Download Regulación de la secreción neuronal de

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
REGULACIÓN DE LA SECRECIÓN NEURONAL DE
LA HORMONA LIBERADORA DE TIROTROPINA EN
EL NÚCLEO PARAVENTRICULAR DEL
HIPOTÁLAMO. PARTICIPACIÓN DE LA
NEUROTRANSMISIÓN GLUTAMATÉRGICA Y
GABAÉRGICA Y SUS CAMBIOS POR LA
EXPOSICIÓN AL FRÍO
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar
al grado académico de Doctor en Farmacología
Por
PABLO ENRIQUE JARA PICAS
Directores de Tesis
Dr. Hernán Lara Peñaloza
Dra. Jenny Fiedler Temer
Santiago - Chile
2007
1
A mis padres Ana María y Rodolfo por su apoyo
A mis hermanas María José y Andrea
Con mucho cariño a mi abuela Catalina
Agradecimientos
Quisiera agradecer de forma muy importante al Dr. Hernán Lara por haber
trabajado en su laboratorio, por gran su apoyo durante todo mi paso por el
doctorado, en el desarrollo de esta tesis, en su discusión y ayuda en la revisión de
2
este manuscrito. Por haberme aportado su conocimiento, formación científica y
calidad humana.
A la Dra. Jenny Fiedler, por haberme ayudado en todas las etapas de esta tesis,
desde su desarrollo hasta este manuscrito y discusión. Muy agradecido por todos
sus consejos, críticas y formación científica.
Al Dr. Sandor Arancibia, por el paso en su laboratorio en Montpellier, Francia.
Por entregarme su conocimiento en el desarrollo de la técnica de push-pull y por
hacer más fácil la estadía en Francia. Muchas gracias por todo.
A la Dra. Carmen Romero, por asesorarme y facilitar su laboratorio para realizar
los radioinmunoensayos y su ayuda en los análisis de esta técnica.
En especial quisiera agradecer al GRAN grupo del Laboratorio de
Neurobioquímica por hacer del trabajo en el laboratorio algo muy agradable y
estar siempre dispuestos a pasar un buen momento. Por la ayuda y discusión de
esta tesis: Gabriel Aravena (Donga), a los compañeros futuros farmacólogos
Mauricio Dorfman, Ramón Sotomayor, Sergio Andrés y Romina Rojas, a
Monika Greiner, Javier Bravo, José Luís Ulloa, Patricia Castañeda, Karina
Araneda.
Agradezco a la Dra. Florance Rage (Montpellier, Francia) por su ayuda durante
el trabajo en Francia y en la enseñanza de las incubaciones in vitro, así como por
los buenos momentos de mi estadía en montpellier.
A Françoise y Edmond por su apoyo técnico durante mi paso por Montpellier.
Y en especial a Makita por su amor, paciencia y apoyo
Financiamiento
- Proyecto del Fondo Nacional para el Desarrollo de Ciencias y Tecnología de Chile FONDECYT 102 0581 y
105 0765
- Proyecto de la Sociedad Chilena de Endocrinología y Metabolismo, actual Sociedad Chilena de Endocrinología
3
y Diabetes. Nº 2005-05 Titulo: Control de la secreción de TRH por glutamato. Posible participación en la
respuesta simpática al estrés de frío.
- ECOS-Conicyt C01S01, Financiamiento de estadía en Montpellier, Francia
Becas.
1.- Beca MECESUP para estudiantes de doctorado, Programa de Mejoramiento de la Calidad y la Equidad de la
Educación Superior (MECESUP): Nº proyecto UCH 0208-001. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas.
Universidad de Chile. Beca de financiamiento obtenida por los años 2004 y 2005.
2.- Beca de Financiamiento Parcial de Tesis Postgrado otorgado por la Vicerrectoria de Asuntos Académicos.
Departamento de Posgrado y Postitulo. Universidad de Chile. PG Nº 61/2005
Publicaciones.
1.- Araya V, Jara P, Lara HE 2004 Cerebro, estrés y ovario poliquístico. Participación de la inervación simpática
en el desarrollo de ovario poliquístico. Endocrinología y Nutrición (Barcelona) 51:474-477
2.- Fiedler J, Jara P, Luza S, Dorfman M, Grouselle D, Rage F, Lara HE, Arancibia S 2006 Cold stress induces
metabolic activation of thyrotrophin-releasing hormone-synthesising neurones in the magnocellular division of
the hypothalamic paraventricular nucleus and concomitantly changes ovarian sympathetic activity parameters. J
Neuroendocrinol 18:367-376
Asistencias a congresos.
4
- Jara, P., Arancibia, S., Fiedler, J. y Lara HE. Participación de glutamato y GABA en la liberación de la
hormona liberadora de tirotropina desde el núcleo paraventricular del hipotálamo frente al estrés de frío. XXIX
Congreso de la Sociedad de Farmacología de Chile. Iquique, 6-9 de Septiembre de 2007.
- Jara, P., Fiedler, J., Luza, S. Dorfman, M. Grouselle, D. Rage, F, Lara, HE. y Arancibia, S. Activación de las
neuronas liberadoras de tirotropina en la división magnocelular del núcleo paraventricular por estrés de frío.
Presentación para incorporación como socio. XXVIII Congreso de la Sociedad de Farmacología de Chile.
Olmué, 2006.
- Dorfman, M., Ramírez , V.D. Sotomayor, R., Jara, P. Lara, HE. Rol de la insulina en la inervación simpática
ovárica en un modelo de ovario poliquístico inducido por estrés crónico. XVII reunión anual. Sociedad Chilena
de Reproducción y Desarrollo. Reñaca, 2006.
- Jara, P., Arancibia, S, Rage, F, Fiedler, J, Lara, HE. Participación de neurotransmisores en la regulación
hipotalámica de la liberación de la hormona liberadora de tirotropina provocada por el estrés. XXVII Congreso
de la Sociedad de Farmacología de Chile. Santiago, 2005.
- Jara P., Arancibia S., Rage F., Fiedler J., Lara HE. Regulación hipotalámica de la liberación de la hormona
liberadora de tirotropina provocada por el estrés. Trabajo Libre. XVI Congreso Chileno de Endocrinología y
Diabetes. Pucón, 2005.
- Jara, P., Arancibia, S, Rage, F, Fiedler, J, Lara, HE. Regulación hipotalámica de los cambios intraovaricos
provocados por el estrés. En Simposio: Mecanismos de control neuroendocrinote la función ovarica.
Participación del sistema nervioso autonómico y el eje hipotálamo-hipófisis-ovario en el control neuroendocrino
de la función ovárica. XXVI Congreso de la Sociedad de Farmacología de Chile. Quinamavida, 2004.
5
ÍNDICE
ABREVIATURAS ................................................................................................................ 6
RESUMEN ............................................................................................................................ 8
ABSTRACT ........................................................................................................................ 10
1.- INTRODUCCIÓN
1.1.-
Antecedentes generales............................................................................................. 12
1.2.-
Actividad nerviosa simpática en el ovario ................................................................ 12
1.3.-
Estrés ........................................................................................................................ 14
1.4.-
El núcleo paraventricular y su relación con el estrés................................................ 17
1.5.-
Neurotransmisores y TRH. Participación en la regulación del NPV ....................... 19
1.5.1.- Participación del ácido  - aminobutírico (GABA) .................................................. 19
1.5.2.- Participación de glutamato ....................................................................................... 20
1.5.3.- Participación de aferencias GABAérgicas y glutamatérgicas en el estrés ............... 22
1.5.4.- Participación de noradrenalina ................................................................................. 22
1.5.5.- Participación de acetilcolina (ACh).......................................................................... 23
1.5.6.- Hormona liberadora de tirotropina (TRH)................................................................ 24
1.6.-
Hormona liberadora de tirotropina y estrés de frío................................................... 25
2.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2.1.-
Hipótesis ................................................................................................................... 27
2.2.-
Objetivo general ....................................................................................................... 27
2.3.-
Objetivos específicos ................................................................................................ 27
3.- MATERIALES Y MÉTODOS
3.1.-
Animales ................................................................................................................... 29
3.2.-
Estudios in vivo......................................................................................................... 29
3.2.1.- Implante de cánula push-pull.................................................................................... 30
6
3.2.2.- Perfusión push-pull ................................................................................................... 30
3.2.3.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción de neurotransmisores
aminoácidicos en animales con libertad de movimiento .......................................... 32
3.3.-
Estudios in vitro ........................................................................................................ 34
3.3.1.- Estudios in vitro de la neurotransmisión GABAérgica y glutamatérgica
en la secreción de la TRH en ratas expuesta a temperatura ambiente
y frente a la exposición a 4 ºC .................................................................................. 34
3.3.2.- Estudio in vitro de la participación de los receptores GABAA
en la secreción de la TRH ......................................................................................... 36
3.3.3.- Estudio in vitro de los receptores NMDA en la secreción de la TRH ...................... 36
3.4.-
Cuantificación de la TRH mediante un radioinmunoensayo .................................... 37
3.5.-
Estudios morfológicos del NPV. Inmunohistoquímica de la TRH e hibridación
in situ del mRNA de la TRH .................................................................................... 39
3.5.1.- Obtención de los cerebros......................................................................................... 39
3.5.2.- Inmunohistoquímica de la TRH ............................................................................... 39
3.5.3.- Hibridación in situ .................................................................................................... 40
3.6.-
Estadística ................................................................................................................. 41
4.- RESULTADOS
4.1.-
Efecto de la exposición a 4 ºC sobre los niveles de los mRNA de la TRH y su relación
con la inmunorreactividad para la TRH en el NPV del hipotálamo ......................... 42
4.1.1.- Estudios de hibridación in situ para el mRNA de la TRH en el NPV ..................... 42
4.1.2.- Estudios inmunohistoquímicos de la TRH en el NPV ............................................. 45
4.2.-
Contenido de la TRH en el NPV ............................................................................. 48
4.3.-
Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción de la TRH in vivo
desde el NPV ............................................................................................................ 48
4.4.-
Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la liberación in vivo de neurotransmisores
aminoácidicos desde el NPV .................................................................................... 53
4.5.-
Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción in vitro de la TRH desde el NPV
y la Eminencia Media ............................................................................................... 57
4.5.1.- Análisis de la secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la Eminencia Media ... 58
7
4.5.2.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción basal de la TRH
desde cortes de tejido ................................................................................................ 61
4.5.3.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción inducida de la TRH frente
al estímulo despolarizante de K+ 56mM................................................................... 63
4.5.4.- Regulación GABAérgica de la secreción de la TRH ............................................... 65
4.5.5. Regulación glutamatérgica de la secreción de la TRH ............................................. 67
5.-DISCUSIÓN.................................................................................................................... 69
6.-CONCLUSIONES .......................................................................................................... 83
7.-REFERENCIAS ............................................................................................................. 84
8
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLA.
FIGURAS.
Figura 1. Circuitos neuronales en la organización de la respuesta al estrés ...................... 16
Figura 2. Representación esquemática del núcleo paraventricular .................................... 18
Figura 3. Participación de las vías noradrenérgicas y colinérgicas en el NPV .................. 24
Figura 4. Esquema de la cánula Push-Pull ......................................................................... 31
Figura 5. Control histológico de implantación de la cánula .............................................. 32
Figura 6. Reacción de derivatización de aminoácidos ....................................................... 34
Figura 7. Esquema del protocolo de secreción de la TRH in vitro .................................... 35
Figura 8. Esquema de protocolo de secreción in vitro de la TRH desde el NPV
y la EM para determinar el efecto del receptor GABAA .................................... 36
Figura 9. Esquema de protocolo de secreción in vitro de la TRH desde el NPV
y la EM para determinar el efecto del receptor NMDA ..................................... 37
Figura 10. Promedio de las curvas estándar del RIA de la TRH ......................................... 38
Figura 11. Fotografías del aumento en los niveles de expresión del mRNA de
la TRH en el NPV frente a la exposición a 4 ºC por 64 horas ............................ 43
Figura 12. La exposición a 4° C por 48 y 64 horas aumenta los niveles
del mRNA de la TRH en el NPV ....................................................................... 44
Figura 13. La exposición a 4° C por 48 y 64 horas aumenta los niveles
del mRNA de la TRH en la subdivisión magnocelular del NPV ....................... 44
Figura 14. Fotografías del aumento por la exposición a 4 ºC por 64 horas
en la inmunorreactividad a la TRH en el NPV ................................................... 46
Figura 15. La exposición a 4° C aumenta la TRH en la totalidad del NPV ......................... 47
Figura 16. La exposición a 4° C aumenta la TRH en la subdivisión
magnocelular del NPV........................................................................................ 47
Figura 17. La exposición y perfusión a 4° C aumenta la secreción
de la TRH desde el NPV magnocelular .............................................................. 50
Figura 18. Cuantificación de la secreción in vivo de la TRH .............................................. 51
Figura 19. L-glutamato estimula la secreción de la TRH desde el NPV magnocelular ...... 52
9
Figura 20. La exposición y perfusión a 4° C aumenta la liberación de
glutamato desde el NPV magnocelular .............................................................. 54
Figura 21. La exposición y perfusión a 4° C mantiene la liberación de
GABA desde el NPV magnocelular ................................................................... 56
Figura 22. La exposición a 4 ºC por 64 horas, no cambia la concentración
de la TRH en el NPV y la disminuye en la EM .................................................. 57
Figura 23. Perfil de secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la EM de
ratas controles ..................................................................................................... 59
Figura 24. Perfil de secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la EM de
ratas expuestas a 4 ºC ......................................................................................... 60
Figura 25. La secreción basal de la TRH desde cortes de NPV no presenta cambios
y en la EM disminuye frente a la exposición a 4 ºC ........................................... 62
Figura 26. Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción inducida
por K+ 56 mM de la TRH desde el NPV y la EM .............................................. 64
Figura 27. La inhibición del receptor GABAA aumenta la secreción basal
in vitro de la TRH en el NPV y en la EM no tiene efecto .................................. 66
Figura 28. El aumento en la secreción basal in vitro de la TRH desde el NPV
por la inhibición del receptor GABAA, es bloqueado por el antagonista
no-competitivo del receptor NMDA de glutamato, MK-801 ............................. 68
Figura 29. Conexiones anatómicas y funcionales que activarían las neuronas
TRHérgicas del NPV en respuesta al estrés de frío ............................................ 75
Figura 30. Modelo propuesto de la regulación de la activación de las
neuronas TRHérgicas del NPV por el receptor GABAA en las ratas
expuestas a 4 ºC por 64 horas ............................................................................. 80
Figura 31. Modelo propuesto de la regulación de las neuronas TRHérgicas del NPV
por el receptor GABAA y el receptor ionotrópico de glutamato
NMDA, en las ratas expuestas a 4 ºC por 64 horas ............................................ 82
TABLA.
Tabla I.
Concentración y contenido de la TRH en el NPV de ratas expuestas
a 4 ºC por 64 horas.............................................................................................. 48
10
ABREVIATURAS.
ACh: Acetilcolina.
AchR: Receptor de acetilcolina.
ACTH: Hormona adrenocorticotropica, Corticotropina.
AMPA: ácido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionico.
APO: área preóptica
AVP: Arginina-vasopresina
C.V: coeficiente de variación.
CPE: Carboxipeptidasa E.
cpm: cuentas por minutos
CREB: cAMP-Ca2+ response element-binding protein. Proteína que une el elemento de
respuesta a cAMP-Ca+2
CRH: Hormona liberadora de corticotropina.
dpm: desintegraciones por minuto.
EEM: error estándar de la media.
EM: Eminencia media.
EV: Estradiol Valerato
GABA: Ácido -  - aminobutírico.
HHA: Eje hipotálamo- hipófisis- drenal.
HHT: Eje hipotálamo- hipófisis- tiroides.
HPLC: cromatografía líquida de alta resolución.
HRP: peroxidasa de rábano.
i.c.v.: intracerebroventricular.
IML: intermedio lateral.
LCRa: Líquido cefalorraquídeo artificial.
mRNA: Ácido Ribonucleico mensajero.
NA: Noradrenalina.
nAChRs: receptores de acetilcolina nicotínicos.
NDM: núcleo dorso medial.
NLET: núcleo del lecho de la estría terminal.
11
NMDA: N-metil-d-aspartato.
No-NMDA: no N-metil-d-aspartato.
NPV: núcleo paraventricular.
NTS: Núcleo del Tracto Solitario.
OPA: o-ftalaldehído.
PC: Prohormona Convertasa.
RIA: radioinmunoensayo.
RVLM: Médula ventrolateral rostral.
SNA: Sistema nervioso autónomo.
SNC: Sistema nervioso central.
SOP: síndrome de ovario poliquístico.
SP: Sustancia P
T3: Triyodotironina
T4: Tetrayodotironina, Tiroxina
TRH: Hormona Liberadora de Tirotropina.
TSH: Hormona Estimulante de la Tiroides, Tirotropina.
VIP: péptido vasoactivo intestinal.
12
Resumen
La función ovárica es regulada a través de una vía endocrina y por una vía neuronal. Un
aumento prolongado en la actividad nerviosa simpática se encuentra causalmente relacionado
con la formación de quistes ováricos. Estudios de nuestro laboratorio han establecido que la
exposición a 4 ºC y la administración intracerebroventricular de la hormona liberadora de
tirotropina (TRH), aumentan la actividad simpática del ovario.
Estudios funcionales y morfológicos han establecido que el origen de la vía neuronal del
ovario proviene del hipotálamo y específicamente desde el núcleo paraventricular (NPV). El
NPV es una estructura que sintetiza variadas hormonas y participa además en la modulación
de respuestas fisiológicas frente al estrés. Una de las hormonas que se sintetiza en el NPV y
que cumple esta función es la TRH, la que es secretada desde la eminencia media (EM) donde
regula el eje hipotálamo-hipófisis-tiroides. Además esta hormona en forma independiente de la
vía endocrina ejerce funciones en estructuras del sistema nervioso central. El NPV es
ampliamente regulado por variados neurotransmisores como noradrenalina, acetilcolina,
glutamato y GABA. Terminales nerviosos glutamato y GABA, forman contactos sinápticos
con neuronas TRHérgicas los que activan o inhiben neuronas del NPV. Sin embargo, no se ha
destacado la participación de estos neurotransmisores en la funcionalidad de las neuronas
TRHérgicas del NPV, como tampoco su participación en la respuesta frente a la exposición a
4 ºC, por lo que, se planteó como hipótesis de trabajo: “La secreción de la TRH desde las
neuronas del NPV aumenta en respuesta a la exposición a 4 ºC siendo el glutamato y GABA
los neurotransmisores que controlan estos cambios”
Para resolver la hipótesis usamos ratas Sprague-Dawley adultas, las cuales fueron divididas en
un grupo control y otro estresado por exposición a 4 ºC por 48 y 64 horas. En este modelo
experimental demostramos que la exposición a 4 ºC activó las neuronas TRHérgicas del NPV
demostrado por el aumento de la expresión del mRNA de la TRH por hibridación in situ y su
inmunorreactividad en el NPV, aumentando tanto en la región parvocelular que es la
característica de las neuronas TRHérgicas, como en la región neuroendocrina magnocelular,
donde se ha descrito la presencia de inmunorreactividad de la TRH, pero no su funcionalidad.
Complementario a los cambios en la expresión e inmunorreactividad de la TRH, se observó in
vivo mediante el implante y perfusión de cánula push-pull, que la exposición a 4 ºC por 64
13
horas estimuló la secreción de la TRH (determinado por radioinmunoensayo) desde la región
magnocelular del NPV. La secreción local de la TRH corresponde a la secreción dendrítica
que se ha observado en las neuronas de la región magnocelular para las neuronas
oxitocinérgicas y vasopresinérgicas, pero no descrito para las neuronas TRHérgicas. Por otra
parte, se determinó por perfusión push-pull in vivo, que la exposición a 4 ºC aumentó la
liberación de glutamato y se mantuvo la de GABA comparado con las ratas controles,
sugiriendo que estos neurotransmisores están involucrados en la secreción de la TRH.
Para conocer la participación de glutamato y GABA en la regulación de las neuronas
TRHérgicas, se analizó la TRH secretada mediante estudios in vitro de cortes de NPV y EM.
Estos estudios determinaron que la inhibición farmacológica de los receptores ionotrópicos de
GABA con el antagonista competitivo bicuculina, estimulan la secreción basal de la TRH en
las ratas expuestas a 4 ºC. El aumento en la secreción de la TRH fue bloqueado al utilizar
MK-801 (50 M), antagonista no-competitivo de los receptores NMDA de glutamato,
confirmando la participación de la inervación glutamatérgica y GABAérgica en la exposición
a 4 ºC. Sin embargo no se puede descartar la participación de otros neurotransmisores que
inervan y regulan la funcionalidad del NPV.
A nivel de la EM, encontramos que la exposición a 4 ºC disminuyó la concentración de la
TRH, lo que se relacionó directamente con un aumento en la secreción basal y estimulada. El
conjunto de estos resultados nos indican que el aumento en la secreción de la TRH desde el
NPV inducida por la exposición a 4 ºC, es principalmente regulado por los sistemas
glutamatérgicos y GABAérgicos, los cuales se constituyen en componentes claves de los
cambios en la actividad nerviosa central que da origen a la vía nerviosa que controla la función
ovárica.
14
Abstract
The ovarian function is regulated by endocrine and neuronal pathways, where a prolonged
increase in the sympathetic nervous activity is causally related to the development of ovarian
cysts. Studies from our laboratory have established that the exposure to cold and the
intracerebroventricular administration of the thyrotropin-releasing hormone (TRH) increases
the sympathetic nervous activity that innervates the ovary.
Functional and morphological studies have established that the origin of the neural network
that innervates the ovary originates in the hypothalamus and specifically the paraventricular
nucleus (PVN). PVN is not only the nucleus where many hormones are synthesized but also is
responsible to modulate physiological responses to stress. One of the hormones that is
synthesized in the NPV that fulfills this function is TRH, who is released from the median
eminence (ME) and regulates the endocrine function of the hypothalamus-pituitary-thyroid
axis and to presents no-endocrine functions. The PVN is widely regulated by several
neurotransmitters like noradrenaline, acetylcholine, glutamate and GABA. The glutamatergic
and GABAergic neurotransmission activate and inhibit neurons of the PVN respectively. Both
type of neurons have synaptic contacts with TRH neurons, however, the participation of these
neurotransmitters to the function of TRH neurons in the PVN has not been described and also
their participation in the response of the neurons to exposure to cold stress. Thus the
hypothesis of this work is: “TRH release from the PVN neurons increases in response to cold
stress being glutamate and GABA the neurotransmitters that are controlling these changes”
To solve the hypothesis, we used Sprague-Dawley adults rats, which were divided in control
and cold stressed rats at 4 ºC for 48 and 64 hours. In this experimental model we demonstrated
that cold stress activated TRH neurons of the NPV, which was demonstrated by the increase in
the expression TRH mRNA demonstrated by in situ hybridization and its immunoreactivity in
the PVN, in the parvocelular region that it is the characteristic of the TRH neurons, and in the
magnocellular neuroendocrine region, where the presence of immunoreactivity of TRH has
been described, but not its functionality. In addition to the changes in the expression and
immunoreactivity of TRH, we used in vivo push-pull cannulae perfusion and we demonstrated
that cold stress during 64 hours stimulated the TRH release (measured for radioimmunoassay)
from the magnocellular region of the PVN. This is a dendritic release that has been previously
15
observed in the magnocellular region for oxytocinergic and vasopressinergic neurones, but
described for the first time in TRHergic neurons. In addition, through the push-pull perfusion
we found an increase of glutamate and GABA released in stressed rats compared with control
rats, suggesting that these neurotransmitters are involved in the TRH release.
To know the participation of glutamate and GABA in the regulation of the TRHergic neurons,
we analyzed the in vitro release of TRH from tissue slices from PVN and from ME.
Pharmacological inhibition of the ionotropic GABA receptors with the competitive antagonist
bicuculline, stimulated the basal TRH release in the stressed rats. The increases in the basal
TRH release was blocked by the addition of MK-801 (non-competitive antagonist of the
glutamate NMDA receptors), confirming the participation of glutamatergic and GABAergic
innervation in the control of TRH release and - without discarding the participation of other
neurotransmitters that are innervated and regulating the functionality of the PVN - in the
control of TRH release under cold stress condition.
In ME (nerve terminal), we found that cold stress decreased the TRH concentration and
increased both basal and stimulated release in a manner that was independent of GABAergic
neurotransmission. Altogether these results indicated that the regulation of the increased TRH
release from the PVN induced by cold stress was mainly regulated by glutamatergic and
GABAergic neurotransmission, which are then constituted in key components of the changes
in the central nervous activity at the origin of the nervous pathway that controls the ovary
function.
16
1.- INTRODUCCIÓN.
1.1.- Antecedentes generales.
Durante los últimos años nuestro grupo de trabajo ha establecido un control neuronal sobre la
función ovárica que es complementario a la regulación tradicionalmente ejercida por las
gonadotropinas. El componente neural involucrado corresponde principalmente a nervios
simpáticos que contienen noradrenalina y neuropéptidos y que llegan a las células secretoras
de esteroides del tejido ovario (1). El grupo de Gerendai y cols (2), describió que esta vía
nerviosa se origina en el núcleo paraventricular del hipotálamo. Estas observaciones
reforzaron el concepto de que cambios en la actividad del sistema nervioso central controlan
las aferencias simpáticas autonómicas y son fundamentales en la regulación de la función
ovárica. En este aspecto nuestro grupo encontró que la exposición a 4 ºC aumenta la actividad
simpática en el ovario, generando cambios en el desarrollo folicular, formándose folículos
prequísticos similares a los observados en el ovario poliquístico (3, 4). Una observación
importante ha sido el que la administración intracerebroventricular (i.c.v.) de hormona
liberadora de tirotropina (TRH) remeda los cambios en la actividad nerviosa simpática que
inerva al ovario (5). Sin embargo, los mecanismos neuroendocrinos que a nivel del hipotálamo
está involucrados en la actividad nerviosa del ovario no han sido aún aclarados.
1.2.- Actividad nerviosa simpática en el ovario.
Está muy bien establecido que el ovario de mamíferos es órgano blanco tanto para neuronas
simpáticas como sensoriales. Las neuronas que se proyectan al ovario inervan en distintos
grados de complejidad a folículos en desarrollo, además de los vasos sanguíneos y el tejido
intersticial. En los últimos años, el acceso a procedimientos simples de cultivo celular y
nuevas técnicas bioquímicas y de biología molecular ha facilitado el abordaje experimental
para conocer la participación de la inervación extrínseca en la fisiología ovárica. Diversos
grupos, incluyendo el nuestro, han demostrado una acción estimuladora de las catecolaminas y
del péptido vasoactivo intestinal (VIP) en la esteroidogénesis folicular; evidencias que han
llevado al concepto de que este control nervioso opera en forma independiente, pero en
armonía con la bien establecida regulación hormonal ejercida por las hormonas
17
hipofisiarias (6, 7).
La inervación simpática que llega al ovario está representada por fibras nerviosas que
contienen noradrenalina (NA) y neuropéptido-Y (NPY) y las neuronas sensoriales que
contienen sustancia P (SP) y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP). Por
otra parte fibras nerviosas tanto de origen sensorial como simpático y que contienen VIP,
también inervan al ovario (8, 9). La inervación extrínseca alcanza al ovario por dos rutas
diferentes: (a) el plexo nervioso que viaja junto a los vasos sanguíneos, lleva la mayoría de las
fibras sensoriales, nervios con NPY y el grueso de la inervación noradrenérgica que controla
los vasos sanguíneos (10-13) y (b) el nervio ovárico superior (SON), que está asociado al
ligamento suspensorio y lleva la mayoría de las fibras noradrenérgicas que inervan los
folículos y toda la inervación VIPérgica de la glándula (8, 14).
Muchas evidencias, incluyendo las presentadas por nuestro grupo de trabajo, han permitido
postular que la actividad ovárica, además de la regulación hormonal clásica, está controlada a
través de mecanismos neuronales de origen cerebral. A principios de la década de los 80,
Kawakami y cols. (15) presentaron las primeras evidencias sobre la existencia de una vía de
control neural directa desde el hipotálamo al ovario. Aunque estos autores no entregaron
evidencias neuroanatómicas directas sobre esta vía, este hallazgo permitió el desarrollo de
estudios neuroquímicos que sugirieron una relación funcional entre el sistema nervioso
autonómico (SNA) y el ovario, tanto en la función ovárica normal como durante el síndrome
de ovario poliquístico (SOP) (16, 17).
El SOP, es quizás la patología endocrina mas común que afecta a las mujeres durante su vida
reproductiva (18). Muchos factores, incluyendo la secreción anormal de gonadotrofinas,
alteraciones en la función adrenal y alteración en los procesos de interacción célula-célula que
regulan el micro ambiente ovárico, se han señalado como los principales responsables en la
etiología del síndrome (revisado por Yen SS (17)). Mientras está claro que la progresión del
SOP es un proceso multifactorial, aún no se alcanza consenso sobre los factores primarios que
pueden iniciar el síndrome. Una forma de SOP puede ser inducida en rata por la
administración de valerato de estradiol (EV), un estrógeno de vida media larga. Utilizando
este paradigma, hemos presentado evidencias para una participación directa del sistema
nervioso en la mantención y progresión del ovario poliquístico (OP). Hemos encontrado que
los ovarios de los animales con esta patología inducida por EV están bajo un tono
18
noradrenérgico aumentado en el cual participa la inervación extrínseca al ovario (16, 19).
En 1984 Axelrod y Reisine (20) demostraron que una gran variedad de agentes estresantes
inducían un aumento en la actividad del SNA y de la glándula suprarrenal. De ahí que ha
adquirido relevancia el estudio de la influencia nerviosa que distintos tipos de estrés ejercen
sobre la secreción endocrina del ovario, y de esa forma, sobre la función reproductiva. En este
contexto, hemos encontrado que procedimientos combinados de estrés de inmovilización y de
exposición a 4 ºC, inducen un aumento en el contenido de noradrenalina (NA), tanto en el
ganglio celíaco como en el ovario, lo que sugiere un aumento del tono simpático que además
se correlaciona con cambios importantes en el desarrollo folicular (3, 21). De esta forma, las
anormalidades en el desarrollo folicular y en la producción de esteroides ováricos
características del SOP, pueden corresponder a alteraciones en el control ejercido por el SNA
sobre la función ovárica. Dado que la respuesta primaria a estos tipos de estrés se origina a
nivel hipotalámico, estos resultados sugieren fuertemente que la activación de núcleos en esta
región puede provocar cambios en la fisiología del ovario.
El uso de la técnica de trazado viral transneuronal, permitió a Gerendai y cols (2, 22)
identificar al núcleo paraventricular (NPV) del hipotálamo como la región del cerebro desde
donde se proyectan las neuronas ya sea directa o indirectamente,
hacia las neuronas
preganglionares simpáticas a nivel del ganglio celíaco, cuyas fibras post ganglionares inervan
directamente el ovario.
1.3.- Estrés.
La correcta funcionalidad del organismo, requiere de un equilibrio en los procesos celulares y
de los sistemas de órganos que mantienen el funcionamiento del organismo (homeostasis). En
la mantención de este equilibrio, que se conoce como alostasis, participan de forma integrada
componentes autonómicos, neuroendocrinos, metabólicos y conductuales. El desequilibrio en
la homeostasis del organismo se conoce como estrés y al estímulo que lo produce se le conoce
como estresor. Los estresores se clasifican como estresores físicos (ruido, vibración, dolor,
choque eléctrico, temperatura), psicológicos (exposición a un ambiente nuevo o incontrolable),
sociales (disponibilidad de espacio) y estresores que se generan en el organismo y que
19
involucran al sistema cardiovascular y la homeostasis metabólica (hemorragia, ejercicio,
exposición a calor).
La mayoría de los estresores activa vías específicas del sistema nervioso central (SNC) y
diversos núcleos o áreas del cerebro que responden de manera coordinada y posteriormente
ejecutan la respuesta restauradora de la homeostasis del organismo frente al estímulo
estresante. Los estímulos estresores activan circuitos neuronales específicos del SNC en donde
activan estructuras corticales, límbicas e hipotalámicas, siendo el hipotálamo el centro
modulador del estrés. En el hipotálamo, frente a los distintos estresores se generan respuestas
específicas, como por ejemplo: frente al estés de inmovilización, miedo condicionado, éter o
hipoxia se activa la respuesta a través del eje hipotálamo (hormona liberadora de
corticotropina o CRH)-hipófisis (ACTH)-adrenal (glucocorticoides) o a través del eje
hipotálamo (TRH)-hipófisis (TSH)-tiroides (T3 y T4) frente a la exposición a 4 ºC. Ambos ejes
hipotálamo-hipófisis-adrenal (HHA) e hipotálamo-hipófisis-tiroides (HHT) tiene como
estructura hipotalámica común al núcleo paraventricular (NPV), donde se encuentra los
cuerpos neuronales de las neuronas CRHérgicas y TRHérgicas. (revisado en Pacák y Palkovits
(23)) (Figura 1 A).
En respuesta a la exposición aguda a 4 ºC, el organismo activa mecanismos neuroendocrinos
termogénicos que se inician como una señal somatosensorial y que a través de aferentes
craneales y espinales llegan al tronco encefálico y desde ahí se conectan con estructuras
hipotalámicas, límbicas y corticales. Por estudios de inmunohistoquímica y usando como
marcador de respuesta temprana, el factor transcripcional c-fos, se ha identificado grupos de
células que se activan por exposición aguda al 4 ºC, las que se ubican en el área preóptica del
hipotálamo, núcleo parabraqueal lateral, núcleo peritrigeminal y en el tronco encefálico (24).
La especificidad en la respuesta está dada por los neurotransmisores característicos de estas
neuronas como catecolaminas, serotonina, ácido -aminobutírico (GABA) y opiáceos, los
cuales regulan el eje HHT al actuar en las neuronas TRHérgicas de la región parvocelular del
NPV (25). De hecho la exposición aguda a 4 ºC incrementa la secreción de la TRH desde la
eminencia media (EM) por un aumento de la actividad de las neuronas TRHérgicas (26-28)
(Figura 1 B).
20
A
B
Amígdala
NLET
Hipotálamo
HHA
HHT
Hipotálamo
APO
NPV
NPV
HHT
Tronco cerebral
Médula espinal
Tronco cerebral
Médula espinal
Piel
(Termorreceptor)
Figura 1. Circuitos neuronales en la organización de la respuesta al estrés. (A) Aferencias
desde la médula espinal llegan a centros autonómicos del tronco cerebral y desde allí se
conectan con el hipotálamo (NPV), corteza y estructuras límbicas modulando la respuesta que
se ejerce a través de los ejes endocrinos HHA y HHT y sistema nervioso autónomo. (B)
Estimulación de la vía termosensorial que llega a la médula espinal y al tronco cerebral y que
a través de la modulación en el hipotálamo y sistema límbico, ejercen la respuesta a través del
eje HHT y SNA. APO: área preóptica, HHA: Eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, HHT: Eje
hipotálamo-hipófisis-tiroides, NLET: Núcleo del lecho de la estría terminal, NPV: Núcleo
paraventricular,.
21
1.4.- El núcleo paraventricular y su relación con el estrés.
El NPV es una estructura hipotalámica que de acuerdo a criterios celulares, funcionales e
inmunohistoquímicos se divide en la región magnocelular (anterior, medial y posterior) y la
región parvocelular (periventricular, anterior, medial, dorsal y lateral). En la porción
magnocelular se encuentran principalmente los cuerpos neuronales de las neuronas
vasopresinérgicas y oxitocinérgicas, esta región proyecta parte de sus axones a la médula
espinal, a la lámina externa de la EM y a la hipófisis posterior desde donde se libera
vasopresina (región posterodorsolateral) y oxitocina (región anterior y medial). En la
subdivisión parvocelular se encuentran los cuerpos neuronales de neuronas CRHérgicas,
TRHérgicas, somatostatinérgicas, GnRHérgicas. Las eferencias de esta subdivisión se
proyectan a la EM, al complejo dorso-vagal, núcleo del tracto solitario (NTS) y región
intermediolateral de la médula espinal en la región toráxica (región dorsal, lateral y ventral
parvocelular proyecta principalmente hacia la medula espinal) (Figura 2 B) (29).
A pesar de que las mayores divisiones del NPV presentan diferencias morfológicas y
funcionales, ellas se encuentran interconectadas, así lo demuestra un estudio de caracterización
morfológica, encontrándose interacciones tanto somáticas como axo-dendrítica del NPV (30).
Es así que se ha determinado la existencia de proyecciones desde la región lateral
magnocelular hacia la neurohipófisis y de la región posterolateral magnocelular hacia el
cerebro medio, médula espinal y en menor cantidad hacia la neurohipófisis. En otro análisis
morfológico realizado en la sección posterior magnocelular se determinó la existencia de
contactos sinápticos entre las dos mayores divisiones del NPV visualizado por
inmunorreactividad a oxitocina propia de la subdivisión magnocelular y a CRH predominante
de la subdivisión parvocelular (31).
En cuanto a las inervaciones que recibe el NPV se destacan las aferencias directas de neuronas
noradrenérgicas y adrenérgicas de la médula ventral, del Locus Coeruleus (LC) y del NTS, y
otras aferencias desde la región septal, amígdala y del núcleo del lecho de la estría terminal
(NLET) (29) (Figura 2 C). Además el NPV presenta inervación indirecta desde la amígdala,
subiculum ventral y la corteza prefrontal. Estas inervaciones son un componente importante en
la respuesta al estrés.
22
A
Núcleo paraventricular
B
C
Figura 2. Representación esquemática del núcleo paraventricular. (A) Se muestra la
ubicación anatómica del NPV en el cerebro de la rata. (B) Eferencias con funciones endocrinas
que se proyectan a la eminencia media y pituitaria posterior y neuronales hacia el tronco
cerebral y la médula espinal. (C) Aferencias que recibe el NPV desde regiones del sistema
nervioso simpático del tronco cerebral (médula ventral, locus coeruleus, NTS) y regiones
límbicas (amígdala, NLET). Subdivisión parvocelular (Pp: parvocelular; Pm: medial;
Pv: ventral; Pl: lateral y Pd: dorsal) y Magnocelular (M). Abreviaciones: IML, Región
intermediolateral; NTS, núcleo del tracto solitario.
Diversas técnicas de marcación han permitido determinar la inervación y proyecciones que se
generan en el NPV y que se conectan con estructuras autonómicas y órganos periféricos. Por
ejemplo, utilizando el método de marcación viral transneuronal que permite identificar
retrógradamente sitios del SNC que están conectados con órganos periféricos, se determinó
una vía de origen central que inerva al ovario. En etapas tempranas de la infección retroviral
se encuentra inmunorreactividad en la región intermediolateral de la médula espinal torácica
(T4-T13), complejo dorso-vagal, núcleo del Rafé caudal, NTS y LC. Posteriormente, aparece
23
marcación en el NPV, predominando en la región caudal (magnocelular) y en menor grado en
el núcleo arcuato y la zona incerta y en forma tardía se presenta leve marcación en el NLET y
el núcleo central de la amígdala (2, 22). Esta evidencia morfológica ha permitido considerar al
NPV como uno de los centros de regulación neuroendocrina que podrían actuar como
moduladores de la funcionalidad periférica, a través de proyecciones hipofisiotrófica y/o
vegetativas. La complejidad estructural del NPV también se refleja en la funcionalidad de este
núcleo y en la amplia regulación a la cual está sujeto por distintos neurotransmisores.
1.5.- Neurotransmisores y TRH. Participación en la regulación del NPV.
1.5.1.- Participación del ácido - aminobutírico (GABA).
El neurotransmisor GABA corresponde a un neurotransmisor inhibitorio, que al unirse a sus
receptores produce potenciales de membranas inhibitorios. Los receptores de GABA
corresponden a receptores GABAA (receptor ionotrópico asociado a canal de cloruro), GABAB
(receptor asociado a proteína-G) y GABAC (receptor ionotrópico asociado a canal de cloruro,
pero que no responde a bicuculina y baclofeno) (32). Se ha postulado que gran parte de la
inervación GABAérgica en el NPV provendría de núcleos hipotalámicas como el núcleo dorso
medial (NDM), NLET, núcleo estrio-hipotalámico y del núcleo supraquiasmático (NSC) (33).
Estudios de marcación mediante a administración intravenosa de peroxidasa de rábano (HRP)
revela marca en estructuras lisosomales del NPV principalmente en la porción magnocelular
en comparación con la parvocelular. Utilizando un antisuero contra el neurotransmisor GABA,
se observan contactos sinápticos HRP/GABA en el núcleo arcuato y NPV (34). En este mismo
estudio utilizando un antisuero contra el neurotransmisor excitatorio glutamato, se observaron
contactos sinápticos HRP/glutamato y una convergencia de axones GABAérgicos y
glutamatérgicos sobre las neuronas magnocelulares y parvocelulares del NPV. Esta
interacción daría cuenta de una participación de estos neurotransmisores en la regulación de la
función neuroendocrina. Se ha establecido que las neuronas TRHérgicas del NPV reciben
inervación de distintas regiones del cerebro, que coinciden con el tipo de regulación que
presentan estas neuronas al estimularse. Mediante la técnica de marcación anterograda por
microinyección en la vena de la cola del animal y posterior detección inmunocitoquímica de
Phaseolus vulgaris- leucoaglutinina (PHA-L), se determinó: a.- inervación profusa desde el
24
NDM al NPV parvocelular, principalmente el periventricular; b.- que estas neuronas se
encuentran yuxtapuestas en un 98% con neuronas TRHérgicas, y c.- mediante microscopia
electrónica, contactos sinápticos entre neuronas provenientes del NDM y las neuronas
TRHérgicas del NPV (35). Dentro de este contexto, se ha establecido que cuerpos neuronales
en el núcleo arcuato proyectan sus terminales GABAérgicos hacia neuronas de NPV que
hacen contacto con dendritas de las neuronas TRHérgicas (36). La funcionalidad de estos
contactos, ha sido demostrada en parte por estudios en cultivos de neuronas hipotalámicas,
donde la secreción de somatostatina es estimulada por glutamato e inhibida por GABA (37) y
ya que somatostatina inhibe la secreción de la TRH desde la EM, la participación de la
inervación GABAérgica es importante en la regulación neuroendocrina hipotalámica (25)
1.5.2.- Participación de glutamato.
El neurotransmisor glutamato ejerce su efecto excitatorio al activar receptores específicos, que
de acuerdo a sus propiedades fisiológicas y farmacológicas se dividen en ionotrópicos (forman
canales iónicos) y metabotrópicos acoplados a proteína G y producción de segundos
mensajeros (38). Los ionotrópicos se han clasificado farmacológicamente de acuerdo al
ligando que los activa, como del tipo NMDA (N-metil-D-aspartato), Kainato y AMPA (ácido
-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionico), estos dos últimos son conocidos como
ligandos no-NMDA (38, 39).
Un estudio estructural y funcional realizado por Van den Pol y cols. (40), mostró fibras
inmunorreactivas a glutamato y que hacen sinápsis en el NPV, núcleo supraóptico y núcleo
arcuato. Específicamente en el NPV se encuentra inmunorreactividad a glutamato y en células
magnocelulares que presentan oxitocina y vasopresina. Más aún el glutamato genera
potenciales postsinápticos excitatorios en el NPV y núcleo arcuato, los cuales son inhibidos
por antagonistas de receptores ionotrópicos para el ácido glutámico del tipo no-NMDA.
En las mencionadas células del NPV también se ha determinado la expresión de mRNA de
receptores ionotrópicos y del receptor metabotrópico de glutamato mGlu1b (41). En el NPV
también existen los mRNA para las distintas subunidades que conforman los receptores
ionotrópicos (a).- la subunidad NMDAR1 presente tanto en la división parvocelular como
magnocelular y (b).- la de las subunidades NMDAR2B cuya expresión es claramente más alta
25
en región magnocelular; aunque también está presente en niveles más bajos en las
subdivisiones dorsal, dorsolateral medial, ventrolateral medial y lateral; zona media
(enriquecida en la TRH) (42).
Con respecto a los receptores AMPA, la subunidad GluR1 se expresa en la región
preautonómica, parvocelular dorsal, ventrolateal medial y lateral; encontrándose niveles de
expresión bajos para las subunidades GluR2-GluR3. Finalmente, la subunidad GluR5 de los
receptores de tipos Kainato se expresa en la región dorsolateral medial, área relacionada con la
secreción de CRH. Por otra parte la subunidad GluR6 presenta bajos niveles en ambas
divisiones. Por otro lado, la subunidad KA2 de los receptores de kainato presenta una alta
expresión en la región medial y dorsolateral parvocelular (42). Considerando en su conjunto,
los estudios morfológicos relacionados con la ubicación de las subunidades de los receptores
de glutamato junto con estudios funcionales, nos indican que estos receptores se encuentran
activos y que además se encuentran relacionados con una vía glutamatérgica en el NPV y que
además activa la vía nerviosa simpática. En efecto se ha demostrado al administrar glutamato
directamente en el NPV un aumento de la temperatura en el tejido adiposo, efecto que es
independiente de la vía hipofisiaria (43). Por otro lado la administración local de glutamato en
la región magnocelular aumenta la presión arterial, frecuencia cardiaca y catecolaminas
plasmáticas (NA) y adrenalina, en forma independiente de vasopresina (44).
Yoshimatsu y cols. (45), microinyectaron glutamato en estructuras hipotalámicas específicas
midiéndose la respuesta bioeléctrica de los nervios simpáticos que inervan el tejido adiposo
pardo. Se observó que dependiendo de la zona hipotalámica microinyectada, se observaron
respuestas estimuladoras, inhibitorias o bifásicas. Las respuestas inhibitorias o las bifásicas
desencadenadas por glutamato es probable que sean respuestas mixtas en las cuales interviene
un neurotransmisor inhibitorio como el GABA. Dado que el NPV se proyecta hacia la médula
espinal y los cuerpos ganglionares que inervan órganos periféricos, la actividad modulada en
el NPV y activada por glutamato se debe transmitir hacia los terminales nerviosos ya sea
directa o indirectamente a través de la TRH y del SNA.
26
1.5.3.- Participación de aferencias GABAérgicas y glutamatérgicas en el estrés.
El control del NPV por sistemas neuronales relacionados con la respuesta al estrés proviene de
circuitos de origen límbico que regulan de la respuesta del eje HHA. Las neuronas que
conforman esta regulación corresponden a neuronas provenientes de subiculum ventral,
amígdala medial, septum lateral, tálamo paraventricular y núcleo supraquiasmatico. Todas
estas podrían ser GABAégicas que regulan la actividad de las neuronas que rodean al NPV e
inervan al NPV o que directamente activan a interneuronas del NPV (circuitos locales), como
las neuronas glutamatérgicas en las regiones periPVN e intraNPV, las que se encuentran
regulando las neuronas relacionadas con la respuesta al estrés, específicamente en la
subdivisión parvocelular del NPV. (46)
1.5.4.- Participación de noradrenalina.
El NPV es una estructura ampliamente inervada tanto por neuronas adrenérgicas provenientes
del NTS y médula ventral y neuronas noradrenérgicas provenientes del LC, NTS y medula
ventral (29). De acuerdo a esto las estructuras que se encuentran involucradas en la respuesta
al estrés corresponden a neuronas nordrenérgicas, Se ha descrito la existencia de interneuronas
glutamatérgicas que actúan a través de receptores ionotrópicos post-sinápticos localizados en
neuronas del NPV magnocelular (47). Estas neuronas son reguladas por NA a través de
receptores 1-adrenérgicos [Figura 3 A (1)]. En estudios posteriores (48), realizados esta vez
en neuronas parvocelulares, se confirmó la existencia de potenciales excitatorios e inhibitorios
presinápticos noradrenérgicos. Estos estudios presentan evidencia de que en la funcionalidad
del NPV participa la activación noradrenérgica y sería mediada directamente o a través de
interneuronas ubicadas dentro del núcleo [Figura 3 A (2)]. Por otra parte, la estimulación del
LC incrementa la concentración de NA en el NPV y este aumento se correlaciona con una
disminución del reflejo baroreceptor a nivel cardiovascular (49) [Figura 3 A(3)].
27
1.5.5.- Participación de acetilcolina (ACh).
En cuanto a la regulación del sistema colinérgico, estudios in vitro han determinado la
activación de receptores nicotínicos (nAChRs) del tipo 7-nicotínicos en la región
magnocelular del NPV, los que se localizan en neuronas secretoras de oxitocina y
vasopresina (50). Estudios funcionales han determinado las propiedades moduladoras de la
ACh en el NPV en donde, aumentando la disponibilidad de ACh mediante la inhibición de la
colinesterasa con neostigmina, se produce disminución de la temperatura corporal, y rectal y
un aumento en la ingesta de agua. El cambio de actividad de estos sistemas se correlaciona
con un aumento en la expresión de c-fos en el NPV, Núcleo Preóptico Medial, LC, Área
Postrema y NTS (51) (Figura 3 B). La administración de glutamato en el NPV estimula la
liberación de ACh en la medula ventrolateral rostral (RVLM). En apoyo a esto, la
estimulación eléctrica del NPV provoca un aumento de la presión arterial, efecto que es
inhibido por la administración de escopolamina en la RVLM y es potenciado por
fisostigmina (52) (Figura 3 B). Estos estudios confirman la presencia de la inervación
colinérgica en el NPV y además sugieren que su activación sería mediada por glutamato.
En el contexto de la regulación de la actividad neuronal en el NPV, Yarbrough, G., ha
revisado la relación entre la TRH y neuronas colinérgicas del SNC (53). La TRH se
encuentra involucrada en la estimulación de la actividad neuronal colinérgica, produciendo
además la sensibilización post-sináptica de receptores colinérgicos. De esta forma la TRH
ejercería a una regulación a nivel de motoneuronas activando la liberación de ACh y en los
sistemas parasimpático y reticular ocurriría por la activación de interneuronas colinérgicas
(53). Por lo tanto, la TRH como el glutamato se encontrarían involucrados en la activación y
regulación del sistema colinérgico.
28
A
B
NA
NA
NA
Figura 3. Participación de las vías noradrenérgicas y colinérgicas en el NPV. (A) Las
aferencias noradrenérgicas activan neuronas glutamatérgicas del NPV, cuya activación se
observa como un efecto a nivel periférico cardiovascular. (B) Las aferencias del sistema
colinérgico presentes en el NPV, regulan la funcionalidad en el cerebro y sistema nervioso
periférico. AP: Área Postrema; Glut: glutamato; LC: Locus Coeruleus; MV: Médula ventral;
Rmusc: receptor muscarínico; RVLM: Médula rostroventrolateral; NA: Noradrenalina;
NPOM: Núcleo preóptico medial; NTS: Núcleo del Tracto Solitario.
1.5.6.- Hormona liberadora de tirotropina (TRH).
La principal función de la TRH es regular la secreción de Tirotropina (TSH) desde la hipófisis.
Se ha determinado además, que la TRH se distribuye y cumple funciones adicionales a la
clásica función de regular el eje HHT. Estas funciones las ejerce tanto en el SNC, SNA y
órganos periféricos (ej. hígado). A nivel del SNC la TRH se distribuye ampliamente por gran
parte del cerebro donde cumpliría funciones no endocrinas, en el retorno de la sedación,
cognición, antidepresivas y anticonvulsivantes. A través del SNA estimula la secreción de
ácido gástrico, contractibilidad y tránsito intestinal, produce vasoconstricción y aumento de la
frecuencia cardiaca, incrementa la frecuencia respiratoria, controla la función motora y la
respuesta al dolor (54). En apoyo a los efectos periféricos de la producidos por la acción no
29
endocrina de la TRH, en nuestro laboratorio hemos encontrado que la TRH administrada i.c.v.,
produce un aumento en la actividad simpática a nivel periférico; efecto independiente de la
respuesta endocrina que media la secreción de TSH. Dichos aumentos se manifiestan a nivel
del ganglio celíaco (punto de origen de la vía simpática que llega al ovario) en donde se
observó aumento en la actividad tirosina hidroxilasa, sin cambios en el contenido de NA en el
ganglio celíaco (5).
La TRH es procesada a partir de un péptido precursor de mayor peso molecular, no
observándose inmunorreactividad para estos precursores en axones y terminales nerviosos de
la EM y médula espinal, sugiriendo fuertemente que la biosíntesis de la TRH proviene del
procesamiento de una proteína precursora a nivel del NPV (55). Se ha logrado determinar que
este precursor es procesado post-traduccionalmente por las enzimas prohormonas convertasas
(PC1 y PC2) y Carboxipeptidasa E (CPE) en el cuerpo neuronal de las neuronas TRHérgicas
del NPV, siendo la división parvocelular del NPV la que contiene la mayoría de las neuronas
TRHérgicas de este núcleo que se proyectan a la EM. Si bien se encuentran precursores de la
TRH en variadas regiones del SNC, las neuronas TRHérgicas del NPV contienen todas las
enzimas necesarias para procesar completamente el péptido precursor (54).
Estudios in vitro han corroborado en cortes de tejido la secreción de la TRH por estimulación
directa del NPV. Nikodèmovà y cols. 1995 (56), demostraron que existe una secreción
diferencial de la TRH desde el NPV y la EM al usar un estimulo despolarizante de K+. Más
aún el Ca2+ y ionóforos de calcio incrementan la secreción de la TRH en NPV y EM. Este
estudio da un indicio de que en parte la TRH que cumple las funciones no endocrinas
provendría del NPV. Al que no se le ha descrito su función en la fisiología normal y menos
aún en condiciones patológicas.
1.6.- Hormona liberadora de tirotropina y estrés por frío.
La secreción de la TRH en respuesta al estrés de frío (exposición a frío) es regulada a nivel del
SNC y a través de este último se regulan las respuestas simpáticas y parasimpáticas ejercidas
por la TRH. En la exposición a 4 ºC se ha observado cambios en la expresión de mRNA de la
TRH. A 30 y 48 horas de exposición a 4 ºC, se ha observado un aumento en la expresión del
mRNA de CRH y del mRNA de la TRH (57), hecho que plantea vías especificas que
30
determinan las respuestas a determinados estresores, (como en este caso la exposición a 4 ºC),
las que son reguladas a nivel cerebral. En el caso de la respuesta a la exposición a 4 ºC, se
activaría el eje HHA, por un aumento en las concentraciones plasmáticas de ACTH, sin
aumentar los niveles plasmáticos de oxitocina y vasopresina (58), no determinándose la
actividad del eje HHT pero se consideró que la respuesta a nivel del NPV frente a los distintos
tipos de estrés es diferencial. Se ha observado además un aumento en la expresión y secreción
de la TRH desde el NPV hacia la EM, correspondiente a una vía que respondería a través del
eje HHT (23, 26, 27). En la exposición a 4 ºC aumenta la secreción de la TRH en forma rápida
y transitoria y al parecer, con una doble finalidad: una neuroendocrina típica, para activar la
secreción de TSH y consiguientemente las hormonas tiroideas; y otra, autonómica para activar
a través de la vía simpática ciertas funciones vegetativas (por ejemplo: termogénesis, presión,
etc.), entre las que se incluiría nuestras recientes observaciones sobre la actividad ovárica
(5, 59). El aumento en la secreción de la TRH inducida por la exposición a 4 ºC es detectado
en el tercer ventrículo (3V), aún cuando se bloquee la secreción de la TRH desde la eminencia
media (25), sugiriendo que la secreción inducida de la TRH por este tipo de estrés hacia el
tercer ventrículo, podría provenir de una secreción de origen dendrítico desde las mismas
neuronas del NPV. Esta secreción dendrítica podría estimular las neuronas del NPV, vecinas
de las endocrinas, que inervan estructuras simpáticas. En efecto, en nuestro laboratorio se ha
determinado que la administración i.c.v. de la TRH es capaz de activar la vía nerviosa
simpática que conectaría al cerebro con el ovario (5). De esta forma - y dado que el NPV
representa la mayor fuente de la TRH en el SNC - nos ha parecido de particular interés no sólo
el investigar los mecanismos de activación de la vía simpática por la TRH sino también cuáles
serían él o los neurotransmisor(es) centrales susceptibles de estimular las neuronas
TRHérgicas contenidas en este núcleo e implicadas en la vía simpática para conocer el control
central de las vías autonómicas que regulan la función ovárica.
31
2.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2.1.- Hipótesis.
La secreción de la TRH desde las neuronas del NPV aumenta en respuesta a la exposición a
4 ºC siendo el glutamato y GABA los neurotransmisores involucrado en estos cambios.
2.2.- Objetivo General.
Caracterizar los cambios en la secreción de la TRH desde el Núcleo Paraventricular por
efectos de la exposición a 4 ºC y la participación de glutamato y GABA en estos cambios
2.3.-Objetivos Específicos.
2.3.1.-Analizar la activación de las neuronas TRHérgicas del NPV en respuesta a la
exposición a 4 ºC y al estímulo de glutamato.
En este objetivo se determinó los cambios causados por la exposición a 4 ºC en la secreción de
la TRH in vivo mediante implante de cánula push-pull en el NPV, lugar donde se encuentran
los cuerpos neuronales de las neuronas TRHérgicas. De acuerdo a los estudios in vitro de
Nikodèmovà y Strbák (56), se observa secreción de la TRH desde el NPV y además, la
exposición a 4 ºC aumenta la secreción de la TRH desde terminales nerviosos de la EM (27),
por lo que de existir secreción dendrítica de la TRH, el estímulo de la exposición a 4 ºC sería
suficiente para producir secreción de la TRH desde los cuerpos neuronales del NPV.
La microinyección de glutamato en distintas estructuras hipotalámicas (45) o específicamente
en el NPV (43, 44) es una de las metodologías que se utiliza para estudiar la función que
cumple este neurotransmisor en la activación y respuesta del NPV, la otra corresponde a los
estudios in vitro, que han ayudado ha determinar la actividad de glutamato como
neurotransmisor excitatorio del NPV (40). Por lo que, de acuerdo a estos antecedentes se
estudió además la secreción de la TRH, por la estimulación con glutamato, in vivo mediante
32
implante de cánula push-pull en el NPV e in vitro incubando NPV o EM, independizándolo de
la vía endocrina NPV-EM, en donde se determinó la participación de la inervación
GABAérgica que hace contacto con neuronas TRHérgicas (36), en la exposición a 4 ºC. Por lo
que, en un grupo separado se determinó la influencia de GABA en nuestro sistema utilizando
antagonista para el subtipo GABAA.
Por otro lado, si la exposición a 4 ºC y glutamato dan cuenta de la secreción de la TRH en el
NPV, se hace necesario determinar los subtipos de receptores glutamatérgicos responsables de
la activación de la secreción de la TRH.
2.3.2.- Estudiar los cambios in vivo de la liberación de aminoácidos frente a la exposición a
4 ºC.
Dada la existencia de las inervaciones glutamatérgica y GABAérgica en el NPV, se determinó
el efecto de la exposición a 4 ºC en la liberación de estos neurotransmisores, mediante estudios
in vivo de implante de cánula y perfusión push-pull.
2.3.3.- Estudiar el efecto de glutamato y GABA en la secreción de la TRH y los cambios en la
respuesta a la exposición a 4 ºC.
Si bien se ha determinado la expresión de subunidades de receptores ionotrópicos NMDA,
AMPA y Kainato en las distintas subdivisiones del NPV (42), no se ha determinado la relación
funcional entre la activación de estos receptores y la secreción de la TRH en el NPV ni
tampoco su cambios frente a la exposición a 4 ºC y por estimulación con glutamato.
Para caracterizar el efecto de glutamato frente a la exposición a 4 ºC, se realizaran estudios in
vivo (push-pull) e in vitro (micro-disección), utilizando un antagonista específico de los
receptores NMDA, para establecer el papel de este receptor ionotrópico de glutamato en la
secreción de la TRH.
33
3.- MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1.- Animales.
Se utilizaron ratas hembras de la cepa Sprague-Dawley de aproximadamente 250 grs. que
presentaron sus ciclos estrales regulares de cuatro días. Los animales fueron obtenidos del
bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile, los
que se mantuvieron a una temperatura ambiente de 22 ºC, con libre disponibilidad de agua y
alimento. Todos los procedimientos fueron autorizados por la comisión de bioética de la
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.
Se utilizaron dos grupos experimentales, ratas que se mantuvieron a temperatura ambiente de
22 ºC (ratas controles) y ratas sometidas a estrés de frío mediante la exposición a 4 ºC en una
cámara refrigerada. Para este efecto los animales se mantuvieron a 4 ºC por 64 horas (en jaulas
individuales) y con libre disposición de agua y alimento. Estudios han mostrado que en esta
escala temporal de exposición a 4 ºC se promueve la activación del ganglio celíaco lugar de
origen de las neuronas simpáticas que inervan al ovario (60). Más aún estudios del laboratorio
han mostrado que la exposición a 4 ºC por 64 horas produce una activación simpática que
conlleva a cambios en la función ovárica (5).
Para los distintos estudios las ratas controles y expuestas a 4 ºC se eutanasiaron en la etapa de
diestro de su ciclo estral, con el fin de evitar variabilidad en los resultados debido a las
variaciones hormonales que ocurren durante el ciclo estral.
Parte de los estudios de implante y perfusión de cánula push-pull, fueron realizados bajo la
supervisión del Dr. Sandor Arancibia, en el Laboratorio de Mecanismos Moleculares en las
Demencias Neurodegenerativas, Universidad de Montepellier II, Montpellier, Francia. Tanto
la cepa de rata como las condiciones de crecimiento y mantención de las ratas entre ambos
bioterios fueron similares.
34
3.2.- Estudios in vivo.
Los estudios in vivo se realizaron mediante la técnica de implante y perfusión de cánula pushpull. La cánula push-pull [Figura 4. (A)], está compuesta por la cánula push (diámetro
interno: 0,127 mm, diámetro externo: 0,229 mm) (Cooper’s Needleworks Ltda, Birmingham,
U.K.), por la cual se administra líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) a un núcleo o área
específica del cerebro usando una bomba de perfusión que permite un flujo continuo de
líquido. La cánula pull (diámetro interno: 0,51 mm, diámetro externo: 0,82 mm) (Becton
Dickinson, USA), permite recolectar el líquido de superfusado desde el núcleo intracerebral
usando una bomba de perfusión independiente. El flujo de entrada y de salida debe ser
idéntico para evitar la acumulación de líquido en el lecho de la cánula. En nuestros
experimentos usamos un flujo de aproximadamente 15 L/minuto.
3.2.1.- Implante de la cánula push-pull.
Las ratas se anestesiaron con Hidrato de Cloral en una dosis intraperitoneal de 400 mg/Kg de
rata. Se fijó la cabeza de la rata en un aparato de estereotaxia (Stoelting Co, Illinois. USA) y
con un bisturí se realizó un corte de la piel, en la línea media de la cabeza, exponiendo en el
cráneo las suturas correspondientes a las uniones de los huesos que se denominan bregma y
lambda y que se utilizan como referencia para establecer la ubicación del NPV magnocelular
en las coordenadas (Lateral: 0,6; Antero-posterior: -1,8 y Dorso-ventral: 0,81 mm) de acuerdo
al atlas de Paxinos y Watson (61). Utilizando un mini taladro, se procedió a realizar un orificio
de no más de 2 mm de diámetro en el cráneo hasta exponer la duramadre, se procedió a
instalar la cánula guía (diámetro externo 0,51 mm y diámetro interno 0,26 mm, Terumo,
Japón) con un estilete para evitar que se tape la cánula [Figura 4 (B)]. Posteriormente se
procedió a fijarla al cráneo mediante tornillos y cemento dental. Las ratas con la cánula
implantada se mantienen en jaulas individuales en el bioterio por un período post-operatorio
de una semana con el objeto de recuperarlas del estrés producto de la operación, observado
como una reducción en el peso corporal. Solo las ratas que recuperaron su peso, se utilizaron
para la perfusión.
35
3.2.2.- Perfusión push-pull.
La perfusión se realizó en las ratas controles y expuestas a 4 ºC en libertad de movimiento. En
el caso de las ratas expuestas a 4 ºC la perfusión se realizó mientras permanecían en la cámara
refrigerada. La composición del medio de perfusión (LCRa) fue de mM NaCl 127,7 mM; KCl
2,6 mM; CaCl2 1,3 mM; MgCl2 1,9 mM; Na2HPO4 1,2 mM; Bacitracina 0,1 mM). La
calibración de las bombas de perfusión permitió un flujo continuo de 15 L/minuto. Los
perfusados obtenidos por la cánula Pull se recolectaron en hielo, por un periodo de 15 minutos
por cada tubo. Las alícuotas en las cuales se cuantificó la TRH se acidificaron con HCl
(concentración final 0,1 M) y fueron centrifugadas y evaporadas en un concentrador (speedvac, Savant). El liofilizado se guardó a -20 ºC para su cuantificación mediante un
radioinmunoensayo específico para la TRH. Las alícuotas que se utilizaron para la
cuantificación de aminoácidos se recolectaron en tubos que se encontraban en hielo y se
guardaron a -20 ºC
Figura 4. Esquema de la cánula Push-Pull. (A) Se observa la cánula push por donde ingresa
el LCRa. a la estructura a prefundir y la cánula pull, por donde se colecta el perfusado. (B) La
cánula guía con su estilete se implantó en el NPV magnocelular y (C) la cánula push-pull en
su integridad como se encuentra durante la perfusión.
36
Para confirmar el lugar donde se implantó la cánula, las ratas se eutanasiaron y los cerebros se
colocaron en un frasco que se congeló en Nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC Se
realizaron cortes coronales para el control histológico de la zona hipotalámica en donde se
confirmó el sitio de implante de la cánula (Figura 5). Las muestras obtenidas de los animales
cuyos implantes se encontraron fuera de la región magnocelular, se descartaron de los
estudios.
3V
Figura 5. Control histológico de implantación de la cánula. La flecha muestra el lecho de
perfusión que se formó durante la perfusión, lo que muestra la correcta localización de la
cánula push-pull en el NPV magnocelular. 3V: tercer ventrículo. (59)
3.2.3.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la liberación de neurotransmisores
aminoácidicos en animales con libertad de movimiento.
La cuantificación de aspartato, glutamato y GABA en los perfusados obtenidos mediante la
cánula push-pull implantada en el PVN magnocelular se realizó mediante la separación por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (62) y su detección mediante un detector de
fluorescencia previa derivatización de los aminoácidos de acuerdo a la técnica descrita por
Lindroth y Mopper (63).
37
El reactivo de derivatización se preparó con 4 mg de o-ftalaldehído (OPA) (Pierce, Rockford,
Illinois, USA) disuelto en 1 mL de etanol absoluto (Merck, calidad HPLC) y se agregó 4 L
de -mercaptoetanol (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. USA) Para la reacción de
derivatización, a 100 L de los estándares de aminoácidos como a las muestras, se les agregó
20 L de ácido bórico pH 10,5 y 20 L del reactivo de derivatización. Se agitó la mezcla
durante 90 segundos, en donde los aminoácidos contenidos en los estándares o muestras, se
derivatizan a un compuesto fluorescente (Figura 6) e inmediatamente se inyectaron en el
equipo de HPLC (Shimatzu, modelo SCL-6A, Japón) que poseía un volumen de inyección de
muestra de 20 L. Las muestras se separaron en una columna analítica de fase reversa
(Bioanalytical Systems, Biophase ODS 5 m, 250 x 4,6 mm) mediante una fase móvil a un
flujo de 0,9 mL/min consistente en NaH2PO4 0,1M, CH3CN 15%, pH 5,7 y desgasificado con
una corriente de Helio. Con el objeto de acelerar la separación de los aminoácidos más
retenidos como GABA, luego de 30 segundos se cambió a una fase móvil formada por
NaH2PO4 0,1M, CH3CN 30%, pH 5,7, la que se mantuvo por 10 minutos y posteriormente se
volvió a la fase móvil anterior. El tiempo de corrida para la separación de aspartato, glutamato
y GABA fue de 25 minutos. Los OPA derivados de aminoácidos, se detectaron
fluorimetricamente (excitación: 320nm, emisión: 450nm) (Waters modelo 474, USA) y los
tiempos de retención obtenidos para aspartato, glutamato y GABA correspondieron a 3,5; 4,7
y 13,5 minutos, respectivamente. Se integró el área bajo la curva (Waters modelo 746 data
module, USA) tanto de los estándares de aminoácido como las muestras.
Los cálculos se realizaron considerando el volumen de muestra de inyección en el HPLC, la
dilución en la mezcla de reacción y el volumen que se tomó de los perfusados colectados
durante 15 minutos mediante la técnica de push-pull.
38
+
+
Aminoácido
-mercaptoetanol
90 segundos
Figura 6. Reacción de derivatización de aminoácidos. Se observa la reacción que se realiza a
temperatura ambiente que a partir de o-ftalaldehído, los estándares o las muestras que
contienen los aminoácidos,-mercaptoetanol y el amortiguador borato, lleva a una molécula
fluorescente que se puede detectar a las longitudes de onda de excitación de 320 nm y con una
emisión de 450 nm.
3.3.- Estudios in vitro:
3.3.1.- Estudios in vitro de la neurotransmisión GABAérgica y glutamatérgica en la
secreción de la TRH en ratas expuesta a temperatura ambiente y frente a la exposición a
4 ºC.
Para realizar los estudios in vitro, se utilizó bloques de tejido cerebral correspondiente a la
región del hipotálamo y de EM. Se obtuvo las regiones de la EM (que se encuentra en la base
del hipotálamo) y el hipotálamo medio basal periventricular donde se ubica el NPV que se
39
encuentra bilateral entre el tercer ventrículo y el fornix, en la región periventricular anterior del
hipotálamo. Los bloques por separado fueron colocados en canastillos que poseen una malla de
poliéster, se incubaron a 37 ºC en un ambiente de composición O2 95%-CO2 5%, de forma
sucesiva durante 10 minutos en 500 L de medio Locke modificado: NaCl 154 mM, KCl 5,6
mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 6 mM, Glucosa 10 mM, CaCl2 2,2 mM y HEPES 2 mM; pH 7,27,4 y suplementado con Bacitracina 3mg/10mL (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. USA).
Para determinar la capacidad de secreción de la TRH desde los tejidos durante las
incubaciones, se realizaron dos incubaciones sucesivas con el estímulo despolarizante de
K+ 56 mM al cual se compensó el aumento de osmolaridad disminuyendo la concentración de
NaCl a 103,6 mM (figura 7).
Una vez cumplidos los 10 minutos de incubación en cada pocillo, los bloques se pasaron al
pocillo siguiente. Se tomaron dos alícuotas de 200 L del medio de incubación las que se
acidificaron con HCl (concentración final 0,1 M). Las muestras se centrifugaron y evaporaron
en un concentrador (Speed-vac, Savant) y se guardaron a -20 ºC para la posterior
cuantificación de la TRH mediante un radioinmunoensayo (RIA) específico.
Control (Tº ambiente)
Estrés (4 ºC por 64 hrs)
NPV
o
EM
Lavado Basal
(30)
(10)
K+ 56mM
Basal Estímulo Post
(10)


NPV
EM
(10)
(10)
Con Mg+2
Sin Mg+2
TRH
Post
Basal
K+ 56mM
Basal Estímulo Post
Post
(10)
(10)
(10)
(10) minutos
(10)
(10)
RIA-TRH
Figura 7. Esquema del protocolo de secreción de la TRH in vitro. El NPV y la EM por
separado se incubaron durante el tiempo determinado y se transfirieron sucesivamente de un
pocillo a otro, de los pocillos libres se colectan dos alícuotas para la posterior determinación de
la TRH mediante RIA. Post: post-estímulo.
40
3.3.2.- Estudio in vitro de la participación de los receptores GABAA en la secreción de la
TRH.
Para los estudios en donde se determinó la participación de la inervación GABAérgica en la
secreción de la TRH, se realizó un primer estímulo control (presencia o ausencia de Mg+2) y se
agregó 20 minutos antes del segundo estímulo se agregó bicuculina 100 M (Sigma Chemical
Co., St. Louis, Mo. USA) un antagonista competitivo de los receptores GABAA (Figura 8).
NPV
o
EM
Lavado Basal
(30)
(10)
Basal Estímulo Post
K+ 56mM
(10)
(10)
(10)
Post
Basal
Basal Estímulo Post
K+ 56mM
Post
(10)
(10)
(10)
(10) minutos
(10)
(10)
Bicuculina 100 M
RIA-TRH
Figura 8. Esquema de protocolo de secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la EM
para determinar el efecto del receptor GABAA. Posterior al segundo post-estímulo los
tejidos se incubaron en presencia de medio de incubación del antagonista competitivo del
receptor GABAA, bicuculina 100 M.
3.3.3.- Estudio in vitro de los receptores NMDA en la secreción de la TRH.
Para los estudios en donde se determinó la participación de la inervación glutamatérgica en la
secreción de la TRH, se realizó un primer estímulo control (presencia o ausencia de Mg+2) y se
incorporó 20 minutos antes del segundo estímulo, bicuculina 100 M final en presencia del
41
antagonista no-competitivo de los receptores de NMDA, MK-801 (Sigma Chemical Co., St.
Louis, Mo. USA) en una concentración final de 50 M (Figura 9).
NPV
o
EM
Lavado Basal
(30)
(10)
Basal Estímulo Post
K+ 56mM
(10)
(10)
(10)
Post
Basal
Basal Estímulo Post
K+ 56mM
Post
(10)
(10)
(10)
(10) minutos
(10)
(10)
Bicuculina 100 M + MK-801 50 M
RIA-TRH
Figura 9. Esquema de protocolo de secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la EM
para determinar el efecto del receptor NMDA. Posterior al segundo post-estímulo los
tejidos se incubaron en presencia de medio de incubación de Bicuculina metayoduro 100 M
más el antagonista no-competitivo del receptor NMDA, MK-801 50 M.
3.4.- Cuantificación de la TRH mediante un radioinmunoensayo.
La cuantificación de la TRH secretada de la perfusión push-pull se realizó a través de la
técnica de RIA con modificaciones de acuerdo a lo publicado por Grouselle y cols. (64). Este
RIA se basa en la competencia por los sitios de unión en el antisuero anti-TRH, entre 125I-TRH
(TRH marcada radioactivamente) (Perkin-Elmer Life Sciences, Inc., Boston, USA) agregada
en una cantidad fija y un volumen fijo de los estándares de la TRH (Sigma Chemical Co., St.
Louis, Mo. USA) (0,81 pg a 103,6 pg en 100 L o una alícuota de los superfusados (in vivo) o
medio de incubación (in vitro) (Figura 10). Lo que finalmente se cuantifica, es la cantidad de
125
I-TRH que se unió al antisuero anti-TRH.
Las muestras y los estándares de la TRH, fueron secados y evaporados, como se mencionó
antes y disueltos en 100 L de amortiguador de RIA (amortiguador fosfato salino 0,1M, pH
42
7,0) y mezclado con 100 L de antisuero anti-TRH (anticuerpo anti-TRH producido por el Dr.
Dominique Grouselle (Centre Paul Broca, Inserm, Paris) y obtenido por el Dr. Sandor
Arancibia, Montpellier, Francia) diluido 1:1.1200 en amortiguador fosfato salino 0,1M,
albúmina de suero de bovino 0,05%, pH 7,0. Además se agregó 100 L de aproximadamente
9.000 cpm, con una eficiencia del contador del 66% correspondió a 13.636 dpm de 125I-TRH,
estos 300 L se incubaron por 24 horas a 4 ºC Posterior a la incubación se agregó 500 L de
polietilenglicol 6.000 al 40% (Merck, Darmstadt, Alemania) y 100 L de gamaglobulina
bovina al 0,5% ambos disueltos en amortiguador fosfato. Los tubos se agitaron vigorosamente
y fueron centrifugados a 3.500 rpm (342 × g) a 4 ºC por 30 minutos, se descartó el
sobrenadante y en el precipitado se determinó la radiación emitida mediante un contador
multipozo de radiación gama. Los resultados se expresan como pg/tubo de la TRH
inmunorreactiva. Para cada cuantificación se realizó una curva estándar, cuyo valor mínimo
correspondió a 0,81 pg y máximo correspondió a 103,6 pg. (Figura 10).
Figura 10. Promedio de las curvas estándar del RIA de la TRH. Las curvas estándar de los
RIA realizados presentan un rango lineal de entre 0,81 pg y 103,6 pg. n=9. C.V. Promedio ±
EEM1,62 pg= 0,2717 ± 0,00684. Inter-ensayo B1,62 pg= 7,96%. Intra-ensayo B1,62pg=9,46%. B:
Unión específica (cpm) y T: cpm totales.
43
3.5.- Estudios morfológicos del NPV. Inmunohistoquímica de la TRH e hibridación in
situ del mRNA de la TRH.
3.5.1.- Obtención de los cerebros.
Los animales fueron eutanasiados mediante decapitación y los cerebros se extrajeron
rápidamente y se congelaron mediante inmersiones sucesivas en nitrógeno líquido, los
cerebros así congelados se guardaron a -80 ºC.
3.5.2.- Inmunohistoquímica de la TRH.
De los cerebros congelados, se realizaron cortes seriados de 12 m que se montaron en placas
portaobjeto gelatinizadas y se fijaron los tejidos en paraformaldehido (PFA) al 4% en PBS
durante 50 minutos a 4 ºC, posteriormente se realizaron dos lavados de 10 minutos en PBS, se
permeabilizó el tejido con una solución de PBS-Tritón 0,3% durante 30 minutos y después de
2 lavados en PBS por 10 minutos, se bloqueó la actividad peroxidasa endógena agregando
H2O2 al 1% en PBS por 30 minutos. El tejido se lavó 2 veces con PBS por 10 minutos, se
bloqueó con NGS (suero normal de cabra) al 5% durante 30 minutos y se agregó el anticuerpo
primario anti-TRH (1:250 en PBS-NGS 3%) (CRR4B72, proporcionado por el Dr V. D.
Ramírez, (Universidad de Illinois, Urbana, USA) y se dejó incubando toda la noche a 4 ºC.
Una vez completado este período se realizaron dos lavados con PBS-Tritón 0,1% por 10
minutos cada uno y se incubó por 24 horas con anticuerpo IgG biotinilado anti-conejo 1:200
(Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA. USA). Una vez cumplido ese periodo se
realizaron dos lavados con PBS-Tritón 0,1 %, se incubó con el complejo avidina-peroxidasa
diluido 1:100 (ABC, Kit Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA. USA) por 1 hora a 37 ºC.
Posteriormente se realizaron dos lavados con PBS-Tritón 0,1 % y se agregó 20 L del sustrato
de la peroxidasa diaminobencidina (buffer + 1,25 mL agua destilada + 40 L DAB + 20 L
H2O2), desarrollándose la marca café característica. El control negativo de los cortes se realizó
en las mismas condiciones, sin la incubación con el anticuerpo primario anti-TRH.
44
3.5.3.- Hibridación in situ.
Se
utilizó
el
oligonucleótido
de
DNA
correspondiente
a
la
secuencia
5`-GTCTTTTTCCTCCTCCTCCCTTTTGCCTGGATGCTGGCGTTTTGTGAT-3`,
complementaria a las bases 319-366 de pro-TRH (65) y obtenida de Sigma-Genosys Ltda.
(Londres, UK). Se
marcó mediante transferasa terminal en su extremo 3`-OH con el
nucleótido dUTP-digoxigenina, utilizando Kit Dig-dUTP (Roche Diagnostics Corporation,
indiannapolis, IN, USA) y posteriormente el oligonucleótido se precipitó en etanol y se
resuspendió en agua tratada con DEPC.
Los cortes coronales de tejido de 12 m de los cerebros se colectaron en portaobjetos y se
fijaron en PFA al 4% en PBS por 30 minutos a 4 ºC, la hibridación se llevó a cabo según lo
descrito por Koller y cols. (66) con modificaciones menores. Después de lavados con PBS los
cortes se permeabilizaron con proteinasa K 0,001% (grado biología molecular, Merck,
Darmstad, Alemania) y tratados con anhídrido acético 0,25% en trietanolamina 0,1M, se
deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol y delipidados en cloroformo por 10
minutos y finalmente lavados en etanol y secados a temperatura ambiente. La hibridación se
realizó en una cámara húmeda a 37 ºC por 16 horas con 40 pmoles/mL del oligonucletidodigoxigenina de la TRH en la presencia de 4X SSC, formamida al 50%, solución de Denhart al
1%, 50 g/mL de DNA de esperma de salmón, dextran sulfato al 10 % y 125 g/mL de tRNA.
La hibridación se detuvo en 2X SSC y los cortes se lavaron en 4X SSC por 10 minutos y 3
lavados de 10 minutos en 2X SSC y finalmente en 2X SSC a 50 ºC por 15 minutos. Se
incubaron por 2 horas en una solución de acido maléico 0,1M NaCl 150 mM pH7,4
(amortiguador 1) en la presencia de Tritón-X100 0,03%, suero fetal de cabra al 3%,
fragmentos Fab antidigoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina diluido 1:500 (Roche
Diagnostics Corporation indiannapolis, IN, USA) y reactivo de bloqueo al 1% para
hibridación de ácidos nucleicos (Roche Diagnostics Corporation) después de un rápido lavado
en amortiguador 1, los cortes fueron incubados en NaCl 100mM, MgCl2 50mM, TRIS (pH
9,5) 100 mM en la presencia del sustrato de fosfatasa alcalina NBT-BCIP y levamizol 0,024%
por 16 horas a temperatura ambiente. La reacción fue detenida por un lavado de 30 minutos en
TRIS 10 mM, EDTA 1mM, pH 8,0. Los controles de la hibridación específica se realizaron
45
con el oligonucleótido-antisentido de digoxigenina en la presencia de 4 nmol/mL de la sonda
no marcada.
El conteo de las células y el análisis digital de los cortes mediante fotomicrografías del NPV
1,8 mm desde bregma de acuerdo al atlas de Paxinos y Watson (61), las fotomicrografías se
tomaron usando un microscopio óptico (Axioskop 20, Carl Zeiss, Germany) adosado a una
cámara digital (Coolpix 995, Nikon, Tokio, Japón). Para determinar la diferencia entre las
células parvocelulares y magnocelulares se toma ventaja de la diferencia en tamaño de estas
células. Al menos tres secciones de cada animal fueron contadas bilateralmente por dos
investigadores independientes, utilizando el programa Scion image (Scion Corporation,
Frederick, MD, USA)
3.6.- Estadística
Los datos en cada grupo experimental fueron expresados como promedios ± error estándar
medio (EEM). Los datos fueron comparados por el test de t de student para datos pareados y
análisis de varianza (ANOVA) para mediciones repetidas. Para grupos independientes se
utilizó ANOVA seguido por comparaciones múltiples de Newman-Keuls. Fueron
consideradas diferencias significativas con un valor de p< 0,05.
46
4.- RESULTADOS
4.1.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre los niveles de los mRNA de la TRH y su relación
con la inmunorreactividad para la TRH en el NPV del hipotálamo.
4.1.1.- Estudios de hibridación in situ para el mRNA de la TRH en el NPV.
Para determinar los niveles de expresión del mRNA de la TRH en las ratas controles y en las
ratas expuestas a 4° C por 48 y 64 horas, se realizaron ensayos de hibridación in situ con un
método no radioactivo. En las ratas controles se detectó marca correspondiente al mRNA de la
TRH en forma uniforme y se determinó que las células positivas fueron 186,6 ± 20,1 en la
totalidad del NPV. Al exponer las ratas a 4 ºC y analizar los niveles del mRNA de la TRH se
observó un aumento significativo del número de células positivas (330,4 ± 31,6) después de 48
horas a 4 ºC lo que corresponde a un aumento del 77%, por sobre el control. A las 64 horas de
exposición a 4 ºC se observó un aumento en el número de células positivas para el mRNA de
la TRH (397,5 ± 17,9), lo que correspondió a un aumento del 113% con respecto a los
controles (Figuras 11 y 12). La subdivisión parvocelular, es la región neuroendocrina donde
tradicionalmente se ha descrito la presencia de neuronas TRHérgicas. Los resultados obtenidos
mostraron que la exposición a 4° C por 64 horas aumentó la expresión de mRNA de la TRH
en la totalidad del NPV. En el NPV magnocelular, se observó 45,5 ± 6,9 células marcadas en
los animales controles, las que aumentaron a 70,2 ± 8,7 células en las 48 horas de exposición a
4 ºC y a 70,5 ± 3,3 células en las 64 horas de exposición a 4 ºC (Figura 13).
47
M
M
P
P
M
P
Figura 11. Fotografías del aumento en los niveles de expresión del mRNA de la TRH en el
NPV frente a la exposición a 4 ºC por 64 horas. Fotografías representativas de la
hibridación in situ para el mRNA de la TRH, donde se destaca la localización de neuronas
TRHérgicas en el Núcleo Paraventricular. (A) muestra el mRNA en las ratas controles, (B)
muestra el mRNA en las ratas expuestas a 4 ºC y (B´) muestra el control negativo de la
hibridación in situ. P, subdivisión parvocelular y M, subdivisión magnocelular. (59)
48
Figura 12. La exposición a 4° C por 48 y 64 horas aumenta los niveles del mRNA de la
TRH en el NPV. Se observa que la exposición a 4 ºC aumenta en el número total de células
que expresan mRNA de la TRH en el Núcleo Paraventricular. Datos mostrados como
promedios ± EEM. (Control, n =6; 48 horas a 4 ºC, n = 4; y 64 horas a 4 ºC, n = 7).
***p<0.001 vs. Control, de acuerdo al test de ANOVA. (59)
Figura 13. La exposición 4° C por 48 y 64 horas aumenta los niveles del mRNA de la TRH
en la subdivisión magnocelular del NPV. Se produce un aumento en el número de células
que expresan mRNA de la TRH en la región magnocelular del NPV. Los datos se muestran
como promedios ± EEM. (Control, n = 6; 48 horas a 4 ºC, n = 4 y 64 horas a 4 ºC, n = 7).
*p<0.05 vs. Control, de acuerdo al test de ANOVA. (59)
49
4.1.2.- Estudios inmunohistoquímicos de la TRH en el NPV.
Dado que se determinó un aumento en la expresión del mRNA para la TRH entre las ratas
controles y expuestas a 4 ºC, se analizó lo que ocurre con la expresión del péptido utilizando
un anticuerpo específico para la TRH.
Se observaron 384,09 ± 144,92 células inmunopositivas en el NPV de ratas controles y con
una distribución uniforme en el NPV. Al exponer a las ratas a 4 ºC durante 64 horas, el
número de células se duplicó detectándose 779,08 ± 154,03 células inmunopositivas (Figuras
14 y 15). La inmunorreactividad en la subdivisión magnocelular de las ratas controles
correspondió a 100,27 ± 32,87 células positivas las que aumentaron a 220,62 ± 55,91 células
inmunopositivas por el efecto de la exposición a 4 ºC (Figuras 14 y 16).
50
P
P
M
M
Figura 14. Fotografías del aumento por la exposición a 4 ºC por 64 horas en la
inmunorreactividad a la TRH en el NPV. Se muestran fotografías representativas del
análisis inmunohistoquímico para la TRH en el NPV. (A) Fotografía del NPV de las ratas
controles y (B) Fotografía del aumento de células inmunopositivas para la TRH en las ratas
expuestas a 4 ºC. P, subdivisión parvocelular y M, subdivisión magnocelular. (59)
51
Figura 15. La exposición a 4° C aumenta la TRH en la totalidad del NPV. Se observa que
la exposición a 4 ºC por 64 horas produce un aumento en el número total de células
inmunopositivas para la TRH en la totalidad del Núcleo Paraventricular. Datos presentados
como promedios ± EEM. (Control, n = 3 y 64 horas a 4 ºC, n = 3). ***p<0.001 vs. Control, de
acuerdo al test de t para datos no pareados. (59)
Figura 16. La exposición a 4° C aumenta la TRH en la subdivisión magnocelular del
NPV. Se produce un aumento en el número de células inmunopositivas para la TRH en la
región magnocelular del Núcleo Paraventricular en comparación a las ratas controles. Datos
presentados como promedios ± EEM. (Control, n = 3 y 64 horas a 4 ºC, n = 3). ***p<0.001 vs.
Control, de acuerdo al test de t de student para datos no pareados. (59)
52
4.2.- Contenido de la TRH en el NPV.
Se observó aumento en los niveles de expresión del mRNA y en la inmunorreactividad de la
TRH al exponer a las ratas a 4 ºC. Por esta razón, determinamos la concentración de la TRH en
el NPV que reflejaría la TRH sintetizada y disponible para ser secretada en el terminal nervioso
ubicado en la EM
Tabla I. Concentración y contenido de la TRH en el NPV de ratas expuestas a 4 ºC por 64
horas.
Región
Condición
Concentración de la TRH
(pg de TRH/mg tejido)
Contenido de la TRH
(pg)
NPV
Control
285,7 ± 36,4
1.790,0 ± 215,1
4 ºC
228,2 ± 20,4
1.717,1 ± 174,8
Los datos se expresan como el promedio ± EEM, n=8 ratas para cada condición.
4.3.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción de la TRH in vivo desde el NPV.
Dado que la exposición a 4 ºC causó tanto un aumento en los niveles del mRNA de la TRH y
en la inmunorreactividad de la TRH en el NPV magnocelular, en donde no se ha descrito un
papel funcional de neuronas TRHérgicas. Por lo tanto, determinamos si el efecto de la
exposición a 4 ºC por 64 horas se refleja en cambios en la actividad de las neuronas
TRHérgicas en la región del NPV (5). Se utilizó la exposición a 4 ºC por 64 horas, ya que en
este período se encontró activación del sistema nervioso simpático que inerva al ovario, lo cual
se podría asociar al aumento en los niveles del mRNA y el péptido de la TRH en el NPV
magnocelular.
Se determinó la secreción espontánea de la TRH desde el NPV magnocelular mediante la
perfusión push-pull en ratas controles y expuestas a 4 ºC por 64 horas y mantenidas a esta
53
temperatura durante la perfusión. Se observó en animales expuestos a 4 ºC una secreción
espontánea de TRH similar a la de los animales controles (Figura 17, A). Sin embargo, en las
ratas expuestas a 4 ºC, se observó que existen dos tipos de picos de secreción: uno de baja
magnitud (Figura 17, A) y otro de alta magnitud que llega a ser de 8 veces sobre los valores
que se observaron en las ratas control (Figura 17, B). Se determinó que el valor promedio de
pico máximo de secreción de la TRH fue de 2,5 ± 1,1 pg/15 minutos en animales control vs.
4,0 ± 1,1 y 37 ± 9,4 pg/15 minutos para el promedio de los valores de pico máximo para los
animales expuestos a 4 ºC con baja y alta secreción, respectivamente. Estas secreciones de la
TRH corresponderían aproximadamente al 0,14%; 0,23% y 2,11% del contenido de la TRH
que se encuentra presente en el NPV en ratas controles, expuestas a 4 ºC de baja secreción y las
ratas expuestas a 4 ºC de alta secreción, respectivamente. La representación estadística de estos
patrones de secreción se encuentra en la figura 18.
54
A
Secreción de TRH (pg/15min)
Control
4 ºC
6
Rata
Rata
Rata
Rata
4
9
4
1
3
2
0
0
15
30
45
60
75
90
105 120 Tiempo (min)
Secreción de TRH (pg/15 min)
B
4 ºC
50
40
30
Rata 6
Rata 8
20
10
0
0
15
30
45
60
75
90
105 120 Tiempo (min)
Figura 17. La exposición y perfusión a 4° C aumenta la secreción de la TRH desde el NPV
magnocelular. Se realizaron perfusiones en el NPV magnocelular (coordenadas respecto a la
bregma, Lateral: 0,6; Antero-posterior: -1,8 y Dorso-ventral: 0,81 mm) mediante la técnica de
cánula push-pull en ratas en libertad de movimiento tanto controles y como ratas a 4 ºC por 64
horas que se mantuvieron a 4 ºC durante la perfusión con LCRa. Las líneas segmentadas
muestran la secreción de la TRH en las ratas controles, las líneas continuas muestran la
secreción de la TRH en las ratas expuestas a 4 ºC. (A) Se observa la secreción espontánea de
las ratas controles y la secreción espontánea y los picos de secreción de las ratas expuestas a
4 ºC. (B) Se observa una alta secreción de la TRH en ratas expuestas a 4 ºC. En la figura se
muestran dos perfusiones representativas para cada condición. La TRH secretada se cuantificó
mediante un RIA específico para la TRH.
55
Figura 18. Cuantificación de la secreción in vivo de la TRH. Los datos para las ratas
controles corresponden al promedio de la secreción de la TRH calculados de las muestras
obtenidas de la perfusión push-pull a temperatura ambiente (secreción espontánea control).
Para las ratas expuestas a 4 ºC se calcularon tres promedios: el primero representa la secreción
espontánea a 4 ºC, la segunda representa los valores promedios de los picos de secreción de
baja magnitud y el tercero corresponde a los picos de secreción de alta magnitud. Los
resultados son expresados como promedio ± EEM (control n=5; 4 ºC n=6). De acuerdo a test
de ANOVA (59).
* p<0,05 4 ºC baja secreción vs. control.
** p<0,01 4 ºC alta secreción vs. 4 ºC secreción espontánea.
*** p<0,001 4 ºC baja secreción vs. 4 ºC secreción espontánea.
Para analizar si el neurotransmisor glutamato promueve la secreción de la TRH, utilizamos en
ratas controles la misma técnica de implante y perfusión de cánula push-pull en el NPV
magnocelular in vivo y se perfundió una solución de 10 nM de L-glutamato durante 30
minutos. Como se observa en la figura 19, la administración de glutamato provocó un pico de
secreción de la TRH de 6,9 pg TRH/15 minutos. Cabe señalar que este experimento en donde
se administró L-glutamato, se repitió en dos animales más y en estos casos el efecto
56
estimulante de L-glutamato frente a la secreción de la TRH fue aún mayor, sobrepasando el
límite de detección mayor para el RIA de la TRH.
Figura 19. L-glutamato estimula la secreción de la TRH desde el NPV magnocelular. En
ratas a temperatura ambiente, durante la perfusión se agregó 10 nM de L-glutamato a la
concentración de 10 nM, a través de la cánula push-pull durante 30 minutos. La flecha indica
el momento de ingreso de L-glutamato al NPV.
Destaca que la administración de 10nM de L-glutamato, produjo en el NPV una secreción de la
TRH en animales controles similar en magnitud a lo observado en las ratas expuestas a 4 ºC.
La secreción de la TRH observada desde el NPV magnocelular, que es justamente el lugar
donde se encuentran los cuerpos neuronales de las neuronas TRHérgicas, lo que sugiere que
esta secreción podría ser de origen dendrítico. Se ha observado una secreción dendrítica en las
neuronas magnocelulares oxitocinérgicas, que es dependiente de la concentración de Ca+2
interno y vasopresinérgicas del NPV, la que es dependiente de la concentración de Ca+2
externo e interno (67). Dado que el glutamato induce la secreción de la TRH y más aún que en
el NPV existen distintas poblaciones de receptores de glutamato como los tipo AMPA, Kainato
y NMDA y siendo este último un receptor permeable a Ca+2, se postuló que el glutamato
podría ser un mediador de la respuesta de la TRH a la exposición a 4 ºC.
57
4.4.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la liberación in vivo de neurotransmisores
aminoácidicos desde el NPV.
Los resultados anteriores indicaron que la exposición a 4 ºC provocó un aumento de la
secreción de la TRH en las neuronas del NPV magnocelular y que además estas neuronas
secretan la TRH por la estimulación neuronal con glutamato administrado localmente. En base
a esto, analizamos la secreción “in vivo” de neurotransmisores aminoácidicos, mediante la
técnica de perfusión push-pull y se analizó en la misma muestra la liberación local en el NPV
magnocelular del neurotransmisor excitatorio glutamato e inhibitorio GABA, mediante la
determinación por HPLC con detección fluorimétrica.
Observamos que la liberación de glutamato desde el NPV magnocelular de las ratas controles
fue de baja magnitud y presentó pocas fluctuaciones (liberación basal) (Figura 20 A). Al
exponer las ratas a 4 ºC por 64 horas y mantenidas a esta temperatura durante toda la
perfusión, se observó un marcado aumento en la liberación de glutamato evidenciada como la
aparición de pulsos de liberación de glutamato, por sobre aquella liberación observada en las
ratas controles (Figura 20 B). Durante el tiempo de perfusión se obtuvo como pico máximo de
liberación de glutamato de 3,2 nmoles/15 minutos en las ratas expuestas a 4 ºC en
comparación al valor máximo de 0,57 nmoles/15 minutos en ratas controles (Figura 20 A y B).
La representación estadística de la comparación entre la liberación de glutamato entre las ratas
controles y las expuestas a 4 ºC, determinado como el promedio de todos los puntos de
liberación, se observa en la figura 20 C. Cabe destacar que el aumento producido por la
exposición a 4 ºC en la liberación de glutamato desde el NPV magnocelular se correlaciona
con el aumento observado en la secreción de la TRH desde la misma región del NPV.
58
A
C
B
Figura 20. La exposición y perfusión a 4° C aumenta la liberación de glutamato desde el
NPV magnocelular. Se observan los perfiles de liberación obtenidos de perfusiones de cánula
push-pull en ratas controles (numeradas como 1, 2 y 3) y ratas expuestas a 4 ºC por 64 horas y
mantenidas a esa temperatura durante la perfusión (numeradas como 5, 6 y 7). (A) Liberación
espontánea de glutamato desde el NPV magnocelular de las ratas controles. (B) Liberación de
glutamato desde el NPV magnocelular de las ratas expuestas a 4 ºC. (C) Representación
estadística de la liberación de glutamato desde el NPV magnocelular. Los datos corresponden
al promedio de los valores en los tiempos de perfusión de cada animal que se observó en los
perfiles de liberación del grafico observado en (A) y (B). Los resultados son expresados como
promedio ± EEM de los 10 primeros tiempos de perfusión. (control n=3; 4 ºC n=3).
** p<0,0001 vs. glutamato liberado en las ratas controles de acuerdo al test de t de student
para datos no pareados.
59
Al determinar la liberación del neurotransmisor inhibitorio GABA en los mismos animales,
también se observó liberación espontánea de GABA desde el NPV magnocelular tanto de las
ratas controles como de las ratas expuestas a 4 ºC (Figura 21 A y B). En las ratas expuestas a
4 ºC se observó una liberación de GABA mayor en el primer periodo de tiempo de liberación
(15 minutos), la que se estabilizó rápidamente. La liberación que se observó en las ratas
controles y las expuestas a 4 ºC es continua y se mantiene estable sin presentar picos de
liberación como los observados en la liberación de glutamato, a pesar de que al exponer a un
animal a 4 ºC por 64 horas, se observó una mayor liberación de GABA, al realizar el análisis
estadístico de la liberación de GABA entre la condición control y la exposición a 4 ºC, este
aumento sólo produce una tendencia al alza en la liberación, como se observa en la
figura 21 C.
60
A
C
B
Figura 21. La exposición y perfusión a 4° C mantiene la liberación de GABA desde el
NPV magnocelular. Se observan los perfiles de liberación obtenidos de perfusiones de cánula
push-pull en ratas controles (numeradas como 1, 2 y 3) y ratas expuestas a 4 ºC por 64 horas y
mantenidas a esa temperatura durante la perfusión (numeradas como 5, 6 y 7). (A) Liberación
espontánea de GABA desde el NPV magnocelular de las ratas controles. (B) Liberación de
GABA desde el NPV magnocelular de las ratas expuestas a 4 ºC (C) Representación
estadística de la liberación de GABA desde el NPV magnocelular. Los datos corresponden al
promedio de los valores en los tiempos de perfusión de cada animal que se observaron en los
perfiles de liberación del grafico observado en (A) y (B). Los resultados son expresados como
promedio ± EEM de los 10 primeros tiempos de perfusión. (Control n=3; 4 ºC n=3).
61
4.5.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la
Eminencia Media.
Considerando los resultados de hibridación in situ e inmunohistoquímica en los cuales se
verificó un aumento en el número de neuronas que expresan tanto el mRNA y el péptido para
la TRH por el efecto de la exposición a 4 ºC por 64 horas (59), se determinó cambios en la
concentración y contenido de la TRH por efecto de la exposición a 4 ºC, en el NPV como lugar
de origen de las neuronas TRHérgicas y donde la secreción de la TRH cumpliría funciones
nerviosas y en la EM en donde se encuentran los terminales nerviosos de las neuronas
TRHérgicas y que cumple las funciones endocrinas. En el NPV, la exposición a 4 ºC no
produjo cambios ni en la concentración de la TRH (pg de TRH/mg de tejido) o en el contenido
total de péptido en el núcleo (Figura 22). Sin embargo, en la EM la exposición a 4 ºC
disminuyó tanto la concentración de la TRH como su contenido en la EM (Figura 22).
Concentración de TRH
(pg TRH/mg tejido)
2500
NPV
EM
2000
1500
**
1000
500
0
Control
4 ºC
(64 hrs)
Control
4 ºC
(64 hrs)
Figura 22. La exposición a 4 ºC por 64 horas, no cambia la concentración de la TRH en el
NPV y la disminuye en la EM. Determinación mediante RIA de la concentración de la TRH
en las ratas controles y expuestas a 4 ºC. Los resultados son expresados como promedio. ±
EEM. Control y 4 ºC por 64 horas, n=8 ratas para cada condición.
**p<0.01 versus control, de acuerdo a test de t de student.
62
4.5.1.- Análisis de la secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la Eminencia Media.
De acuerdo a los resultados mostrados anteriormente, se esperaba que en las ratas expuestas a
4 ºC existiera una mayor concentración de la TRH, que sería el reflejo de la TRH que se
secretó durante los estudios in vivo. Sin embargo, no hubo diferencia en la concentración de la
TRH en el NPV entre las ratas controles y las expuestas a 4 ºC. Para explicar esto, analizamos
la posibilidad de que en las ratas expuestas a 4 ºC existiera un control local de la secreción de
la TRH desde el NPV y de la EM. Para ello se analizó la secreción in vitro de la TRH desde el
NPV y la EM, tanto de las ratas controles como las expuestas a 4 ªC.
Estudiamos la secreción basal y la secreción inducida de la TRH por el estímulo despolarizante
de K+ 56 mM, de acuerdo a las condiciones previamente establecidas de incubación del NPV y
la EM (ver Figura 7, materiales y métodos). En la figura 23, se muestran gráficos
representativos de los perfiles de secreción de los tejidos provenientes de ratas controles que se
incubaron en un medio que presenta Mg+2, expresados como pg de TRH/mg de tejido (figura
23, panel superior) o como porcentaje de liberación fraccional (figura 23, panel inferior). En el
NPV la estimulación con K+ 56 mM, provocó un aumento en la secreción de la TRH
comparada con la secreción basal y al realizar un segundo estimulo con K+ 56 mM se observó
un leve aumento en la secreción de la TRH (figura 23 NPV en panel superior e inferior). En la
EM se presenta secreción basal de la TRH, además de liberación inducida por el estimulo
despolarizante de K+ 56 mM, el cual produjo un leve aumento sobre la secreción basal, cabe
destacar que el aumento en la secreción de la TRH se mantuvo y respondió a un segundo
estímulo despolarizante de K+ 56 mM (figura 23 EM en panel superior e inferior).
63
A
A`
B
B`
Figura 23. Perfil de secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la EM de ratas controles.
La secreción de la TRH se obtiene de incubaciones seriadas de 10 minutos de NPV y EM
proveniente de ratas controles que fueron incubados en medio de incubación en presencia de
Mg+2. En A y A` se observa la secreción de la TRH desde el NPV expresado como pg de
TRH/mg de tejido y porcentaje de liberación fraccional, respectivamente. En B y B` se observa
la secreción de la TRH desde la EM expresado como pg de TRH/mg de tejido y porcentaje de
liberación fraccional. La TRH secretada se cuantificó mediante un RIA específico para la TRH.
Los resultados son expresados como promedios ± EEM. n=3 ratas para cada condición,
K+= estímulo de K+ 56 mM.
En la figura 24, se muestran gráficos representativos de los perfiles de secreción de los tejidos
provenientes de ratas expuestas a 4 ºC que se incubaron en un medio ausente de Mg+2,
expresados como pg de TRH/mg de tejido (figura 24, panel superior) o como porcentaje de
liberación fraccional (figura 24, panel inferior). En el NPV la estimulación con K+ 56 mM,
provocó un aumento en la secreción de la TRH y el tejido es capaz de responder a un segundo
64
estimulo despolarizante de K+ (figura 24 NPV en panel superior e inferior). En la EM se
presenta secreción basal de la TRH, además de liberación inducida por el estimulo
despolarizante de K+ 56 mM, la que mantuvo niveles de secreción aumentado de la TRH
(figura 24 EM en panel superior e inferior).
Como se observa el patrón de secreción expresados como pg de TRH/mg de tejido o como
porcentaje de liberación fraccional fueron similares. Los resultados de los análisis posteriores
se utilizó la expresión como pg de TRH/mg de tejido.
A
A`
B
B`
Figura 24. Perfil de secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la EM de ratas expuestas
a 4 ºC. La secreción de la TRH se obtiene de incubaciones seriadas de 10 minutos de NPV y
EM proveniente de ratas expuestas a 4 ºC que fueron incubados en medio de incubación en
ausencia de Mg+2. En A y A` se observa la secreción de la TRH desde el NPV expresado como
pg de TRH/mg de tejido y porcentaje de liberación fraccional, respectivamente. En B y B` se
observa la secreción de la TRH desde la EM expresado como pg de TRH/mg de tejido y
porcentaje de liberación fraccional. La TRH secretada se cuantificó mediante un RIA
específico para la TRH.
Los resultados son expresados como promedios ± EEM. n=3 ratas para cada condición,
K+= estímulo de K+ 56 mM.
65
Los resultados sobre el efecto estimulante de la exposición a 4 ºC sobre la secreción de la TRH
en el NPV junto con la estimulación de la secreción de la TRH provocado por la
administración intra-NPV de glutamato y el aumento en la secreción de glutamato en el NPV
magnocelular en las ratas expuestas a 4 ºC, nos indicaron que el glutamato tiene una
participación importante en la regulación de la secreción de la TRH. Glutamato podría actuar
en los receptores del tipo AMPA, Kainato y/o NMDA. Este último corresponde a un canal
iónico de Na+ y Ca+2 activado por ligando, modulado por Mg+2, ión que bloquea al receptor
NMDA en forma sensible a voltaje (68, 69). Valiéndose del bloqueo de la actividad del
receptor del tipo NMDA por Mg+2, se realizaron los ensayos in vitro en presencia y ausencia de
este ión para determinar la participación de glutamato, además de determinar la participación
de GABA como neurotransmisor inhibitorio del NPV y de la EM.
4.5.2.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción basal de la TRH desde cortes de
tejido.
Al analizar la secreción basal de los tejidos provenientes de ratas controles y expuestas a 4 ºC,
no encontramos diferencia en la secreción basal de la TRH desde el NPV, ni tampoco se
observaron diferencias al incubar estos tejidos en ausencia o presencia de Mg+2, como
estrategia para determinar la posible influencia del receptor de glutamato NMDA (Figura 25,
panel superior). El hecho de no observar cambios en la secreción basal de la TRH desde el
NPV in vitro, se debe probablemente a que no estarían presentes las inervaciones que son
responsables de la secreción de la TRH.
En la EM, donde se encuentran los terminales de las neuronas TRHérgicas, existe un aumento
importante en la secreción basal de la TRH en las ratas controles en ausencia de Mg+2
(4,07 ± 0,55 pg de TRH/mg tejido para la EM de ratas controles en presencia de Mg+2 y de
10,87 ± 1,82 pg de TRH/mg tejido para la EM incubadas en ausencia de Mg+2 (Figura 25,
panel inferior). En la EM de ratas expuestas a 4 ºC sin embargo, no se observaron estas
diferencias en la secreción de la TRH dependiente de Mg+2, alcanzando valores similares a lo
observado en las ratas controles.
66
Liberación basal de TRH desde el NPV
NPV
de ratas controles y estresadas
Secreción de TRH
(pg de TRH/mg tejido)
15
Mg+2
Sin Mg+2
10
5
0
Control
Control
ºCpor
por64
64 hrs
hrs
4 4ºC
Liberación basal de TRH desde la EM
EM de ratas controles y estresadas
Secreción de TRH
(pg de TRH/mg tejido)
15
***
***
Mg+2
Sin Mg+2
10
5
0
Control
Control
por64
64 hrs
hrs
4 4ºCºCpor
Figura 25. La secreción basal de la TRH desde cortes de NPV no presenta cambios y en la
EM disminuye frente a la exposición a 4 ºC secreción de la TRH obtenida de acuerdo a los
protocolos de secreción indicados en materiales y métodos. NPV, secreción basal desde NPV y
EM, secreción basal desde la EM. Los resultados son expresados como promedios ± EEM.
Número de experimentos: Ratas Controles, con Mg+2 n=6, sin Mg+2 n=3 y 4 ºC por 64 hrs, con
Mg+2 n=3, sin Mg+2 n=12.
*** p<0,001, de acuerdo a test de t de student.
67
4.5.3.- Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción inducida de la TRH frente al
estímulo despolarizante de K+ 56mM.
Se estudió la secreción de la TRH frente al estímulo de K+ 56 mM para determinar capacidad
de secreción de la TRH y la viabilidad de los tejidos frente a un estímulo despolarizante. Al
exponer cortes del NPV a K+ 56 mM, hubo un aumento en la secreción control de la TRH,
aunque su magnitud no fue similar a la observada en las ratas expuestas a 4 ºC. En la EM se
observó una disminución marcada en la secreción de la TRH en las ratas expuestas a 4 ºC,
obteniéndose un valor de 1,36 ± 0,39 pg de TRH/mg tejido comparado con 3,68 ± 1,02 pg de
TRH/mg tejido para las controles. Es decir, en la EM de las ratas expuestas a 4 ºC disminuyó
tanto la secreción basal como la inducida de la TRH (Figura 26).
68
Liberación neta de TRH desde el NPV
NPV de ratas controles y estresadas
Secreción de TRH
(pg de TRH/mg tejido)
8
Mg+2
Sin Mg+2
6
4
2
0
Control
4 ºC por 64 hrs
Liberación neta de TRH desde la EM
EM de ratas controles y estresadas
*
Secreción de TRH
(pg de TRH/mg tejido)
8
Mg+2
Sin Mg+2
6
4
2
0
Control
4 ºC por 64 hrs
Figura 26. Efecto de la exposición a 4 ºC sobre la secreción inducida por K+ 56 mM de la
TRH desde el NPV y la EM. Los resultados se presentan como secreción neta calculada como
la secreción total inducida por K+ 56 mM menos el promedio de la secreción basal de cada
animal. Los resultados se presentan como promedios ± EEM, de un n=6 para controles y 4 ºC
por 64 horas, n=6.
*p<0,05, de acuerdo a test de t de student.
69
Dado que un estímulo despolarizante como el usado en este trabajo no sólo despolariza
neuronas TRHérgicas, sino también todas las neuronas y terminales presentes en la preparación
- y de esta forma estimula la secreción de neurotransmisores excitatorios e inhibitorios
presentes en los tejidos - quisimos analizar si la neurotransmisión GABAérgica que ha
demostrado estar presente en el NPV y la EM es un componente importante en la funcionalidad
de las neuronas TRHérgicas en nuestro sistema de estudio.
4.5.4.- Regulación GABAérgica de la secreción de la TRH.
Para analizar si la inervación GABAérgica participa en laGsecreción de la TRH desde el NPV,
G
B
B
A
concentración
A
A
se utilizó como herramienta farmacológica el antagonista
competitivo
de los receptores
A
GABAA, bicuculina (100 M), considerando que esta
del fármaco estimula la
secreción in vitro de somatostatina hipotalámica (37).
La presencia de bicuculina, no modificó la secreción basal de la TRH desde el NPV de ratas
controles, ya sea en presencia o en ausencia de Mg+2 (que facilitaría la activación de los
receptores de glutamato del tipo NMDA) (Figura 27). En cambio en el NPV de animales
expuestos a 4 ºC se observa que la presencia del antagonista provocó un aumento significativo
de la secreción basal de la TRH (Figura 27). Es decir se observó un claro aumento de la TRH
en el NPV proveniente de animales expuestos a 4 ºC cuando se eliminó la actividad
GABAérgica sólo en ausencia de Mg+2, indicando que GABA regula la secreción de la TRH
desde el NPV frente a la exposición a 4 ºC.
En la EM de ratas controles hubo un aumento significativo de la secreción basal de la TRH en
ausencia de Mg+2, sugiriendo la participación de receptores NMDA en la secreción basal de la
TRH de la EM en condiciones controles y este aumento no fue modificado en presencia de
bicuculina. (Figura 27). Considerando lo observado en la EM de las ratas expuestas a 4 ºC, se
sugiere que en la EM, donde se localizan los terminales nerviosos de las neuronas TRHérgicas,
los receptores GABAA no modularían la secreción de la TRH a diferencia de lo observado en el
NPV, lugar de origen de estas neuronas.
70
Liberación basal de TRH desde el NPV de ratas controles
y estresadas en presencia de Bicucullina
NPV
***
*
Secreción de TRH
(pg de TRH/mg tejido)
6
Mg+2
Sin Mg+2
4
2
0
-
Bicuculina
-
+
Control
+
4 ºC por 64 hrs
Liberación basal de TRH desde la EM de ratas controles
y estresadas en presencia de Bicucullina
EM
Secreción de TRH
(pg de TRH/mg tejido)
15
***
***
**
Mg+2
Sin Mg+2
***
10
5
0
Bicuculina
-
+
Control
-
+
4 ºC por 64 hrs
Figura 27. La inhibición del receptor GABAA aumenta la secreción basal in vitro de la
TRH en el NPV y en la EM no tiene efecto. Se observa que al incubar el NPV en un medio
que presenta bicuculina (100 M), un inhibidor competitivo del receptor GABAA, las ratas
expuestas a 4 ºC presentan un aumento en la secreción basal de la TRH. En EM no se observa
diferencia en presencia de bicuculina. Ratas Controles, n=3 y 4 ºC por 64 horas, n=3.
Los resultados son expresados como promedios ± EEM.
*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, de acuerdo a test de t de student.
71
4.5.5.- Regulación glutamatérgica de la secreción de la TRH.
Se verificó si la activación de receptores glutamatérgicos en el NPV y la EM participan en la
secreción de la TRH. Para este objetivo se incubaron tejidos en presencia de MK-801 (50 M),
antagonista no-competitivo de los receptores glutamatérgicos del tipo NMDA.
Dado que la secreción basal de la TRH en el NPV de las ratas expuestas a 4 ºC incubadas en
medio sin Mg+2 y en presencia de bicuculina, se observó un aumento de la secreción basal de la
TRH, lo que podría indicar que la exposición a 4ºC activaría la liberación de glutamato. Se
observó que el aumento en la secreción basal de la TRH inducida por el bloqueo de los
receptores GABAA (4,50 ± 1,07 pg de TRH/mg de tejido) se previene al bloquear el receptor
NMDA con MK-801 (50 M) (2,29 ± 0,36 pg de TRH/mg de tejido), sugiriendo que en la
secreción basal de la TRH en animales expuestos a 4 ºC existe la participación simultánea de
receptores GABAA y de los receptores del tipo NMDA (Figura 28). Este efecto solo se vería a
nivel de la secreción dendrítica de la TRH puesto que en la EM no se observó modificación por
la presencia de bicuculina y del MK-801 (Figura 28).
72
Liberación basal de TRH desde el NPV
de ratas estresadas
NPV
Secreción de TRH
(pg de TRH/mg tejido)
6
4
*
2
0
-
Bicuculina
MK-801
Mean
2.410
SD
1.242
+
+
-
+
Liberación basal de TRH desde la EM
de
ratas estresadas
Bicucullina
Bicucullina + MK-801
EM
N
6
Mean
4.503
SD
2.620
N
6
Mean
2.292
SD
0.875
N
6
Secreción de TRH
(pg de TRH/mg tejido)
15
10
5
0
Bicuculina
MK-801
-
Bicucullina
+
+
-
+
Bicucullina + MK-801
Mean
SD en N
Mean
SD basal
N in Mean
SD la TRH
N
Figura 28. El aumento
la secreción
vitro de
desde el NPV por la
9.661
7.012
6
7.132
5.730
6
5.354
2.822
6
inhibición del receptor GABAA, es bloqueado por el antagonista no-competitivo el
receptor NMDA de glutamato, MK-801. Efecto de incubar el NPV y la EM de ratas
expuestas a 4 ºC en un medio sin Mg+2 que presenta bicuculina (100 M), un antagonista
competitivo del receptor GABAA y MK-801 (50 M) un antagonista no-competitivo del
receptor NMDA. Ratas expuestas a 4 ºC por 64 hrs, n=6. Los resultados son expresados como
promedios ± EEM.
*p<0,05 vs. Incubación sólo en presencia de bicuculina, de acuerdo a test de t de student.
73
5.- DISCUSIÓN.
En esta tesis se planteó la hipótesis de que la secreción de la TRH desde las neuronas del NPV
aumenta en respuesta a la exposición a 4 ºC siendo el glutamato uno de los neurotransmisores
involucrado en estos cambios. De acuerdo a los estudios realizados, se observó que en la
exposición a 4 ºC aumentó los niveles de expresión del mRNA y el péptido de la TRH en todo
el NPV y también en la región magnocelular. In vivo, la exposición a 4 ºC aumentó la
secreción de la TRH, glutamato y se mantuvo la de GABA desde el NPV magnocelular. Se
estableció in vitro que la regulación de la secreción de la TRH desde el NPV por la exposición
a 4 ºC participaría la neurotransmisión glutamatérgica y GABAérgica a través, de receptores
del subtipo NMDA y GABAA, respectivamente, sin descartar la participación de otros
neurotransmisores. En cambio, en la EM se estableció que el componente excitatorio es el
predominante en la secreción de la TRH.
Los estudios realizados por Zoeller y cols. mediante un método radioactivo (57), mostraron un
aumento en la expresión del mRNA de la TRH en el área tirotrófica del NPV (parvocelular)
posterior a 48 horas de exposición a 4 ºC. En conjunto a los hallazgos de Sánchez y cols. que
evidenciaron incrementos del mRNA de la pro-TRH en la lactancia y frente a exposición aguda
a 4 ºC, a nivel de las neuronas presentes en la zona rostral, media y caudal del NPV (70),
entregaron evidencias de la respuesta en las neuronas TRHérgicas del NPV frente a distintos
tiempos de exposición a 4 ºC. En esta tesis se analizó la expresión del mRNA de la TRH en el
NPV, frente a la exposición de 4 ºC por 48 y 64 horas en el NPV y observándose un aumento
en la expresión del mRNA de la TRH en la región magnocelular, ampliando los estudios
previamente realizados en las neuronas TRHérgicas (57, 70).
La diferencia con otros estudios de localización del mRNA en el NPV y fundamentalmente el
hallazgo de células marcadas en la región magnocelular, se debió probablemente al uso de la
sonda de oligonucleótido marcado con digoxigenina, marcación que posee buena penetración y
excelente resolución espacial y que a su vez presenta una sensibilidad tan buena como el
método radioactivo (71, 72).
74
El hecho de que los cambios en la expresión del mRNA de la TRH, ocurran
concomitantemente con cambios bioquímicos de actividad simpática en el ovario (16), ha
permitido plantear la posibilidad de que la activación de la vía TRHérgica desde el NPV
proporciona una unión funcional vegetativa, apoyada por la descripción morfológica de
conectividad polisináptica entre el ovario y el NPV, mediante la administración de un trazador
viral transneuronal en el ovario (2, 22). De hecho varios trabajos han indicado la actividad no
endocrina de la TRH la cual estaría involucrada en el control de varias funciones fisiológicas
tales como termorregulación (73) activación de la secreción ácida gástrica vía inervación vagal
(74) y en la regulación actividad simpática ovárica (5). La modulación que se ejerce desde el
NPV sobre el sistema simpático, se ha atribuido principalmente a las neuronas que se
encuentran en la región parvocelular-medial del núcleo (75), sin embargo, no existen
evidencias de esta relación funcional específicamente que involucre a las neuronas
TRHérgicas. En forma paralela existen funciones simpáticas de neuronas vasopresinérgicas
ubicadas en la región magnocelular del NPV (76) y considerando que las neuronas
vasopresinérgicas magnocelulares son sensibles a frío (77) el aumento en el número de las
células que expresan el mRNA de la TRH en el PVN magnocelular por 48 y 64 horas de
exposición a 4 ºC se debe tener en consideración, ya que se observó colocalización de células
AVP y células TRHérgicas en el NPV magnocelular (78).
Elegimos 64 horas de exposición a 4 ºC porque, en este período, hay un aumento específico de
tirosina hidroxilasa (enzima limitante de la síntesis de catecolaminas) en blancos simpáticos
como las glándulas suprarrenales y el ganglio cervical superior (60). En estas condiciones
experimentales, se ha observado alteraciones en marcadores simpáticos en el ovario y ganglio
celíaco (es decir justamente en el sitio de origen de los nervios simpáticos que inervan al
ovario). Considerando que la exposición a 4 ºC gatilla simultáneamente, la producción y
secreción neuroendocrina de la TRH (observados como un aumento en los niveles plasmáticos
de TSH (79)), sugiere una correlación temporal entre los acontecimientos neuroendocrinos y
vegetativos en la cual la TRH actuaría como una molécula reguladora (25).
El aumento en la expresión del mRNA de la TRH en la región magnocelular del NPV frente a
la exposición a 4° C por 64 horas junto con el aumento en la inmunorreactividad para el
75
péptido de la TRH, sugieren que tanto el mRNA como el péptido de la TRH se encuentran
situados en los cuerpos neuronales de la región parvocelular. Esta región corresponde a la zona
característica de estas neuronas y de manera igualmente importante aumentó en la región
magnocelular del NPV. este aumento es propio de esta región, ya que no se observó
inmunorreactividad de las proyecciones axonales que provienen de la región parvocelular (30).
Previamente se ha demostrado mediante métodos inmunológicos, la localización del péptido de
la TRH en la región magnocelular del NPV (78, 80). Utilizando colchicina, una droga que evita
la polimerización de los microtúbulos, se detectó por primera vez la acumulación en el NPV de
las vesículas que almacenan la TRH (78). Similarmente Anraku y cols. (81), en ausencia del
tratamiento con colchicina, visualizaron cuerpos neuronales inmunorreactivos a la TRH en el
NPV magnocelular humano (80). Nuestras observaciones claramente demostraron que la
marcación inmunohistológica para la TRH es más intensa en los animales expuestos a 4 ºC que
en los controles (aumentó al doble la inmunorreactividad), utilizando dos anticuerpos
caracterizados anti-TRH de distintos fuentes (82, 83).
Aunque no se determinó la localización subcelular de la TRH, es posible que el aumento en la
expresión del mRNA de la TRH inducido por la exposición a 4 ºC, se refleje en una mayor
traducción, procesamiento y almacenamiento del péptido, obteniéndose una mayor cantidad de
la TRH disponible para ser secretado y por ende almacenado en vesículas de secreción.
Se observó en el NPV que el número de células inmunopositivas para la TRH es el doble del
número de células que expresan el mRNA de la TRH en los estudios morfológicos
provenientes de las ratas controles y de ratas expuestas a 4 ºC, este aumento en el número de
células inmunopositivas sugiere por una parte que se presentan más células del NPV que
almacenan la TRH que es procesada o que la sensibilidad de la técnica de hibridación in situ,
no permita evidenciar la totalidad de las células que expresan el mRNA de la TRH y que
presentan el tripéptido.
La determinación de la TRH en los perfusados obtenidos por push-pull desde el NPV
magnocelular, sugiere secreción dendrítica de la TRH. Este tipo de secreción se ha descrito en
las neuronas oxitocinérgicas y vasopresinérgicas del NPV magnocelular y regula de forma
autocrina y paracrina las neuronas en esta región del NPV (84). La secreción dendrítica
76
controla la descarga neuronal (85) y como se ha reportado recientemente, se necesitan
contactos sinápticos excitatorios para mantener descargas fásicas en las células
magnocelulares neurosecretoras (86). Por lo que, dado que en las neuronas oxitocinérgicas y
vasopresinérgicas el patrón de descarga es autorregulado por la secreción dendrítica que actúa
a nivel pre-sináptico y post-sináptico, los patrones de secreción de la TRH observados durante
la perfusión push-pull pueden estar dado por este mismo mecanismo de regulación, aunque no
se ha descrito aún la presencia de receptores de la TRH en las neuronas del NPV.
La actividad estimuladora de aferencias excitatorias en el NPV magnocelular podría dar
cuenta de los pulsos en la secreción de la TRH in vivo inducida por la exposición a 4 ºC.
Debido a que la TRH ejerce importantes funciones vegetativas complementaria a su función
endocrina (5, 73, 74, 87), y que la TRH es capaz de regular la actividad de células que poseen
actividad vegetativa (88), es posible éstas sean mediadas a través de la secreción dendrítica de
la TRH desde el hipotálamo magnocelular. El aumento en la secreción de la TRH desde la
región magnocelular puede ejercer acciones autocrinas y paracrinas activando neuronas
relacionadas a funciones vegetativas del sistema nervioso periférico; como así mismo
ejerciendo acciones generalmente activadoras de la función neuronal, como las que se han
descrito en el retorno de la sedación inducida por barbitúricos, acciones neurolépticas o
relacionada con propiedades antidepresivas (revisado en (54)).
De acuerdo a la estructura morfo-funcional del NPV, no se puede descartar la posibilidad de
que la secreción de la TRH obtenida por la perfusión push-pull, provenga de neuronas de la
región parvocelular cuyos axones se prolongan a la región magnocelular (30), y que se
activarían en la respuesta endocrina frente a la exposición a 4 ºC. Sin embargo, esta
posibilidad es poco probable ya que se controló rigurosamente el sitio exacto de la
implantación de la cánula en la subdivisión magnocelular.
El hecho que la secreción de la TRH se modifique por efecto de la exposición a 4 ºC, planteó la
pregunta sobre si sería la TRH su propio modulador o si existían neurotransmisores
involucrados. De acuerdo a la hipótesis planteada, postulamos un efecto de aminoácidos
excitatorios, como glutamato e inhibitorio como GABA en esta regulación, sin descartar la
participación de otros neurotransmisores presentes tanto en el NPV como en la EM.
77
La administración de glutamato induce la activación de las inervaciones simpáticas periféricas
del tejido adiposo (31) o del sistema cardiovascular (44), con origen en el NPV y que pueden
estar modulados o tienen como intermediario la secreción de neurohormonas, idea que se ha
demostrado por la activación simpática periférica al administrar la TRH por vía i.c.v. (5). El
hecho que la perfusión con L-glutamato estimulara la secreción de la TRH desde el NPV
magnocelular, da mucha fuerza a la idea que un aumento local de glutamato regula la
funcionalidad del NPV y en este caso las neuronas TRHérgicas del NPV magnocelular. Dado
que la administración de glutamato activa la secreción de la TRH desde el NPV magnocelular,
determinamos que sucedió con este neurotransmisor y su contraparte inhibitoria
mayoritariamente presente en el SNC que corresponde a GABA.
Si existe esta relación funcional entre glutamato y la TRH, esperábamos cambios en la
secreción de este neurotransmisor durante la exposición a 4 ºC, dado que en el NPV existe
inervación glutamatérgica y GABAérgica que se vería afectada por esta exposición, se
determinó conjuntamente ambos neurotransmisores. Se observó que la exposición a 4 ºC
induce un marcado aumento en la liberación de glutamato, sin presentar cambios en la
liberación de GABA respecto a la liberación que presentaron las ratas controles. El eflujo de
glutamato fue pulsátil al igual que la secreción de la TRH; y no se correlacionaron
temporalmente con la de GABA.
La exposición a 4 ºC como estresor activa vías específicas del cerebro (23) y en nuestro caso
predominarían las vías excitatorias de glutamato que en el NPV son activadas por aferencias
NA (47), las que provendrían de estructuras del tronco cerebral como la médula ventral, NTS y
LC (29). En esta tesis se observó que la exposición a 4 ºC por 64 horas aumentó en forma no
significativa la liberación de GABA, activando a los receptores GABAA, cuya actividad
mantendría mas bien un tono inhibitorio sobre la secreción de la TRH en las neuronas del
NPV. En estudios de liberación in vivo de GABA y mediante la utilización de la técnica de
microdiálisis en el NPV de ratas expuestas a 24 horas a 4 ºC, otros autores han observado una
reducción en la liberación de GABA en comparación a ratas que se encontraban a temperatura
ambiente (89). Este resultado es diferente al nuestro posiblemente que en nuestro caso, debido
a una exposición más prolongada (64 horas), podría ocurrir una adaptación al frío. Sin
embargo, aunque in vivo se mantuvieron niveles constantes de liberación de GABA, los
78
estudios in vitro confirmaron que el GABA participa activamente de esta regulación del NPV
(ver adelante).
De acuerdo a estudios morfológicos recientes, existen terminales glutamatérgicos (dado por la
expresión del transportador vesicular de glutamato VGLUT2) en todo el NPV así como en la
región magnocelular (90, 91), además de contacto entre terminales VGLUT2 con neuronas
TRHérgicas en la subdivisión parvocelular (92, 93). Nuestros resultados por la exposición a
4 ºC son los primeros en indicar una relación funcional entre el aumento de la liberación de
glutamato y de la TRH desde la región magnocelular. Las limitaciones técnicas de nuestros
procedimientos no nos permitieron resolver si la liberación de glutamato correspondía
simultáneamente a una descarga de secreción de la TRH. Esta posibilidad podrá evaluarse a
futuro mediante la administración de antagonistas de receptores de glutamato en el NPV
durante la perfusión push-pull, lo cual permitiría específicamente determinar la participación
funcional de estos receptores en la secreción de la TRH.
El conjunto de estos resultados nos permiten sugerir que el aumento de la expresión del mRNA
de la TRH, de la inmunorreactividad del péptido y de la liberación de glutamato podría estar
gatillado por la inervación noradrenérgica desde el LC y adrenérgica proveniente del NTS o de
otras regiones del cerebro. En apoyo a ésto, recientemente se estableció que frente a la
exposición aguda a frío, NA activa la biosíntesis de la pro-TRH en el NPV (94). Se sugiere
además que la activación de las neuronas TRHérgicas por glutamato, produciría una activación
de las cascadas de transducción río abajo del receptor que llevan a la fosforilación del factor
transcripcional CREB (cAMP-Ca2+ response element-binding protein), el que produce un
aumento en la transcripción del mRNA de la pro-TRH, mecanismo que ya se ha descrito para
las neuronas TRHérgicas del NPV (95, 96). Se ha establecido que la fosforilación del factor
transcripcional CREB se activa por la neurotransmisión glutamatérgica, que aumenta la
conductancia a Ca+2, permitiendo la activación de las cascadas de transducción de señales vía
MAPK (mitogen-activated protein kinases) o Ca+2-calmodulina los que llevan a la fosforilación
de CREB y por consiguiente la expresión de genes (97). El aumento en la expresión el mRNA
de la TRH frente a la exposición a 4 ºC se activaría por la vía de transducción de señales
favorecida por la fosforilación de CREB y posterior transcripción del mRNA de la pro-TRH
(Figura 29).
79
Glutamato
GABA
Glutamato
APO
NPV
(TRH)
TRH
GABA
NDM
HHT
AMPA
NMDA
Mg+2
Tronco cerebral
Ca+2
TRH
[Ca+2]
Pro-TRH
Médula espinal
mRNA TRH
Piel
(Termorreceptor)
CREB-P
Figura 29. Conexiones anatómicas y funcionales que activarían las neuronas TRHérgicas
del NPV en respuesta a la exposición a frío. Frente a la exposición a frío se activarían las
neuronas TRHérgicas por un aumento en la neurotransmisión glutamatérgica que se activa por
la inervación noradrénergica y adrenérgica proveniente del tronco cerebral o de otras regiones
del cerebro, la que a través de un aumento intracelular de Ca+2 se activan vías de transducción
de señales y activación de factores de transcripcionales, los que incrementan los niveles del
mRNA de la TRH y del procesamiento de la pro-TRH.
APO: Área preóptica, CREB-P: cAMP-Ca2+ response element-binding protein fosforilado,
HHT: Eje hipotálamo-hipófisis-tiroides, NDM: Núcleo dorso medial
80
Ya que el conjunto de nuestros resultados señalaban que la exposición a 4 ºC producía un
aumento en la liberación de glutamato relacionado con el aumento en la secreción de la TRH in
vivo y en la expresión del mRNA para la TRH y el péptido, nos pareció fundamental estudiar
in vitro la participación de los neurotransmisores reguladores glutamato y GABA en la
secreción de la TRH
La concentración y contenido de la TRH en el NPV entre las ratas controles y las expuestas a
4 ºC, resultó ser similar entre ambos grupos de animales, a pesar que los datos de hibridación
in situ e inmunohistoquímica indicaban aumento de la TRH en las ratas expuestas a 4 ºC (59).
El hecho de no existir cambio en el contenido de la TRH en el NPV entre las ratas controles y
las expuestas a 4 ºC, podría explicarse por el aumento en la secreción de la TRH desde el NPV
observado al exponer a las ratas a 4 ºC por 64 horas (secreción de la TRH in vivo mediante
perfusión push-pull), como también por el transporte axonal de la TRH hacia el terminal
nervioso que explicaría la existencia de una mayor cantidad de la TRH en la EM.
La disminución en el contenido de la TRH en la EM respecto al contenido de la TRH de las
ratas controles, puede ser consecuencia del aumento en la secreción de la TRH desde el
terminal nervioso en la EM activado por la exposición a 4 ºC (25), confirmado además por el
aumento de la T3 plasmática (5). A su vez se puede sugerir que el aumento en la secreción de
la TRH desde el cuerpo neuronal en el NPV por efecto de la exposición a 4 ºC, disminuiría la
cantidad de la TRH disponible para ser transportada al terminal nervioso de la EM para ser
secretada por despolarización. El aumento en la secreción dendrítica comprobada por los
experimentos de push-pull in vivo haría que exista una menor cantidad de la TRH para que se
transporte axonalmente hacia el terminal nervioso en la EM, y posiblemente la exposición a
4 ºC esté afectando transporte del péptido.
La determinación de la secreción in vitro de la TRH desde el NPV y la EM mediante una
técnica similar a la utilizada por Nikodèmovà y Strbák (56), nos permitió caracterizar la
secreción de la TRH desde el cuerpo neuronal (NPV) (efecto a nivel central) y desde el
terminal nervioso (EM) que corresponde a la secreción endocrina de la TRH. Adicionalmente
nos permitió la manipulación farmacológica para estudiar la participación relativa de los
neurotransmisores excitatorios e inhibitorios.
81
En el caso del NPV, la secreción de la TRH inducida por el estímulo despolarizante
(K+ 56 mM) fue mayor a la secreción basal y aunque no fue evidente en todas las condiciones
experimentales, el tejido fue capaz de responder a un segundo estímulo. En la EM se observó
una secreción basal de la TRH con niveles por sobre los observados en el NPV, diferencia que
no se estableció en los estudios in vitro de Nikodèmovà y Strbák (56). En la EM se observó
que posterior a la estimulación con K+ 56 mM la secreción de la TRH se mantuvo aumentada y
con gran variabilidad, sugiriendo que en esta área la secreción de la TRH podría activar
receptores de la TRH cuya presencia ha sido reportada (98) incrementando la excitabilidad
celular, favoreciendo la secreción de la TRH (99);. Por otra parte, aunque se ha descrito la
presencia de terminales GABAérgicos, estos posiblemente no se encontrarían regulando la
secreción de la TRH.
En la estimulación por despolarización por K+ del NPV, no se observó un efecto de la
exposición a 4 ºC. Dado que por este estímulo se despolarizan todas las neuronas presentes en
el tejido, no se puede discriminar si es un neurotransmisor excitatorio o inhibitorio el que se
encuentra regulando la secreción de la TRH.
En la EM proveniente de las ratas expuestas a 4 ºC tanto la secreción basal como la estimulada
con K+ fue menor a la del control. Esto sugiere que la exposición a 4 ºC activa el sistema
favoreciendo la capacidad de secreción de la TRH. Estos resultados indican que la
neurotransmisión GABAérgica presente en la EM no afecta de manera importante la
funcionalidad de los terminales de las neuronas TRHérgicas (100, 101).
Si la secreción de la TRH es un proceso que se activa por la exposición a 4 ºC, se esperaría una
mayor secreción basal en las ratas expuestas a 4 ºC. En nuestros estudios in vitro, no se
observaron diferencias en la secreción basal de la TRH desde el NPV entre las ratas controles y
las expuestas a 4 ºC como tampoco se observó cambios en la secreción basal de la TRH por la
presencia o ausencia de Mg+2. Estos resultados sugieren que se requiere la integridad de los
circuitos para activar la secreción de la TRH por el efecto de la exposición a 4 ºC, puesto que
en los cortes de tejido tendríamos sólo los terminales nerviosos de las aferencias. Es decir
podrían participar de este control estructuras provienen de las neuronas del área preóptica, NTS
82
(NA) o del núcleo del Rafé (5-HT), correspondientes a las vías sensoriales relacionadas a
termorregulación y específicamente frente a la exposición a 4 ºC (23, 25).
En la EM de ratas controles observamos una mayor secreción basal de la TRH en ausencia de
Mg+2, indicándonos la participación de glutamato en la secreción de la TRH. Esta idea se ve
reforzada por el hecho de la existencia de inervación glutamatérgica en la EM (102) y por
estudios in vitro con explantes y sinaptosomas de esta estructura en donde la secreción de
GnRH se induce por glutamato (103) En la EM de las ratas expuestas a 4 ºC, no se observaron
cambios en la secreción basal en presencia de Mg+2, siendo ésta similar al control indicando
que: a) la exposición a 4 ºC modifica la actividad de los terminales TRHérgicos y b) se
requiere de la integridad neuronal para que se active la secreción de la TRH desde el terminal
nervioso ya que estudios in vivo nos indican claramente que frente a la exposición a 4 ºC, se
estimula la secreción de la TRH desde el terminal nervioso (26, 28).
Se debe tener en consideración que el NPV es una estructura ampliamente regulada, hecho que
se ha demostrado morfológicamente por los múltiples contactos sinápticos de las neuronas
glutamatérgicas (40) y conjuntamente con neuronas GABAérgicas, en las subdivisiones del
NPV dando cuenta de la capacidad de regulación neuroendocrina de estos neurotransmisores
en
la
funcionalidad
de
este
núcleo
(34).
Específicamente
existen
evidencias
inmunohistoquímicas donde se encuentran terminales GABAérgicos (36), de neuronas
provenientes de regiones peri-paraventriculares e hipotalámicas cercanas al NPV, como
también terminales glutamatérgicos (92, 93) en contacto con cuerpos neuronales y dendritas de
las neuronas TRHérgicas de la subdivisión parvocelular del NPV.
En resumen, nuestros resultados entregan por primera vez evidencias de mecanismos asociados
en la regulación de la secreción de la TRH al inhibir específicamente al receptor GABAA en el
NPV. En animales controles no se modificó la secreción basal de la TRH, ya sea por ausencia
de Mg+2 o al inhibir el receptor GABAA. En cambio en las ratas expuestas a 4 ºC se observó
que la inhibición de los receptores GABAA produjo aumento en la secreción basal de la TRH
cuando el experimento se realizó en ausencia de Mg+2, por lo que al bloquear el tono
inhibitorio se expresó una activación local de la neurona TRHérgica a consecuencia de la
exposición a 4 ºC, evidenciando una activación debida a la participación de los receptores
NMDA de glutamato (ver adelante). Hasta el momento no se ha determinado el papel que
83
cumpliría este tipo de regulación en la funcionalidad de neuronas TRHérgicas del NPV. En las
sinapsis glutamatégicas, se encuentran colocalizados los receptores ionotrópicos AMPA y
NMDA. Los receptores AMPA son permeables principalmente a Na+ y K+ y dependiendo de
los subunidades que los conformen son permeables a Ca+2. Una vez que se libera el glutamato
de la neurona pre-sináptica, se activan rápidamente los receptores ionotrópicos AMPA, los que
facilitan el desbloqueo del Mg+2 de los receptores NMDA y por lo tanto, facilitan su activación
y por ende se produce ingreso de Ca+2 extracelular a la neurona post-sináptica. (97)
(ver modelo en Figura 30).
A diferencia de lo ocurrido en el NPV, al incubar la EM en presencia del antagonista de
GABA, no se observaron cambios en la secreción basal de la TRH en las ratas controles como
tampoco en las expuestas a 4 ºC, manteniéndose el mismo patrón de disminución de la
secreción basal de la TRH en los tejidos de las ratas expuestas a 4 ºC incubadas en ausencia de
Mg+2, indicándonos que: a) la influencia de la inhibición GABAérgica en la EM y que se
encuentra relacionada con la secreción de la TRH no es preponderante en su regulación y
b) que al tener aislada la EM no tenemos el control de las vías GABAérgicas que llegan a la
EM.
84
A
GABA
Glutamato
Mg+2
Mg+2
Mg+2
GABAA
Mg+2
TRH
NMDA
AMPA
Mg+2
Mg+2
Ca+2
+2
[Ca ]
TRH
B
Glutamato
GABA
TRH
GABAA
AMPA
Cl-
NMDA
[Ca+2]
Mg+2
Ca+2
TRH
C
Glutamato
GABA
TRH
TRH
Bicuculina
XGABA
A
Cl-
TRH
TRH
AMPA
NMDA
[Ca+2]
Mg+2
Ca+2
TRH
Figura 30. Modelo propuesto de la regulación de la activación de las neuronas
TRHérgicas del NPV por el receptor GABAA en las ratas expuestas a 4 ºC por 64 horas.
En (A y B) la incubación del NPV de ratas por la exposición a 4 ºC, en presencia o ausencia de
Mg+2 presentó una secreción basal de la TRH. En (C) se observó que al inhibir los receptores
GABAA del NPV de las ratas expuestas a 4 ºC incubadas en un medio ausente de Mg+2 se
presentó un aumento en la secreción de la TRH.
85
En un estudio previo, se ha encontrado que el NPV sería el origen de la actividad simpática
periférica cardiaca, cuya regulación esta dada por la participación de la actividad GABAérgica
en equilibrio con la actividad glutamatérgica, mecanismo que ocurre tras la activación de los
receptores de glutamato asociada a la inactivación de la actividad GABAérgica (104).
Nuestros resultados indican que el aumento en la secreción basal de la TRH en el NPV de las
ratas expuestas a 4 ºC, requiere de la inhibición de los receptores GABAA, asociada a la
ausencia de Mg+2 durante la incubación, evidenciándonos la participación de los receptores
NMDA (Figura 30).
Para confirmar la participación de este receptor en la regulación de la secreción de la TRH, se
agregó el antagonista no competitivo del receptor NMDA, MK-801 inhibiéndose la acción
estimuladora del bloqueo GABAérgico (bicuculina) en ausencia de Mg+2. De acuerdo a esto,
se confirmó la participación del receptor NMDA en la secreción basal de la TRH en las ratas
expuestas a 4 ºC y por ende la participación de glutamato como uno de los neurotransmisores
que media la secreción de la TRH en el NPV (ver modelo en Figura 31). El hecho de que
MK-801 sea un antagonista no-competitivo del receptor NMDA y que solo ejerce su acción
cuando el canal está activado (105), apoya fuertemente el planteamiento que frente a la
exposición a 4 ºC aumenta el tono excitatorio mediante la participación de aferencias y/o
interneuronas glutamatérgicas que actúan a través de receptores ionotrópicos post-sinápticos
localizados en neuronas del NPV magnocelular (106).
Al incubar la EM de las ratas expuestas 4 ºC en ausencia de Mg+2 y presencia de bicuculina
disminuyó la secreción de la TRH y al agregar MK-801 en el medio de incubación se observó
una tendencia a la disminución de la secreción basal de la TRH, indicio de que la
neurotransmisión glutamatérgica regularía los receptores del subtipo NMDA, los que
participan en la secreción de la TRH en la EM, sin descartar la participación de otros
neurotransmisores en la EM, donde se ha demostrado la existencia de regulación de la
secreción de la TRH frente a la exposición aguda a 4 ºC por la inervación adrenérgica a través
de receptores 1 adrenérgicos (28).
86
A
Glutamato
GABA
TRH
TRH
Bicuculina
TRH
TRH
XGABA
A
NMDA
AMPA
Mg+2
[Ca+2]
Cl-
Ca+2
TRH
B
Glutamato
GABA
TRH
TRH
MK-801
Bicuculina
XGABA
A
Cl-
AMPA
TRH
TRH
XNMDA
[Ca+2]
Mg+2
Ca+2
TRH
Figura 31. Modelo propuesto de la regulación de las neuronas TRHérgicas del NPV por el
receptor GABAA y el receptor ionotrópico de glutamato NMDA, en las ratas expuestas a
4 ºC por 64 horas. En (A) se observó que en la incubación del NPV en un medio ausente de
Mg+2 se aumentó la secreción de la TRH al inhibir el receptor GABAA. En (B) se muestra que
el aumento en la secreción de la TRH que se observó al inhibir el receptor GABAA es
bloqueado al inhibir el receptor NMDA de glutamato.
87
6.- CONCLUSIONES.
Los resultados obtenidos en esta tesis permiten concluir que:
1.- Los aminoácidos glutamato y GABA son reguladores neuronales del aumento de actividad
de las neuronas TRHérgicas inducida por la exposición a 4 ºC.
2.- Este aumento en la actividad secretora de las neuronas TRHérgicas está además asociada al
aumento en la expresión del mRNA y la inmunorreactividad para la TRH, tanto en la región
endocrina (parvocelular) como en la región neuroendocrina (magnocelular).
3.- Las neuronas TRHérgicas del NPV magnocelular presentan secreción dendrítica de la TRH
confirmando las funciones neuroendocrinas y extrahipotalámicas que presenta la TRH. .
4.- Finalmente, el hecho de encontrar una regulación diferencial por glutamato y GABA entre
el cuerpo neuronal (NPV magnocelular) y el terminal de las neuronas TRHérgicas (EM) nos
permite concluir que la actividad de la TRH se controla diferencialmente ya sea referido a
efectos endocrinos o autonómicos
88
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