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VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN
SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS
DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA
JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de
Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia”.
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN
SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS
DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA
JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ
APROBADO
___________________________
Fernando Murcia, Microbiólogo.
Director
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN
SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS
DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA
JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ
APROBADO
___________________________
Fernando Murcia, Microbiólogo.
Director
_____________________________
María Clara Méndez, Microbióloga
Jurado
_______________________
Adriana Páez, Microbióloga
Jurado
VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN
SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS
DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA
JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ
APROBADO
__________________________
Angela Umaña Muñoz, M. Phil
Decana Académica
_______________________
David Gómez Méndez, Msc
Director de carrera
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN
1
1. INTRODUCCIÓN
2
2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
5
2.1 Generalidades de la validación
2.1.1 Validación
7
8
2.1.2 Validación Primaria
10
2.1.3 Validación secundaria
11
2.1.4 Tipos de validación
11
2.1.4.1 Validación prospectiva
11
2.1.4.2 Validación retrospectiva
12
2.1.4.3 Validación concurrente
12
2.1.4.4 Revalidación
13
2.1.5 Parámetros analíticos para la validación de una técnica o método
14
2.1.5.1 Precisión
14
2.1.5.2 Selectividad
15
2.1.5.3 Especificidad
15
2.1.5.4 Linealidad
16
2.1.5.5 Exactitud
16
2.1.5.6 Estabilidad
16
2.1.5.7 Limite de detección
16
2.1.5.8 Limite de cuantificación
16
2.2 Microorganismos de estudio
17
2.2.1 Bacillus cereus
17
2.2.2 Staphylococcus aureus
19
2.3 Toma de muestras y análisis microbiológico de alimentos
21
2.3.1 Toma de muestras
21
2.3.2 Análisis microbiológico de alimentos
23
2.4 Recuento y siembra en placa por superficie
24
2.4.1 Método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus
24
2.4.2 Método de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus
coagulasa positiva
2.5 Control en la validación de los métodos
25
26
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
28
4. OBJETIVOS
29
4.1 Objetivo general
29
4.2 Objetivos específicos
29
5. MATERIALES Y METODOS
30
5.1 Control de calidad de los medios de cultivo
30
5.2 Verificación del control de equipos
32
5.3 Control de ambientes
32
5.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie
33
5.4.1 Dilución y homogeneización de las muestras
33
5.4.2 Recuento en placa en superficie de Bacillus cereus
34
5.4.3 Recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus coagulasa
positiva
5.4.4 Evaluación de la validación
5.5 Informe de resultados
6. RESULTADOS Y DISCUSION
34
35
36
37
6.1 Control de calidad de los medios de cultivo
37
6.2 Verificación del control de equipos
43
6.3 Control de ambientes
44
6.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie
45
6.4.1 Ensayos de validación para Bacillus cereus
47
6.4.1.1 Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus
47
6.4.1.2 Ensayos de reproducibilidad de Bacillus cereus
53
6.4.2 Ensayos de validación para Staphylococcus aureus coagulasa positiva
64
6.4.2.1 Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
64
6.4.2.2 Ensayos de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
69
7. CONCLUSIONES
82
8. RECOMENDACIONES
84
9. REFERENCIAS
85
8.1 Recursos Electrónicos
10. ANEXOS
89
90
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al inicio del estudio
39
Tabla 2. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al finalizar el estudio
40
Tabla 3. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al inicio del estudio
41
Tabla 4. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al finalizar el estudio
41
Tabla 5. Recuento del control de ambientes
45
Tabla 6. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Bacillus cereus en una muestra de albahaca
48
Tabla 7. Análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación prueba
repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca
50
Tabla 8. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie
de Bacillus cereus en muestra de albahaca
50
Tabla 9. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad recuento en placa en
superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca
51
Tabla 10. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido
51
Tabla 11. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una
muestra de albahaca en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1)
53
Tabla 12. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la
prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus
en albahaca evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1)
55
Tabla 13. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Bacillus
cereus en muestra de albahaca
55
Tabla 14. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo
56
Tabla 15. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado en diferentes horas
(ensayo de reproducibilidad 1)
57
Tabla 16. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una
muestra de albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2)
59
Tabla 17. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la
prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus
en albahaca evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2)
60
Tabla 18. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Bacillus
cereus en muestra de albahaca
61
Tabla 19. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo
62
Tabla 20. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado por diferentes analistas
(ensayo de reproducibilidad 2)
63
Tabla 21. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda
64
Tabla 22. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación
prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en
leche cruda
67
Tabla 23. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie
de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda
67
Tabla 24. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad para Staphylococcus
aureus en una muestra de leche cruda
67
Tabla 25. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida
68
Tabla 26. Resultados recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en
una muestra de leche cruda a las diferentes horas evaluadas (ensayo de
reproducibilidad 1)
70
Tabla 27. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la
prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus
aureus en leche cruda evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 71
Tabla 28. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para
Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda
72
Tabla 29. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo
73
Tabla 30. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado en diferentes
horas (ensayo de reproducibilidad 1)
74
Tabla 31. Resultados de los recuentos en placa en superficie de Staphylococcus
aureus en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo de
reproducibilidad 2)
76
Tabla 32. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la
prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus
aureus en leche cruda evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2)
77
Tabla 33. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para
Staphylococcus aureus en leche cruda
78
Tabla 34. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo
79
Tabla 35. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado por diferentes
analistas (ensayo de reproducibilidad 2)
80
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (Prueba)
40
Figura 2. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (interferente)
40
Figura 3. Método ecométrico agar TSA (control)
40
Figura 4. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (Prueba)
41
Figura 5. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (interferente)
42
Figura 6. Método ecométrico agar TSA (control)
42
Figura 7. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en
superficie de Bacillus cereus en albahaca
48
Figura 8. Crecimiento de Bacillus cereus en la prueba de repetibilidad
49
Figura 9. Confirmación bioquímica de Bacillus cereus con BBL Crystal
49
Figura 10. Prueba repetibilidad en arroz cocido
52
Figura 11. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus a las
diferentes horas analizadas
54
Figura 12. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 1
54
Figura 13. Prueba reproducibilidad 1 en arroz cocido
58
Figura 14. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus
realizado por diferentes analistas
59
Figura 15. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 2
60
Figura 16. Prueba reproducibilidad 2 en arroz cocido
63
Figura 17. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa
en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda
65
Figura 18. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda en la prueba de
repetibilidad
66
Figura 19. Confirmación de Staphylococcus aureus coagulasa positiva con el kit Slidex
Staph plus
66
Figura 20. Confirmación bioquímica de Staphylococcus aureus con BBL Crystal
66
Figura 21. Prueba repetibilidad en carne cocida
69
Figura 22. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus
a las diferentes horas analizadas
70
Figura 23. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda.
Prueba reproducibilidad 1
71
Figura 24. Prueba reproducibilidad 1 en carne cocida
75
Figura 25. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus
realizado por diferentes analistas
76
Figura 26. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda.
Prueba reproducibilidad 2
77
Figura 27. Prueba reproducibilidad 2 en carne cocida
81
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1. Certificados de calidad de las cepas ATCC
90
Anexo 2. Certificados de calidad de los medios de cultivo
93
Anexo 3. Certificados de calibración de los equipos
95
Anexo 4. Confirmación bioquímica por medio del kit de identificación rápida de
microorganismos Gram positivos BBL Crystal
111
AGRADECIMIENTOS
A Biotrends Laboratorios Ltda., por la financiación total del proyecto, en especial a la
doctora Maria Clara Méndez y al doctor Fernando Murcia, por su valiosa colaboración;
a todo el personal de Biotrends Laboratorios por su ayuda; a la profesora Lorena
Valencia por su asesoría y al profesor Miguel Pinzón por su asesoría estadística.
A mis padres por todo el apoyo que me han dado siempre.
A mis hermanos por su ayuda y tolerancia.
A Ana Maria,
y a mis amigos, You know who you are.
RESUMEN
Con el fin de brindar una mayor calidad a los consumidores, las empresas
productoras de alimentos deben realizar análisis microbiológicos y
fisicoquímicos para determinar la confiabilidad del producto y verificar si
aprueban los niveles de calidad exigidos para que dichos productos
puedan ser comercializados. Por esta razón, es necesario que los
laboratorios que llevan a cabo dichos análisis se comprometan a realizar
los respectivos análisis teniendo como objetivo principal proporcionar
resultados altamente confiables, razón por la cual, el laboratorio debe
controlar y asegurar la calidad de sus resultados, lo cual radica
principalmente
en
la
alineación
con
parámetros
nacionales
e
internacionales, para así poder garantizar un buen desarrollo del
procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se
ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de
las técnicas más utilizadas en el laboratorio.
En este estudio se llevó a cabo la validación secundaria del método de
recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras de
albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus en muestras de
leche cruda y carne cocida, debido a que es una de las técnicas más
frecuentemente utilizadas en Biotrends Laboratorios Ltda. De esta forma,
se obtuvieron resultados que permitieron validar esta técnica y que fueron
analizados estadísticamente, entre los cuales se encontró un alto grado
de concordancia en los coeficientes de variación de los diferentes
ensayos de repetibilidad y reproducibilidad realizados.
1
1. INTRODUCCIÓN
Las empresas productoras de alimentos deben brindar una mayor calidad
a los consumidores, ya que los productos que estas elaboran pueden
comprometer la salud de los mismos, razón por la cual es necesario llevar
a cabo análisis microbiológicos y caracterización físico química para
determinar la confiabilidad del producto y verificar si aprueban los niveles
de
calidad
exigidos
para
que
dichos
productos
puedan
ser
comercializados.
Es por esta razón que se ha visto la necesidad de crear laboratorios de
análisis de alimentos que lleven a cabo dichos análisis para determinar la
calidad de los productos de las empresas o personas que los elaboran, y
que además brinden asesoría en los respectivos análisis y en la
implementación de un sistema de calidad en estas empresas productoras
de alimentos.
Estos laboratorios se deben comprometer a realizar los respectivos
análisis
teniendo
como
objetivo
principal
proporcionar
resultados
altamente confiables, los cuales dependerán del programa que se haya
implementado en el laboratorio para garantizar la confiabilidad de los
resultados finales emitidos; razón por la cual, el laboratorio, debe controlar
y asegurar la calidad de sus resultados, entendiéndose calidad como el
grado en el que un conjunto de características inherentes cumplen con los
requisitos, lo cual radica principalmente en la alineación con parámetros
nacionales e internacionales.
Los programas de control interno de un laboratorio incluyen evaluación
continua y/o monitoreos de los principales materiales y objetos que se
utilizan dentro de los análisis, como medios de cultivo, reactivos, equipos
o instrumentos, además de la validación de procedimientos técnicos y del
2
personal,
también
debe
incluir
manuales
de
procedimientos
y
documentación en general, para así poder garantizar un buen desarrollo
del procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se
ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de
las técnicas más utilizadas en el laboratorio.
La validación de una técnica, es el proceso por el cual se establecen
mediante estudios de laboratorio si las características de desempeño del
método analítico cumplen los requerimientos para la aplicación analítica
propuesta, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la
confiabilidad de los resultados obtenidos, en la cual se determinarán las
posibles variaciones que se presentan entre diferente número de
ensayos, para así disminuir las posibilidades de error dentro del método,
generando un alto grado de confianza en los resultados finales.
Para realizar la validación de un método microbiológico se debe tener en
cuenta la evaluación de los medios de cultivo a utilizar para la
recuperación de la microflora bacteriana presente en el producto; también
se debe llevar a cabo la calibración y verificación de los equipos que se
utilizan en este tipo de técnicas, tales como: balanzas, micropipetas,
incubadoras, autoclaves, etc. Además de realizar la evaluación de los
analistas que efectúan dichos procedimientos a diario, así como el
conocimiento de las técnicas que se desarrollan y si se han presentado
modificaciones o no de estas dentro del laboratorio, para así poder llevar
a cabo un proceso de validación secundaria, en el que se verifique que la
técnica que ha sido desarrollada en otra parte se está realizando
adecuadamente en el laboratorio.
Esta validación de técnicas microbiológicas es de gran importancia, ya
que permite emitir resultados confiables que garanticen que el proceso
planificado se efectuará uniformemente en conformidad con los resultados
previstos especificados, que conlleven a la toma de decisiones
3
adecuadas; además ayuda a la regulación y el cumplimiento de la
normatividad gubernamental, a la reducción de costos en el laboratorio y
como requisito para dar cumplimiento a la norma NTC ISO/IEC 17025
“Requisitos Generales para la competencia de laboratorios de Prueba y
calibración”, la cual es de vital cumplimiento en el proceso de acreditación
del laboratorio.
4
2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
El consumo de algunos alimentos representa un riesgo por la presencia
de microorganismos patógenos, de sus toxinas, metabolitos tóxicos o por
la de microorganismos capaces de deteriorar la calidad del alimento hasta
un estado inaceptable. Por lo tanto, deben tenerse muy en cuenta los
tipos de microorganismos presentes en el alimento y su número. Ciertos
microorganismos simplemente alteran el producto, algunos pueden
causar enfermedades y otros indican la posibilidad de que los alimentos
estén contaminados por patógenos. A menudo, el riesgo de enfermedad
alimentaria
es
tanto
más
elevado,
conforme
el
patógeno
va
multiplicándose en el alimento y, por tanto, su número aumenta; al
contrario el riesgo será menor si el microorganismo se multiplica
escasamente en el alimento. En algunos casos el alimento solo actúa
como vehiculo de transmisión del organismo infeccioso. La manipulación
sufrida por un alimento durante su distribución, almacenamiento y
preparación
para
el
consumo
puede
provocar
la
disminución,
mantenimiento o aumento del número de microorganismos presentes,
mientras que las toxinas más lábiles se desactivan y las más resistentes
se mantienen (ICMSF, 1999).
Es por esto que se hace necesario llevar a cabo un análisis microbiológico
de los alimentos, que asegure que estos son aptos para el consumo
humano y que poseen las condiciones de calidad necesarias para cumplir
con la normatividad gubernamental y así poder ser comercializados.
El análisis microbiológico de alimentos permite valorar la carga microbiana
que se encuentra en los diferentes productos, por esta razón se debe
determinar en la industria cuales son los puntos de riesgo de
contaminación o multiplicación microbiana (los puntos críticos del
proceso) y evitarlos, siguiendo un código estricto de Buenas Practicas de
Manufactura (BPM) y distribución del alimento (Decreto 3075, 1997).
5
La calidad del producto puede garantizarse, mediante la identificación y
manejo de los diferentes puntos críticos de control que se dan en el
proceso, de una correcta manipulación que dependerá de las buenas
practicas de manufactura seguidas durante el proceso de producción, de
un adecuado proceso de envasado o empaquetado, del transporte y de
las características de almacenamiento del producto (Decreto 3075, 1997).
Debido a la importancia de garantizar la calidad de los alimentos, es
importante la verificación y validación de los procesos o técnicas de
evaluación y diagnóstico de la calidad higiénica de estos, que
proporcionen la confiabilidad de los productos de consumo, ya que los
consumidores exigen cada vez más, atributos de calidad en los productos
que adquieren para su consumo (Lightfoot & Maier, 2002).
Estos atributos de calidad son los que el laboratorio debe demostrar
mediante la implementación de un adecuado análisis microbiológico, en
donde se verifiquen los procedimientos que se usan para tal fin,
generando así confiabilidad por medio de técnicas reconocidas y
validadas que se encuentren contempladas en las especificaciones
técnicas propuestas por los entes reguladores, para así poder determinar
si un producto es apto para salir o no al mercado, y si se encuentra bajo
los más altos estándares de calidad; característica requerida para lograr
mayor aceptación por parte del consumidor.
El análisis microbiológico entonces, cobra gran importancia al ser un
punto álgido en la elaboración y distribución de los alimentos, por esta
razón el laboratorio encargado del análisis debe mantener estándares de
calidad aceptables en el procesamiento de muestras y en los resultados
que emitan sus técnicas para garantizar la seguridad e inocuidad de los
alimentos que sus clientes producen y/o distribuyen (ICMSF, 2000). Sin
embargo, la exactitud y precisión de los resultados microbiológicos no
solo dependen de los métodos utilizados y de la competencia del personal
6
del laboratorio, sino también del correcto funcionamiento de los equipos
empleados (Lightfoot & Maier, 2002).
La garantía de calidad en un laboratorio debe tomarse como un programa
para identificar el origen de las variaciones significativas y para minimizar
o aminorar sus efectos sobre la fiabilidad de los resultados analíticos.
Sus objetivos son:
1. Estandarizar los métodos y prácticas del laboratorio.
2. Lograr que su funcionamiento sea comparable, no solo entre
analistas individuales dentro de un mismo laboratorio, sino también
entre distintos laboratorios que realizan el mismo tipo de análisis y
examinan la misma clase de alimentos.
3. Impedir que informes de laboratorio inexactos o en los que no se
pueda confiar sean utilizados para decidir si un producto se ajusta
a las especificaciones aplicables a la industria o cumple los
requisitos legales (ICMSF, 2000).
2.1 Generalidades de la validación
Un adecuado proceso de validación debe desarrollarse dentro del marco
de buenas prácticas de manufactura, ya que garantizan la seguridad de
los datos obtenidos para poder así juzgar sobre la seguridad de un
producto, permitiendo obtener una documentación confiable y segura,
además, la validación permite obtener una optimización y estandarización
de procesos al disminuir el tiempo muerto, reducir costos y la probabilidad
de fallas (Medina & Quintana, 2002).
7
2.1.1 Validación
Es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia
documentada que un proceso específico producirá de forma consistente y
permanente productos que poseerán las características de calidad
predefinidas (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). Es el
proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio que
las características de desempeño del método analítico cumplen los
requerimientos para la aplicación analítica propuesta (USP XXVI, 2003),
es decir, para detectar o cuantificar grupos microbianos específicos como
es el caso, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la
confiabilidad de los resultados obtenidos.
Para validar un proceso se deben realizar sistemáticamente los
procedimientos de puesta a punto del mismo, mediante el seguimiento de
las siguientes fases:
Planificación:
Se busca establecer programas temporales y listas de verificación,
protocolos de la validación con criterios de aceptación/rechazo,
necesidades
de
recursos,
análisis
de
riesgos,
etc.
(European
Commission, 2001).
Calificación del diseño:
El primer elemento de la validación es la evaluación de nuevas
instalaciones, sistemas o equipos. Se deberá demostrar y documentar la
adecuación del diseño a las normas de correcta fabricación (European
Commission, 2001).
Calificación de la instalación:
La calificación de la instalación busca establecer por evidencia objetiva
que todos los aspectos claves del equipo de proceso y la instalación de
8
sistemas auxiliares cumplan con las especificaciones aprobadas del
fabricante y las recomendaciones del abastecedor del equipo para el
correcto funcionamiento, y las exigencias de mantenimiento de este.
Además de esto, también se incluyen requisitos de calibración y
verificación de los materiales de construcción (European Commission,
2001).
Calificación del funcionamiento:
Esta calificación deberá realizarse tras la calificación de la instalación, y
busca establecer por medio de evidencia objetiva los límites de control de
proceso y los niveles de acción que resultan en un producto que cumpla
con todos los requerimientos predeterminados.
Debe incluir:
(a) Ensayos que hayan desarrollado especialistas con conocimiento sobre
procesos, sistemas y equipos.
(b) Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que
abarquen los límites máximos y mínimos de trabajo, condiciones
denominadas como frecuencia “caso más desfavorable”.
La finalización de forma satisfactoria de la calificación del funcionamiento
permitirá terminar los procedimientos de calibración, fabricación y
limpieza, la formación del operario y las exigencias de mantenimiento
preventivo. Así, permitirá la aprobación formal de las instalaciones,
sistemas y equipos (European Commission, 2001).
Calificación de desempeño:
La calificación de desempeño deberá efectuarse una vez realizadas
satisfactoriamente la calificación de la instalación y de funcionamiento.
Esta proveerá evidencia documentada, bajo condiciones anticipadas, que
9
se produce de manera consistente un producto que cumpla con las
especificaciones y el criterio de diseño (European Commission, 2001).
La calificación de la ejecución del proceso incluirá, entre otras cosas, lo
siguiente:
(a) Ensayos, empleando materiales de producción (o componentes
sustitutivos calificados y/o simulaciones de productos), que se hayan
desarrollado a partir del conocimiento especializado sobre los procesos y
las instalaciones, sistemas o equipos.
(b) Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que
abarquen los límites máximos y mínimos de funcionamiento (European
Commission, 2001).
2.1.2 Validación primaria
La validación primaria es un proceso exploratorio que tiene como metas
establecer los límites operacionales y las características de desempeño
de un método nuevo, modificado o caracterizado en forma inadecuada.
Debe dar origen a especificaciones numéricas y descriptivas para el
desempeño e incluir una descripción detallada y precisa del objeto de
interés.
Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de
esquemas de ensayo especialmente diseñados.
Los laboratorios que desarrollan un método “en casa” o una variante de
una norma existente deben realizar los pasos de la validación primaria
(GTC 84, 2003).
10
2.1.3 Validación secundaria
La validación secundaria tiene lugar cuando un laboratorio procede a
implementar un método desarrollado en otra parte. Esta validación se
centra en la reunión de evidencia acerca de que el laboratorio está en
capacidad de cumplir las especificaciones establecidas en la validación
primaria. Suele llamarse verificación; y es la confirmación, mediante el
aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos
establecidos (ISO 9000, 2000).
Normalmente, la validación secundaria emplea formas seleccionadas y
simplificadas de los mismos procedimientos empleados en la validación
primaria, aunque posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las
muestras naturales constituyen el material de ensayo óptimo y el trabajo
solo requiere tratar el procedimiento dentro de los límites operacionales
establecidos por la validación primaria (GTC 84, 2003).
Para un laboratorio de análisis es importante validar sus técnicas para así
optimizar sus procesos, al mejorar el uso de equipos y de personal de
laboratorio y eliminar los tiempos muertos, lo cual genera confiabilidad en
los resultados, lo que a su vez implica reducción en los gastos (PDA
Suggested Revision, 2000). Así mismo sirve para dar cumplimiento a las
normas legales pertinentes o a normas internacionales de calidad,
contribuyendo a la credibilidad del laboratorio y a obtener altos niveles de
calidad que generen confianza dentro de sus clientes.
2.1.4 Tipos de validación
2.1.4.1 Validación prospectiva
Este tipo de validación se basa en información obtenida antes de
implantar el proceso de validación. Se debe realizar un análisis de riesgos
para determinar si podrían conducir a situaciones críticas; se investigan
11
posibles causas y se determina la probabilidad de que suceda. Luego se
efectúan los ensayos y se hace una valoración general; si los resultados
son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los procesos no
satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva
validación demuestre su carácter satisfactorio (European Commission,
2001).
2.1.4.2 Validación retrospectiva
Este tipo de validación involucra la revisión y análisis de la información
histórica del proceso para proveer de la evidencia documentada necesaria
que el proceso está haciendo lo que debe hacer. Los pasos involucrados
en este tipo de validación requieren la preparación de un protocolo
específico, el reporte de los resultados de los datos analizados que
conlleven a unas conclusiones y recomendaciones (PDA Suggested
Revision, 2000), (WHO, 1997).
Este tipo de validación solo es aceptable para procesos bien establecidos
y sería inapropiado si recientemente se hubieran realizado cambios en la
composición del producto, en los procedimientos de operación o en los
equipos (PDA Suggested Revision, 2000), por lo tanto, nunca se debe
aplicar a nuevos procesos o productos. Esta validación puede ser útil en
el establecimiento de las prioridades en un programa de validación (WHO,
1997).
Dentro de la validación retrospectiva es necesario tener en cuenta el
control
de
la
materia
prima,
controles
ambientales,
controles
microbiológicos, equipos, procedimientos, especificaciones y métodos
analíticos (European Commission, 2001).
2.1.4.3 Validación concurrente
Este tipo de validación sirve para demostrar y establecer evidencia
documentada que un proceso hace lo que debe hacer basado en
12
información generada durante una implementación real del proceso. La
validación concurrente es muy utilizada cuando se ha variado alguna
etapa del proceso. Esta da una información muy valiosa para modificar y
corregir el proceso. Podría considerarse como una evaluación continua
del proceso, mientras se controla al máximo para procurar que el producto
o resultado final sea correcto (ISO 14000, 1996).
Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las variables críticas
que demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos
sobre la marcha del proceso en estado productivo. Sin embargo, cada
aproximación tiene sus características y limitaciones y por lo tanto, antes
de desarrollar una validación deberá evaluarse qué tipo de validación
puede dar la mayor información sobre la seguridad y la estabilidad del
proceso (García, 2001).
2.1.4.4 Revalidación
Se aplica cuando se presenta el cambio de uno de los componentes
críticos de la formulación, cambio o reemplazo de una pieza crítica en un
sistema o equipo o cambio en instalaciones. La revalidación periódica se
presenta
cuando
los
procesos
experimentan
cambios
graduales
(European Commission, 2001).
Es la repetición de un procedimiento de validación o un procedimiento del
mismo. Esto no significa que el programa original deba ser repetido, pues
la revalidación se efectúa para asegurar que los cambios intencionales o
no intencionales en los procesos no afecten las características del
proceso ni la calidad del producto (European Commission, 2001), (WHO,
1997).
13
2.1.5 Parámetros analíticos para la validación de una técnica o
método
Son las propiedades, características o capacidades del método que
indican su grado de calidad en cuanto a exactitud, exactitud relativa,
desviación, desviación positiva, desviación negativa, efecto matricial,
repetibilidad, precisión intermedia, reproducibilidad, especificidad, límite
de detección, límite de cuantificación, linealidad, rango, sensibilidad,
fortaleza y solidez y robustez, entre otras características (OGA-016,
2005).
2.1.5.1 Precisión
Se relaciona con la dispersión de la medida alrededor de un valor medio o
central, que puede ser expresada en términos de varianza, desviación
estándar o coeficiente de variación. La precisión puede ser considerada a
tres niveles: repetibilidad, reproducibilidad y solidez y robustez (OGA-016,
2005).
- Repetibilidad
Medida de la precisión del método cuando se realizan mediciones
sucesivas por el mismo analista el mismo día, mismos reactivos, mismo
instrumento y condiciones de medición (precisión dentro del ensayo). Por
mediciones sucesivas se entiende aquellas mediciones repetidas dentro
de un corto periodo de tiempo (OGA-016, 2005), (WHO Technical Report
Series, No. 823, 1992).
- Reproducibilidad
Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo
analito realizadas en diferentes condiciones de medición. Una declaración
válida de reproducibilidad requiere que se especifiquen los cambios en las
condiciones del análisis o calibración. Estos cambios pueden incluir: el
principio en que se basa la medición, el método, analista/observador e
14
instrumento, material y patrones de referencia, ubicación, condiciones de
uso y tiempo. La reproducibilidad puede ser expresada cuantitativamente
en términos de los parámetros de dispersión de los resultados (desviación
estándar, varianza, coeficiente de variación) (OGA-016, 2005). La
reproducibilidad intra-laboratorio es uno de los principales objetivos de los
programas internos de aseguramiento de la calidad. Garantiza que un
laboratorio es capaz de producir resultados constantes a lo largo del
tiempo (Lightfoot & Maier, 2002).
- Solidez y robustez
Busca demostrar la veracidad de un análisis con respecto a variaciones
deliberadas en parámetros del método. Examina el efecto que las
condiciones operacionales y del medio ambiente tienen sobre los
resultados del análisis (diferentes temperaturas y porcentaje de humedad,
analistas con diferente experiencia, instrumentos y reactivos de diferentes
marcas). Se determina analizando muestras provenientes de un lote
homogéneo por diferentes analistas y que el procedimiento analítico no se
vea afectado por estas variaciones deliberadas (OGA-016, 2005).
2.1.5.2 Selectividad
Se define un método selectivo como aquel que produce resultados
exactos para todos los analitos de interés (WHO Technical Report Series,
No. 823, 1992).
2.1.5.3 Especificidad
Es la capacidad del método para diferenciar precisa y específicamente el
compuesto de interés, en presencia de los demás componentes, que se
espera estén presentes en la matriz de la muestra (WHO Technical
Report Series, No. 823, 1992). La especificidad se puede estudiar
agregando a la muestra algunas sustancias que se sospecha que
reaccionan de la misma manera que el componente estudiado y comparar
15
estadísticamente los resultados analíticos con y sin agregado (OGA-016,
2005).
2.1.5.4 Linealidad
Tiene que ver con la proporcionalidad entre la concentración del analito y
su respuesta, es decir, si la técnica o método produce resultados directa o
indirectamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito,
dentro de un intervalo determinado (WHO Technical Report Series, No.
823, 1992).
2.1.5.5 Exactitud
Es el grado de concordancia entre el valor aceptado como un valor
verdadero convencional, o un valor de referencia, y el valor encontrado
(OGA-016, 2005). Se conoce también como error sistemático o sesgo.
2.1.5.6 Estabilidad
La estabilidad se considera adecuada si la desviación estándar relativa
calculada en los resultados obtenidos en diferentes intervalos de tiempo,
no excede el 20% del valor correspondiente de la precisión del sistema
(WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
2.1.5.7 Límite de detección
Concentración mínima del analito que puede detectarse en una muestra,
pero no es necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas
específicas (OGA-016, 2005).
2.1.5.8 Límite de cuantificación
Corresponde a la concentración mínima del analito que puede ser
cuantificada con una exactitud y precisión aceptable en una muestra bajo
condiciones analíticas específicas (OGA-016, 2005).
16
2.2 Microorganismos de estudio
El análisis rutinario de los alimentos para poner de manifiesto un amplio
rango de bacterias patógenas resultaría poco práctico para la mayoría de
las industrias. Es por esto que se ha convertido en práctica corriente
investigar en los alimentos la presencia de grupos indicadores que
determinen la posibilidad de la existencia de microorganismos causantes
de intoxicaciones o de otros riesgos asociados con el crecimiento
microbiano (Hayes, 1993). Entre los microorganismos que se usan como
indicadores se encuentran las bacterias mesófilas esporuladas, de las
cuales hace parte Bacillus cereus, que revelan un tratamiento térmico
insuficiente de los alimentos enlatados o de un almacenamiento
prolongado sin refrigeración de los alimentos cocinados, tales como la
carne y el arroz. También se puede mencionar como indicador a
Staphylococcus aureus, cuya presencia en los alimentos se interpreta
como indicativo de contaminación a partir de la piel, la boca y las fosas
nasales de los manipuladores de alimentos, ya que el material y equipo
sucios y las materias primas de origen animal pueden ser también la
fuente de la contaminación (ICMSF, 2000).
2.2.1 Bacillus cereus
Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, móvil, esporoformador,
aerobio. Común en el suelo, en los vegetales, en los alimentos crudos y
procesados. Puede producir intoxicación alimentaria generalmente de
curso leve, que no suele durar más de 12 - 24 horas (ICMSF, 2000).
Bacillus cereus causa dos tipos diferentes de intoxicación por alimentos:
el tipo diarreico y el tipo emético (Sarrías et al., 2002). El tipo diarreico de
intoxicación alimentaria es causado por las enterotoxinas producidas
durante el crecimiento vegetativo de B. cereus en el intestino delgado, y
los alimentos asociados más frecuentemente a este tipo de enfermedad
son los postres, carnes y los productos lácteos; mientras que la toxina
17
emética, que causa vómito, es producida por las células que crecen en el
alimento. El arroz es el vehículo de intoxicación más común por este tipo
de toxina. Para ambos tipos de intoxicaciones, los alimentos implicados
usualmente han sido calentados, y las esporas sobrevivientes han sido la
fuente de la enfermedad. Carlin et al. (2006), evaluaron los riesgos de la
producción de la toxina emética en ciertos tipos de alimentos,
encontrando que la poca habilidad de crecer a bajas temperaturas
demuestra que las cepas de B. cereus productoras de la toxina emética
representan un bajo riesgo en alimentos refrigerados. Por el contrario, la
notable resistencia de sus esporas a altas temperaturas favorece su
crecimiento en alimentos calentados cuando estos son dejados a
temperatura ambiente por más de 2 horas.
Las esporas de B. cereus son un factor importante en las enfermedades
transmitidas por alimentos, ya que estas son mas hidrofóbicas que otras
esporas de Bacillus spp., lo cual permite que estas se adhieran a varios
tipos de superficies. De aquí que sean difíciles de remover de equipos
durante la limpieza, pues estas poseen apéndices y/o pilis que están, en
menor parte, involucrados en la adhesión. Estas propiedades de
adherencia no solo permiten que las esporas resistan los procedimientos
normales de saneamiento, y así contaminar los alimentos durante el
procesamiento, sino que ayudan a que se unan a las células epiteliales
(Doyle, 1997).
B. cereus no es un microorganismo competitivo, pero crece bien después
de cocinar el alimento y dejarlo enfriar (< 48° C). El tratamiento con calor
causa la germinación de las esporas y, en ausencia de flora competitiva,
B. cereus crece óptimamente (Doyle, 1997). B. cereus es un
microorganismo común del suelo y se propaga fácilmente a muchos tipos
de alimentos, especialmente los de origen vegetal, pero también es
aislado normalmente de carne, huevos, leche cruda y productos lácteos
debido a procesos de contaminación cruzada. Estos últimos, además del
18
arroz y las especias, están entre los alimentos que más frecuentemente
se contaminan con B. cereus.
Bacillus cereus produce intoxicaciones alimentarias solamente cuando el
alimento
ingerido
contiene
números
muy
elevados
de
células,
generalmente superiores a 107 UFC/g o ml. Por ello, el recuento de B.
cereus es el factor decisivo a la hora de evaluar el significado de este
microorganismo en los alimentos (ICMSF, 2000). Sin embargo, las
enfermedades causadas por B. cereus no son muy reportadas, pues
ambos casos de intoxicaciones son relativamente poco agresivas y
usualmente duran menos de 24 horas (Doyle, 1997).
2.2.2 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo, inmóvil que forma
agrupaciones irregulares de células usualmente parecidas a los racimos
de uvas. Son anaerobios facultativos, pero crecen mejor en presencia de
aire, siendo su temperatura óptima de crecimiento los 37° C, pero
desarrollándose hasta los 10° C o ligeramente menos (Hayes, 1993).
La intoxicación alimentaria estafilocócica es un síndrome caracterizado
por nauseas, vómitos, diarrea, malestar y debilidad general. Los síntomas
comienzan a manifestarse de 1 a 6 horas después de consumido el
alimento (ICMSF, 2000).
S. aureus ha sido ampliamente caracterizado, ya que se sabe que este
microorganismo produce una gran variedad de productos extracelulares.
Muchos de ellos, como las enterotoxinas estafilococales (SE en inglés),
son factores virulentos que han estado implicados en enfermedades de
humanos y animales. Estas enterotoxinas elaboran un juego de
propiedades biológicas que causan al menos dos enfermedades humanas
comunes, síndrome de shock tóxico (TSS en inglés) e intoxicaciones
19
debidas a Staphylococcus en alimentos (Doyle, 1997). Si en un alimento
asociado a un brote es identificado S. aureus, también se debe estudiar la
producción de enterotoxinas, lo cual incrementa la complejidad del
ensayo, ya que es usual que S. aureus produzca una o más toxinas
simultáneamente. Comúnmente, las SE han sido divididas en cinco
grandes clases serológicas (SE A, SE B, SE C, SE D, SE E) debido a sus
propiedades antigénicas, pero en los últimos años se han identificado
nueve clases más (SE G hasta SE O). Siendo la SE A la enterotoxina más
comúnmente recuperada de brotes de enfermedades transmitidas por
alimentos (Aznar et al., 2005).
Las intoxicaciones debidas a Staphylococcus en alimentos están
clasificadas como unas de las causas más prevalentes de gastroenteritis
en el mundo. Esto se debe a la ingestión de una o más enterotoxinas
estafilocócicas preformadas en alimentos contaminados por miembros del
género Staphylococcus, en donde predomina Staphylococcus aureus
(Doyle, 1997).
La principal fuente de contaminación de los alimentos por Staphylococcus
se debe a la manipulación de estos por parte de personas contaminadas,
ya que los humanos son el principal reservorio de este microorganismo. Si
bien muchas especies del género Staphylococcus se consideran
habitantes normales del cuerpo humano, S. aureus es el patógeno más
destacado. En los humanos, las fosas nasales son los sitios de
colonización predominantes, aunque se pueden encontrar células de S.
aureus en diferentes sitios de la piel. La diseminación de S. aureus entre
humanos y de los humanos a los alimentos puede ocurrir por contacto
directo o indirectamente por fragmentos de piel (Doyle, 1997).
Algunas propiedades únicas de resistencia de S. aureus facilitan la
contaminación y crecimiento en alimentos. Afuera del cuerpo humano,
20
S. aureus es uno de los patógenos humanos no esporoformador más
resistente, pues puede sobrevivir por extensos periodos de tiempo. Es por
esto que para algunos alimentos procesados o tratados, S. aureus es un
buen indicador del grado de contacto humano, o con alimentos naturales
no tratados de origen animal dentro de la fábrica de alimentos (ICMSF,
2000). Por tal razón, se debe realizar la búsqueda de S. aureus; pues su
presencia indica insuficiencia en los tratamientos con calor como
pasteurización de la leche o cocción de la carne y en el uso de agentes
químicos sanitizantes que generalmente destruyen a este microorganismo
(Ingham & Schoeller, 2001).
Los factores que originan las enfermedades transmitidas por alimentos
debido a la contaminación de estos por S. aureus son:
a) Refrigeración inadecuada.
b) Poca higiene personal (no lavar las manos o los instrumentos
apropiadamente o no usar tapabocas).
c) Cocción o calentamiento inadecuados de los alimentos.
d) Uso prolongado de platos para calentar cuando se sirven los alimentos,
una práctica que promueve el crecimiento del microorganismo y la
producción de enterotoxinas (Doyle, 1997).
2.3 Toma de muestras y análisis microbiológico de alimentos
2.3.1 Toma de muestras
La calidad del informe final emitido por un laboratorio dependerá
directamente de la calidad de la muestra recogida y analizada. Los
análisis se solicitan para obtener una respuesta a una demanda
específica, por lo que deben ser realizados sobre muestras recogidas de
forma correcta y aplicando las técnicas más adecuadas para obtener
resultados representativos. Para cumplir este objetivo se debe seguir un
21
adecuado plan de toma de muestras (Lightfoot & Maier, 2002). Los
criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento
porque son diferentes los microorganismos patógenos y alterantes de
cada tipo de alimento (Romero, 2005).
El factor más importante en el análisis es el muestreo, el cual incluye: a)
evaluación de la muestra necesaria para evitar la distorsión producida por
los microorganismos presentes en las diferentes partes de la superficie
(canales, máquinas, platos, etc.); b) determinación del modo óptimo de
remoción del microorganismo de la muestra o lugar de muestro y c)
eliminación del riesgo de la contaminación ambiental durante la toma o
transporte de muestras (Romero, 2005).
En cuanto al transporte de muestras, es importante evitar que durante el
tiempo que este va a durar se produzca una multiplicación de los
microorganismos presentes o por el contrario, inactivación de algún
microorganismo (Romero, 2005). Para conseguir este objetivo, la muestra
debe ser protegida de los rayos ultravioletas, luz visible y las altas
temperaturas. Esto se consigue utilizando recipientes isotérmicos
refrigerados con bolsas de hielo o cualquier otro sistema adecuado
(Lightfoot & Maier, 2002).
En el momento de tomar las muestras es muy importante evitar sesgos y
propensiones, y obtener un número suficiente de unidades de muestra
para poder confiar en el juicio derivado de su análisis. El muestreo
aleatorio es el método más reconocido para evitar subjetividades y
proporciona
mejores
resultados
que
intentar
recoger,
de
forma
consciente, unidades de muestra de varias partes de un lote. Aunque no
hay garantía de que la muestra elegida con los números aleatorios tenga
las mismas características que el lote, es más probable que las tenga,
que si las muestras no se hubieran tomado aleatoriamente (ICMSF,
1999).
22
2.3.2 Análisis microbiológico de alimentos
El análisis microbiológico en la industria de alimentos, se constituye en
una herramienta básica para el control de materias primas, procesos,
productos y manipuladores, ya que permite establecer el grado de
contaminación biológica de estos, por esta razón el control microbiológico
es parte fundamental de todo el proceso (Carrascal, et al., 2003).
Los principales objetivos del análisis microbiológico son:
- Asegurar que el alimento cumpla con las normas estatutarias.
- Que se ajuste a normas internas establecidas por la empresa que los
procesa y a las que exige el comprador.
- Que las materias alimenticias que llegan a la fábrica para ser
procesadas cumplan las normas exigidas y las pactadas con el productor.
- Que se mantenga el control del proceso y la higiene de la línea de
fabricación (Hayes, 1993).
Los métodos de examen microbiológico utilizados para controlar la calidad
del alimento son en sí mismos muy variados y dependientes, en gran
parte del alimento que va a ser analizado (Soler, 2006).
Para el análisis microbiológico se debe tomar un peso conocido del
alimento (10 o 25 g). El alimento se debe adicionar en un diluyente como
agua peptonada al 0.1%. El tratamiento implica una homogenización
mecánica o en el Stomacher. El volumen de diluyente utilizado
generalmente es nueve veces mayor que la muestra; para 25 g se utilizan
225 ml de diluyente de forma que se obtenga un homogeneizado de
dilución 10-1, a partir de la cual se preparan las correspondientes
diluciones seriadas en base 10, dependiendo de la calidad microbiológica
del producto objeto de análisis (Hayes, 1993).
23
2.4 Recuento y siembra en placa por superficie
Cada tipo de recuento de microorganismos viables es potencialmente útil
para fines específicos. Los recuentos de bacterias viables se basan en el
número de colonias que se desarrollan en placas de agar que han sido
previamente inoculadas con cantidades conocidas del alimento diluido e
incubadas en condiciones ambientales predeterminadas. Tales recuentos
se denominan, en algunos casos con evidente error, recuentos totales en
placa, cuando en realidad únicamente pueden contarse aquellas bacterias
que pueden crecer en las condiciones ambientales elegidas; pues se
pueden cambiar las condiciones ambientales, las de incubación, la
composición del medio de cultivo (añadiendo inhibidores selectivos al
medio o agentes con actividad de superficie o colorantes) favoreciendo
así el crecimiento de unos u otros microorganismos (ICMSF, 1999).
2.4.1 Método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus
-Sembrar por triplicado 0.1 ml de muestra líquida o 0.1 ml de dilución
madre a placas de Agar Bacillus cereus.
-Extender con un asa estéril sobre el agar.
-Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
-Tapar y dejar absorber durante unos 15 minutos a temperatura ambiente.
-Incubar a 35° C ± 2° C durante 18 h – 24 h (+ 24 horas si es necesario).
Recuento:
Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al
nivel de 2 diluciones sucesivas.
Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que
no fermentan manitol y casi siempre rodeadas de una zona de
precipitado) (Holguín et al., 1998), (Allaert & Escolá, 2002).
24
Además de Bacillus cereus, otras especies dan reacciones positivas o
débilmente positivas en medios con yema de huevo. La actividad
hemolítica no es exclusiva de Bacillus cereus. Por estas razones, deben
someterse a confirmación colonias representativas procedentes del medio
(ICMSF, 2000).
2.4.2 Método de recuento en placa en superficie de Staphylococcus
aureus coagulasa positiva
Sembrar por triplicado 0.1 ml de la muestra líquida o 0.1 ml de dilución
madre en placas de petri con medio Baird Parker.
Extender con un asa estéril sobre el agar.
Repetir esta operación con 0.1 ml de cada una de las siguientes
diluciones decimales.
Tapar y dejar absorber durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Incubar a 37° C ± 2° C durante 18 h – 24 h.
Recuento:
Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias
características (de 1 a 1.5 mm de diámetro, negras o grises, brillantes y
convexas, rodeadas de una zona clara).
Incubar durante 24 h ± 2 h más.
Marcar las colonias características (de 1.5 a 2.5 mm de diámetro; parte de
la zona clara puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias),
y también las colonias no características (estas pueden no tener zona
clara).
Retener las placas que tengan un máximo de 300 colonias, con 150
colonias características y no características al nivel de dos diluciones
sucesivas (Holguín et al., 1998), (Allaert & Escolá, 2002).
25
A las colonias presuntivas de S. aureus, realizarles el test de confirmación
de coagulasa por medio del kit Slidex Staph plus, el cual es una prueba
para evidenciar la rápida combinación de látex y eritrocitos; desarrollado
para detectar el factor de aglutinamiento, proteína A y un inmunógeno
específico de superficie para S. aureus (Wichelhaus, 1999).
2.5 Control en la validación de los métodos
El método de recuento y siembra en placa provee un estimado de la
posible contaminación de un alimento, este estimado tiene sus bases en
principios científicos, que involucran la incorporación de controles de cada
uno de los lotes y de todas las pruebas (Akers, 1998).
Estos controles son los estipulados en las buenas prácticas de laboratorio
(BPL) e incluyen medio ambiente, analista y condiciones de esterilización
empleadas durante la elaboración, ensayo o análisis.
Los controles en las pruebas de siembra en placa son:
Control positivo del medio de cultivo: verificar la capacidad del medio de
cultivo de recuperación del microorganismo para el cual esta diseñado.
Control negativo del medio de cultivo: probar la esterilidad del medio.
Controles específicos: control de ambientes, analista, empaques, agua
peptonada, etc. (Romero, 2005).
Por lo anterior y como norma general conviene probar experimentalmente
los medios usados para determinar su selectividad y su productividad; así
como no debe usarse un medio diseñado para un producto en otro
producto diferente porque las condiciones ecológicas pueden ser
diferentes dando lugar a una distorsión de los resultados (Romero, 2005).
Dada la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los
medios de cultivo, tanto los generales como los selectivos, es necesario
hacer controles periódicos que permitan comprobar tanto que las
bacterias a diagnosticar crecen incluso a partir de células aisladas, como
26
que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas. Este
tipo de control de los medios de cultivo se denomina ensayo ecométrico
(Doyle, et al., 1997).
El medio de cultivo debe proveer los requerimientos nutricionales básicos
para el crecimiento de los microorganismos, por lo tanto, debe cumplir con
dos características fundamentales: la selectividad y la productividad. La
selectividad hace referencia a la composición básica del medio que
favorece el crecimiento de la cepa esperada con las características
propias de su especie, además permite evaluar el equilibrio nutricional
pertinente para cada especie, mientras que la productividad se ocupa de
la formulación del medio con respecto a los inhibidores del crecimiento de
flora acompañante, indeseable en un análisis especifico y que obedezca a
factores externos al análisis del alimento. El fundamento de la técnica es
establecer la eficiencia con la cual un medio de cultivo sirve para
recuperar una cepa, mediante la comparación que se realiza entre un
microorganismo que crece fácilmente en un medio (de referencia) y un
microorganismo que se espera no crezca debido a la composición del
medio (interferente) (Romero, 2005).
27
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
Los laboratorios de análisis microbiológico buscan realizar procedimientos
e implementar técnicas que permitan generar resultados altamente
confiables, para satisfacer las necesidades de los clientes, autoridades
reglamentarias u organizaciones que otorgan reconocimiento, mediante
procesos de planificación, que se efectuarán uniformemente en
conformidad con los resultados previstos, y originarán una reducción de
tiempo y de costos, para poder así cumplir con las especificaciones del
cliente, con los requisitos exigidos por la normatividad nacional y con
aquellas normas internacionales que les pueden dar un reconocimiento,
como la norma NTC ISO/IEC 17025.
Debido a lo anterior, se debe tener en cuenta una variedad de
procedimientos
a
seguir,
dentro
de
los
que
se
encuentra
la
estandarización, documentación y validación de técnicas y/o métodos que
se llevan a cabo dentro del laboratorio de análisis microbiológico
Biotrends Laboratorios Ltda., para verificar que estos cumplen los
requerimientos para la aplicación analítica propuesta, es decir, para
detectar o cuantificar grupos microbianos específicos, siendo su principal
objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados
obtenidos.
Por tal razón, es necesario implementar una validación de los métodos
analíticos utilizados más frecuentemente en Biotrends Laboratorios Ltda.,
como lo son los análisis de detección de Bacillus cereus y Staphylococcus
aureus en muestras de alimentos por medio del método de recuento en
placa en superficie, ya que son análisis que se llevan a cabo diariamente
en el laboratorio para evaluar la calidad de los alimentos, materias primas,
productos en proceso, producto terminado; o en análisis de operarios y
superficies de acuerdo a la especificación técnica de cada producto o
análisis.
28
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Realizar la validación secundaria concurrente del método de recuento en
placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en
muestras de albahaca, arroz cocido, leche cruda y carne cocida.
4.2 Objetivos Específicos
•
Evaluar la repetibilidad y reproducibilidad (estudio r y R) de la
técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en
muestras de albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus
en muestras de leche cruda y carne cocida, mediante repeticiones
sucesivas realizadas en diferentes condiciones de medición.
•
Realizar la evaluación de selectividad y especificidad de la técnica
de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y
Staphylococcus aureus.
•
Evaluar los parámetros estadísticos de la validación de la técnica
de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y
Staphylococcus aureus.
•
Evaluar la calidad de los medios de cultivo a utilizar en el análisis,
por medio de pruebas de esterilidad, pruebas de selectividad y
productividad (ensayo ecométrico) y control de pH.
•
Realizar un análisis de control de datos de los resultados obtenidos
durante el estudio.
29
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Para llevar a cabo la validación secundaria del método de recuento en
placa
en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en
muestras de alimentos, fue necesario realizar un control de la calidad de
los medios de cultivo que se trabajaron y se realizó la verificación del
estado de los equipos.
A los productos analizados (albahaca, arroz cocido, leche cruda y carne
cocida) se les realizó el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus
y Staphylococcus aureus de acuerdo con la propuesta por Holguín et al.,
(1998). De la misma forma, se evaluó la repetibilidad y reproducibilidad de
la técnica de recuento en placa en superficie de estos microorganismos,
además de evaluar la selectividad, la especificidad y los demás
parámetros estadísticos de la validación.
Este proyecto se realizó en las instalaciones de Biotrends Laboratorios
Ltda., ubicado en la ciudad de Bogotá D.C.
5.1 Control de calidad de los medios de cultivo
A los medios de cultivo utilizados en el estudio se les realizaron diferentes
controles para asegurar que estuvieran en óptimas condiciones. Estos
controles fueron: control de esterilidad, control de pH a 25° C, control
macroscópico y un control para medir la productividad y selectividad por
medio del método ecométrico.
•
Control de esterilidad: de cada lote disponible se eligió al azar un
2% de la totalidad de las cajas servidas con el medio de cultivo y
se llevaron a incubación durante 48 horas a 35 ± 1° C, para
verificar que no se presentara crecimiento de ningún tipo en las
cajas (Allaert & Escolá, 2002).
30
•
Control de pH a 25° C: se tomó una muestra del medio de cultivo y
con un pH-metro se realizó una medición del medio a una
temperatura de 25° C. El valor de pH obtenido para los medios de
cultivo debe corresponder con el indicado en la ficha técnica del
medio, donde se da un intervalo de aceptación de ± 0.2 (Allaert &
Escolá, 2002).
•
Control macroscópico: se realizó un examen visual para poder
descartar cualquier error importante en la preparación del medio.
Se observó si su consistencia (sólida), su color o aspecto
corresponden con los que indica la ficha técnica de estos (Allaert &
Escolá, 2002).
•
Método ecométrico: este control se realizó para comprobar la
eficacia del medio de cultivo. Para realizar este método se preparó
una suspensión de un microorganismo blanco y otro interferente a
una concentración igual al tubo 1 de Mc Farland (3 x 108 UFC/ ml).
Para lo cual se tomó una asada de los microorganismos de prueba
(Bacillus cereus ATCC 11778 y Staphylococcus aureus ATCC
6538) y el microorganismo interferente (Escherichia coli ATCC
8739) (anexo 1) previamente crecidos en un medio de cultivo
nutritivo y resuspendidos en solución salina, hasta alcanzar un
patrón de turbidez igual al mencionado. Posteriormente se tomaron
los medios para evaluar a los microorganismos de prueba (agar
Bacillus cereus y agar Baird Parker), y al microorganismo
interferente (en los mismos medios de cultivo) y como control se
sembraron los microorganismos de prueba en agar Tripticasa
Soya, para verificar su crecimiento. Luego se dividieron en cuatro
cuadrantes y con un asa calibrada se tomó el microorganismo
indicado y se trazaron cinco estrías en la superficie del medio de
forma paralela por cuadrante y una central sin voltear ni retomar
31
muestra sobre el medio de prueba, interferente y de control para
cada microorganismo (Lightfoot & Maier, 2002). Se realizaron dos
repeticiones del método ecométrico para evaluar los medios de
cultivo (mismos lotes), una al comienzo y otra al finalizar el estudio
Se realizó además una revisión de la fecha de caducidad de cada uno
de los medios de cultivo utilizados. Después de la preparación, cada
caja con el medio se etiquetó con la fecha y hora de preparación,
además de la persona encargada y estas se almacenaron a 4° C por
periodos no mayores a 8 días.
5.2 Verificación del control de equipos
Se revisó el historial de los equipos involucrados en el estudio
incluyendo certificados de calibración, mantenimiento y registros de su
uso en los últimos meses.
5.3 Control de ambientes
Empleando la técnica de sedimentación, se colocaron cajas abiertas
con medio de cultivo para microorganismos mesófilos (TSA) y para
hongos y levaduras (Sabouraud) en diferentes puntos del cuarto de
siembra durante un periodo de 15 minutos. Posteriormente las cajas
se llevaron a incubar a una temperatura de 35 ± 2° C durante 48 horas
para mesófilos y a 22 ± 2° C durante 5 días para hongos y levaduras.
Este control se llevó a cabo durante todas las pruebas realizadas.
32
5.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en
superficie
La metodología para realizar los análisis de alimentos en el laboratorio
se llevó a cabo de acuerdo al protocolo descrito por Holguín et al.,
(1998).
Se tomaron muestras de alta influencia en el laboratorio y las más
susceptibles a contaminación por S. aureus (leche cruda) y por B.
cereus (albahaca). Además, se tomaron dos muestras que se sabe
que presentan bajos recuentos de S. aureus y B. cereus, tales como
carne cocida y arroz cocido, respectivamente.
Se realizó la evaluación de repetibilidad, reproducibilidad intralaboratorio, especificidad, selectividad y los demás parámetros
estadísticos de la validación. Para esto, se tuvo en cuenta lo descrito
por el comité de expertos de la OMS (WHO Technical Report Series,
No. 823, 1992).
5.4.1 Dilución y homogeneización de las muestras
•
La muestra se agitó manualmente antes de iniciar la prueba
•
Se verificó que el recipiente de la muestra se encontrara limpio
y en buenas condiciones antes de abrirlo, para luego abrirlo de
forma aséptica.
•
Se pesaron las muestras (albahaca, leche cruda, arroz cocido y
carne cocida) y se agregaron a recipientes con agua peptonada
(obteniendo la dilución 10-1). Posteriormente se homogenizaron
en el stomacher.
•
Se realizaron diluciones seriadas en base 10 (obteniendo así
las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, etc.) (Holguín et al., 1998).
33
5.4.2 Recuento en placa en superficie de Bacillus cereus
•
Luego de realizar las diluciones, se tomó 0.1 ml de cada
dilución y se agregó en la superficie de la caja de petri con agar
Bacillus cereus, este procedimiento se realizó por triplicado.
•
Se extendió la muestra con un asa estéril sobre el agar.
•
Se taparon las cajas y se dejó absorber la muestra durante
unos 15 minutos a temperatura ambiente.
•
Se invirtieron las cajas y se llevaron a incubar a 35° C ± 2° C
durante 18 h – 24 h.
•
Se realizó el recuento de UFC/g o ml de las colonias
características de Bacillus cereus.
•
Se
sometieron
a
confirmación
colonias
representativas
procedentes del medio por medio de coloración de Gram
(Holguín et al., 1998).
•
Posterior a esto, se realizó una modificación de la técnica que
consistió en realizar la confirmación bioquímica por medio del kit
de bioquímicas rápidas Crystal BBL.
5.4.3 Recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus
coagulasa positiva
•
Se tomó 0.1 ml de cada dilución y se agregó en la superficie
de la caja de petri con agar Baird Parker, este procedimiento
se realizó por triplicado.
•
Se extendió la muestra con un asa estéril sobre el agar.
•
Se taparon las cajas y se dejó absorber la muestra durante
unos 15 minutos a temperatura ambiente.
•
Se invirtieron las cajas y se llevaron a incubar a 37° C ± 2° C
durante 18 h – 24 h.
•
Después de 24 h ± 2 h de incubación, se marcaron en la
placa las colonias características (de 1 a 1.5 mm de
34
diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas
de una zona clara).
•
Posteriormente se incubaron durante 24 h ± 2 h más.
•
Se realizó el recuento de UFC/g o ml de la muestra (Holguín
et al., 1998).
•
Se realizó una modificación a la técnica para evaluar S.
aureus coagulasa positiva, debido a que resulta ser más
práctica y además se encuentra validada por la AOAC; la
cual consiste en realizar la confirmación de S. aureus
coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus. Para llevar a
cabo esta prueba se debe depositar una gota del reactivo
anti - S. aureus y una gota del reactivo control sobre la
lámina. Luego, se deben tomar una o dos colonias
sospechosas y emulsificar en los reactivos. La aglutinación
(combinación de látex y células rojas sanguíneas) dentro de
30
segundos
indica
la
presencia
de
S.
aureus
(http://www.biomerieuxusa.com/clinical/microbiology/slidex/sl
idex_staph.htm) (2006).
•
Además de esto, se realizó una confirmación bioquímica por
medio del kit de bioquímicas rápidas BBL Crystal (GramPositive ID System) a las colonias características.
5.4.4 Evaluación de la validación
La evaluación de repetibilidad se realizó por medio de tres repeticiones
para cada producto, y cada repetición se hizo por triplicado. La
reproducibilidad se evaluó por medio de tres repeticiones para cada
producto, por triplicado, variando las condiciones de realización del
método (diferentes analistas y diferentes horas).
35
5.5 Informe de resultados
Mediante la evaluación de los parámetros estadísticos, tales como
media, desviación estándar, varianza y coeficiente de variación, se
analizaron los respectivos datos obtenidos durante el estudio, para
determinar la homogeneidad y los niveles de repetibilidad y
reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en superficie de
Bacillus cereus en muestras de albahaca y arroz cocido y de
Staphylococcus aureus en muestras de leche cruda y carne cocida.
36
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Control de calidad de los medios de cultivo
Control de esterilidad: de cada lote disponible se eligió al azar un 2% de la
totalidad de las cajas servidas con el medio de cultivo y se llevaron a
incubación durante 48 horas a 35 ± 1° C. Posteriormente se observó el
aspecto y se comprobó la esterilidad, ya que no hubo crecimiento de
ningún microorganismo en las cajas de los respectivos medios de cultivo,
permitiendo utilizar satisfactoriamente las cajas de petri con los medios de
cultivo. Este control se realizó cada vez que se preparaban medios para
las diferentes pruebas llevadas a cabo.
Control de pH a 25° C: el control del pH de los medios de cultivo
preparados después de la esterilización es esencial, esta única
comprobación podría ser suficiente, siempre y cuando el proceso de
esterilización esté bajo control (Lightfoot & Maier, 2002). Para esto, se
tomó una muestra del medio de cultivo estéril y con un pH-metro se
realizó una medición del medio a una temperatura de 25° C. El valor de
pH obtenido para el medio de cultivo agar Bacillus cereus de la casa
comercial Scharlau con lote 14800, fue de 6.82 (anexo 2), el cual
corresponde con el indicado en la ficha técnica del medio, donde se da un
intervalo de aceptación de ± 0.2. El valor de pH obtenido para el medio de
cultivo agar Baird Parker de la casa comercial Oxoid con lote 464615, fue
de 6.62 (anexo 2), que corresponde con el indicado en la ficha técnica del
medio donde se da un intervalo de aceptación de ± 0.2 (Allaert & Escolá,
2002).
Control macroscópico: se realizó un examen visual para poder descartar
cualquier error importante en la preparación de los medios. Se observó
que su consistencia (sólida), su respectivo color y aspecto corresponden
con los que indica la ficha técnica de estos (Allaert & Escolá, 2002). La
37
caducidad y las condiciones de conservación forman parte de la
documentación que acompañe a la preparación de los medios de cultivo
(Lightfoot & Maier, 2002). Para esto, se revisó la fecha de caducidad de
los medios de cultivo utilizados, y después de la preparación, cada caja
con el medio se etiquetó adecuadamente y estas se almacenaron a 4° C
por periodos no mayores a 8 días.
Método ecométrico: el control de la calidad rutinario de medios de cultivo
ya preparados suele ser considerado como superfluo dado que los lotes
de medios de cultivo deshidratados se controlan en fábrica y el proceso
de preparación también suele estar perfectamente controlado. Sin
embargo, dada la variabilidad debida a pequeños errores en la
preparación de medios de cultivo, es recomendable realizar un control
antes de la utilización de un lote de medio de cultivo, el cual puede
efectuarse mediante el método ecométrico (Lightfoot & Maier, 2002).
Se considera valida cualquier estría que crezca más del 25% de la línea.
Cada estría tiene un valor de 0.2 y la estría central un valor de 1, es decir,
que el crecimiento máximo que se puede presentar es de 5 ((0.2 * 20) + 1
= 5), por lo que se debe multiplicar el número de estrías que presentaron
crecimiento por 0.2 y sumar 1 en caso de que se haya presentado
crecimiento en la estría central, obteniendo así, el índice de crecimiento
absoluto (ICA) (Tortora, 1993).
El ICA va a determinar el grado de selectividad y productividad del medio
según el caso. El ICA obtenido del medio prueba (caja 1) va a determinar
la productividad del medio: ICA = 4.5 – 5, medios altamente productivos,
ICA = 2.5 – 4.5, medios medianamente productivos, ICA < 2.5, medios
poco productivos, ICA = 0, medios no productivos (Tortora, 1993).
El ICA resultante del interferente (caja 2) evalúa la selectividad, por lo que
a mayor selectividad, menor será el ICA: ICA = 0, medios altamente
38
selectivos, ICA = 0 – 2.5, medios medianamente selectivos, ICA > 2.5,
medios no selectivos (Tortora, 1993).
Se debe llevar a cabo un control en un medio nutritivo o enriquecido para
determinar que el microorganismo de estudio no tiene ningún problema
para crecer. Por otra parte el ICA obtenido en la caja 3 o de control debe
ser muy similar al ICA de la caja 1, lo cual quiere decir que el
microorganismo de prueba, no presenta ningún problema de crecimiento y
la cepa resulta viable para el estudio, dándole así validez a la prueba
(Tortora, 1993).
El índice de crecimiento relativo (ICR) determina la capacidad que tiene el
medio de prueba de recuperar la flora de una muestra determinada, frente
a un medio nutritivo como lo es el del control. El ICR se obtiene de la
división del ICA prueba / ICA control y al ser crecimientos similares el
valor debe estar por encima de 0.95 a 1, es decir, la prueba solo tiene
validez si existe por lo menos un crecimiento del 95 – 100% (Tortora,
1993).
Este control se efectuó para comprobar la eficacia del medio de cultivo
luego de someter las cajas a su respectivo periodo de incubación y se
observó el crecimiento en cada una de las líneas sembradas. Al inicio del
estudio se realizó la evaluación de productividad y selectividad para el
medio de cultivo agar Bacillus cereus Scharlau lote batch 14800 y se
obtuvieron los siguientes resultados (tabla 1):
Tabla 1. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al inicio del estudio.
MEDIO DE CULTIVO
Prueba ecométrico
Medio de cultivo
Agar Bacillus cereus
Prueba
Interferente
Agar Bacillus cereus
Control
Agar Tripticasa soya
Microorganismo
Bacillus cereus
ATCC 11778
Escherichia coli
ATCC 8739
Bacillus cereus
ATCC 11778
Fuente: Autor
39
ICA
3.8
ICR
0
0.95
4
Como prueba complementaria, al finalizar el estudio se realizó una
evaluación de productividad y selectividad del mismo medio de cultivo, y
se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 2):
Tabla 2. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al finalizar el estudio.
MEDIO DE CULTIVO
Prueba ecométrico
Medio de cultivo
Agar Bacillus cereus
Prueba
Interferente
Agar Bacillus cereus
Control
Agar Tripticasa soya
Microorganismo
Bacillus cereus
ATCC 11778
Escherichia coli
ATCC 8739
Bacillus cereus
ATCC 11778
ICA
5
ICR
0
1.0
5
Fuente: Autor
Figura 1.
Método ecométrico agar
Bacillus cereus Scharlau (Prueba).
Fuente: Autor
Figura 2.
Método ecométrico agar
Bacillus cereus Scharlau
(Interferente).
Fuente: Autor
Fuente:
Figura 3. Método ecométrico
agar TSA (control).
Fuente: Autor
40
También se realizó la evaluación de productividad y selectividad mediante
método ecométrico para el medio de cultivo agar Baird Parker Oxoid lote
464615 y se obtuvieron los siguientes resultados al iniciar el estudio (tabla
3):
Tabla 3. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al inicio del estudio.
MEDIO DE CULTIVO
Prueba ecométrico
Medio de cultivo
Prueba
Agar Baird Parker
Interferente
Control
Agar Baird Parker
Agar Tripticasa soya
Microorganismo
Staphylococcus
aureus
ATCC 6538
Escherichia coli
ATCC 8739
Staphylococcus
aureus
ATCC 6538
ICA
ICR
4.6
0
1.0
4.6
Fuente: Autor
Igualmente, se realizó una evaluación de productividad y selectividad del
mismo medio de cultivo al finalizar el estudio, y se obtuvieron los
siguientes resultados (tabla 4):
Tabla 4. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al finalizar el estudio.
MEDIO DE CULTIVO
Prueba ecométrico
Medio de cultivo
Prueba
Agar Baird Parker
Interferente
Control
Agar Baird Parker
Agar Tripticasa soya
Microorganismo
Staphylococcus
aureus
ATCC 6538
Escherichia coli
ATCC 8739
Staphylococcus
aureus
ATCC 6538
Fuente: Autor
Figura 4. Método ecométrico agar
Baird Parker Oxoid (Prueba).
Fuente: Autor
41
ICA
ICR
5
0
5
1.0
Figura 5. Método ecométrico
Agar Baird Parker Oxoid
(Interferente).
Fuente: Autor
Figura 6. Método ecométrico
agar TSA (control).
Fuente: Autor
El medio de cultivo agar Bacillus cereus para detectar Bacillus cereus en
muestras de alimentos de Scharlau, demostró ser al inicio del estudio un
medio medianamente productivo ya que presentó un ICA de 3.8. Sin
embargo, es un medio altamente selectivo ya que presentó un ICA de
interferencia de 0, lo que quiere decir que se presentó inhibición del
microorganismo interferente. Por otra parte, el valor de ICR fue de 0.95, lo
cual refleja la capacidad que tiene el medio de recuperar la flora y la
viabilidad del microorganismo (Tortora, 1993).
Por otro lado, en el ensayo realizado al finalizar el estudio se demostró
que este medio de cultivo es altamente productivo (ICA = 5) y altamente
selectivo (ICA = 0), además se obtuvo un ICR = 1, lo cual confirma lo
descrito anteriormente sobre la capacidad de este medio para recuperar
el microorganismo evaluado.
42
Según los resultados obtenidos en el método ecométrico realizado al
iniciar el estudio, se encontró que el agar Baird Parker de Oxoid es un
medio de cultivo altamente productivo, pues presentó un ICA de 4.6. Así
mismo, este medio presentó un ICA de interferencia de 0, demostrando
que es altamente selectivo, ya que se logró la inhibición del
microorganismo aquí evaluado. De la misma manera, se obtuvo un ICR
de 1, valor que demuestra la capacidad que tiene este medio de recuperar
los microorganismos, además de demostrar que el microorganismo de
prueba no presenta ningún problema de crecimiento y la cepa resulta
viable para el estudio, dándole así validez a la prueba (Tortora, 1993).
Por otro lado, con el método ecométrico realizado al finalizar el estudio se
demostró que este medio de cultivo es altamente productivo (ICA = 5) y
altamente selectivo (ICA = 0), además se obtuvo un ICR = 1, lo cual
confirma lo descrito anteriormente sobre la capacidad de este medio para
recuperar el microorganismo evaluado.
6.2 Verificación del control de equipos
Para el presente estudio es de relevancia considerar que los equipos de
medida y ensayo utilizados a diario en el laboratorio, y que tengan un
efecto sobre la exactitud o validez de los ensayos, se deberán encontrar
calibrados, además de poseer un adecuado mantenimiento. Es importante
que el laboratorio emplee métodos y procedimientos apropiados para
todos los ensayos y/o calibraciones, ya que el laboratorio debe equiparse
con todos los elementos que garanticen un margen de trazabilidad en las
medidas que se realizan durante su utilización dentro de la ejecución del
análisis o método microbiológico y así avalar los resultados de las
pruebas (Romero, 2005), (Soler, 2006).
El laboratorio debe en este caso, tener presente programas de
mantenimiento y calibración; calibrar y revisar el equipo antes de ponerse
43
en servicio con el fin de establecer si reúne los requisitos de las
especificaciones del laboratorio y si cumple las especificaciones de
normatividad pertinentes; plantear un programa de revisión periódica de
dichos equipos de conformidad con las disposiciones del laboratorio,
acorde con la normatividad vigente (Soler, 2006).
Todos los procedimientos para la calibración y uso de los equipos deben
estar en orden, asimismo se especificará cada verificación que se deba
efectuar antes de su empleo en el laboratorio. Igualmente, todos los
equipos deben ser registrados con la indicación de la frecuencia de
mantenimiento así como de las operaciones que comporta este y el
responsable de su realización (Lightfoot & Maier, 2002).
Al iniciar el proceso de validación se revisó el historial de los equipos
involucrados en el estudio incluyendo certificados de calibración,
mantenimiento y registros de su uso en los últimos meses, en los que se
verificó que presentaran características apropiadas para su utilización
como las descritas anteriormente (anexo 3).
6.3 Control de ambientes
Para llevar a cabo el control de ambientes, se empleó la técnica de
sedimentación en placa, colocando cajas abiertas con medio de cultivo
para microorganismos mesófilos (TSA) y para hongos y levaduras
(Sabouraud) en diferentes puntos del cuarto de siembra durante un
periodo de 15 minutos. Estas cajas se llevaron a incubar a una
temperatura de 35 ± 2° C durante 48 horas para mesófilos y a 22 ± 2° C
durante 5 días para hongos y levaduras. Este control se realizó durante
todas las pruebas realizadas, encontrando los siguientes recuentos de
mesófilos y de hongos y levaduras (tabla 5):
44
Tabla 5. Recuento del control de ambientes.
Recuento de Mesófilos en
UFC / 15 min. de exposición
Control de calidad de
medios de cultivo
Prueba de repetibilidad
Prueba de reproducibilidad
(diferentes horas)
0
Recuento de Hongos y
levaduras
en UFC / 15 min. de exposición
0
3
0
8:00 a.m.
0
0
12:00 m
1
0
4:00 p.m.
Prueba de reproducibilidad
(diferentes analistas)
4
1
1
4
Prueba realizada
Fuente: Autor
Los resultados obtenidos para el control de ambientes del área de
siembra en donde se llevaron a cabo las diferentes pruebas indican la
baja carga de microorganismos presentes en el ambiente, lo que permite
deducir que se realizó una correcta limpieza de esta área, que no permitió
la proliferación de microorganismos en el ambiente que pudieran aportar
contaminación alguna a las diferentes pruebas realizadas.
6.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en
superficie
Para llevar a cabo el proceso de validación de las técnicas de recuento en
placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus se
evaluaron los parámetros de repetibilidad y reproducibilidad intralaboratorio de estas técnicas que se realizan a diario en el laboratorio
para el análisis de alimentos que puedan contener estos microorganismos
indicadores,
que
determinen
la
posibilidad
de
la
existencia
de
microorganismos causantes de intoxicaciones o de otros riesgos
asociados con el crecimiento microbiano (Hayes, 1993).
Para la evaluación de repetibilidad, se realizaron los respectivos métodos
bajo igualdad de condiciones, en cuatro diferentes tipos de alimentos;
teniendo en cuenta que la repetibilidad es el parámetro que evalúa el
45
grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del
mismo elemento, realizadas bajo las mismas condiciones (GTC 84, 2003).
Para la evaluación de reproducibilidad intra-laboratorio, se realizaron los
respectivos métodos variando las condiciones de realización del método
(hora de realización y analistas), en cuatro diferentes tipos de alimentos,
ya que la reproducibilidad se define como el grado de concordancia entre
los resultados de las mediciones en el mismo elemento bajo condiciones
de medición alteradas (GTC 84, 2003), garantizando que el laboratorio es
capaz de producir resultados constantes a lo largo del tiempo (Lightfoot &
Maier, 2002).
Para reconocer el grado de concordancia de los métodos validados, se
llevó a cabo el estudio mediante estadística deductiva en la que se evaluó
tanto la repetibilidad como la reproducibilidad de las técnicas, y esto se
realizó mediante el análisis de coeficientes de variación y mediante el
análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.
La metodología para realizar los análisis de alimentos en el laboratorio se
llevó a cabo de acuerdo al protocolo descrito por Holguín et al., (1998).
Se tomaron muestras de alta influencia en el laboratorio y las más
susceptibles a contaminación por S. aureus (leche cruda) y por B. cereus
(albahaca). Además, se tomaron dos muestras que se sabe que
presentan bajos recuentos de S. aureus y B. cereus, tales como carne
cocida y arroz cocido, respectivamente, con las cuales se realizó el
estudio de validación secundaria del método de recuento en placa en
superficie de Staphylococcus aureus y Bacillus cereus.
Por otro lado, para realizar cada uno de los recuentos se usó lo estipulado
en la NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales.
Reglas generales para el análisis microbiológico (NTC 4092, 1997).
N=
∑C
V [(n1+0.1*n2)*d]
46
Donde:
∑C: es la suma de las colonias contadas en todas las cajas de petri que
contienen dos diluciones sucesivas.
V: es el volumen del inóculo aplicado a cada caja, en mililitros.
n1: es el número de cajas retenidas en la segunda dilución.
n2: es el número de cajas retenidas en la segunda dilución.
d: es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución retenida.
Una vez ha sido obtenido el recuento, se hace su equivalencia
redondeando el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto,
si la última cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica, si la última
cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad, y se
muestra el resultado en forma exponencial.
6.4.1 Ensayos de validación para Bacillus cereus
6.4.1.1 Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus
•
Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra que
presenta un alto recuento (albahaca).
En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra de
albahaca, se obtuvieron los siguientes recuentos (tabla 6):
47
Tabla 6. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie
de Bacillus cereus en una muestra de albahaca.
Repetición
1/10000
1/10000
1/10000
Promedio
1/100000
1/100000
1/100000
Promedio
Recuento
Según
NTC
4092
1
10
9
13
11
2
1
2
2
1121212
11 x 105
2
9
9
11
10
1
1
2
1
1000000
10 x 105
3
13
14
12
13
2
3
1
2
1363636
14 x 105
Fuente: Autor
La dispersión de un conjunto de observaciones se refiere a la variedad
que muestran estas. Una medida de dispersión conlleva información
respecto a la cantidad total de variabilidad presente en el conjunto de
datos. Si todos los valores son iguales, no hay dispersión, pero si no
todos son iguales, entonces existe dispersión en los datos. La magnitud
de la dispersión es pequeña cuando los valores, aunque diferentes, son
cercanos entre sí (Daniel, 1996).
Según los datos presentados en la tabla 6, se presenta una dispersión
aunque es de pequeña magnitud, ya que los resultados que arrojaron las
repeticiones realizadas se encuentran dentro de un rango similar que
oscila entre las 10 x 105 y 14 x 105 UFC / g-ml de Bacillus cereus, lo que
permite ver la homogeneidad de los datos obtenidos entre repeticiones de
una misma prueba (figura 7).
Dispersión prueba repetibilidad
Bacillus cereus
UFC / g-ml
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Num ero de repeticiones
Figura 7. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del
recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca. Fuente: Autor
48
En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus se obtuvo un
considerable crecimiento de este microorganismo aislado a partir de una
muestra de albahaca sobre el agar Bacillus cereus, en donde se evidenció
la morfología típica de las colonias (figura 8), que luego fue confirmada
por medio de una coloración de Gram, en la cual se obtuvieron bacilos
Gram positivos, comprobando así la presencia de este microorganismo en
la muestra de albahaca analizada. Asimismo, se realizó una confirmación
bioquímica de estas colonias por medio del kit de identificación rápida de
microorganismos Gram positivos BBL Crystal, con el cual se confirmó, con
un 99% de confianza (anexo 4), de que se trataba de Bacillus cereus
(figura 9).
Figura 8. Crecimiento de Bacillus cereus
en la prueba de repetibilidad. Fuente: Autor
Figura 9. Confirmación bioquímica de
Bacillus cereus con BBL Crystal. Fuente: Autor
49
Por otra parte, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y
coeficiente de variación para este ensayo, y se obtuvieron los resultados
presentados en la tabla 7; además, se realizó un análisis de varianza en
donde se establecieron los limites para un intervalo de confianza de 95%
(tabla 8).
Tabla 7. Análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación prueba
repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca.
Repetición
Promedio
1/10000
Promedio
1/100000
Recuento
1
11
3
1121212
2
10
3
1000000
3
13
5
1363636
X
V
SD
CV
Según NTC
4092
11 x 105
12 x 105
3,86111111
185154,574
15,9393937
10 x 105
14 x 105
Fuente: Autor
El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos
presentados para la prueba de repetibilidad realizada a la técnica de
recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de
albahaca. Dicho coeficiente de variación (16%) muestra que hay un alto
grado de concordancia entre los resultados obtenidos en las tres
repeticiones, ya que se presenta en un porcentaje inferior al 20%,
demostrando así la varianza relativa presentada entre las dos mediciones.
Tabla 8. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en
superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca.
N
Media
3
1161616
Desviación
estándar
185154,5735
Intervalo de confianza para
la media al 95%
Limite inferior
Limite superior
739791
1660209
Fuente: Autor
Se realizó el análisis de distribución para construir intervalos de confianza
y se obtuvieron los datos presentados en la tabla 9:
50
Tabla 9. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad recuento en placa en
superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca.
Variable 1
11,11111111
Media
Varianza
Variable 2
1,666666667
3,861111111
0,5
9
0
9
Observaciones
Diferencia hipotética de las medias
Grados de libertad
10
Estadístico t
13,56747704
P(T<=t) una cola
4,56821E-08
Valor crítico de t (una cola)
1,812461102
P(T<=t) dos colas
9,13642E-08
Valor crítico de t (dos colas)
2,228138842
Fuente: Autor
En la tabla anterior se presenta el valor de t (coeficiente de confiabilidad),
que es 4,56821 x 10-8, y se puede deducir que el análisis de la hipótesis
alternativa utilizando la prueba t confirma que el promedio de recuentos
de la dilución 10-4 es mayor que el promedio de los recuentos de la
dilución 10-5 (P<0,005) (P = 4. 56821 x 10-8), aceptando así la hipótesis
alternativa, para concluir que se presenta repetibilidad para la técnica de
recuento en placa en superficie de Bacillus cereus.
•
Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra que
presenta un bajo recuento (arroz cocido).
En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra de arroz
cocido, se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 10):
Tabla 10. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en
superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido.
Repetición
1/100
1/100
1/100
Promedio
1/1000
1/1000
1/1000
Promedio
Recuento
Según
NTC 4092
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
Fuente: Autor
51
Para llevar a cabo las pruebas de evaluación de los parámetros de
repetiblidad y reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en
superficie de B. cereus se realizó el ensayo con una muestra de arroz
cocido, en donde no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual
confirma lo que se esperaba para la muestra de arroz cocido analizada,
ya que este microorganismo no debe encontrarse en este alimento, pues
la presencia de B. cereus indica puntos críticos de contaminación que
pueden ir desde las materias primas que fueron utilizadas, errores de
manipulación durante el proceso de producción, hasta errores en el
proceso
de
cocción,
un
tratamiento
térmico
insuficiente
o
un
almacenamiento prolongado sin refrigeración, factores que pueden causar
intoxicaciones y otros riesgos asociados con el crecimiento microbiano
(Hayes, 1993).
Se presentaron datos homogéneos para las pruebas realizadas y la
evaluación de los parámetros establecidos, en la que la constante fue la
obtención en cada prueba de 0 UFC en la muestra (figura 10) y un
resultado de <100 UFC / g de Bacillus cereus a causa de las diluciones
trabajadas.
Figura 10. Prueba repetibilidad en arroz cocido. Fuente: Autor
52
6.4.1.2 Ensayos de reproducibilidad de Bacillus cereus
•
Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra que
presenta un alto recuento (albahaca) en diferentes tiempos (ensayo de
reproducibilidad 1).
En el ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de
albahaca, se obtuvieron los siguientes recuentos a las diferentes horas
analizadas (tabla 11):
Tabla 11. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una
muestra de albahaca en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1).
Tiempo
Repetición 1
8:00 a.m.
Repetición 2
8:00 a.m.
Repetición 3
8:00 a.m.
Repetición 1
12:00 p.m.
Repetición 2
12:00 p.m.
Repetición 3
12:00 p.m.
Repetición 1
4:00 p.m.
Repetición 2
4:00 p.m.
Repetición 3
4:00 p.m.
1/10000
1/10000
1/10000
Promedio
1/100000
1/100000
1/100000
Promedio
Recuento
Según
NTC 4092
24
22
25
24
2
2
4
3
2393939
24 x 105
26
22
24
24
3
2
2
2
2393939
24 x 105
20
22
21
21
2
1
1
1
2030303
20 x 105
22
27
25
25
2
4
2
3
2484848
25 x 105
25
25
23
24
3
2
2
2
2424242
24 x 105
25
21
23
23
3
2
1
2
2272727
23 x 105
23
21
24
23
2
2
3
2
2272727
23 x 105
22
20
20
21
2
1
1
1
2000000
20 x 105
20
25
23
23
1
3
2
2
2242424
22 x 105
Fuente: Autor
Según los valores presentados en la tabla 11, se presenta una dispersión
aunque es de pequeña magnitud, ya que los resultados que arrojaron las
repeticiones realizadas a las diferentes horas se encuentran dentro de un
rango similar que oscila entre las 20 x 105 y 25 x 105 UFC / g de Bacillus
cereus lo que permite ver la homogeneidad de los datos obtenidos (figura
11).
53
Dispersión prueba reproducibilidad diferentes horas
Bacillus cereus
Recuentos UFC / g-ml
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
0
0,5
1
1,5
2
Repeticiones
08:00 a.m.
12:00 m
2,5
3
3,5
04:00 p.m.
Figura 11. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de
Bacillus cereus a las diferentes horas analizadas. Fuente: Autor
En el ensayo de reproducibilidad 1 se obtuvo un notable crecimiento de
Bacillus cereus, el cual fue aislado a partir de una muestra de albahaca y
se evidenció la morfología típica de las colonias de este microorganismo
(figura 12), que posteriormente se confirmó mediante coloración de Gram,
en donde se obtuvieron bacilos Gram positivos, confirmando así la
morfología del microorganismo aislado.
Figura 12. Bacillus cereus en muestra de albahaca.
Prueba reproducibilidad 1. Fuente: Autor
Igualmente, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y
coeficiente de variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los
resultados presentados en la tabla 12; además, se realizó el análisis de la
54
prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los datos presentados
en la tabla 13.
Tabla 12. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de
la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus
cereus en albahaca evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1).
Tiempo
Repetición 1
8:00 a.m.
Repetición 2
8:00 a.m.
Repetición 3
8:00 a.m.
Repetición 1
12:00 p.m.
Repetición 2
12:00 p.m.
Repetición 3
12:00 p.m.
Repetición 1
4:00 p.m.
Repetición 2
4:00 p.m.
Repetición 3
4:00 p.m.
Promedio
1/10000
Promedio
1/100000
Recuento
24
3
2393939
24
2
2393939
21
1
2030303
20 x 105
25
3
2484848
25 x 105
24
2
2424242
23
2
2272727
23 x 105
23
2
2272727
23 x 105
21
1
2000000
23
2
2242424
X
V
SD
CV
Según
NTC 4092
24 x 105
23 x 105
3,86111111
24 x 105
22 x 105
3,5
3,5
209945,342
9,23759618
109259,02
4,56398514
149481,149
6,88308603
24 x 105
24 x 105
20 x 105
22 x 105
Fuente: Autor
El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos
presentados para la prueba de reproducibilidad a diferentes horas
realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus
cereus en una muestra de albahaca. Se obtuvieron coeficientes de
variación de 9.23% a la primera hora analizada (8:00 a.m.), 4.56% a la
segunda hora analizada (12:00 m) y 6.88% a la tercera hora analizada
(4:00 p.m.). Estos coeficientes de variación demuestran que hay un alto
grado de concordancia entre los resultados obtenidos en las diferentes
horas analizadas, ya que presentan un porcentaje inferior al 20%.
Tabla 13. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1
para Bacillus cereus en muestra de albahaca.
Repeticiones
Variable 1
Observaciones
9
Grados de libertad
8:00 a.m.
Estadístico t
11
28,68449058
P(T<=t) una cola
Valor crítico de t (una cola)
55
5,43E-12
1,795884814
Variable 1
Observaciones
9
Grados de libertad
12:00 m.
11
Estadístico t
31,52963125
P(T<=t) una cola
1,94019E-12
Valor crítico de t (una cola)
1,795884814
Variable 1
Observaciones
9
Grados de libertad
4:00 p.m.
11
Estadístico t
29,7562167
P(T<=t) una cola
3,64281E-12
Valor crítico de t (una cola)
1,795884814
Fuente: Autor
En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de
reproducibilidad a las 8:00 a.m. (5,43 x 10-12), a las 12 m. (1,94019 x 10-12)
y a las 4:00 p.m. (3,64281 x 10-12), en donde se puede deducir que el
análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el
promedio de recuentos de la dilución 10-4 es mayor que el promedio de
los recuentos de la dilución 10-5 (P<0,005) aceptando así la hipótesis
alternativa en los tres casos, para concluir que existe una reproducibilidad
para la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus.
Adicional a esto, se realizó un análisis de varianza de dos factores con
varias muestras por grupo y se obtuvieron los resultados presentados en
la tabla 14.
Tabla 14. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.
RESUMEN
dil 10-4
dil 10-5
Total
08:00 a.m.
Cuenta
3
3
6
Suma
71
8
79
Promedio
23,6666667
2,66666667
13,1666667
Varianza
2,33333333
1,33333333
133,766667
12:00 m.
Cuenta
3
3
6
Suma
74
8
82
Promedio
24,6666667
2,66666667
13,6666667
Varianza
6,33333333
1,33333333
148,266667
04:00 p.m.
Cuenta
3
3
6
Suma
68
7
75
Promedio
22,6666667
2,33333333
12,5
Varianza
2,33333333
0,33333333
125,1
56
Total
Cuenta
9
9
213
23
23,6666667
2,55555556
3,5
0,77777778
Suma
Promedio
Varianza
Fuente: Autor
•
Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra que
presenta un bajo recuento (arroz cocido) en diferentes tiempos
(ensayo de reproducibilidad 1).
En el ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de
arroz cocido, se obtuvieron los siguientes recuentos a las diferentes horas
analizadas (tabla 15):
Tabla 15. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en
superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado en diferentes
horas (ensayo de reproducibilidad 1).
Tiempo
Repetición
1
8:00 a.m.
Repetición
2
8:00 a.m.
Repetición
3
8:00 a.m.
Repetición
1
12:00 p.m.
Repetición
2
12:00 p.m.
Repetición
3
12:00 p.m.
Repetición
1
4:00 p.m.
Repetición
2
4:00 p.m.
Repetición
3
4:00 p.m.
1/100
1/100
1/100
Promedio
1/1000
1/1000
1/1000
Promedio
Recuento
Según
NTC 4092
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
Fuente: Autor
57
En este ensayo tampoco se encontró crecimiento de B. cereus, lo cual
confirma lo que se esperaba para la muestra de arroz cocido analizada,
pues, como se mencionó anteriormente, este microorganismo no debe
encontrarse en este alimento porque puede causar graves intoxicaciones.
Se presentaron datos semejantes para las pruebas realizadas y la
evaluación de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada
prueba 0 UFC en la muestra (figura 13) y un resultado de <100 UFC / g de
Bacillus cereus.
Figura 13. Prueba reproducibilidad 1 en arroz cocido. Fuente: Autor
•
Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de
albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
En el ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de
albahaca, se obtuvieron los siguientes recuentos para los diferentes
analistas (tabla 16):
58
Tabla 16. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una
muestra de albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
Analista 2
Repetición 1
Analista 2
Repetición 2
Analista 2
Repetición 3
Analista 3
Repetición 1
Analista 3
Repetición 2
Analista 3
Repetición 3
1/10000
1/10000
Promedio
1/100000
1/100000
1/100000
Promedio
Recuento
Según
4092
18
16
15
16
2
1
1
1
1606060
16 x 105
15
17
15
16
1
2
1
1
1545454
15 x 105
10
14
16
13
1
1
2
1
1333333
13 x 105
12
14
9
12
1
2
2
2
1212121
12 x 105
11
10
14
12
1
1
2
1
1181818
12 x 105
15
16
10
14
1
2
1
1
1363636
14 x 105
13
14
10
12
1
2
1
1
1242424
12 x 105
12
13
15
13
1
3
2
2
1393939
14 x 105
18
15
12
15
2
2
1
2
1515151
15 x 105
Fuente: Autor
De acuerdo con los valores presentados en la tabla 16, se presenta una
dispersión aunque es de pequeña magnitud, ya que los resultados que
arrojaron las repeticiones realizadas a las diferentes horas se encuentran
dentro de un rango similar que oscila entre 12 x 105 y 16 x 105 UFC / g de
Bacillus cereus, lo que permite ver la homogeneidad de los datos
obtenidos (figura 14).
Dispersión prueba de reproducibilidad diferentes
analistas Bacillus cereus
1800000
1600000
Recuentos UFC /g - ml
Analista 1
Repetición 1
Analista 1
Repetición 2
Analista 1
Repetición 3
1/10000
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
0
0,5
1
1,5
2
Repeticiones
Analista 1
Analista 2
2,5
3
3,5
Analista 3
Figura 14. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de
Bacillus cereus realizado por diferentes analistas. Fuente: Autor
59
En el ensayo de reproducibilidad 2 se observó el crecimiento de Bacillus
cereus, aislado a partir de una muestra de albahaca, en donde se logró
evidenciar la morfología típica de sus colonias (figura 15), las cuales
fueron sometidas a coloración de Gram, y se confirmó la presencia de
este microorganismo, pues se observaron bacilos Gram positivos.
Figura 15. Bacillus cereus en muestra de albahaca.
Prueba reproducibilidad 2. Fuente: Autor
También, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y
coeficiente de variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los
resultados presentados en la tabla 17; además, se realizó el análisis de
prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los datos presentados
tabla 18:
Tabla 17. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de
la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus
cereus en albahaca evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
Analista 1
Repetición 1
Analista 1
Repetición 2
Analista 1
Repetición 3
Analista 2
Repetición 1
Analista 2
Repetición 2
Analista 2
Repetición 3
Promedio
1/10000
Promedio
1/100000
Recuento
16
1
1606060
16
1
1545454
13
1
1333333
13 x 105
12
2
1212121
12 x 105
12
1
1181818
14
1
1363636
X
V
SD
CV
Según
NTC 4092
16 x 105
15 x 105
12 x 105
5,11111111
6,25
143206,391
97410,5163
9,57934959
7,7771315
15 x 105
12 x 105
14 x 105
60
Analista 3
Repetición 1
Analista 3
Repetición 2
Analista 3
Repetición 3
12
1
1242424
13
2
1393939
15
2
1515151
12 x 105
14 x 105
5,27777778
136643,795
9,8742624
14 x 105
15 x 105
Fuente: Autor
El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos
presentados para la prueba de reproducibilidad con diferentes analistas
realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus
cereus en una muestra de albahaca. Se obtuvieron coeficientes de
variación de 9.57% (analista 1), 7.77% (analista 2) y 9.87% (analista 3).
Estos coeficientes de variación demuestran que hay un alto grado de
concordancia entre los resultados obtenidos entre los diferentes analistas,
ya que presentan un porcentaje inferior al 20%.
Tabla 18. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2
para Bacillus cereus en muestra de albahaca.
Analistas
Variable 1
Observaciones
9
Grados de libertad
1
Estadístico t
9
17,85143062
P(T<=t) una cola
1,23394E-08
Valor crítico de t (una cola)
1,833112923
Variable 1
Observaciones
9
Grados de libertad
2
Estadístico t
9
12,78563023
P(T<=t) una cola
2,23918E-07
Valor crítico de t (una cola)
1,833112923
Variable 1
Observaciones
Grados de libertad
3
Estadístico t
9
10
14,83823025
P(T<=t) una cola
1,94005E-08
Valor crítico de t (una cola)
1,812461102
Fuente: Autor
En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de
reproducibilidad variando los analistas. Analista 1 (1,23394 x 10-8),
analista 2 (2,23918 x 10-7) y analista 3 (1.94005 x 10-8), en donde se
puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la
prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-4 es
61
mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-5 (P<0,005),
aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que
existe una reproducibilidad intra-laboratorio para la técnica de recuento en
placa en superficie de Bacillus cereus.
Adicional a esto, se realizó un análisis de varianza de dos factores con
varias muestras por grupo y se obtuvieron los resultados presentados en
la tabla 19.
Tabla 19. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.
dil 10-4
RESUMEN
dil 10-5
Total
Analista 1
Cuenta
3
3
6
Suma
49
4
53
Promedio
16,33333333 1,333333333 8,833333333
Varianza
2,333333333 0,333333333 68,56666667
Analista 2
Cuenta
3
3
6
Suma
35
5
40
Promedio
11,66666667 1,666666667 6,666666667
Varianza
6,333333333 0,333333333 32,66666667
Analista 3
Cuenta
3
3
6
Suma
37
4
41
Promedio
12,33333333 1,333333333 6,833333333
Varianza
4,333333333 0,333333333 38,16666667
Total
Cuenta
Suma
9
9
121
13
Promedio
13,44444444 1,444444444
Varianza
8,027777778 0,277777778
Fuente: Autor
•
Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de
arroz cocido, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
En el ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de
arroz cocido, al realizarse por diferentes analistas, se obtuvieron los
siguientes resultados (tabla 20):
62
Tabla 20. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en
superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado por diferentes
analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
Analista 1
Repetición 1
Analista 1
Repetición 2
Analista 1
Repetición 3
Analista 2
Repetición 1
Analista 2
Repetición 2
Analista 2
Repetición 3
Analista 3
Repetición 1
Analista 3
Repetición 2
Analista 3
Repetición 3
1/100
1/100
1/100
Promedio
1/1000
1/1000
1/1000
Promedio
Recuento
Según
4092
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
Fuente: Autor
En esta prueba no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual
confirma lo que se esperaba para la muestra de arroz cocido analizada,
pues, como se ha mencionado, este microorganismo no debe poder
aislarse de este alimento ya que puede causar graves intoxicaciones.
Se presentaron los mismos valores en las pruebas realizadas y la
evaluación de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada
prueba 0 UFC en la muestra (figura 16) y un resultado de <100 UFC / g de
Bacillus cereus.
Figura 16. Prueba reproducibilidad 2 en arroz cocido. Fuente: Autor
63
6.4.2 Ensayos de validación para Staphylococcus aureus coagulasa
positiva
6.4.2.1 Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa
positiva
•
Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
en una muestra que presenta un alto recuento (leche cruda).
En el ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra de
leche cruda, se obtuvieron los siguientes recuentos (tabla 21):
Tabla 21. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en
superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda.
Repetición
1/1000
1/1000
1/1000
Promedio
1/10000
1/10000
1/10000
Promedio
Recuento
Según
NTC 4092
1
5
6
8
6
1
0
0
0
60606
60 x 103
2
5
5
7
6
0
1
1
1
57575
57 x 103
3
4
5
6
5
1
0
2
1
54545
54 x 103
Fuente: Autor
La estadística se ocupa de la dispersión de la distribución, es decir, si los
datos aparecen sobre todo alrededor de la media o si están distribuidos
por todo el rango. Una medida de dispersión conlleva información
respecto a la cantidad total de variabilidad presente en el conjunto de
datos. Si todos los valores son iguales, no hay dispersión, pero si no
todos son iguales, entonces existe dispersión en los datos. La magnitud
de la dispersión es pequeña cuando los valores, aunque diferentes, son
cercanos entre si (Daniel, 1996).
Acorde con los resultados presentados en la tabla 21, se puede deducir
que existe dispersión en los datos ya que todos los valores no son
iguales, y tampoco son muy parecidos; por lo tanto, no existe una
homogeneidad de los datos obtenidos entre repeticiones de una misma
prueba (figura 17).
64
Dispersión prueba repetibilidad
Staphylococcus aureus
63000
UFC / g-ml
62000
61000
60000
59000
58000
57000
56000
55000
54000
53000
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Num ero de repeticiones
3
3,5
Figura 17. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del
recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda. Fuente: Autor
En el ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus se obtuvo un
apropiado crecimiento de este microorganismo aislado a partir de una
muestra de leche cruda sobre el agar Baird Parker, en donde se evidenció
la morfología típica de las colonias (figura 18), que posteriormente fueron
confirmadas por medio de coloraciones de Gram, en las cuales se
encontraron cocos Gram positivos, demostrando así la presencia de este
microorganismo en la muestra de leche cruda estudiada.
Por otro lado, se realizó la confirmación de S. aureus coagulasa positiva
con el kit Slidex Staph plus, depositando una gota del reactivo anti - S.
aureus y una gota del reactivo control sobre la lámina, luego se tomó una
colonia
sospechosa y se
emulsificó en
los
reactivos.
Pasados
aproximadamente 30 segundos se observó la aglutinación mediante
combinación de látex y células rojas sanguíneas, confirmando así la
reacción positiva de coagulasa. Esta confirmación se realizó a todas las
colonias presuntivas de S. aureus en los diferentes ensayos llevados a
cabo durante el estudio (figura 19). Igualmente, se realizó una
confirmación bioquímica de las colonias presuntivas de S. aureus por
medio del kit de identificación rápida de microorganismos Gram positivos
BBL Crystal, con el cual se confirmó, con un 99% de confianza (anexo 4),
de que se trataba de Staphylococcus aureus (figura 20).
65
Figura 18. Staphylococcus aureus en muestra de
leche cruda en la prueba de repetibilidad. Fuente: Autor
Figura 19. Confirmación de Staphylococcus aureus
coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus. Fuente: Autor
Figura 20. Confirmación bioquímica de
Staphylococcus aureus con BBL Crystal. Fuente: Autor
Se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de
variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los resultados
presentados en la tabla 22; además, se realizó un análisis de varianza en
donde se establecieron los limites para un intervalo de confianza de 95%
(tabla 23).
66
Tabla 22. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación
prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en
leche cruda.
Repetición
Promedio
1/1000
Promedio
1/10000
Recuento
1
6
0
60606
2
6
1
57575
3
5
1
54545
X
V
SD
CV
Según
NTC 4092
60 x 103
57 x 103
3030,50001
1,5
5,26353881
57 x 103
54 x 103
Fuente: Autor
El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos
presentados para la prueba de repetibilidad realizada a la técnica de
recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una
muestra de leche cruda. Dicho coeficiente de variación (5.3%) muestra
que hay un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos en
las tres repeticiones, ya que se presenta en un porcentaje inferior al 20%.
Tabla 23. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en
superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda.
N
Media
Desviación
estándar
3
57575
3030,50001
Intervalo de confianza para
la media al 95%
Limite inferior
Limite superior
49468
64532
Fuente: Autor
Se realizó el análisis de distribución para construir intervalos de confianza
y se obtuvieron los datos presentados en la tabla 24:
Tabla 24. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad para
Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda.
Variable 1
5,666666667
Media
Varianza
Observaciones
Diferencia hipotética de las medias
Grados de libertad
Variable 2
0,666666667
1,5
0,5
9
0
9
13
Estadístico t
10,60660172
P(T<=t) una cola
4,52372E-08
Valor crítico de t (una cola)
1,770933383
P(T<=t) dos colas
9,04745E-08
Valor crítico de t (dos colas)
2,160368652
Fuente: Autor
67
En la anterior tabla se presenta el valor de t (4,52372 x 10-8), en la cual se
puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la
prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-3 es
mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005) (P =
4,52372 x 10-8), aceptando así la hipótesis alternativa, para concluir que
se presenta repetibilidad para la técnica de recuento en placa en
superficie de Staphylococcus aureus.
•
Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
en una muestra que presenta un bajo recuento (carne cocida).
En el ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra
de carne cocida, se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 25):
Tabla 25. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en
superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida.
Repetición
1/100
1/100
1/100
Promedio
1/1000
1/1000
1/1000
Promedio
Recuento
Según
NTC 4092
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
Fuente: Autor
Para llevar a cabo las pruebas de evaluación de los parámetros de
repetiblidad y reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en
superficie de S. aureus coagulasa positiva se realizó el ensayo con una
muestra de carne cocida, en la cual no se encontró crecimiento alguno de
este microorganismo, lo cual confirma lo esperado para la muestra de
carne cocida analizada, ya que este microorganismo no debe encontrarse
en este alimento, pues su presencia se interpreta como indicativo de
contaminación a partir de la piel, la boca y las fosas nasales de los
manipuladores de alimentos, y cuya intoxicación alimentaria estafilocócica
es un síndrome caracterizado por nauseas, vómitos, diarrea, malestar y
68
debilidad general, que comienzan a manifestarse de 1 a 6 horas después
de consumido el alimento (ICMSF, 2000).
Se presentaron datos homogéneos para las pruebas realizadas y la
evaluación de los parámetros establecidos, en la que la constante fue la
obtención en cada prueba de 0 UFC en la muestra (figura 21) y un
resultado de <100 UFC / g de Staphylococcus aureus a causa de las
diluciones trabajadas.
Figura 21. Prueba repetibilidad en carne cocida. Fuente: Autor
6.4.2.2 Ensayos de reproducibilidad de Staphylococcus aureus
coagulasa positiva
•
Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa
positiva en una muestra que presenta un alto recuento (leche cruda)
en diferentes tiempos (ensayo de reproducibilidad 1).
En el ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una
muestra de leche cruda, se obtuvieron los siguientes recuentos a las
diferentes horas analizadas (tabla 26):
69
Tabla 26. Resultados recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una
muestra de leche cruda a las diferentes horas evaluadas (ensayo de reproducibilidad 1).
Repetición 1
8:00 a.m.
Repetición 2
8:00 a.m.
Repetición 3
8:00 a.m.
Repetición 1
12:00 p.m.
Repetición 2
12:00 p.m.
Repetición 3
12:00 p.m.
Repetición 1
4:00 p.m.
Repetición 2
4:00 p.m.
Repetición 3
4:00 p.m.
1/1000
1/1000
1/1000
Promedio
1/10000
1/10000
1/10000
Promedio
Recuento
Según
NTC 4092
4
3
5
4
1
1
0
1
42424
42 x 103
5
6
4
5
1
1
1
1
54545
54 x 103
3
5
2
3
1
1
1
1
39393
40 x 103
4
3
7
5
0
2
1
1
51515
51 x 103
3
3
5
4
1
1
1
1
42424
42 x 103
6
5
4
5
1
0
0
0
48484
48 x 103
5
3
5
4
1
0
1
1
45454
45 x 103
4
6
5
5
1
2
0
1
54545
54 x 103
7
3
6
5
0
1
0
0
51515
51 x 103
Fuente: Autor
Según los resultados presentados en la tabla 26, se presenta una
dispersión, en los valores ya que los resultados que arrojaron las
repeticiones realizadas a las diferentes horas no son iguales y tampoco
parecidos; por lo tanto, no existe una semejanza de los datos obtenidos
entre repeticiones de una misma prueba (figura 22).
Dispersión prueba reproducibilidad diferentes horas
Staphylococcus aureus
60000
Recuento UFC / g-ml
Tiempo
50000
40000
30000
20000
10000
0
0
0,5
1
1,5
2
Repeticiones
08:00 a.m.
12:00 m.
2,5
3
3,5
04:00 p.m.
Figura 22. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de
Staphylococcus aureus a las diferentes horas analizadas. Fuente: Autor
70
En el ensayo de reproducibilidad 1 se obtuvo un notable crecimiento de
Staphylococcus aureus, el cual fue aislado a partir de una muestra de
leche cruda y se evidenció la conformación típica de las colonias de este
microorganismo (figura 23). Posteriormente se realizó una coloración de
Gram a las colonias características de S. aureus, obteniendo cocos Gram
positivos agrupados en racimos, lo que confirma así la morfología del
microorganismo aislado.
Figura 23. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda.
Prueba reproducibilidad 1. Fuente: Autor
Por otro lado, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y
coeficiente de variación para el ensayo de reproducibilidad 1, en donde se
obtuvieron los resultados presentados en la tabla 27; además, se realizó
el análisis de la prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los
datos presentados en la tabla 28:
Tabla 27. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de
la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de
Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado en diferentes horas
(ensayo de reproducibilidad 1).
Tiempo
Repetición 1
8:00 a.m.
Repetición 2
8:00 a.m.
Repetición 3
8:00 a.m.
Repetición 1
12:00 p.m.
Repetición 2
12:00 p.m.
Repetición 3
12:00 p.m.
Promedio
1/1000
Promedio
1/10000
Recuento
4
1
42424
5
1
54545
3
1
39393
40 x 103
5
1
51515
51 x 103
4
1
42424
5
0
48484
X
V
SD
CV
Según
NTC 4092
42 x 103
45 x 103
47 x 103
1,61111111
2,02777778
8017,57139
4628,8379
17,6388687
9,75019043
54 x 103
42 x 103
48 x 103
71
Repetición 1
4:00 p.m.
Repetición 2
4:00 p.m.
Repetición 3
4:00 p.m.
4
1
45454
5
1
54545
5
0
51515
45 x 103
50 x 103
1,86111111
4628,947
9,16538472
54 x 103
51 x 103
Fuente: Autor
El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos
presentados para la prueba de reproducibilidad a diferentes horas
realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de
Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. Se obtuvieron
coeficientes de variación de 17.63% a la primera hora analizada (8:00
a.m.), 9.75% a la segunda hora analizada (12:00 m) y 9.16% a la tercera
hora analizada (4:00 p.m.). Estos coeficientes de variación demuestran
que hay un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos en
las diferentes horas analizadas, ya que presentan un porcentaje inferior al
20%.
Tabla 28. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1
para Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda.
Repeticiones
Variable 1
Observaciones
9
Grados de libertad
8:00 a.m.
9
Estadístico t
7,36600737
P(T<=t) una cola
2,1271E-05
Valor crítico de t (una cola)
1,83311292
Variable 1
Observaciones
9
Grados de libertad
12:00 m.
Estadístico t
11
6,99598601
P(T<=t) una cola
1,1408E-05
Valor crítico de t (una cola)
1,79588481
Variable 1
Observaciones
9
Grados de libertad
4:00 p.m.
Estadístico t
12
8,2433574
P(T<=t) una cola
1,3815E-06
Valor crítico de t (una cola)
1,78228755
Fuente: Autor
72
En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de
reproducibilidad a las 8:00 a.m. (2,1271 x 10-5), a las 12 m. (1,1408 x 10-5)
y a las 4:00 p.m. (1,3815 x 10-6), en donde se puede deducir que el
análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el
promedio de recuentos de la dilución 10-3 es mayor que el promedio de
los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005) aceptando así la hipótesis
alternativa en los tres casos, para concluir que existe una reproducibilidad
para la técnica de recuento en placa en superficie de Staphylococcus
aureus.
Adicional a esto, se realizó un análisis de varianza de dos factores con
varias muestras por grupo y se obtuvieron los siguientes resultados (tabla
29).
Tabla 29. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.
dil 10-3
RESUMEN
dil 10-4
Total
08:00 a.m.
Cuenta
3
Suma
12
3
6
2
14
Promedio
4
0,666666667 2,333333333
Varianza
1
0,333333333 3,866666667
12:00 m.
Cuenta
3
3
6
Suma
14
3
17
Promedio
4,666666667
1 2,833333333
Varianza
4,333333333
1 6,166666667
04:00 p.m.
Cuenta
3
3
6
Suma
13
2
15
Promedio
4,333333333
0,666666667
2,5
Varianza
1,333333333
0,333333333
4,7
Cuenta
9
9
Suma
39
7
4,333333333
0,777777778
1,75
0,444444444
Total
Promedio
Varianza
Fuente: Autor
73
•
Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra
que presenta un bajo recuento (carne cocida) en diferentes tiempos
(ensayo de reproducibilidad 1).
En el ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una
muestra de carne cocida, se obtuvieron los siguientes recuentos a las
diferentes horas analizadas (tabla 30):
Tabla 30. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en
superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado en
diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1).
Tiempo
Repetición
1
8:00 a.m.
Repetición
2
8:00 a.m.
Repetición
3
8:00 a.m.
Repetición
1
12:00 p.m.
Repetición
2
12:00 p.m.
Repetición
3
12:00 p.m.
Repetición
1
4:00 p.m.
Repetición
2
4:00 p.m.
Repetición
3
4:00 p.m.
1/100
1/100
1/100
Promedio
1/1000
1/1000
1/1000
Promedio
Recuento
Según
NTC 4092
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
Fuente: Autor
En este ensayo tampoco se encontró crecimiento de Staphylococcus
aureus, lo cual confirma lo que se esperaba para la muestra de carne
cocida examinada, ya que este microorganismo produce una gran
cantidad de productos extracelulares, muchos de ellos enterotoxinas. La
diseminación de S. aureus entre humanos y de los humanos a los
alimentos puede ocurrir por contacto directo o indirectamente por
fragmentos de piel (Doyle, 1997).
74
Se presentaron datos semejantes para las pruebas realizadas y la
evaluación de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada
prueba 0 UFC en la muestra (figura 24) y un resultado de <100 UFC / g de
S. aureus.
Figura 24. Prueba reproducibilidad 1 en carne cocida. Fuente: Autor
•
Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa
positiva en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo
de reproducibilidad 2).
En el ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una
muestra de leche cruda, se obtuvieron los siguientes recuentos para los
diferentes analistas (tabla 31):
75
Tabla 31. Resultados de los recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus
en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2)
Analista 1
Repetición 1
Analista 1
Repetición 2
Analista 1
Repetición 3
Analista 2
Repetición 1
Analista 2
Repetición 2
Analista 2
Repetición 3
Analista 3
Repetición 1
Analista 3
Repetición 2
Analista 3
Repetición 3
1/1000
1/1000
1/1000
Promedio
1/10000
1/10000
1/10000
Promedio
Recuento
Según
NTC 4092
3
4
5
4
1
1
1
1
45454
45 x 103
4
4
3
4
1
1
0
1
39393
40 x 103
4
5
5
5
0
1
2
1
51515
51 x 103
5
6
5
5
1
1
1
1
57575
57 x 103
4
4
6
5
1
1
1
1
51515
51 x 103
4
3
5
4
1
2
1
1
48484
48 x 103
3
5
6
5
1
0
1
1
48484
48 x 103
5
7
6
6
1
1
1
1
54545
54 x 103
5
5
3
4
2
1
1
1
51515
51 x 103
Fuente: Autor
Según los resultados presentados en la tabla 31, se presenta una
dispersión en los valores, ya que los resultados que arrojaron las
repeticiones realizadas por los distintos analistas son diferentes entre si;
variando en un rango que se encuentra entre 40 x 103 y 57 x 103 UFC / ml
de Staphylococcus aureus, por lo tanto, la semejanza en los datos
obtenidos entre repeticiones de una misma prueba no es muy uniforme
(figura 25). Sin embargo, es lógico que se presenten estos resultados
debido a que se está tratando con microorganismos que varían según las
condiciones de crecimiento a las que fueron sometidos.
Dispersion prueba reproducibilidad diferentes analistas
Staphylococcus aureus
Recuentos UFC / g-ml
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
0
0,5
1
1,5
2
Repeticiones
Analista 1
Analista 2
76
2,5
3
Analista 3
3,5
Figura 25. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de
Staphylococcus aureus realizado por diferentes analistas. Fuente: Autor
En el ensayo de reproducibilidad 2 se obtuvo un notable crecimiento de
Staphylococcus aureus, aislado a partir de una muestra de leche cruda,
en donde se observó la morfología típica de las colonias de este
microorganismo (figura 26), a las cuales se les realizó una coloración de
Gram, para confirmar posteriormente las características propias de tinción
de S. aureus, pues se observaron cocos Gram positivos agrupados en
forma de racimos.
Figura 26. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda.
Prueba reproducibilidad 2. Fuente: Autor
Por otro lado, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y
coeficiente de variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los
resultados presentados en la tabla 32; además, se realizó el análisis de
prueba t para obtener la distribución, obteniendo los datos presentados en
la tabla 33:
Tabla 32. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de
la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de
Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado por diferentes analistas
(Ensayo de reproducibilidad 2).
Analista 1
Repetición 1
Analista 1
Repetición 2
Analista 1
Repetición 3
Promedio
1/1000
Promedio
1/10000
Recuento
4
1
45454
4
1
39393
5
1
51515
X
V
SD
CV
Según
NTC 4092
45 x 103
45 x 103
0,61111111
6061
13,33436
40 x 103
51 x 103
77
Analista 2
Repetición 1
Analista 2
Repetición 2
Analista 2
Repetición 3
Analista 3
Repetición 1
Analista 3
Repetición 2
Analista 3
Repetición 3
57 x 103
5
1
57575
5
1
51515
4
1
48484
48 x 103
5
1
48484
48 x 103
6
1
54545
4
1
51515
52 x 103
51 x 103
1
1,75
4628,8379
3030,50001
8,81269353
5,88279069
51 x 103
54 x 103
51 x 103
Fuente: Autor
El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos
presentados para la prueba de reproducibilidad con diferentes analistas
realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de
Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. Se obtuvieron
coeficientes de variación de 13.33% (analista 1), 8.81% (analista 2) y
5.88% (analista 3). Estos coeficientes de variación demuestran que hay
un alto grado de concordancia en los resultados obtenidos entre los
diferentes analistas, ya que presentan un porcentaje inferior al 20%.
Tabla 33. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2
para Staphylococcus aureus en leche cruda.
Analistas
Variable 1
Observaciones
9
Grados de libertad
1
Estadístico t
P(T<=t) una cola
Valor crítico de t (una cola)
Observaciones
Estadístico t
P(T<=t) una cola
Valor crítico de t (una cola)
Observaciones
10
10,11928851
7,12846E-07
1,812461102
Variable 1
9
Grados de libertad
3
3,24058E-08
1,753050325
Variable 1
9
Grados de libertad
2
15
9,803789355
Estadístico t
P(T<=t) una cola
Valor crítico de t (una cola)
Fuente: Autor
78
10
8,485281374
3,50212E-06
1,812461102
En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de
reproducibilidad variando los analistas. Analista 1 (3,24058 x 10-8),
analista 2 (7,12846 x 10-7) y analista 3 (3,50212 x 10-6), en donde se
puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la
prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-3 es
mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005),
aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que
existe una reproducibilidad intra-laboratorio para la técnica de recuento en
placa en superficie de Staphylococcus aureus.
Para este ensayo también se realizó un análisis de varianza de dos
factores con varias muestras por grupo y se obtuvieron los resultados
presentados en la tabla 34.
Tabla 34. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.
dil 10-4
RESUMEN
dil 10-5
Total
Analista 1
Cuenta
3
3
6
Suma
12
3
15
Promedio
4
1
2,5
Varianza
1
0
3,1
Analista 2
Cuenta
3
3
6
Suma
16
3
19
Promedio
5,333333333
1 3,166666667
Varianza
0,333333333
0 5,766666667
Analista 3
Cuenta
3
3
6
Suma
14
2
16
Promedio
4,666666667 0,666666667 2,666666667
Varianza
2,333333333 0,333333333 5,866666667
Total
Cuenta
Suma
Promedio
9
9
42
8
4,666666667 0,888888889
Varianza
1,25 0,111111111
Fuente: Autor
79
•
Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra
de carne cocida, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
En el ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una
muestra de carne cocida, al realizarse por diferentes analistas, se
obtuvieron los siguientes resultados (tabla 35):
Tabla 35. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en
superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado por
diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2).
Analista 1
Repetición 1
Analista 1
Repetición 2
Analista 1
Repetición 3
Analista 2
Repetición 1
Analista 2
Repetición 2
Analista 2
Repetición 3
Analista 3
Repetición 1
Analista 3
Repetición 2
Analista 3
Repetición 3
1/100
1/100
1/100
Promedio
1/1000
1/1000
1/1000
Promedio
Recuento
Según
NTC 4092
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
< 100
Fuente: Autor
En esta prueba no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual
confirma lo que se esperaba para la muestra de carne cocida analizada,
ya que, como se ha mencionado, este microorganismo no debe poder
aislarse de este alimento porque puede causar graves intoxicaciones
debido a las enterotoxinas que produce. La principal fuente de
contaminación de los alimentos por Staphylococcus se debe a la
manipulación de estos por parte de personas contaminadas, ya que los
humanos son el principal reservorio de este microorganismo.
80
Se presentaron datos iguales para las pruebas realizadas y la evaluación
de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada prueba 0
UFC en la muestra (figura 27) y un resultado de <100 UFC / g de S.
aureus.
Figura 27. Prueba reproducibilidad 2 en carne cocida. Fuente: Autor
81
7. CONCLUSIONES
•
Para los laboratorios de análisis microbiológico es importante
desarrollar técnicas que produzcan confiabilidad de resultados, lo
cual se logra a través de la validación secundaria de dichos
métodos, ya que de esta forma se consigue emitir resultados
exactos, que permiten al laboratorio mantener altos estándares de
calidad.
•
La metodología ejecutada permitió evaluar la repetibilidad y
reproducibilidad de la validación secundaria concurrente del
método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en
muestras de albahaca y arroz cocido, la cual arrojó coeficientes de
variación con altos grados de concordancia para los diferentes
ensayos realizados; lo que significa que entre ensayos existe una
variación menor al 20%.
•
La validación secundaria concurrente del método de recuento en
placa en superficie de Staphylococcus aureus en muestras de
leche cruda y carne cocida, arrojó coeficientes de variación con
altos grados de concordancia para los diferentes ensayos
realizados; lo que significa que entre ensayos existe una variación
menor
al
20%,
logrando
así
evaluar
la
repetibilidad
y
reproducibilidad de esta técnica.
•
La evaluación de la repetibilidad y la reproducibilidad de la técnica
de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras
de albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus en
muestras de leche cruda y carne cocida, mostró valores que
aseguran la estandarización de la técnica.
82
•
El análisis estadístico permitió corroborar que las técnicas de
recuento en placa en superficie tanto para el análisis de Bacillus
cereus como para Staphylococcus aureus en muestras de
alimentos son repetibles y reproducibles.
•
Mediante la realización del método ecométrico a los medios
utilizados en los ensayos de validación se pudo evidenciar la alta
productividad y selectividad del agar Bacillus cereus y del agar
Baird Parker, lo que permite confiar en los resultados obtenidos en
cada uno de los ensayos llevados a cabo en el proceso de
validación.
•
La demostración de los parámetros de calidad de los medios de
cultivo, tales como esterilidad, selectividad, productividad y pH
arrojó altos grados de confiabilidad para el estudio realizado.
•
El sistema de aseguramiento de calidad en lo concerniente a
instalaciones,
equipos
y
controles
minimiza
las
desviaciones y deficiencias en la obtención de resultados.
83
posibles
8. RECOMENDACIONES
1. Mediante el desarrollo de la validación secundaria dar continuidad a la
validación de otras técnicas como, recuento de esporas anaerobias de
sulfito reductores, Vibrio cholera, Listeria monocytogenes, entre otras.
2. Realizar pruebas interlaboratorios nacionales e internacionales para dar
una mayor confiabilidad a los resultados obtenidos.
3. Implementar esta metodología para realizar una evaluación de
analistas, para lograr estandarizar este método, de manera que el
personal nuevo la conozca y la ejecute siempre de la misma forma.
84
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89
10. ANEXOS
Anexo 1. Certificados de calidad de las cepas ATCC.
Anexo 2. Certificados de calidad de los medios de cultivo.
Anexo 3. Certificados de calibración de los equipos
Anexo 4. Confirmación bioquímica por medio del kit de identificación rápida de
microorganismos Gram positivos BBL