonces detectada bajo el
microscopio como líneas brillantes alrededor de
células musculares sanas. En la distrofía Duchenne, esta no es observada o solo se ven muy
pequeñas trazas, en la distrofía Becker en cambio, estas líneas están a menudo raídas, interrumpidas y mayormente mas débil su brillo que lo
normal.
Si el análisis provee un resultado inequívoco
de distrofia muscular, una biopsia muscular a
menudo no es necesaria más. Especialmente en
niños pequeños, pudiéndose evitar este procedi5
presentes o faltantes puntos luminosos, lo que
significaría regiones genéticas normales o faltantes respectivamente. Pero este método, denominado hibridización fluorescente en situ o FISH,
puede solo ser usado si ciertas deleciones específicas han ocurrido en la familia.
Análisis de secuencia del gen de la distrofina como examen de rutina: La nueva técnica
analítica SCAIP (amplificación de condición
individual/”primer” interno) permitirá que en el
futuro sea posible analizar en tres días de forma
confiable mutaciones puntuales, pequeñas deleciones, así como todas las otras mutaciones en
forma rutinaria. En este método, todos los exones del gen de la distrofina, todas las regiones
límite exón-intrón con sus señales de empalme, y
todos los promotores son completamente secuenciados. Estas regiones del gen, que juntas tienen
una extensión de cerca de 110 000 pares de bases
son amplificadas con sus primers específicos en
una sola reacción PCR y luego son checados con
micro electroforesis. Esto permite determinar
todas las deleciones en exones y promotores,
también aquellas que no se localizaban con otros
métodos. La secuencia de bases de cada fragmento de gen es entonces determinado automáticamente con secuenciación individual por primers para detectar las mutaciones puntuales.
Como este método también detecta todas las
mutaciones de las portadoras de distrofía muscular Duchenne, esto conducirá a una mejora en
el consejo genético. Archivos de datos son ahora
compilados, lo cual permitiría la predicción del
curso clínico de una distrofia muscular Duchenne o Becker basándose la definición de la
deleción, duplicación o mutación puntual. Para
este propósito, varios pacientes serán investigados clínicamente y genéticamente (Flanigan,
Salt Lake City).
Detección temprana infantil (sin técnica
genética): En Alemania, entre las 4 semanas y el
año de edad los chicos con distrofia muscular
Duchenne o Becker, los cuales todavía no tienen
síntomas clínicos, son detectados en un programa voluntario de detección CK en el cual la
enzima creatina kinasa, CK, es determinada en
una mancha de sangre seca. Desde 1974, hasta
Julio del 2003, más de 500 000 infantes varones
han sido analizados. Entre ellos, se encontraron
178 chicos con muy altos niveles de CK, y 130
de ellos fueron diagnosticados con distrofia muscular Duchenne (1:3 700) y 28 tenían distrofia
faltantes. No obstante, la amplificación de los
exones no es fácil de controlar. Adicionalmente
a menudo es dificultoso detectar de forma
confiable las diferencias en la intensidad de las
bandas.
Por esto a menudo se usan marcadores polimorficos para el análisis. Estos marcadores son
secuencias de ADN en los intrones entre los exones, los cuales son casi siempre tienen diferente
organización en un cromosoma individual, y de
igual forma tienen diferentes longitudes pudiéndose así distinguir dos cromosomas. Estas secuencias marcadoras no tienen relación con la enfermedad, ellas son características de cada persona, y pueden también ser amplificadas con el
método de PCR y de esta forma ser inequivocadamente identificadas después por electroforesis
Si un chico tiene una deleción en el gen de la
distrofina, no solo esta faltante uno o mas exones, si no también los marcadores en los intrones
entre los exones. En una mujer, pueden checarse
en donde estos marcadores están también faltantes en uno de sus cromosomas X. Si los marcadores estuvieran faltantes, entonces es altamente
probable que ella tenga las misma deleción en
uno de sus cromosomas X. Ella por lo tanto es
una portadora genética. Si ella no es una portadora, deberá tener marcadores adicionales en esa
región.
Los marcadores de ADN pueden también ser
usados si el afectado en la familia no tuviera una
deleción en el gen. Por lo que en ese caso no se
conocería que mutación se debe buscar en las
mujeres emparentadas. Pero basándose en la
organización de los marcadores, se puede decir
en cual de los dos cromosomas-X de la mujer se
localiza el gen mutado, el cual heredo y afecto a
su hijo. Cada mujer en la familia con el mismo
cromosoma-X tiene un alto riesgo de ser portadora.
Este método indirecto ha sido usado por cerca
de 20 años, no obstante actualmente se conocen
muchos mas marcadores. Por lo que, es posible
distinguir uno del otro los dos cromosomas X de
una mujer, y es difícil no ocurra a menos que sea
una familia poco informativa.
Sin embargo si todos estos métodos no son
exitosos, entonces, en algunos casos, pueden
marcarse ciertas regiones genéticas en el cromosoma X con sondas genéticas fluorescentes y
entonces checar bajo el microscopio donde están
6
años hasta encontrar un experto en enfermedades
musculares. Tales programas serán necesarios en
el futuro, porque el progreso de la investigación
terapéutica conducirá a estudios con pacientes
muy jóvenes quienes no tienen ninguno de los
síntomas clínicos y cuyos músculos están
todavía en gran parte intactos. (Scheuerbrandt,
Breitnau/ Friburgo).
muscular Becker (1:17 800).
Una detección temprana permite a los padres
hacer con suficiente tiempo las decisiones que
serán las correctas para ellos, y así evitar otros
chicos con la misma enfermedad nazca en la
misma familia o de mujeres emparentadas.
Adicionalmente, puede ser evitada la odisea del
diagnostico que a menudo todavía toma varios
Posibilidades Terapéuticas
Estrategias de investigación para una terapia causal.
No hay ninguna terapia aún para distrofia muscular Duchenne.
pueda curar la enfermedad de los chicos con Duchenne. Sólo en un tipo de fármacos, tres cortico-esteroides estrechamente relacionados,
prednisona, prednisolona, y deflazacort, ha sido
encontrado que, durante un período limitado de
tiempo, pueden reducir la velocidad de la degeneración de los músculos. Por la severidad de la
enfermedad, las familias de los pacientes, sus
doctores, y el público en general buscan desesperadamente aun el más pequeño resultado positivo
de investigación, y los medios de comunicación,
principalmente los periódicos y la televisión,
tienden a exagerar pequeños avances como saltos importantes. No sólo los medios de comunicación, los mismos científicos son a menudo
sobre-optimistas y pueden declarar los resultados
de experimentos con animales como victorias
terapéuticas, levantando así falsas esperanzas. Ni
un solo chico con Duchenne alguna vez ha sido
curado (Dubowitz, Londres).
Para curar la distrofia muscular Duchenne, la
consecuencia de la mutación que dañó el gen de
la distrofina, que es la degeneración del músculo,
tiene que ser detenida o al menos aliviada. La
investigación intenta hacer esto por medio de
una terapia génica o por una terapia farmacológica. La terapia génica significa que todas las
secciones activas, los exones, del gen intacto de
la distrofina, su ADNc, o partes de el, sean introducidos en cada célula muscular, o que el daño
específico del gen sea reparado por técnicas
genéticas. Una terapia farmacológica significa
que se de una sustancia química ordinaria, un
fármaco o droga normal, que no tiene nada que
ver con un gen, para bloquear o reducir la velocidad de la degeneración del músculo. En ambos
enfoques, se han hecho progresos durante los
pasados últimos años.
No hay ninguna terapia aún: A pesar de
este progreso, ni una terapia génica, ni una farmacológica ha sido desarrollada hasta ahora que
Transferencia de un nuevo gen de la distrofina
Los exones del gen de la distrofina completo o acortado pueden ser transferidos
a las células musculares por medio de virus, plásmidos o mioblastos.
Reacciones inmunes deben ser evitadas.
Ratones distróficos: La mayor parte de los
experimentos para transferir el gen son realizados con una clase de animal de laboratorio: el
ratón-mdx distrófico, que tiene una mutación
puntual en el nucleótido 3,185 en el exón 23 de
su gen de la distrofina. En esta mutación se ha
cambiado un codón CAA, que representa un
aminoácido glutamina, por un codón TAA, que
es un codón de parada, para que la síntesis de
distrofina sea parada antes de tiempo y el ratón
no tenga ninguna distrofina funcional en sus
músculos. Estos ratones no pierden sus múscu-
Es razonable de creer que la transferencia, o el
transporte, de cantidades suficientes del gen intacto de distrofina en los núcleos de las células
del músculo distrófico podría curar la enfermedad proporcionando la información genética de
los nuevos genes que será usada para sintetizar la
proteína por los ribosomas de la célula, produciendo cantidades bastante grandes de distrofina
funcional que entonces emigraría a su lugar normal bajo la membrana de célula, para ser incorporada en el intrincado complejo distrófinoglicoproteico de forma normal.
7
en ratones jóvenes como en los más viejos
(Lochmüller, München; Chamberlain, Seattle).
Dos genes en un virus: En recientes experimentos dos ADNc de distrofina de ratón fueron
empacados en un mismo virus destripado, lo que
significa la duplicacion de todos los 79 exones
sin sus intrones, y en adición a esto dos secuencias genéticas, el muy fuerte reforzador genético
del citomegalovirus y el promotor de la betaactina. Estos vectores génicos fueron inyectados
en el músculo tibial interior de ratones-mdx
recién nacidos y juveniles de 4 a 6 semanas de
edad. Después de 30 días, en los ratones recién
nacidos el 42 % de las células en el músculo
tratado tenía nueva distrofina, la cual todavía fue
detectada después de seis meses. En los ratones
juveniles, el 24 % de las células musculares
tenían nueva distrofina después de 30 días, no
obstante, fue reducida la cantidad a la mitad
después de seis meses. Solo los ratones juveniles
mostraron pequeños problemas inmunes. Hasta
el momento, tales nuevos vectores construidos
son mas efectivos para el tratamiento de la distrofia muscular Duchenne vía terapia génica
(Karpati, Montreal).
Transferencia génica con virus adeno-asociados: Los pequeños virus adeno-asociados
sólo pueden transportar material genético que no
sea mayor de aproximadamente 5.000 nucleótidos, un tercio del ADNc de distrofina entero.
Su ventaja consiste en que ellos transfieren el
gen con más eficacia que los adenovirus normales. La desventaja es que para ser transferido
el ADNc de distrofina, este tiene que ser acortado bastante para que quepa en este pequeño vector. Los pacientes con distrofia muscular Becker,
que progresa mucho más despacio que la distrofia Duchenne, tienen tal distrofina acortada en
sus músculos, por lo tanto, una posible terapia
génica con la transferencia de uno de estos mini
genes tipo Becker no curarían completamente la
distrofia muscular Duchenne, sólo la transformarían en la forma Becker mas benigna.
Para determinar cuales de las cuatro regiones
de la proteína distrofina normal - las dos regiones terminales, la rica en cisteina, o las regiones
de la barra central - son importantes y cuales no
lo son, se han hecho extensos experimentos en el
que ratones distrófico fueron genéticamente modificados para que ellos tuvieran una de nueve
diferentes proteínas distrofinas acortadas en sus
músculos.
los, debido a que ellos no desarrollan fibrosis, la
proliferación de tejido conectivo, como en los
chicos con Duchenne, sus procesos de degeneración causados por la enfermedad no sobrepasen
la regeneración. Aunque la transferencia génica
pueda ser estudiada con ellos, habría que tener
presente que cualquiera de los resultados obtenidos con estos ratones no pueden ser considerados
como inmediatamente aplicable a niños sin estudios clínicos adicionales con pacientes con Duchenne. ¡Un niño no es un ratón grande!
Perros distróficos: Algunos experimentos
son realizados en perros distróficos, con distrofia
muscular del perdiguero dorado, perros GRMD
en sus siglas en ingles, los cuales en contraste
con los ratones, tienen una distrofia muscular
similar a la distrofia Duchenne. Ellos realmente
están impedidos y por lo tanto difíciles de criar y
mantener. Su gen de la distrofina tiene una mutación puntual en el sitio donde se empalma el
receptor del intrón 6 que conduce a una deleción
del exón 7 en el ARNm, un cambio del marco de
lectura y un codón de parada prematuro.
Transferencia génica con adenovirus: Para
transferir un gen, un transportador, un vector
génico es necesario. Un modo de transferir el
material genético a células vivas es empaquetarlo en virus, que consisten en una cadena de
sus propios genes dentro de una cápsula de proteína. Ellos se unen por si mismos a receptores
especiales de proteínas en la superficie de la
célula, introducen sus genes en la célula y luego
usan, o esclavizan, el aparato sintetizador de la
célula para reproducirse. Principalmente dos
clases de virus son usadas como vectores génicos
en la investigación de Duchenne, el adeno virus
y el diez veces el más pequeño virus adeno-asociado. Estos virus no pueden multiplicarse dentro
de la célula objetivo porque los científicos han
eliminado casi todos sus propios genes. El virus
que mas ventajas tiene parece ser el destripado,
prácticamente vaciar el contenido de un adenovirus, que no contenga ningunos de su propios
genes, y así tener el espacio para las mas de 36
000 letras genéticas foráneas, suficiente para
contener el ADNc entero, por ejemplo todos los
exones con la información para la proteína distrofina completa, y para secuencias adicionales
de control. Con estos virus destripados, en hasta
el 30 % de las fibras de músculo de un ratón distrófico, fue sintetizada distrofina nueva seguida
de una mejoría de la función del músculo tanto
8
en la circulación sanguínea. Para asegurar que
nueva distrofina sea sintetizada sólo en las células musculares, otra secuencia genética es agregada al gen de la distrofina en el virus, un promotor CK, el cual normalmente activa el gen de
la proteína muscular creatina kinasa. Este promotor se aseguraría que el nuevo gen de la distrofina sea activado sólo en células de músculo y
no en otra parte.
Para investigar que tanto tales estrategias podrían funcionar en un animal viviente, fueron
creados ratones-mdx los cuales tienen una construcción génica insertada en sus cromosomas.
Esta consiste en el a menudo usado gen Becker
(el gen de la distrofina con el defecto común de
la distrofía muscular Becker), con 6,300 pares de
bases, y de solo la mitad de la longitud del gen
normal, el cual es precedido de un promotor CK
de 1,354 pares de bases. La distrofina acortada
estuvo presente durante el completo tiempo de
vida de los ratones, más de 24 meses, en cantidades suficientes para mejorar todos los síntomas clínicos cuantificables.
La nueva proteína aparecía solo en los músculos de los ratones transgénicos, significativamente mas en músculos de contracción rápida
que de contracción lenta. Los músculos de contracción rápida, los cuales pueden trabajar inmediatamente pero no de forma consistente,
obteniendo su energía a través de la glicólisis,
por la rápida degradación de la glucosa sin el uso
de oxigeno. La energía de los músculos de contracción lenta y consistente es proveída por las
enzimas de la cadena del proceso respiratorio, o
la lenta “combustión” de sustancias orgánicas
con oxigeno. Como los músculos de contracción
rápida son destruidos primero en la distrofia
muscular, la aparición predominante de nueva
distrofina en esos músculos de contracción rápida permite el simple aminoramiento de esta consecuencia temprana de la enfermedad. Experimentos también han mostrado que algo tan poco
como 20 a 30 % de la cantidad normal de distrofina tiene un significante efecto terapéutico.
Para estos experimentos con ratones transgénicos, el gen Becker de la distrofina junto al
promotor CK fue introducido en las células
germinales por medio de inseminación artificial
y manipulación genética, así que esto fue heredado a la progenie de los ratones. Esta es una
técnica la cual obviamente no puede ser realizada con humanos. Para curar a un niño afectado,
Hasta ahora se sabía que algo de la región
central parecida a una barra puede ser quitada sin
la pérdida de función. El análisis detallado de la
estructura tridimensional ahora revela cuales
partes particulares de la estructura de la barra
podrían ser suprimidas sin perderse considerablemente la función que protege al músculo. Una
de las distrofinas acortadas, que era aproximadamente la mitad de lo normal, tenía prácticamente
las mismas propiedades que la proteína inalterada. La entrega de este y algunos otros genes
acortados de la distrofina por medio de virus
adeno-asociados en los músculos de los ratonesmdx previno y parcialmente revirtió los síntomas
distróficos. Estos resultados demostraron que
modificaciones específicas a la distrofina pueden
generar nuevas proteínas que son considerablemente más pequeñas, pero más funcionales que
las distrofinas naturalmente acortadas en pacientes con distrofia muscular Becker (Chamberlain,
Seattle).
Si aproximadamente el 30 % de la cantidad
normal de distrofina inalterada reaparece, medidas hechas sobre el diafragma de los ratones
indican que la función del músculo también se
mejora. La transferencia del mini gen también
conduce a una mejora de la función muscular.
Además, estos experimentos han mostrado que la
transferencia génica conduce a un mejor término
en los animales más jóvenes, debido a que hay
menos problemas de rechazo inmune y, a que
después de una sola inyección, la nueva distrofina recién sintetizada se mantiene en los músculos por mayor tiempo que en animales adultos.
Después de aplicarse un solo tratamiento en
ratones recién nacidos, la recién formada distrofina todavía puede ser encontrada después de un
año.
Para un uso futuro en la gente, esto significa
que los pacientes tendrían que ser tratados
cuanto antes después del nacimiento cuando sus
músculos todavía están en gran parte intactos
(Clemens, Pittsburgh).
Transferencia génica vía circulación sanguínea: En los experimentos hasta ahora descritos, las soluciones han sido que los virus que
contienen el gen de la distrofina fueran inyectados directamente en los músculos de los animales. Para alcanzar todos los músculos, hasta
aquellos del corazón y los pulmones, son realizados experimentos para desarrollar un tratamiento
sistémico, lo que posibilitaría inyectar los virus
9
mentos para transferir el gen de la distrofina
están siendo preparados (Kochanek, Colonia).
Transferencia de genes desnudos: Para esta
técnica, el ADN del material genético a ser transferido no es incorporado en virus, si no en plasmidos, pequeñas estructuras de ADN circulares
sin cubierta de proteína, que existen, a veces en
cantidades grandes, en bacterias donde sobre
todo dan lugar a la resistencia contra los antibióticos. La ventaja de esta clase de transferencia
génica consiste en que los plasmidos no contienen ninguna proteína, sólo material genético,
ADN desnudo, para que ninguna reacción
inmune se desarrolle contra el material vector.
Los experimentos fueron hechos con plasmidos que contenían un marcador o delator de genes, genes cuyas proteínas pueden ser descubiertas en el tejido del músculo por tinción o por la
producción de luz para que así el éxito de un
experimento de transferencia pueda ser supervisado fácilmente.
Cuando volúmenes relativamente grandes de
una solución de plasmidos fue inyectada bajo
presión en arterias de los miembros de ratas y
monos de rhesus, el delator de los genes betagalactosidasa y luciferasa fueron transferidos en
hasta el 20 % de las fibras del músculo después
de una sola inyección y en hasta el 40 % después
de varias inyecciones repetidas. La presión fue
creada bloqueando la salida venosa de un miembro durante un corto tiempo. Los experimentos
para transferir el gen de la distrofina actualmente
son realizados en ratones mdx, monos, y perros
GRMD (Wolff, Madison; Braun, Estrasburgo).
En Francia, estudios clínicos con chicos con
Duchenne han sido iniciados, los cuales serán
descritos en la sección “Estudios clínicos”.
Experimentos para vencer los problemas
inmunológicos: Como los plasmidos de ADN no
contienen ninguna proteína, la transferencia
génica con tal ADN desnudo también permite
examinar los problemas potenciales con respuestas inmunes hacia la distrofina recién creada
sin la interferencia de otras proteínas que son
introducidas con otros métodos de transferencia
génica como los que usan vectores virales y
celulares.
Si el gen humano de la distrofina es introducido en músculos de ratones-mdx, una respuesta
inmune se desarrolla contra la distrofina extraña.
Esto no pasa después de la transferencia del gen
de raton de la distrofina, a pesar que no estaba
se tendría que transportar el gen con su promotor
por medio de transferencia génica con un vector
pronto después de nacer, si es posible, en todos
sus músculos. (Lochmüller, Munich).
Amplificación del blanco de la transferencia génica: Los virus se unen por si mismos a
estructuras específicas sobre la membrana de la
célula, los receptores usados por el virus coxsackie y el adenovirus son por donde ellos penetran a través de la membrana de la célula del
músculo. Estos receptores, sin embargo, son más
numerosos en el desarrollo y regeneración de las
células músculares. Siendo menos numerosos en
los músculos maduros que no se regeneran más.
Así, la transferencia génica con adenovirus vectores es más eficiente en células de músculo que
se dividen.
Para vencer esta deficiencia, los ratones transgénicos fueron producidos para que expresen
estos receptores en grandes cantidades sobre la
superficie de las fibras maduras del músculo.
Esto conduce a una transferencia del gen de la
distrofina 10 veces más eficiente (Holland,
Montreal; Lochmüller, Munich).
Ya que la multiplicación de los receptores, a
los que se une el virus, en las células musculares
del paciente solo puede ser lograda por medio de
métodos o técnicas génicas adicionales con todos
sus riesgos, deberan ser creadas proteínas de
ayuda. En este caso, serian anticuerpos monoclonales los cuales consisten en una clase unicas de
moléculas que pueden por un extremo unirse
muy específicamente con un solo receptor entre
otros receptores más numerosos. Por el otro
extremo, tales proteínas inmunes pueden unirse a
las proteínas modificadas del recubrimiento de
los adenovirus. Para lograr esta union, información genética adicional de una cadena de 33
aminoácidos de una bacteria fueron introducidos
en los adenovirus por manipulación genética.
Estos adenovirus pueden entonces unirse
ellos mismos, por medio del anticuerpo que hace
de puente, a los receptores de la integrina y los
receptores nerviosos (NCAM) de la membrana,
que son más numerosos que los receptores a los
que se une normalmente el adenovirus. Este método permite que 77 veces mas adenovirus pasen
a través de la membrana de la célula muscular
que antes. Con esta nueva técnica, la cual también es usada en otras enfermedades, únicamente
fue transportado el gen que produce la fácilmente detectable proteína beta-galactosidasa. Experi10
con mutaciones puntuales que no interfieren con
la síntesis de otras formas de distrofina. El trabajo experimental actual se enfoca en la determinación de cuales otras distrofinas deben estar presentes para permitir la tolerancia inmune al aspecto (forma) del nuevo tipo de distrofina muscular después de la transferencia génica (Wells,
Londres).
presente distrofina normal en los músculos de
estos ratones distróficos. La carencia de una
respuesta inmune a la distrofina de ratón podría
haberse debido a la presencia de otras formas de
distrofina. Estos resultados sugieren que respuestas inmunes a la transferencia génica de distrofina no puedan ser un problema particular en pacientes con Duchenne, sobre todo en aquellos
Experimentos con células madre
Entre las células satélite y los mioblastos de los músculos,
así como entre las células de la piel y vasos sanguíneos,
se encuentran células madre las cuales pueden formar nuevos músculos o regenerarlos.
como en células nerviosas o de vasos sanguíneos
para crear nuevos músculos. Y que estas pueden
ser cultivadas por largo tiempo.
Estas células madre de músculo fueron multiplicadas en el laboratorio, y a continuación
400,000 de ellas en 25 microlitros (un cuarentavo de centímetro cúbico) de liquido se inyectaron en una sola porción de un músculo de ratones-mdx. Con el fin de ver en que forma son
diferentes estas células de las células miogénicas
normales, las más especializadas células EP fueron inyectadas en ratones-mdx bajo las mismas
condiciones.
En los ratones que fueron tratados con células
EP, 130 células musculares en la zona de la inyección contenían nueva distrofina después de
30 días, la cual no obstante, después de 90 días,
habia desaparecido extensivamente. En estos
ratones, reacción inmune de linfocitos fue observada, la cual probablemente es responsable de la
lenta desaparición de la nueva distrofina.
En contraste a estos resultados, 1,500 células
musculares en la zona de la inyección en los
ratones tratados con células madre de músculo
contenían nueva distrofina, cerca de 10 veces
mas que después de la inyección con células EP.
Aun después de 90 días, en prácticamente todas
estas células, la nueva distrofina estaba todavía
presente. En este caso, no hubo reacción inmune
aunque los ratones receptores no habían recibido
ninguna medicación inmuno supresora.
Debido a que las células madre de músculo
usadas en estos experimentos fueron aisladas de
ratones normales recién nacidos, esta técnica
probablemente no será aplicable en humanos sin
una modificación para el caso de niños con
distrofía muscular Duchenne. Esto puede, no
obstante, influenciar los recientes trabajos de
Las células madre existen en muchos tejidos del
cuerpo, también en músculos esqueléticos y en la
médula ósea. Estas células no-especializadas
pueden desarrollar muchas clases de células especializadas, por ejemplo células madre de médula ósea en los diferentes tipos de células sanguíneas, y células madre de músculo en células
de músculo nuevas. Estas células pluripotentes
son células madre somáticas o adultas, en contraste con las células madre embrionarias que
son totipotentes y que pueden desarrollarse en
todas las clases de células del cuerpo y células
germen. La investigación de células madre para
encontrar una terapia para la distrofia Duchenne
sólo usa las células madre adultas de animales
experimentales, así los problemas éticos unidos
con el empleo de células madre humanas embrionarias serian evitados.
Células madre de músculos esqueléticos:
En la superficie de las células musculares se encuentran las denominadas células satélite, también llamadas células miogénicas o mioblastos,
las cuales después de una activación a través de
varios pasos intermedios, pueden formar nuevos
músculos o reparar músculos lesionados. Para
determinar cuales de tales células de “respaldo”
son entera o parcialmente células madre, fueron
aisladas células satélite de músculos esqueléticos
de ratones recién nacidos. De esta forma se encontró que estas consisten de tres diferentes
clases, principalmente las así llamadas células
miogénicas EP y LP, las cuales ya se encuentran
algo especializadas. La tercera clase son células
madre derivadas de músculo, MDSC. Estas son
bastante raras, solo una entre 100,000 células
satélite es una de tales células MDS. Pero estas
raras células son pluripotentes, esto es, que
pueden desarrollarse en células musculares así
11
20,000 de estas fueron inyectadas en el flujo sanguíneo de ratones-mdx hembras. Después de un
mes, entre 5 y 9 % de sus células musculares
contenían distrofina normal y algunas también
contenían cromosomas-Y.
Actualmente, en el 2002/2003, estos experimentos fueron repetidos y extendidos a células
madre obtenidas de la piel. Las ventajas de un
aislamiento de células de la piel es que este
tejido es más accesible que el tejido muscular, y
que los animales receptores no tienen más que
ser irradiados.
Una pequeña población lateral de células fue
también obtenida con la técnica FACS de células
de piel, las cuales tienen las mismas propiedades
en su superficie, o marcadores, como las células
madre de músculo SP. Los porcentajes de células
SP actualmente es de 0,1 % entre células de medula ósea, de 0,7 % entre células musculares, y
de 1,2 % entre células de piel. Tres meses después de la inyección de 6,000 a 50,000 de células
SP de piel, 2,3 % de las células musculares de
los ratones hembra contenían nueva distrofina y
algunas también contenían cromosomas-Y.
Este experimento ha probado que las células
madre pueden ser aisladas de piel, y que, después de su aplicación vía flujo sanguíneo, pueden formar nuevas células musculares con distrofina normal. Esta técnica todavía no es suficientemente efectiva para ser significativamente
terapéutica. Pero después de ser optimizada con
más investigación, una terapia para distrofía
muscular Duchenne posiblemente se base en ella
(Kunkel, Boston).
Activación de células madre de músculo:
Las células madre de músculo con estructuras específicas en su superficie se localizan en músculos intactos, y no se desarrollan en nuevas células musculares, estas por lo tanto no son miogénicas. Pero si los músculos son lesionados y las
células musculares se regeneran solas, entonces
el número de células madre de músculo aumenta
más de diez veces. Estas células son ahora miogénicas, pudiendo desarrollarse en mioblastos y
nuevas células musculares, esto fue observado en
experimentos con cultivos de células y ratones.
Esta activación fue iniciada por proteínas Wnt,
una familia de proteínas señaladoras las cuales
aparentemente son producidas al lesionarse las
células musculares y las cuales también juegan
un rol durante el desarrollo embrional (Rudnicki,
Ottawa).
estudios con mioblastos (Huard, Pittsburgh;
Wernig, Bonn).
Células madre de medula ósea, músculo y
piel: A finales de la última década, fue realizado
el primer experimento con células madre de medula ósea y con células satélite musculares. En
todos los experimentos, las células madre fueron
obtenidas de ratones machos normales con genes
normales de distrofina, y estas células fueron
inyectadas en la vena de la cola de ratones-mdx
hembras. Los ratones hembras eran homocigóticos, esto es, que los genes en sus dos cromosomas-X estaban mutados, así que no podían producir ninguna distrofina propia. Esto permitía
que las células inyectadas en los ratones hembras
pudieran ser localizadas por el cromosoma-Y.
Los ratones hembras habían recibido una irradiación muy alta de rayos X, letal para el sistema
inmune, para evitar una reacción inmune. La
transferencia de las células madre regenero la
medula ósea de los ratones.
Se inyectaron 10 a 50 millones de células de
medula ósea sin tratar. Tres meses después, distrofina pudo ser detectada en más de un 10 % de
las células musculares de los ratones. Algunas de
las células positivas de distrofina contenían cromosomas-Y, comprobándose que las células de
medula ósea de los ratones machos, que llegaron
vía el flujo sanguíneo, se fundieron con las células musculares de los ratones-mdx hembras.
Estos tuvieron de esta forma la información normal de la distrofina, la cual fue entonces usada
para la producción de distrofina funcional. Esto
fue muy importante para probar que la nueva
distrofina no apareció por reversión, esto es, por
una omisión espontánea de exón la cual ocurre
en pequeñas excepciones en ratones-mdx y
también en chicos con Duchenne.
Para encontrar cual parte de las células de
medula ósea tenían propiedades de célula madre,
un pequeña población lateral, SP, pudo ser separada de la mezcla celular original por el método
de clasificación por activación celular fluorescente o FACS. Como estas células SP tenían
propiedades de célula madre, fueron usadas para
experimentos posteriores.
Tres meses después de la inyección de solo
2,000 a 5,000 de esas células SP de medula ósea,
mas del 4 % de las células musculares de los
ratones-mdx tenían distrofina. En una forma
similar, células madre SP de músculo fueron
aisladas de células satélite musculares, y 7,000 a
12
Genes de la distrofina intactos podrían ser
transferidos en estas células madre derivadas del
paciente por procedimiento ex-vivo con vectores
conocidos, siendo después multiplicadas en el
laboratorio, y finalmente inyectadas en las más
importantes arterias del niño. Posiblemente, el
tratamiento tendría que ser repetido después de
varios meses, por lo que es importante que esas
células no sean rechazadas por el sistema inmune. Una de las más importantes ventajas podría ser, que con esta técnica pueden ser alcanzados todos los músculos, incluido el cardiaco y
músculos respiratorios. Este podría ser un tratamiento sistémico con relativamente pocas inyecciones comparado a otros acercamientos de terapia génica (Cossu, Milan).
Un experimento natural con células madre: A la edad de un año, un chico con distrofía
muscular Duchenne recibió un transplante de
medula ósea de su padre debido a que sufría otra
enfermedad (sin relación a distrofía Duchenne).
Ya que el todavía caminaba a los 14 años a pesar
de tener una deleción en el marco de lectura del
exón 45, fue asumido que las células madre de la
medula ósea habían proveído la información
para nueva distrofina. La investigación con un
nuevo material bioptico, no obstante, ahora
mostró que los síntomas mas moderados de la
enfermedad se debían únicamente en un pequeño
grado al transplante, pero principalmente a la
deleción espontánea adicional del exón 44, así
que en el ARNm, el exón 46 seguía inmediatamente después del exón 43. Esta omisión de
exón normalizo el marco de lectura. La distrofina pudo otra vez ser producida pero de una
extensión mas acortada, por lo que causaría
síntomas de distrofia Becker (Ver el párrafo
sobre la omisión de exon). Aparentemente, después de 13 años, un transplante de medula ósea
pudo contribuir en algún grado como una terapia
para distrofía muscular Duchenne, no obstante,
no es suficiente para causar un cambio significativo de la enfermedad (Kunkel, Boston).
Terapia celular con mioblastos: Los músculos tienen sus propias células madre, las células
satélite o mioblastos, los cuales durante el desarrollo o la reparación de músculos, se funden
entre ellos para formar miotubos y estos a la vez
en largas fibras musculares. Debido a que la
palabra “transferencia de mioblastos” ha sido
mal usada de forma fraudulenta, actualmente se
prefiere a menudo decir células miogénicas en
Algunas proteínas Wnt han sido aisladas y caracterizadas ahora. Estas tienen cerca de 400
aminoácidos largos y contienen ácido palmitico,
un ácido graso el cual parece es importante para
la transmisión de señales moleculares (Nusse,
Stanford).
Mesoangioblastos, células madre de vasos
sanguíneos: Medio millón de células madre de
vasos sanguíneos de fetos de ratones normales,
recientemente detectadas, fueron inoculadas en
una sola inyección en la arteria de una de las
patas posteriores de ratones. Estos ratones tenían
faltante una proteína del complejo distrófino, la
alfa-sarcoglicano, lo cual causa una de varias
distrofias musculares del anillo óseo (cinturas)
en los humanos. Las células inyectadas migraron
hacia los capilares sanguíneos, pasaron a través
de sus paredes celulares, y desde ahí a todos los
músculos de la pata inyectada, especialmente en
las fibras regenerantes.
Por al menos tres meses después de la inyección, nuevo sarcoglicano estaba otra vez presente
en cantidades casi normales. Lo mismo ocurrió
para varias de las otras proteínas del complejo
distrófino las cuales también estaban faltantes.
También, no hubo reacciones inmunes. Después
de tres inyecciones consecutivas cada 40 días, no
solo fue casi corregido el defecto genético, si no
que también la fuerza de la pierna tratada prácticamente fue normalizada. De la misma forma, no
fueron encontrados problemas inmunes.
Con el objetivo de checar que tanto esta técnica podía posiblemente ser usada para una terapia génica, los mesoangioblastos de ratones
“enfermos” fueron aislados, y el gen faltante de
alfa-sarcoglicano fue transferido por medio de
retrovirus en las células madre defectuosas. La
aplicación sistémica de estas células tratadas exvivo condujeron a los mismos resultados positivos que en los encontrados con células madre
normales.
Para estos experimentos, células madre derivadas de vasos sanguíneos fueron aisladas de
fetos de ratón. Pero si fuera posible aislarlas de
los mismos chicos con distrofia muscular Duchenne, estos resultados positivos inesperados
significaría que un numero de problemas relacionados con los presentes experimentos de transferencia génica podrían ser evitados, por ejemplo, la baja efectividad, rechazo inmune, y el
requerimiento de varias inyecciones en todos los
músculos que puedan ser alcanzados.
13
nos. Estos han mostrado que el inhibidor inmune
FK506 solo o combinado con el inhibidor MMF
evitaba los problemas de rechazo mucho mejor
por varios meses. Una gran densidad de aplicación, con una distancia de inyecciones de solo 1
milímetro y un alto número de transplantes de
células, contribuyo al resultado de que en los
monos mas del 67 % de las células musculares
habían recibido los mioblastos, volviéndose
células musculares híbridas (Tremblay, Québec).
Un estudio clínico con la técnica modificada
ha sido iniciado en Canadá (ver la sección “Pruebas Clínicas”). También en otros laboratorios, se
trabaja para mejorar esta técnica de terapia celular. Por ejemplo se encontró que la m144, una
proteína del sistema inmune, evita la inmediata
muerte de los mioblastos después del transplante
en los músculos de ratón (Hodgetts, Crawley,
Australia).
Experimentos con terapia génica ex-vivo:
Para evitar completamente los problemas inmunes, experimentos fueron realizados para aislar
los mioblastos del paciente mismo, y después en
el cultivo celular, transferir un gen intacto de
distrofina a las células, antes de re-inyectarlas de
nuevo. En experimentos preliminares, usando
electroporación, se transportaron plasmidos con
un gen para una proteína fluorescente marcadora
a través de la membrana celular de los mioblastos humanos en un recipiente de cultivo. Esta
técnica transitoriamente hace permeables las
membranas con un solo pulso eléctrico, por
ejemplo 400 V a través de un hueco de 4 mm. En
condiciones óptimas, hasta al 70 % los mioblastos se les transfirió el gen, el cual producía proteína fluorescente. Las células mantenían su habilidad para fusionarse en miotubos, la siguiente
etapa de desarrollo muscular (Bernheim,
Ginebra).
vez de mioblastos.
En los años 1990 y 1991, fueron realizados
extensivos estudios con mioblastos en chicos con
DM Duchenne. Esta técnica de transferencia de
mioblastos había mostrado resultados positivos
en ratones-mdx. Las células usadas contenían el
gen normal de la distrofina debido a que estas
derivaban de donadores sanos, mayormente el
padre del paciente. Estas células fueron aplicadas
en múltiples inyecciones a 0,5 centímetros de
distancia en algunos músculos de los chicos con
DM Duchenne con la esperanza de que células
musculares con distrofina normal fueran encontradas. Estos experimentos no fueron exitosos en
chicos con Duchenne, porque los mioblastos no
emigraron suficientemente fuera de los sitios de
la inyección, había problemas inmunológicos y,
encima de todo, casi todos los mioblastos inyectados habían muerto después de un corto tiempo
(Karpati, Montreal).
Nuevos experimentos de transplante de
mioblastos: Se continúo trabajando en esta
técnica con el objetivo de determinar la razón
por la que menos del 1 % de los mioblastos
transplantados sobrevivía en los músculos
distróficos. Los investigadores ahora están
tratando de caracterizar estas pocas y raras
células activas, y encontrar la forma de aislarlas
de la mayoría de células inactivas. Por lo que
ellos buscan señales moleculares, sustancias
especiales en las células musculares, las cuales
pueden activar a los mioblastos (Partridge,
Londres).
En los primeros experimentos, solo dos fármacos conocidos, la ciclosporina A y la ciclofosfamida fueron usadas para suprimir las reacciones inmunes en los pacientes con distrofía
muscular Duchenne. Actualmente, otras sustancias han sido investigadas en estudios con mo-
Cambiando la información genética (reparación génica)
Mutaciones del gen de la distrofina en el cromosoma-X son reparadas con oligoribonucleótidos.
Exones enteros son omitidos con el objetivo de restaurar el marco de lectura.
Codones finales, o de parada, prematuros pueden posiblemente ser omitidos.
serían evitados, (2) no sólo la distrofina de los
músculos esqueléticos, si no todas otras formas
de distrofina también serían reparadas, (3) la
regulación específica de la producción de distrofina en el tejido sería mantenida, (y 4) la fabricación del agente terapéutico, los oligonucleótidos,
probablemente sería más fácil y más barata que
Experimentos han sido emprendidos con el objetivo de no introducir una secuencia génica funcional de distrofina en las células de músculo,
pero si de cambiar la información genética defectuosa reparando la mutación. Tal técnica tendría cuatro ventajas importantes: (1) los riesgos
de una transferencia génica mediada por virus
14
dedor del sitio de la inyección contenían distrofina nueva la cual no era distrofina revertante,
por ejemplo distrofina normal después de una
supresión espontánea de la mutación. Esta cantidad de distrofina nueva permaneció estable durante al menos 10 semanas (Rando, Palo Alto).
Omisión de exón: Con esta técnica se intenta
cambiar una mutación Duchenne en una mutación Becker. Esto puede ser hecho induciendo el
mecanismo de empalme, el cual elimina los intrones del ARN pre-mensajero, a eliminar también un exón específico después de una mutación
puntual o una deleción que ha alterado el orden
del marco de lectura y por lo tanto causando un
codón final o de parada prematuro. El objetivo
de este método es restaurar el marco de lectura
perturbado.
El gen con su mutación no es alterado al
omitir el exón, sólo el ARN mensajero, ARNm,
el cual no contiene la información del exón
omitido. Como el ARNm es más corto de lo
normal, la proteína distrofina es también más
corta, esta contiene menos aminoácidos. Si los
aminoácidos faltantes formaran parte de la
región central de la distrofina, no serian esenciales, y la proteína más corta resultante todavía
podrá realizar su papel estabilizante en la membrana de las células del músculo. El resultado
sería un cambio de los severos síntomas de la
distrofia Duchenne a los mucho más suaves
síntomas de la distrofia muscular Becker.
Eliminación de la mutación de ratonesmdx: Este acercamiento fue usado para pasar de
largo un solo defecto nucleótido, la mutación
puntual en el exón 23 del ratón mdx. Un oligonucleótido en antisentido, consistiendo de 20
pares de bases que son complementarias a la
secuencia de ARN del ARNpre-m en una de las
zonas entre el exón 23 y el intrón 23, indujo la
omisión del exón que contenía la mutación durante el proceso de empalme. La información
genética del exón 23 del gen, que codifica 71
aminoácidos en la zona de la barra (de la proteína distrofina), fue omitida de esta forma durante
el proceso de lectura.
Este y los otros oligonucleótidos de antisentido fueron químicamente modificados, por ejemplo, protegiendo los normalmente libres y sensitivos grupos-OH en las unidades de ribosa del
ARN por medio de grupos metílicos (-CH3).
Cerca de 5 microgramos (una millonésima de
gramo) de estos fármacos génicos, potencial-
la fabricación del virus vectores con el material
genético a ser transportado.
Los Oligonucleótidos son cortas secuencias
específicas de ADN o ARN, las cuales consisten
en unas pocas bases (nucleótidos) conectadas
unas con otras por puentes de fosfato-ribosa o
desoxirribosa de los andamios del ácido nucleico. Estos pueden ser manufacturados en el
laboratorio automáticamente.
Tres clases de estrategias de reparación son
aplicadas: (1) reparar la mutación a nivel del gen
mismo, (2) cambiar la información genética durante trascripción del ARN por omisión de exón,
(y 3) ignorando un codón de parada prematuro.
Reparando el gen de perros GRMD: Los
intentos para reparar las mutaciones puntuales a
nivel génico son hechos usando cortos oligonucleótidos quiméricos, que contienen tanto
ARN sobre unas de las cadenas como ADN
sobre la otra. La cadena de ADN de los oligonucleótidos quiméricos es perfectamente complementaria a la correcta secuencia génica del
sitio de la mutación puntual del gen, mientras
que la parte de ARN es perfectamente complementaria a la secuencia mutante. Esto conduce a
estructuras cuádruples apareadas, cadenas cuádruples, que son capaces de corregir una mutación tan pequeña activando los mecanismos
biológicos de reparación del ADN de la célula.
Con esta técnica, un ADN y un ARN oligoucleótido complementario se empalmarian al
sitio de la mutación en el gen de la distrofina de
perros GRMD distroficos al ser inyectados en un
perro afectado de 6 semanas de edad. El músculo
tratado mostró: (1) La evidencia de restauración
del exón que se omitía debido a la mutación, (2)
la restauración de la región codificada de la proeína por el exón faltante dentro de la proteína de
completa de distrofina que se localizo correctaente en la membrana del músculo, (y 3), el más
importante, la demostración de que el gen en el
cromosoma-X fue corregido. La reparación de la
mutación fue sostenida para casi un año en este
perro (Bartlett, Bethesda).
Reparando el gen de ratones-mdx: En un
experimento similar, fue reparada en-vitro la
mutación puntual en el exón 23 de mioblastos de
ratones mdx y estos mioblastos entonces se uniron en miotubos los cuales crearon distrofina
completa normal. Dos semanas después de una
sola inyección de oligonucleotidos en los músculos de ratones mdx, del 1 a 2 % de las fibras alre15
última página de este reporte muestra los detalles
moleculares de este experimento.)
Este porcentaje de ARNm acortado sin exones 45 y 46 condujo a cantidades normales de
distrofina acortada en al menos el 75 % de los
miotubos. Después de 16 horas, esta nueva distrofina pudo ser detectada en las células, después
de 48 horas esta se movió a la membrana celular
y ahí se mantuvo por al menos una semana. La
reaparición de la distrofina también condujo a la
restauración del complejo distrófino en y bajo la
membrana de la célula muscular. Entre tanto, el
marco de lectura pudo ser corregido en preparaciones in-vitro de seis otros pacientes quienes
tenían diferentes deleciones y también una mutación puntual.
Esta técnica fue sumamente específica, resultando solamente en el retiro de un exón objetivo.
Con la misma técnica, fue posible omitir otros 18
exones en las células de músculo cultivadas. Así,
que esta estrategia muy prometedora, probada
en experimentos en probeta, posiblemente más
tarde pueda convertir las mutaciones Duchenne
en mutaciones Becker en más del 65 % de los
pacientes con deleciones.
Los estudios en curso investigan diferentes
métodos para la transferencia de los oligonucleótidos de antisentido en un organismo vivo. En
este extremo, experimentos con ratones vivos
son realizados, los cuales en lugar de su propio
gen de la distrofina (de ratón), tienen el gen
humano en sus músculos, el cual ha sido cambiado para crearles deleciones “humanas”. Estudios
clínicos en chicos con DM Duchenne con estos
métodos solo pueden ser considerados después
de que estos estudios con ratones “humanizados”
den resultados positivos.
Ya que la estructura del gen de la distrofina
es conocida en todo detalle, es posible predecir
cual exón debe ser omitido con el fin de restaurar
el marco de lectura después de una deleción o
mutación puntual definida. Sin embargo, en este
momento tales predicciones solo pueden ser
puramente teóricas. No hay certeza, que tanto los
resultados obtenidos en cultivo de células como
en ratones, serán los mismos en chicos con DM
Duchenne, de igual forma no hay certeza si en
un caso individual, la restauración de distrofina
acortada conducirá realmente a síntomas de
distrofia muscular Becker (van Ommen, van
Deutekom, Leiden).
mente estabilizados, fueron inyectados junto con
el detergente F127 en los músculos de la pata de
ratones-mdx vivos. Después de dos a cuatro semanas, más del 20 % de las fibras musculares
contenían al menos cantidades normales de la
levemente acortada distrofina. Junto a esta, los
otros componentes del complejo distrófino fueron localizados correctamente en la membrana
celular. La fuerza muscular fue mejorada significativamente pero no completamente normalizada. Un repetido tratamiento incremento el número de fibras musculares positivas de distrofina
sin el desarrollo de un rechazo inmune (Wilton,
Perth, Partridge, Londres).
Omisión de exón en el ARNm de la distrofina humana: El exón 45 del gen de la distrofina
es el exón delecionado con más frecuencia en
chicos con distrofia Duchenne. Esto causa un
cambio del marco de lectura en el ARNm y un
codón de parada prematuro, lo que conduce a
una proteína truncada y no-funcional de distrofina que posteriormente es degradada en las células del músculo. Sin embargo, si ambos exones
45 y 46 se encuentran delecionados simultaneamente, el marco de lectura no es afectado, resultando una distrofina más corta de lo normal con
la falta de una cadena de 108 aminoácidos no
esenciales de la parte media de la proteína. Los
pacientes con esta clase de deleción tienen síntomas más suaves, de distrofia muscular Becker.
En experimentos en-vitro para deleciones
especificas del exón 46 del ARNpre-m de distrofina en miotubos de ratones mdx se logro exitosamente con cuatro diferentes oligoribonucleótidos en antisentido complementarios a una
secuencia regulatoria de empalme en el interior
del exón 46. Con estos oligonucleótidos, una
secuencia de reconocimiento de exón (ERS) o un
reforzador de empalme exonico (ESE) son bloqueados, estructuras las cuales son necesarias
para los procesos de empalme, la unión de los
exones en el ARNm.
Seguidos a estos, experimentos en-vitro similares fueron realizados con varios oligonucleótidos en antisentido específicos en el sitio de
empalme análogo del exón humano 46. Con uno
de ellos, consistiendo de 19 nucleótidos, era
posible suprimir el exón 46 de aproximadamente
el 15 % de los ARNpre-m’s de distrofina en miotubos obtenidos de dos pacientes con Duchenne
quienes tenían una deleción del exón 45. (La
16
final del exón 23 del ARNpre-m de la distrofina
en los sitios importantes del proceso de empalme. Por lo que, estos sitios de empalme fueron
bloqueados y el exón 23 fue removido junto a los
intrones durante el empalmado del ARNpre-m
(siendo una omisión de exon). Como la mutación
puntual de los ratones-mdx se localiza en el exón
23, la remoción de este exón resulto en que los
células musculares de los ratones-mdx, las cuales
no podían crear ninguna distrofina, ahora
producían una proteína distrofina levemente
acortada la cual fue correctamente localizada
bajo la membrana celular.
El objetivo de este fundamental experimento
in-vitro – fuera de ratones vivos – fue probar que
las células musculares pueden por si mismas producir los oligonucleótidos de antisentido terapéuticos.
Para una aplicación humana, tendrían que ser
usados ARNsn-U7 adaptados para la mutación
individual del paciente, cuyo gen debe ser transportado por un vector génico terapéutico al núcleo celular de las fibras musculares. Una alternativa podría ser una transferencia ex-vivo transportando genes ARNsn-U7 a células satélite u
otras células madre de músculo y después inyectar estas al flujo sanguíneo o directamente en el
músculo. Como los genes de ARNsn-U7 son
muy cortos, la transferencia seria probablemente
más fácil que transferir el ADNc de la distrofina
entera o acortada, como se ha venido tratando
con otros métodos (Weis, Berna; Lochmüller,
Munich).
Recombinación homóloga: La mutación
puntual en el gen de la distrofina de ratones mdx
podría ser reparada en el 15 a 20 % de mioblastos aislados por la adición de una cadena de
ADN de 603 pares de bases (nucleótidos) cuya
secuencia es la misma que la secuencia antes y
después del sitio de mutación del exón 23 de los
ratones, pero sin contener el cambio C-a-T de la
mutación. Parte del segmento del nuevo gen fue
cambiado siguiendo una correspondencia, u homólogia, en el exón 23. Esta técnica de recombinación homóloga por fragmento corto, SFHR
con sus iniciales en ingles, ahora es aplicada a
mioblastos aislados de pacientes con Duchenne
con mutacion de deleción en el exón 13. (Kapsa,
Melbourne).
Ignorar un codón de parada prematuro
por medio de antibióticos: Aproximadamente
el 5 % de los chicos con Duchenne tienen una
Los sitios de empalme son secuencias de
ARN específicas en la frontera entre exones e
intrones, la cual es esencial para el retiro correcto del intrón no-codificando de la secuencias de
ARNpre-m. Este ARN pre mensajero es el primer producto de un gen activo; después del
retiro de las secuencias del intrón por empalme
este se convierte en ARN mensajero, ARNm,
que se mueve a los ribosomas donde actúa como
el transmisor de la información para la síntesis
de la proteína.
Omisión de exón con oligonucleótidos producidos internamente: En un nuevo método de
omisión de exon, los oligonucleótidos de antisentido no tienen que ser inyectados aunque son
sintetizados en el núcleo celular, donde son necesarios, después de transcribirse su propio gen.
Las secuencias del intrón son cortadas y eliminadas del ARNpre-m en el núcleo celular por los
splicesomas. Estos son estructuras complejas que
consisten en varias proteínas y pequeños ARN's,
o ARNn’s, los cuales reconocen los limites entre
exón e intrón y unen los exones después de cortarlos, empalmandolos sin alterar el marco de
lectura.
Algunos de estos muy cortos ARN’s son los
ARNn-U7. Estos se unen a sitios de empalme al
reconocer secuencias especiales en el ARNprem, bloqueando el empalme de exones específicos, y de esta forma asegura que varias proteínas de diferente longitud puedan ser producidas
por un mismo gen. Los ARNn-U7 normalmente
regulan el proceso de empalmado del ARNm de
las histonas. Las histonas son proteínas necesarias para el empacado del ADN en los cromosomas.
Para este nuevo método, los ARNn-U7 fueron
genéticamente modificados para que no estén
ligados mas al ARNpre-m de la histona, si no a
los sitios de empalme en la región del exón 23
del ARNpre-m de la distrofina de ratón. Para
lograr esto, el gen que codifica el ARNsn-U7
modificado junto con un reforzador de creatinakinasa fue empacado en plásmidos como vectores, seguido a esto, en un experimento de laboratorio, se transfirieron a mioblastos aislados de
los ratones. Estas células se desarrollaron en el
contenedor de cultivo en células musculares.
En el núcleo de los mioblastos transgénicos,
el gen transferido produjo los ARNn-U7 modificados. Estos realizaron el nuevo reconocimiento de secuencias y se unieron ahora al inicio y
17
posible terapia para la distrofia muscular no
necesitaría largos procedimientos de aprobación
(Sweeney, Filadelfia).
Con el fin de confirmar estos resultados positivos, otros dos estudios con ratones-mdx fueron
realizados los cuales mostraron, sin embargo,
que bajo condiciones similares después de un
tratamiento con gentamicina no pudo detectarse
nueva distrofina (Karpati, Montreal; Lochmüller,
Munich).
Dos estudios clínicos con gentamicina han
sido realizados en chicos con Duchenne, pero
tampoco condujeron a nueva distrofina. Posiblemente el periodo de prueba de 14 días fue
insuficiente. Por lo que, otra y mas larga prueba
clínica con 36 pacientes es ahora realizada
(Mendell, Columbus).
mutación puntual en su gen de la distrofina
donde esta cambiada una palabra del código de
aminoácidos en uno de los tres codones de
parada, TGA, TAG y TAA, después de los
cuales la síntesis de distrofina se detiene o
finaliza prematuramente.
La gentamicina es un antibiótico que causa
que el mecanismo de traducción del ARN en los
ribosomas ignore un codón de parada tan prematuro, esto es leer a través de el. Los codones de
parada normales, los que están protegidos por
una estructura especial tridimensional, sin embargo, serian leídos o usados como antes. En
ratones-mdx, hasta el 20 % de la cantidad normal
de distrofina nueva y funcional ha sido obtenida
de este modo. La gentamicina tiene la ventaja de
ser un fármaco conocido, cuyo empleo como una
Reemplazo de la distrofina
La utrofina es una proteína muscular presente en pequeñas cantidades en los pacientes
con Duchenne. En grandes cantidades esta podría asumir las funciones de la distrofina.
utrofina únicamente cuando se les daba el antibiótico tetraciclina en su agua de beber. El incremento de las cantidades de utrofina prevenía el
desarrollo de síntomas de distrofía muscular Duchenne, y esto efecto fue mas pronunciado en
ratones recién nacidos que en de 10 o 30 días de
edad.
Para una posible terapia para la distrofia
Duchenne, otra estrategia es seguida, que es
aumentar la cantidad normalmente baja de utrofina aumentando la actividad de su gen. Para
hacer esto, una sustancia de activación es necesaria, la que podría ser un fármaco conocido, o
alguna otra sustancia química o natural.
Durante los últimos años, la química sintética
actual ha desarrollado métodos para producir
automáticamente miles de sustancias parcialmente desconocidas. Varias de esas sustancias
han sido probadas en el laboratorio, también
automáticamente, en cultivos de células de ratones-mdx por su habilidad de activar el gen de
la luciferasa, la cual es precedente de dos promotores del gen de la utrofina. Cada acierto, por
ejemplo, cada sustancia que mostraba al menos
una pequeña actividad en estas pruebas preliminares, es posteriormente modificada, y entonces,
todas estas sustancias similares son probadas
primero en cultivos de células musculares, y si
estas reaccionan positivamente, se observa que
tanto en ratones-mdx vivientes pueden también
Activación del gen de la utrofina: La utrofina
es una proteína similar a la distrofina. En los humanos, su gen esta localizado en el cromosoma
6, teniendo 75 exones y cerca de un millón de
pares de bases de extensión. La proteína de la
utrofina es aproximadamente 7 % más corta que
la distrofina. Está presente en muchos tejidos del
cuerpo, también en el músculo, pero allí se concentra en las regiones donde los nervios motores
se ponen en contacto con la membrana del músculo. Antes del nacimiento, la concentración de
utrofina en el músculo es mucho más alta que
después del mismo. Esta proteína, incluso cuando está presente sólo en pequeñas cantidades,
hace los síntomas de la distrofia Duchenne menos severos de lo que serían si la utrofina también estuviera ausente. De hecho, en ratonesmdx, cuyo gen de la utrofina fue eliminado experimentalmente, no teniendo ni distrofina, ni
utrofina, tienen síntomas como de DM Duchenne
y mueren pronto en contraste a los ratones-mdx
normales cuyos músculos no se degeneran.
Los experimentos con ratones han mostrado,
que la utrofina, si está presente en cantidades
suficientes, puede sustituir a la distrofina. Los
ratones usados fueron ratones transgénicos los
cuales contenían mini genes de utrofina en su
línea germinales, introducidos por una técnica
que no puede ser usada en humanos. Otros ratones transgénicos fueron inducidos a producir
18
nica en los músculos de ratones-mdx conduce a
una marcada activación de la utrofina en la
membrana exterior que contacta con los nervios
motores. --- El aminoácido L-arginina puede
incrementar las cantidades de utrofina en
ratones-mdx y aliviar significativamente los
síntomas distróficos. La enzima oxido nítrico
sintetasa usa arginina para la producción del
biológicamente activo oxido nítrico gaseoso.
Pero el oxido nítrico es también activo en otros
procesos biológicos. La arginina, no obstante, no
puede ser usada como un tratamiento para la
distrofía muscular Duchenne sin posteriores
investigaciones. --- La pequeña proteína llamada
heregulina con la cual los nervios motores estimulan al músculo a desarrollarse, puede también
aliviar significativamente los síntomas de ratones-mdx. --- Un extremo del ARNm de la utrofina no es trasladado en proteína, pero se une a
estructuras en las regiones de contacto con los
músculos de los nervios, interfiriendo de esta
forma a la utrofina en esos sitios. Si esta interferencia pudiera ser prevenida por medio de un
fármaco, esto podría hacer posible que la utrofina se distribuya mucho mas sobre la membrana
muscular entera, pudiendo así reemplazar mejor
a la distrofina. --- Otra forma de utrofina, la muy
similar utrofina-B fue recientemente identificada
en vasos sanguíneos. Pero solo la “normal” utrofina-A esta presente en los músculos y puede
parcialmente compensar a la distrofina después
de la activación de su gen.
activar el gen de la distrofina. Solo después que
una o varias sustancias activas convincentes son
encontradas, serian entonces posible iniciar estudios clínicos con pacientes con distrofía muscular Duchenne en unos pocos años (Davies,
Oxford).
Tal activador del gen de la utrofina podría, si
fuera una molécula pequeña, ser aplicado vía el
flujo sanguíneo desde donde pudiera alcanzar
todos los músculos. El sistema inmune reconocería las cantidades adicionales de utrofina como
una sustancia propia del cuerpo debido a que
esta ya presente en pequeñas cantidades en los
chicos con distrolfía Duchenne. Por lo que, ninguna reacción inmune deberá desarrollarse.
Sin embargo, algo que puede activar el gen de
la utrofina, podría también hacer lo mismo con
otros genes. Por lo tanto, antes de que tal activador sea probado en niños, debe tenerse la certeza
que este no producirá efectos secundarios adversos.
Otros experimentos para incrementar la
utrofina: La transferencia de un gen acortado de
la utrofina en perros distróficos condujo a la
producción de utrofina, la cual pudo tomar las
funciones de la distrofina faltante. --- Glucocorticoides, entre ellos la prednisona, pueden aumentar la expresion del gen de la utrofina en
algun grado. --- Tales corticoesteroides han sido
aislados de medicinas chinas de plantas que
tradicionalmente son usadas contra la distrofia
muscular. --- Un leve grado de inflamación cró-
Otras proteínas
Las mutaciones del gen de la distrofina y la ausencia de distrofina
influencian la actividad de varios otros genes.
donde hay secuencias complementarias de ADN
de esos genes activos. La intensidad de la luminosidad de esos puntos es automáticamente
medida, lo cual hace posible determinar cuales
genes están activos, en que proporción y cuales
no están activos.
Con este perfilamiento de expresión génica,
varios miles de genes de muestras musculares
fueron examinadas provenientes de ratones
normales y mdx, chicos sanos y con distrofía
muscular Duchenne, de ratones transgénicos sin
distrofina ni utrofina propia, y también de ratones que en vez de la propia tienen distrofina
humana en sus músculos.
Estos resultados mostraron que la ausencia de
Actividad de miles de genes musculares: Con
el objetivo de medir simultáneamente la actividad de infinidad de varios genes en una muestra
de tejido muscular en un único experimento, se
usa un método de clasificación con chips génicos
(gene arrays). Ya que las secuencias de prácticamente todos los genes humanos son conocidas,
pequeños segmentos de miles de genes pueden
ser producidos automáticamente y aplicados por
un robot en ciertos patrones a un chip de cuarzo
de pocos centímetros cuadrados de extensión. Si
se producen bioquímicamente copias de ADN de
ARNm’s de todos los genes activos, se aplican
como muestra de análisis al chip, apareciendo
puntos luminosos en aquellos lugares del chip
19
elegans es un gusano transparente de 0,9 milímetros de largo que es usado extensivamente por
investigadores génicos debido a que todos sus
19.733 genes son ya conocidos, así como sus
959 células de su cuerpo, 95 de las cuales son
células musculares. Sus músculos tienen una distrofina similar a la de los humanos, la cual también puede tener mutaciones causando síntomas
distróficos.
Genes individuales les fueron inactivados y
también activados, permitiendo que los síntomas
distróficos puedan ser estudiados y ver donde
son causados por la falta o incremento de la
actividad génica. Por ejemplo, esto podría mostrar que la activación de la distrobrevina, una
muy corta forma de distrofina, puede aminorar
significativamente la degeneración muscular.
Posteriores investigaciones contribuirán a aclarar
todavía desconocidas relaciones moleculares
durante el desarrollo de la distrofia muscular
(Ségalat, Lyón).
Integrinas y sintrofinas: Las integrinas son
una familia de proteínas las cuales se localizan
en la membrana de las células musculares. Estas
son necesarias para la fusión de los mioblastos a
los miotubos y el desarrollo de miotubos a células musculares maduras. También estas participan en la propagación de señales de célula a
célula.
En ratones sin distrofina y utrofina, la cantidad de una de esas integrinas fue aumentada cerca de dos veces por vía de terapia génica. La extensión de la expectativa de vida de los ratones
fue tres veces mayor, y sus síntomas distróficos
aminoraron significativamente (Kaufman,
Urbana).
Las cinco sintrofinas conocidas son proteínas
que median la interacción de las proteínas señalizadoras entre los complejos distrófino y utrofino en la membrana de la célula muscular. El
entendimiento más detallado de este proceso
puede tener consecuencias para una terapia con
utrofina (Froehner, Seattle).
distrofina causa el incremento y la disminución
de la actividad de varios genes musculares. Toda
una serie de genes que son responsables de la
producción de energía en las células musculares
son menos efectivos en ratones sin distrofina y
utropina, por ejemplo, sus músculos sufren una
crisis de energía la cual contribuye a la degeneración de sus músculos distróficos. Por otro lado,
varios genes necesarios para el desarrollo y reparación de los músculos ven aumentada su actividad, en algunos casos cien veces, por ejemplo, se
ven activados por el proceso de la enfermedad.
Similares resultados fueron obtenidos con muestras musculares humanas.
Experimentos posteriores mostraron que en
ratones varios otros genes se encontraban sobre
activados, genes los cuales están implicados en
el desarrollo de estructuras de la superficie celular, en la producción de factores señalizadores
para la síntesis de proteínas, en la intensificación
de reacciones inmunes, y en otros procesos responsables de los síntomas de los músculos distróficos de ratones-mdx. En los pacientes con
distrofía Duchenne, estos cambios fueron menos
pronunciados, y en los ratones transgénico con
distrofina humana, esta actividad de lo genes fue
normal, debido a que ellos no tenia distrofia
muscular.
Después de estos primeros resultados que
fueron obtenidos hace pocos años, varios mas
experimentos con esta nueva técnica han sido
realizados para responder otras preguntas de la
investigación en DM Duchenne. Los resultados
actuales y futuros ayudaran a entender la compleja relación entre las varias partes de la arquitectura muscular y los cambios que ocurren si
uno de sus más importantes componentes, la
distrofina, esta ausente. Abriendo esto nuevas
vías para el desarrollo de una terapia para la
distrofía muscular Duchenne (van Ommen,
Leiden; Kunkel, Boston; Hoffman, Washington,
y otros).
Un gusano distrófico: El Caenorhabditis
Estrategías Farmacológicas
Los corticoesteroides y otras drogas pueden aminorar los síntomas
de la distrofia muscular Duchenne sin curar la enfermedad misma.
menos aliviar los síntomas de la distrofia Duchenne por medio de un tratamiento farmacológico. Recientemente ha habido algunos éxitos en
esta área.
Debido a que los grandes esfuerzos para transferir un gen funcional de la distrofina o reparar el
gen dañado por el momento no han conducido a
una cura, se han venido haciendo intentos por al
20
cura para la distrofia muscular Duchenne debido
a que la causa genética de la enfermedad no será
eliminada. Pero, comparado con otros métodos,
este podrá tener ventajas: no provoca problemas
inmunes o de toxicidad, no hay riesgo genético
de virus, y seria un fármaco de fácil manufactura. Compañías farmacéuticas están actualmente
interesadas en esta técnica debido a que el incremento de masa muscular podrá ser importante
para personas ancianas y personas con otras enfermedades musculares degenerativas (Khurana,
Filadelfia).
Glucocorticoides (corticoesteroides): Los
corticoides relacionados prednisona, prednisolona, y deflazacort retrasan la degeneración muscular, pero la causa de este efecto no es todavía
comprendida. Mientras parte de su acción implica propiedades anti-inflamatorias, podrían también tener otros mecanismos de acción posibles.
Por el análisis por medio de micro clasificación
de la actividad de mas de un millar de genes de
ratones-mdx tratados con prednisona, se encontró que cerca del 5 % de los genes mostró una
reducción o aumento de su actividad. Análisis
posteriores del patrón de expresión génica inducida por glucocorticoides podría ayudar a entender el mecanismo molecular de la acción de los
glucocorticoides en músculos esqueléticos. Esto
podrá ayudar a desarrollar un más específico
pero menos toxico tratamiento con estos fármacos (Muntoni, Londres).
Creatina: Este compuesto puede posiblemente también aminorar la degeneración muscular. Este es un compuesto natural el cual es
usado en grandes cantidades por los atletas para
aumentar su rendimiento. La creatina, la forma
fosforilatada de la fosfocreatina, provee energía
no solo para la contracción muscular si no también para la remoción del calcio superfluo, una
de las causas de la destrucción de las células
musculares. Experimentos con ratones mdx han
mostrado que suplementación con creatina mejora la salud muscular, y pudiera proveer las bases
científicas para su uso como terapia coadyuvante
en la distrofia Duchenne (Wallimann, Zürich;
Rüegg, Lausanne).
Otros experimentos farmacológicos: Extractos de te verde en el alimento de ratones-mdx
aminoro la degeneración de algunos de sus
músculos, posiblemente debido a que el te verde
contiene sustancias antioxidantes. --- Ratones
transgénicos fueron creados para que produzcan
Miostatina: El ganado bovino belga “azulblanco” ha existido por cerca de 200 años, el
cual tiene más de 20 % más carne que el ganado
normal. Hace seis años, se encontró que tales
reses tenían una deleción de 11 pares de bases en
el gen de la proteína miostatina. Los ratones
transgénicos sin el gen de la miostatina tenían de
dos a tres veces mas peso que los ratones normales, no a causa de tener mas células musculares,
si no debido a que sus células musculares eran
mucho mas grandes. La miostatina es una proteína señalizadora, un tipo de hormona, que
consiste de 375 aminoácidos y es necesaria para
limitar la masa muscular.
Esta proteína es producida en las células
musculares y sus células precursoras, después de
lo cual es modificada: dos tercios de la cadena de
aminoácidos son removidos, y dos de las cadenas remanentes de 109 aminoácidos cada una
forman un doble anillo. Esta miostatina activa
inhibe el crecimiento de los músculos al influenciar la regulación genética de las células precursoras miogénicas. Otros factores están también implicados en la optimización de la masa
muscular.
Estos hechos conducen suposición de que si
se bloquea la actividad de la miostatina, los músculos de los chicos con distrofía muscular Duchenne podrían hacerse más grandes o al menos
reducir su destrucción. Por lo que, fueron creados anticuerpos monoclonales, por ejemplo,
proteínas inmunes que se unen muy específicamente solo a la miostatina y de esta forma
inactivarla. Estos anticuerpos fueron inyectados
una vez por semana debajo del diafragma de
ratones-mdx. Después de tres meses, los animales tratados eran 12 % mas pesados que los animales de control sin tratamiento debido a que en
estos su masa muscular había disminuido. Adicionalmente, tenían mejor función muscular,
ellos podían trepar mejor la rueda de ejercicios,
su degeneración muscular disminuyo y los niveles de CK estuvieron prácticamente normales.
Posteriores experimentos están ahora siendo
realizados con ratones. Estos tendrán que ser
repetidos con perros distróficos los cuales tienen
una distrofia mas parecida a la enfermedad humana que la distrofia de los ratones. Solo cuando
los resultados sean positivos podrán ser hechas
pruebas clínicas con pacientes con distrofía muscular Duchenne.
Este método de tratamiento no podrá ser una
21
neran cantidades normales de oxido nítrico sintetasa mostraron una reducción de los síntomas
distróficos. --- En ratones-mdx, la proteína señalizadora JNK1 es activada y esta contribuye a la
degeneración de las células musculares. La inyección de adenovirus que portaban el gen de la
proteína natural JIP1, inhibidora de la actividad
de la JNK1, redujo la degeneración muscular.--La proteína galectina-1 participa en el proceso
que conduce a nuevo o regenerado tejido muscular. Los fibroblastos obtenidos de piel de ratones
recién nacidos se desarrollaron en células musculares con distrofina, si crecían en cultivos celulares que contenían galectina-1. Tales fibroblastos podrían ser fácilmente colectados de pacientes con distrofía muscular Duchenne, transformados en células musculares con galectina-1,
siendo entonces modificadas genéticamente para
sintetizar distrofina normal, y finalmente transplantadas de nuevo al paciente.
en sus músculos, en relativamente grandes cantidades, el factor de crecimiento muscular similar
a la insulina-1 (mIGF1). Este aumento su masa
muscular en más de 40 %, y la fibrosis, como la
degeneración muscular fue disminuida, y la
regeneración mejoro significativamente. --- La
leupeptina es un péptido que consta de tres aminoácidos parcialmente modificados. Combinada
con la carnitina, esta inhibe la enzima calpaina
que destruye proteínas en las células musculares
cuando el calcio entra de forma descontrolada,
como en la distrofia Duchenne. En experimentos
con monos y ratones, la degeneración muscular
fue significativamente aminorada con el uso de
leupeptina. --- La concentración de la enzima
oxido nítrico sintetasa en el complejo distrófino
de ratones-mdx esta significativamente reducida.
Por lo que, su producto, el biológicamente activo
oxido nítrico gaseoso, no puede mas completar
su función. Esto contribuye a la degeneración
muscular. Los ratones-mdx transgénicos que ge-
Estudios clínicos en pacientes con Duchenne
La primera prueba de transferencia génica y una nueva prueba con mioblastos han iniciado.
Corticoesteroides, creatina, y otras sustancias químicas son estudiadas.
Un largo estudio con prednisona junto a ciclosporina empezó a prepararse.
den tomar varios años, y son costosos de realizar.
Transferencia del gen de la distrofina por
medio de plásmidos: La primera fase de este
primer experimento de transferencia génica con
pacientes con distrofíoa Duchenne fue completada a principios del 2003 y los resultados se reportaron en Junio del 2003. La compañía biotecnológica Transgène en Estrasburgo junto con la
asociación francesa de distrofia muscular (AFM)
comenzaron a preparar este acercamiento de
terapia génica en 1995. La autorización para esta
primera prueba en humanos fue dada por las
autoridades francesas en Noviembre 1999, y las
primeras inyecciones de los vectores fueron aplicadas en Septiembre del 2000 en el Hôpital de la
Pitié Salpêtière en Paris.
Los 9 chicos participantes eran todos mayores
de 15 años, por lo que ellos pudieron dar su consentimiento de manera informada. Ellos estaban
conscientes que no habría ningún beneficio clínico de este tratamiento, este todavía no es una
terapia.
Después de que varios métodos de transferencia génica fueran probados en ratones y perros
Estudios clínicos con chicos con Duchenne serán
más y más necesarios en vista del aumento de resultados positivos en experimentos con animales.Estos estudios con humanos tendrían que ser
realizados en varios pasos, el primero de los cuales, la fase I, actualmente llevaría varios años
para probar que el nuevo tratamiento no vendrá
acompañado de inaceptables efectos secundarios.
Solo después de esto pueden ser iniciados estudios posteriores con afectados, lo que seria la
fase II, para determinar que tanto el tratamiento
realmente puede mejorar o mantener la fuerza
muscular, seguido a esto, en la fase III, se determina cual podría ser la dosis optima.
Todos estos estudios tienen que ser realizados
con el método denominado doble-ciego, por
ejemplo, solo cerca de la mitad de los pacientes
recibe la sustancia que se probaba, mientras la
otra mitad recibe un compuesto inactivo, llamado placebo. Ni a los pacientes, ni a los investigadores se les permite saber cual paciente forma
parte de cual grupo antes de que termine la prueba, que es cuando el código es roto y los resultados son analizados. Estos estudios y los procedimientos de aprobación consumen tiempo, pue22
distróficos, se decidió usar el ADNc entero del
gen de distrofina de extensión completa, el cual
se coloco en un plasmido que haria de vector,
junto a un fuerte promotor proveniente de un
virus. Los plásmidos tienen la ventaja de no contener ninguna proteína y por lo cual no deben
causar una reacción inmune. El gen terapéutico a
ser transportado no tenia ninguna proteína, era
ADN puro o desnudo.
En experimentos preeliminares ulteriores con
cultivos de células musculares y ratones, se mostró que este vector construido conducía a la aparición de nueva distrofina en el lugar correcto
bajo la membrana de las células musculares de
los animales, restaurando el complejo distrófinoglicoproteico, y prolongando la vida de las
células.
El objetivo de este estudio clínico con pacientes con distrofía muscular Duchenne fue demostrar que el procedimiento es seguro, por ejemplo,
que este no conduce a una reacción inmune o inflamación, y que la nueva y normal distrofina
aparecía en los lugares correctos en aquellas fibras musculares que habían recibido el plásmido
vector.
La solución (liquida) a inyectar contenía 0,2
mg de plásmidos con 10 billiones (1 seguido de
13 ceros) de copias del gen de la distrofina y fue
inyectada en un músculo del antebrazo de los
primeros tres pacientes. Esta es una muy pequeña cantidad de material génico comparado a
experimentos similares en animales. Los siguientes tres pacientes recibieron una dosis de 0,6 mg
y los últimos tres pacientes dos dosis de 0,6 mg
con dos semanas de separación. La seguridad de
los pacientes fue la principal preocupación, por
consiguiente, ningún otro paciente fue tratado
antes de tener la certeza que el primer paciente
tratado no mostraba ninguna señal de intolerancia inmune.
Tres semanas después de las inyecciones, el
área tratada de músculo de cerca de 0,5 centímetros cúbicos fue extraída por medio de biopsia
y checada en busca de presencia de distrofina.
En tres de los seis chicos de los dos primeros
grupos y en todos los tres chicos del tercer grupo, nueva distrofina apareció entre menos de 1 %
a más de 25 % de las fibras musculares alrededor
de los sitios de la inyección. No hubo señales de
una respuesta inmune, ni a los plásmidos ni a la
nueva distrofina producida. Esto respondió las
preguntas de la fase-I de un estudio: La trans-
ferencia génica con ADN desnudo es un procedimiento seguro. Esto podría, después de una
ampliación, volverse un método terapéutico
debido a que se sabe que en experimentos animales una producción de distrofina en cerca del
20 % de las fibras musculares puede mejorar la
función muscular significativamente.
Los científicos franceses ahora trabajan con el
equipo de Jon Wolff en Madison en los Estados
Unidos, el cual inyecto construcciones de plásmidos similares con genes de una proteína marcadora en el flujo sanguíneo de patas de ratones,
perros, y monos a presión. Posterior a esto, más
del 40 % de las fibras musculares contenían la
proteína marcadora transferida.
El siguiente paso seria aplicar este procedimiento de entrega arterial en chicos con distrofía
Duchenne, probablemente en una prueba clínica
iniciada en el 2004. En esta etapa de la prueba,
se planea tratar, de nuevo por razones de seguridad, solo un pequeño músculo del pie. Si el
resultado es positivo, este método seria aplicado
en un los músculos de una pierna o brazo entero.
Esto podría ser planeado para el 2006.
Mas adelante, los músculos respiratorios y
cardiaco podrían ser el objetivo. Por razones de
seguridad, es imposible proceder rápido, debido
a que podría ser una catástrofe si efectos secundarios adversos severos o algún otro evento indeseables ocurrieran, lo cual conduciría a la interrupción de este y otros experimentos de terapia
génica (Braun, Estrasburgo).
Estudios clínicos con mioblastos (transferencia de mioblastos): A principios del 2003,
inicio en Québec en Canadá la fase-1 de una
prueba clínica con chicos de 5 a 15 años de edad
con distrofía muscular Duchenne por deleción.
Esta deberá responder la pregunta de que tanto la
transferencia de mioblastos bajo modificaciones
es segura, por ejemplo, que no provocara rechazo inmune o inflamación, y que tanta nueva distrofina aparece después del tratamiento.
La diferencia con los experimentos fallidos
realizados en 1990, es que ahora es usado el
mucho mas efectivo inhibidor inmune FK506
(Tacrolimus) A en vez de ciclosporina, y que a
diferencia de antes, donde se inyectaron 60 a 90
millón de células en el músculo bíceps entero,
ahora se inyectaran 30 millones de células en el
músculo tibial interior del pie por múltiple aplicaciones, a una distancia de un milímetro entre
ellas en un volumen de músculo de solo un cen23
an comenzar este tratamiento deben hacerlo en
acorde con un estudio bien documentado para
obtener más información y garantizar los extensos controles necesarios debido a los efectos
secundarios. El estudio en Alemania es continuado con documentación a largo plazo que incluye los datos de algunos pacientes quienes fueron tratados durante más de siete años (Reitter,
Mainz).
Prednisolona: En el Reino Unido una prueba
de largo termino ha sido preparada, en la cual
será probado que tanto la prednisolona es capaz
de prolongar la habilidad para caminar y mejorar
la calidad de vida. Un tratamiento intermitente,
10 días con y 10 días sin medicación ha sido planeado. Debido a que el financiamiento no pudo
ser obtenido, solo será posible llevar a cabo un
estudio abierto, sin método doble-ciego, con el
objetivo de documentar la eficacia y los efectos
secundarios (Muntoni, Londres).
Prednisona combinada con ciclosporina A:
En Alemania un estudio clínico empezó a ser
preparado para iniciar a fines del 2003, el cual
deberá responder dos preguntas: ¿Puede la ciclosporina A por si sola aumentar la fuerza muscular a corto plazo? ¿Puede la combinación de
ciclosporina A y prednisona reducir mejor la
perdida de fuerza a largo plazo que la prednisona
sola? ¿Cuando dar prednisona de forma intermitente, por ejemplo, en un ciclo de 10 días con
y 10 días sin tratamiento? Ya que los procesos
inmunes juegan un papel en la distrofia muscular
Duchenne, experimentos tempranos han mostrado que los fármacos inmuno supresores tales
como la ciclosporina A pudieran retrasar la degeneración muscular.
Con el objetivo de obtener resultados confiables, al menos 150 pacientes con distrofía muscular Duchenne deberán participar, lo cuales
estarán inequivocadamente diagnosticados, serán
mayores de seis años, y que todavía pueden caminar 50 metros. Durante la primera fase de al
menos tres meses, todos los niños recibirán, en
procedimiento doble-ciego de 3, 5 a 4 mg/Kg/día
de ciclosporina A sola o galactosa, azúcar de
leche, como placebo. Durante la segunda fase de
al menos 12 meses, todos los niños recibirán
adicionalmente 0, 75 mg/Kg./día de prednisona
por 10 días, seguidos por 10 días sin prednisona.
Ocho centros alemanes musculares realizaran
esta prueba (Korinthenberg, Friburgo).
Creatina: En un estudio clínico controlado,
tímetro cúbico. No se espera un mejoramiento de
la función muscular. Como en la prueba francesa, los participantes no tendrán un beneficio
terapéutico de estas inyecciones.
Un mes después del tratamiento y después de
una biopsia será determinado que tanto ADN y
ARNm de distrofina, así como la proteína misma, ha aparecido y que tanto se genera alguna
reacción inmune. Tres pacientes han sido tratados hasta Julio del 2003, la prueba completa
deberá ser terminada antes del fin del 2003.
Si los resultados son positivos, la prueba continuaría con la fase-II de estudio, durante la cual
serán transferidos mioblastos a todo el músculo
bíceps entero. Después de lo cual, durante dos
años, la fuerza muscular será medida, esperándose pueda posiblemente incrementar o al menos
mantenerse sin cambios (Trembley, Québec).
Prednisona y deflazacort: Dieciséis estudios
clínicos en todo el mundo han probado la
eficacia de fármacos derivados de la cortisona,
sobre todo la prednisona, para reducir la pérdida
de la fuerza muscular de chicos con Duchenne.
Entonces, hubo indicaciones de que un nuevo
corticoide, el deflazacort, podría actuar de modo
similar, pero con menos efectos secundarios.
Desde 1992 hasta 1997, fue realizado con la
participación de 14 centros musculares alemanes
un estudio en el cual el efecto de mantenimiento
muscular de los dos fármacos similares fue comparado con la historia natural bien documentada
de la enfermedad. Las dosis empleadas eran de
0,75 mg por kilogramo de peso corporal por día
para la prednisona y 0,9 mg por kilogramo por
día para el deflazacort. Ambos fármacos pueden
mantener la fuerza muscular durante al menos
dos o tres años y, en casos aislados, pueden prolongar la capacidad de andar hasta los 14 años de
edad. El efecto secundario más importante de la
prednisona es el aumento de peso en aproximadamente el 20 % de los pacientes. Con el deflazacort, las cataratas leves, opacamiento de la
lente del ojo, eran más frecuentes que con la
prednisona. Ambos fármacos tenían un efecto de
retardación del crecimiento, otros efectos secundarios fueron insignificantes. Después de detenerse la medicación, la degeneración del músculo y crecimiento normal inicio de nuevo.
Los resultados del estudio aún no permitieron
decidir todavía cual es el mejor momento para
empezar el tratamiento, por ejemplo antes de los
cinco años de edad. Los pacientes quienes dese24
trado un significativo aumento de la fuerza muscular (de cerca de 8 %) y muy pocos efectos secundarios en una prueba preeliminar con 10 chicos con DM Duchenne. En Agosto del 2002, un
estudio doble-ciego fue iniciado con entre 25 y
30 chicos por al menos 9 meses.
Una prueba con coenzima Q10 inicio en Septiembre del 2001 con 15 chicos, los cuales también recibían regularmente deflazacort o prednisona. Otra prueba es planeada con pacientes en
silla de ruedas.
Oxatomida, un antihistamínico, empezó a ser
probado en una prueba de 9 meses con 15 chicos
con distrofía muscular Duchenne.
Pentoxifilina interfiere con el sistema inmune, por lo que reduce la inflamación y la fibrosis.
Una prueba inicio en Febrero del 2003 y durara
al menos 15 meses.
Una prueba clínica de al menos 15 meses ha
iniciado en Enero del 2003 para comparar los
efectos positivos y negativos de la prednisona
cuando es dada cada dia o solamente uno o dos
días cada semana en una dosis alta.
Una prueba con 54 chicos con distrofía muscular Duchenne fue realizada durante 6 meses
terminando en Marzo del 2003, en la cual tanto
creatina y glutamina fueron probadas en un
estudio doble-ciego. Los resultados están siendo
evaluados.
Pruebas con otras tres sustancias: taurina,
carnitina, y ácido nicotinico, son planeadas.
Para la documentación y supervisión de estos
estudios, se han desarrollado métodos de control
estandarizados para medir no solo las funciones
musculares, si no también otros parámetros tales
como la calidad de vida. Algunos de esos métodos están siendo modificados para que puedan
también ser usados para pacientes muy jóvenes o
mayores (Escolar, Washington).
también llamado doble ciego, con 8 pacientes
con Duchenne, 10 con Becker, y 18 con otras
enfermedades musculares, mostró después de 8
semanas con dosis de creatina monohidrata de 5
gramos para niños y 10 gramos para adultos, un
ligero pero significante efecto benéfico a corto
plazo en la fuerza y rendimiento muscular sin
efectos adversos. Mas estudios clínicos deberán
ser hechos antes de que pueda ser recomendado
como medicación a largo termino para preservar
el músculo en chicos con Duchenne (Walter,
Munich).
En Canadá, una prueba clínica para determinar el efecto de la creatina ha iniciado con 40
chicos con distrofía distrofía muscular Duchenne. --- En Bélgica, la creatina fue probada
tres meses en 12 pacientes con distrofía muscular
Duchenne y 3 con distrofía muscular Becker con
el resultado de un leve aumento de la fuerza
muscular.
Oxandrolona: Un esteroide anabólico (diferente de los corticoesteroides, que son esteroides
catabólicos) a veces usado por atletas, fue probado en un estudio con 51 chicos con Duchenne.
Sin embargo, la pequeña mejora en la fuerza del
músculo encontrada, no justifica su empleo como fármaco en vez de la prednisona o el deflazacort (Fenichel, Nashville).
Pruebas clínicas internacionales: El Grupo
Cooperativo Internacional de Investigación Neuromuscular (CINRG en sus siglas en ingles) en
Washington, una cooperación de laboratorios en
EUA, Canadá, Bélgica, Argentina, Australia, y
India realizan estudios clínicos en chicos con
Duchenne con sustancias, algunas de las cuales
han sido seleccionadas de entre 45 sustancias
que han mostrado resultados positivos cuando
fueron probados varios compuestos en largos
experimentos de observación con ratones.
Albuterol, un fármaco para el asma, ha mos-
¿Cuándo se tendrá una terapia?
pio del siglo 20 que un defecto en el cromosoma
-X es responsable de la enfermedad. Pero sólo
hasta 1986 era identificado el gen mismo, el gen
de la distrofina, (Kunkel, Boston) y poco tiempo
después la proteína distrofina fue caracterizada
(Hoffman, Washington), la que esta ausente en
los chicos con Duchenne. El rápido paso de la
investigación genética dio lugar a la esperanza
de que pronto sería posible sustituir o reparar el
La distrofia muscular Duchenne siempre ha
acompañado al hombre y también a los animales
que tienen músculos esqueléticos. Esta fue descrita correctamente por primera vez en 1851 por
el doctor inglés Edward Meryon. Sin embargo,
obtuvo después su nombre del médico francés
Duchenne de Bologne, quien describió en 1861
no sólo sus síntomas, sino también su histología.
De su modo de herencia, se conoció a princi25
podía curar a cerca del 90 % de los pacientes con
leucemia mieloide crónica, un cáncer sanguíneo.
Todos estos resultados de investigación deben
ser considerados y muchos datos adicionales
colectados, antes de que sea posible hacer cualquier predicción sobre cuanto tiempo mas tomará que se tenga listo un tratamiento seguro y
eficaz para niños con distrofia muscular Duchenne en todas partes del mundo. La respuesta a
esta pregunta es la más importante para los padres y sus hijos enfermos. Esto probablemente
todavía tomará muchos años hasta que la distrofia muscular Duchenne sea derrotada. Esto es
menos de que lo que había sido esperado, lo que
es el lado negativo de este difícil problema, lo
positivo es que cientos de investigadores capaces
y dedicados en varios laboratorios alrededor del
mundo entero trabajan para encontrar una cura:
por lo tanto, es seguro que un tratamiento eficaz
estará ahí, tarde o temprano.
gen y así curar la enfermedad.
Este optimismo fue prematuro. Los primeros
estudios en 1991 con la transferencia de mioblastos mostraron que esta técnica, que se veía
promisoria en ratones, era ineficaz en los chicos
con Duchenne. Ahora, más de 17 años después
de la detección del gen, no hay en ninguna parte
ninguna terapia para la distrofia Duchenne. Como este informe muestra, el trabajo de investigación se realiza basándose en más de 30 métodos
diferentes que son aplicados en ratones y perros
distróficos, y algunos ya en chicos con Duchenne. Sin embargo, estos estudios consumen
tiempo, y la aprobación de un tratamiento tomará
años adicionales.
No obstante, hay ejemplos de tratamientos
que alcanzan a los pacientes muy rápido, tales
como el Gleevec, un fármaco que fue aprobado
en el 2001 en pocos meses sin examinarse todos
los efectos secundarios después que se mostró
Los científicos mencionados en el informe
Únicamente los científicos mencionados en este reporte son enlistados con sus direcciones abreviadas y
sin ninguno de sus títulos. La mayor parte de ellos son profesores y todos tienen una especialidad médica
o postgrado (MD o PhD). Muchas publicaciones originales, que contienen los nombres de todos los
miembros de un equipo de investigación, pueden ser obtenidas del autor de este informe.
Richard J. Bartlett, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA
Laurent Bernheim, Hôpital Cantonal Universitaire, Ginebra, Suiza
Serge Braun, Synthetic Vector Products, Transgène S.A., Estrasburgo, Francia
Kevin P. Campbell, University of Iowa College of Medicine, Iowa City, IA, EUA
Jeffrey Chamberlain, Dept. of Neurology, University of Washington, Seattle, WA, EUA
Paula Clemens, Dept. of Neurology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EUA
Judith C. T. van Deutekom, Dept. of Human Genetics, Leiden University Med. Center, Leiden, Holanda
Kay Davies, Dept. of Genetics, University of Oxford, Oxford, Inglaterra
Diana Escolar, Children's National Medical Center, Washington, DC, EUA
Gerald M. Fenichel, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, EUA
Kevin M. Flanigan, Dept. of Neurology and Pathology, University of Utah, Salt Lake City, UT, EUA
Stanley Froehner, Dept. of Physiology and Biophysics, University of Washington, Seattle WA, EUA
Stuart Hodgetts, University of Western Australia, Crawley, Australia
Eric Hoffman, Children's National Medical Center, Washington, DC, EUA
Paul C. Holland, Montreal Neurological Institute, McGill University, Montreal, Canadá
Johnny Huard, Children's Hospital, University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA, EUA
Robert Kapsa, Melbourne Neuromuscular Research Institute, Melbourne, Australia
George Karpati, Montreal Neurological Institute, McGill University, Montreal, Canadá
Stephen Kaufman, Dept. of Cell and Structural Biology, University of Illinois, Urbana, IL, EUA
Tejvir S. Khurana, Pennsylvania Muscle Institute, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, EUA
Stefan Kochanek, Zentrum für Molekularmedizin, University of Colonia, Alemania
Louis Kunkel, Harvard University, Children's Hospital, Boston, MA, EUA
Hanns Lochmüller, Genzentrum der Universität, Munich, Alemania
Jerry Mendell, Dept. of Neurology, Ohio State University, Columbus, OH, EUA
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Clemens Müller-Reible, Humangenetisches Institut, Biozentrum der Universität, Würzburg, Alemania
Francesco Muntoni, Dept. of Paediatrics, Imperial College School of Medicine, Londres, Inglaterra
Roel Nusse, Dept. of Developmental Biology, Stanford University, Stanford, EUA
Gertjan B. van Ommen, Dept. of Human Genetics, Leiden University Medical Center, Leiden, Holanda
Terrence Partridge, Muscle Cell Biology Group, Hammersmith Hospital, Londres, Inglaterra
Thomas Rando, Dept. of Neurology, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, EUA
Bernd Reitter, Kinderklinik der Universität, Mainz, Alemania
Michael Rudnicki, Ottawa Health Research Institute, Ottawa, Canadá
Urs T. Rüegg, Ecole de Pharmacie de l'Université, Lausanne, Suiza
Günter Scheuerbrandt, Testlaboratorium Breitnau, Breitnau near Freiburgo, Alemania
H. Lee Sweeney, Dept. of Physiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, EUA
James G. Tidball, Dept. of Physiological Sciences, University of California, Los Angeles, EUA
Jacques Tremblay, Unité de Génétique Humaine, Université Laval, Québec, Canadá
Theo Wallimann, Institut für Zellbiologie, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich, Suiza
Maggie C. Walter, Friedrich-Baur-Institut, Medizinische Klinik der Universität, Munich, Alemania
Dominic Wells, Dept. of Neuromuscular Diseases, Imperial College of Medicine, Londres, Inglaterra
Steve Wilton, Australian Neuromuscular Research Institute, Univ. of Western Australia, Perth, Australia
Jon Wolff, Dept. of Pediatrics, University of Wisconsin Medical School, Madison, WI, EUA
Dr. Günter Scheuerbrandt
Im Talgrund 2
D-79874 Breitnau
Alemania
Tel.: +49-7652-1777, Fax: +49-7652-91813-13
e-Mail: [email protected]
Este informe será actualizado cada tanto tiempo con los nuevos resultados de investigación.
Aquellos que deseen recibir estas actualizaciones y la versión del 2004 de este informa deben enviar
su dirección de correo electrónico al Dr. Scheuerbrandt.
El informe puede ser visto en Internet en http://www.duchenne-investigacion.com, también en
alemán, francés, ingles e italiano.
Traducción al español: Ricardo Rojas Caballero
E-mail: [email protected]
Internet: http://www.distrofia-mexico.org
Playa Rosarito 319
Fracc. Playa Sur
CP 82040
Mazatlan, Sinaloa, Mexico
27
Omisión de Exon, un Ejemplo
Aquí los detalles moleculares de la omisión del exón 46 son explicados cambiando una distrofia muscular Duchenne causada por la deleción del exón 45 en una distrofia muscular Becker.
Parte de la secuencia de bases del exón 45 y 46 del ARNm del gen de la distrofina es mostrado sin defectos al
final del exón 44 y del inicio del exón 47. En el exón 45, 50 tripletas de bases no son mostradas y 30 en el exón 46.
Debajo de cada tripleta, se muestra el nombre abreviado del aminoácido que concuerda con el código genético. Las
tripletas están seguidas cada una de otra sin espacios entre ellas, pero aquí se usan guiones indicando la separación
entre tripletas del marco de lectura y líneas verticales para indicar los bordes de los exones. En la omisión de exón
“terapéutica”, un oligoribonucleótido se une por si mismo a las 19 bases subrayadas en el exón 46 del ARNpre-m.
Las tres bases que señalizan un codón de parada oculto en el código (por lo que no es leído como tal) se encuentra
subrayado en azul. El exón 45 finaliza después de la segunda base de su ultima tripleta, la cual es entonces completada como AGG con la primera base del exón 46 (-AGG-AG | G-CUA-).
final exon 44 | inicia exon 45
final exon 45 | inicia exon 46
-UGG-UAU-CUU-AAG | GAA-CUC-CAG-GAU---AGA-AAA-AAG-AG | G-CUA-GAA-GAAtrp tyr leu lys | glu leu gln asp
arg lys lys arg|
leu glu glu
codón de parada oculto
oligoribonucleótido en antisentido
GUC-GUU-GAU-UUU-UUU-UUC-G
final exon 46 |
--AAU-GAA-UUU---AAA-GAG-CAG-CAA-CUA-AAA-GAA-AAG-CUU-GAG-CAA-GUC-AAG |
asn glu phe
lys glu gln gln leu lys glu lys leu glu gln val lys |
| inicia exon 47
| UUA-CUG-GUG-GAA-GAG-UUG--| leu leu val glu glu leu
Si el exón 45 estuviera faltante en el ARNm, el marco de lectura en el exón 46 es alterado, al quedar incompleta la
tripleta (AGG), iniciando con solo un nucleótido el exón 46.
Cambiando la lectura de | G-CUA-GAA-GAA-C
|
leu glu glu
por
| GCU-AGA-AGA-ACA
| ala arg arg thr
con la consecuencia de que 16 aminoácidos incorrectos son incorporados en la distrofina hasta que finalmente es
alcanzado el codón de parada prematuro UGA el cual antes había estado oculto entre la secuencia
(-AAU-GAA-UUU-) y que ahora deja de estarlo y es leído (–AAA-UGA-AUU-). La síntesis de proteína es
entonces interrumpida prematuramente, quedando la distrofina incompleta, y la distrofia muscular Duchenne se
desarrolla. Después de una deleción del exón 45, el exón 44 es seguido directamente por el exón 46:
final exon 44 | inicia exon 46
-UGG-UAU-CUU-AAG | GCU-AGA-AGA-ACA---AGA-UUU-AAA-UGA-AUU-UGU-UUU-AUGtrp tyr leu lys | ala arg arg thr
arg phe lys alto!
Si adicionalmente a la falta del exón 45, es removido también el exón 46, el marco de lectura no es alterado, no
habría ningún codón de parada prematuro, aunque 108 aminoácidos estarían faltantes en la parte central de la
distrofina, sin embargo aunque acortada, esta seria todavía funcional. Esto cambiaria la distrofia muscular
Duchenne en una menos severa distrofia muscular Becker.
final exon 44 | inicia exon 47
---UAC-AAA-UGG-UAU-CUU-AAG | UUA-CUG-GUG-GAA-GAG-UUG--tyr lys trp tyr leu lys | leu leu val glu glu leu
28