Download aplicacion in vitro e in vivo de compuestos enjaulados con ligandos

Universidad de Buenos Aires
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Aplicación in vitro e in vivo de compuestos enjaulados con
ligandos neuroactivos
Tesis de Licenciatura en Ciencias Biológicas
Tesista: Julieta E. Campi
Director: Dr. Roberto Etchenique
Codirector: Dr. Gustavo Murer
Laboratorio de Dispositivos Moleculares
Instituto de Química-Física de Materiales, Medio Ambiente y Energía
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
Buenos Aires, Abril 2011
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A mis papás por dejarme
hacer mi propio camino,
a mis hermanas por
ayudarme a transitarlo.
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Agradecimientos
Quiero agradecer a la gente del labo por compartir tantas cosas fuera del laboratorio y por
hacer tan divertidas las horas pasadas adentro. También por estar siempre dispuestos a
escuchar resultados, proponer soluciones a problemas y a cortar la tarde para tomar un café
cuando alguno lo necesita. Gracias Betty, Marce, Richard, Eugecita, Euge, Vicky, Rober, Oski,
Gaby, Leo, Agus y a todos los que hayan formado parte del LDM formal o informalmente!!!
A Rober por haberme abierto las puertas de su laboratorio en un momento tan temprano de mi
carrera y por incentivarme a hacer lo que me gustaba, aunque eso significara tomar el camino
difícil.
A Oski, por ser Oski. Por estar SIEMPRE dispuesto a ayudarme. Por sacarme de las crisis con esa
tranquilidad que me genera. Por quedarse hasta las 11.30 de la noche en el laboratorio conmigo
tratando de averiguar qué le pasa al set-up. Gracias por las charlas, por los cafés, por las cenas,
los almuerzos. Por enseñarme todo lo que sé de electrofisiología y mucho más. Por preguntarme
qué me pasa, cuando me pasa algo. Por creer en mí. En fin, por ser la persona que más se ocupa
y preocupa por mí en el laboratorio y por haber hecho que lo considere una persona y un amigo
muy especial.
A Vicky por sus historias tragicómicas y por ayudarme a cargar con el peso de los ratones, que es
mucho más que 30 gramos!!!
A “los minis” por haberme dado el valor para embarcarme con ellos en lo que en esos
momentos parecía un delirio.
A Gustavo le agradezco toda la ayuda que me brindó y la disponibilidad que siempre tuvo para
reunirse, charlar de resultados, hacer experimentos, etc. Por leer esta tesis con tanta
responsabilidad y por las buenas sugerencias que surgieron de eso. Aprovecho también para
agradecerle a Julián por el tiempo invertido en esta tesis y a todo el laboratorio de Fisiología de
Circuitos Neuronales por haberme recibido tan bien.
A Vero de la Fuente, Gregorio Galiñanes y Lu Lucchina por ayudarme con la anestesia de los
ratones y la cirugía.
Agradezco a la gente del laboratorio de Lidia Szczupak por las sanguijuelas.
A mis amigos de exactas no puedo dejar de agradecerles todo lo vivido tanto adentro como
afuera de la facultad. Gracias por hacer esas ETERNAS horas de cursada y esas NUMEROSAS
horas de estudio tan divertidas. Gracias por todos los momentos que pasamos juntos: Lalo, Ceci,
Sofi, Euge, Maru, Mechi, Fede, Facu, Memi, Gaby, Fran, Mati, Vir, Dani, Eli y muchos más.
Quiero agradecer especialmente a Ceci y a Dardo. A Dardo (cuqui) por entenderme siempre aún
siendo tan distinto a mí y por siempre tener un buen consejo para darme. A Ceci por ser muchas
cosas de las que me gustan en una persona. Y a los dos en conjunto por estar en momentos
cuyo recuerdo siempre me alegra y por ser los tres lo que alguna vez fuimos.
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A Sofi porque aunque se haga la dura siempre tiene un buen consejo o una palabra de aliento
para dar demostrando todo su cariño y por acompañarme en las quejas. A Euge por su alegría
que siempre me contagia, por estos 9 años de Titas y Rhodesias y por ser del L5.
A Fabi por sus consejos y por preocuparse siempre por mí con tanta dulzura. También por
demostrarme en muchas ocasiones que puedo contar con ella para cualquier cosa.
A Soli por tantas cosas… Por su bondad insuperable, por su sensibilidad, por ser mi “melliza”
durante tantos años. Porque aunque estemos lejos la siento tan cerca como cuando sólo nos
separaba una calle. Porque a pesar de las cosas malas que le dio la vida no perdió esa bondad y
esa dulzura que la hacen ser la persona más especial que conocí en mi vida. Por ser
incondicional y una de las personas que más quiero en el mundo.
A Le y a Marcos por generarme sentimientos tan parecidos aún siendo tan distintos. A Le por
aguantar tantas cosas durante todo el secundario, como mi música, mis tristezas, mis alegrías
(que a veces eran más difíciles de aguantar que mis tristezas), mis jueguitos con colores en las
horas libres, etc. A Marcos por sacarme siempre una sonrisa que termina siendo una ruidosa
carcajada. Por contagiarme esa alegría que lo caracteriza. Y especialmente, porque pase lo que
pase, siempre va a seguir siendo mi “sobrino”.
A los Polo por ser mi segunda familia y por permitirme compartir tantas cosas con ellos durante
tantos años.
A Joaco por no dejar que miles de kilómetros nos separen. Por estar siempre presente. Por
ayudarme tanto en todo. Por ser una de las mejores personas que conocí. Por ser mi compañero
en todos los aspectos de la vida.
A los Navajas por todo el cariño que siempre me demuestran.
A mis hermanas por ser mucho más que sólo eso. A Merce por hacer tan bien la tarea de
hermana mayor. Por aconsejarme siempre y bien. A Ia por esperarme siempre con la comida
hecha después de 12 horas de cursada y 2 de viaje. Por tener la bondad de los hermanos del
medio. A las dos por ser las primeras amigas de mi vida. A Dani por ser la “cuarta hermana”. Por
no parar de hablar, por sus cambios de tema, por su espontaneidad y sus risas que siempre
terminan mezclándose con las mías.
A los Fedes por los lindos momentos en el campo, los asados, los partidos de tabú (esos que aún
haciendo trampa nunca pudieron ganar) y por ser, más que mis cuñados, mis hermanos.
A mi Mamá y a mi Papá por apoyarme en todas las decisiones, aún en las más difíciles. Por ser
incondicionales, por estar siempre. Por todo lo que nos dan y todo lo que hacen por nosotras.
En pocas palabras: por querernos tanto.
A Irma por ser la mejor tía del mundo!!
Y a todos los que aportaron algo para esta tesis, desde ideas hasta correcciones, pasando por
edición de imágenes y consejos en momentos de crisis… MUCHAS GRACIAS!!!
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Índice
1. Resumen ......................................................................................................................... 6
2. Introducción .................................................................................................................... 8
2.1 Compuestos enjaulados ............................................................................................ 8
2.2 Compuestos de coordinación .................................................................................. 11
2.3 Modelos biológicos .................................................................................................. 13
2.3.1 Ganglio de sanguijuela ...................................................................................... 13
2.3.2 Corteza cerebral de ratón ................................................................................. 16
2.4 Neurotransmisores .................................................................................................. 17
2.4.1 Ácido γ-amino butírico ...................................................................................... 17
2.4.2 Receptores de GABA ......................................................................................... 18
2.4.3 Glutamato ......................................................................................................... 18
2.4.4 Receptores de glutamato .................................................................................. 19
2.5 Ketamina .................................................................................................................. 20
2.6 Hipótesis y objetivos ................................................................................................ 20
3. Materiales y métodos ................................................................................................ 23
3.1 Compuestos enjaulados .......................................................................................... 23
3.1.1 Precursor ........................................................................................................... 23
3.1.2 Compuesto enjaulado de GABA ........................................................................ 24
3.1.3 Compuesto enjaulado de Glutamato ................................................................ 25
3.1.4 Preparación de los compuestos para los experimentos biológicos .................. 25
3.2 Animales .................................................................................................................. 25
3.2.1 Sanguijuelas....................................................................................................... 25
3.2.2 Ratones.............................................................................................................. 26
3.2.2.1 Pruebas de toxicidad in vivo........................................................................... 27
3.2.2.2 Pruebas de funcionalidad in vivo ................................................................... 27
3.3 Electrofisiología ....................................................................................................... 30
3.4 Análisis de datos ...................................................................................................... 32
4. Resultados ..................................................................................................................... 34
4.1 Sanguijuelas ............................................................................................................. 34
4.1.1 Prueba de funcionalidad de los compuestos enjaulados de GABA
([Ru(bpy)2(PMe3)(GABA)]+)......................................................................................... 34
4.1.2 Prueba de funcionalidad de los compuestos enjaulados de Glutamato
([Ru(bpy)2(PMe3)(Glu)]+) ............................................................................................ 35
4.2 Ratones .................................................................................................................... 36
4.2.1 Prueba de toxicidad in vivo de los compuestos enjaulados de Glutamato y de
GABA........................................................................................................................... 36
4.2.2 Prueba de funcionalidad del compuesto enjaulado de Glutamato .................. 36
4.2.3 Prueba de funcionalidad del compuesto enjaulado de GABA .......................... 38
5. Conclusiones ................................................................................................................. 42
6. Anexo ............................................................................................................................ 49
7. Bibliografía .................................................................................................................... 52
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1. Resumen
Los compuestos enjaulados están formados por dos partes: un grupo protector
(jaula) y una molécula bioactiva (enjaulado). El grupo protector puede unirse de forma
reversible a la biomolécula que de esta manera se vuelve inactiva debido a que ya no es
capaz de interactuar con los receptores específicos en las células. Cuando el enlace se
rompe por medio de un estímulo lumínico y la biomolécula queda libre, ésta recupera su
actividad biológica. La principal ventaja de esta herramienta es que permite controlar
temporal y espacialmente la liberación de concentraciones determinadas de un
compuesto de interés mediante el uso de una fuente de energía lumínica.
Hasta hace unos años, se necesitaba utilizar luz UV para poder liberar el enjaulado, lo
cual puede resultar perjudicial para los tejidos vivos. En este trabajo se utilizaron
compuestos enjaulados de coordinación a base de Rutenio, que tienen la particularidad
de ser fotoactivos mediante la absorción de luz visible (azul, en particular, aunque
también se puede utilizar luz verde).
El objetivo principal de este trabajo fue probar la funcionalidad y la toxicidad de dos de
estos
complejos, [Ru(bpy)2(PMe3)(GABA)]+ (donde bpy = 2,2’ bipiridina, PMe3 =
trimetilfosfina y GABA = ácido γ-aminobutírico) y [Ru(bpy)2(PMe3)(Glu)]+ (Glu =
Glutamato). Para llevarlo a cabo se realizaron experimentos con electrofisiología de
neuronas de sanguijuela (registros intracelulares in vitro) y de corteza cerebral de ratón
(registros extracelulares in vivo). Con este último modelo se obtuvieron resultados muy
novedosos, ya que los compuestos enjaulados no habían sido probados in vivo antes de
este trabajo. A su vez, se realizaron pruebas de toxicidad inyectando ratones
intraperitonealmente con una solución de compuesto enjaulado. Esto tampoco se había
realizado previamente, ya que las únicas pruebas existentes habían sido hechas en una
línea celular.
Las hipótesis planteadas fueron tres: las dos primeras plantean que tanto el
compuesto enjaulado de GABA como el de Glutamato producirán en las neuronas de
sanguijuela o en la actividad cortical del ratón el efecto esperado según la naturaleza del
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ligando desenjaulado. La tercera se refiere a que los compuestos no serán tóxicos para
el animal vivo, ya que recientemente se les han realizado algunas modificaciones con
este fin.
Puede decirse que los objetivos de esta tesis de licenciatura fueron alcanzados: por
un lado, se logró aplicar GABA y Glutamato enjaulado in vitro produciendo el efecto
buscado, por el otro, se pudo dar una prueba de que los compuestos enjaulados
también funcionan in vivo y se desarrolló una técnica para aplicarlos, y por último, los
resultados con las pruebas de toxicidad fueron concluyentes a la hora de demostrar que
los compuestos, en las concentraciones utilizadas, no presentan toxicidad aguda para un
ratón vivo.
Palabras clave: Compuestos enjaulados, GABA, Glutamato, electrofisiología, ganglio de sanguijuela, ratón.
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2. Introducción
2.1 Compuestos enjaulados
Hace ya más de dos milenios Platón situaba al cerebro en el lugar privilegiado de
controlar el comportamiento de los animales, mientras que otros filósofos
contemporáneos, como Aristóteles, pensaban que la razón estaba dada por el corazón,
quitando toda importancia al cerebro. La ciencia siguió siendo protagonista de
numerosos debates a través de los siglos, algunos de los cuales han quedado resueltos
mientras que otros aún siguen vigentes. El estudio del sistema nervioso resulta cada vez
más desafiante a medida que se va conociendo un poco más acerca del mismo. Cuando
se logra encontrar una respuesta a una pregunta la misma trae consigo muchos más
interrogantes, lo cual generó en el último siglo que numerosos científicos decidieran
dedicar sus vidas a enfrentar un gran reto: entender el cerebro. Así, una nueva disciplina
basada en varias ramas de la ciencia se fue afianzando a lo largo de los años hasta
constituir lo que actualmente se conoce como neurociencia. La matemática, la física, la
ingeniería, la química y la biología, entre otras, han aportado al desarrollo de
herramientas para el estudio del sistema nervioso.
Entre los aportes realizados desde la Química, se pueden nombrar a los compuestos
enjaulados (Ellis-Davies, 2007). Estos compuestos están formados por dos partes: un
grupo protector (jaula) y una molécula bioactiva (enjaulado). El grupo protector puede
unirse de forma reversible a esta molécula, que de esta manera se vuelve inactiva
debido a que ya no es capaz de interactuar con los receptores específicos en las células.
Cuando el enlace se rompe por medio de un estímulo lumínico y la molécula queda
libre, recupera su actividad biológica. La principal ventaja de esta herramienta es que
permite controlar temporal y espacialmente la liberación de concentraciones
determinadas de un compuesto de interés mediante el uso de una fuente de energía
lumínica (Figura 2.1).
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Figura 2.1: ejemplo de compuesto enjaulado (adaptado de Li, 1997)
Los primeros compuestos enjaulados surgieron en la década de 1970 (Patchornik et
al., 1970). Desde el momento de su aparición, numerosos experimentos han sido
realizados utilizando estos compuestos. Por ejemplo, en los comienzos de la década de
1990, se logró enjaular Inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), lo cual fue muy importante debido
a que esta molécula es un mensajero intracelular que media la respuesta de numerosos
neurotransmisores y hormonas (Parker et al., 1991). También, a partir del enjaulado de
varios neurotransmisores, se pudo estudiar la localización y la densidad de receptores
ionotrópicos en la membrana plasmática de neuronas (Denk, 1994).
Desde que se dieron a conocer, los compuestos enjaulados han ido conquistando
todas las áreas de la biología, y con el enjaulado de neurotransmisores la neurociencia
ha hecho mucho uso de esta herramienta tan útil para el estudio de circuitos neuronales
(Nerbonne, 1996). Por ejemplo, gracias a la existencia de estos dispositivos, se puede
estudiar qué tipo de conexión hay entre dos neuronas, registrando la actividad de una y
liberando neurotransmisor en otra (Callaway et al., 1993). Si se registra en la neurona
post-sináptica y se libera el enjaulado justo sobre la neurona pre-sináptica, se puede
determinar si la sinapsis es excitatoria o inhibitoria, dependiendo del efecto que se
produce en la neurona registrada después de la fotoliberación y del ligando que se esté
liberando. Si la sinapsis fuera excitatoria y se estuviera liberando un neurotransmisor
inhibitorio (con lo cual se inhibe a la presinapsis), lo que se vería es una disminución en
el potencial de membrana de la célula que se está registrando. Si por el contrario, la
sinapsis fuera inhibitoria, se vería una excitación (Figura 2.2). Esto se puede realizar
9
gracias a la precisión espacial que brindan los compuestos enjaulados, ya que, a pesar
de que el compuesto esté en contacto con todas las células, la molécula con actividad
biológica sólo interactuará con los receptores que se encuentren cercanos al punto de
su liberación y esto puede solamente afectar a una célula.
Figura 2.2: esquema de un posible experimento utilizando compuestos enjaulados. Se esquematiza una
pipeta con un electrodo para tomar registros intracelulares mientras se estimula con luz sobre otra
neurona con la cual está formando una sinapsis. Todas las neuronas están en contacto con el compuesto
pero el enjaulado sólo tendrá efecto sobre la neurona que reciba luz. Al liberarse la molécula con actividad
biológica sobre una de las neuronas, se debería observar un cambio en la actividad eléctrica de la que
está siendo registrada (si es que el compuesto se libera sobre la pre-sinapsis y se registra la post-sinapsis).
Dependiendo del efecto del neurotransmisor enjaulado y del tipo de sinapsis (inhibitoria o excitatoria) se
verá una inhibición o una excitación en la célula registrada. (Adaptado de Brewer et al., 2007).
Si bien pueden citarse una gran cantidad de trabajos realizados con compuestos
enjaulados (Lev-Ram et al., 1995, Wang et al., 1995; Wieboldt et al., 1994), estos
complejos presentaban ciertas desventajas que reducían su biocompatibilidad. Según
Pelliccioli y Wirz (2002), un buen grupo protector debe cumplir con los siguientes
criterios:
a) la fotoliberación debe ocurrir con una alta eficiencia cuántica;
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b) se debe poder fotoliberar con luz de longitudes de onda mayores a 300 nm, para
que la radiación no sea absorbida (o lo sea en menor medida) por el tejido
biológico;
c) los productos de la fotólisis no deben ser nocivos ni interferir en lo que se desea
investigar;
d) debe ser soluble en medios biológicamente amigables.
Los primeros compuestos enjaulados no cumplían con varios de estos criterios. Por
un lado, al ser moléculas orgánicas bastante hidrofóbicas, no eran solubles en solventes
polares, lo cual no es ideal a la hora de aplicarlos en un cultivo celular o en un animal
vivo. Por el otro, la absorción de luz ocurría a energías altas, por lo cual era necesario
irradiar el cultivo de células con luz de longitudes de onda cercanas a los 350 nm, es
decir, luz ultravioleta. Trabajar con luz UV no sólo es nocivo para las células, como ya se
mencionó, sino que aumenta los costos de equipamiento debido a la necesidad de
utilizar óptica de cuarzo. Además, estos compuestos no eran muy estables en solución
acuosa, por lo cual liberaban el enjaulado aun estando en oscuridad.
2.2 Compuestos de coordinación
Con la posibilidad de superar estas dificultades se desarrollaron en el laboratorio los
compuestos enjaulados basados en complejos de coordinación. En este tipo de
compuestos el átomo central es un metal de transición, el cual, en el caso de este
trabajo, es Rutenio (Zayat et al., 2003). Este centro puede formar enlaces de
coordinación con 6 ligandos, entendiéndose como ligando a una molécula capaz de
formar enlaces de coordinación con un metal. Para que esto sea posible el ligando debe
poseer un par de electrones libres con los cuales forma el enlace de coordinación con el
metal. Si estos ligandos forman una única unión con el metal se denominan ligandos
monodentados. En cambio, si forman más de una se denominan ligandos polidentados o
quelatos. Los ligandos monodentados pueden ser fotoliberados con mayor facilidad que
los polidentados. (Noval, 2010). La presencia del ligando bipiridina (figura 2.3) es crucial
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para el funcionamiento de estos complejos, ya que toda la fotoquímica que permite el
desenjaulado depende de la interacción de ésta con el centro de Ru(II). En los
compuestos estudiados se utilizan dos bipiridinas.
Figura 2.3: bipiridina (Bpy). En color verde se marcan los átomos dadores de electrones que permiten
formar el enlace de coordinación con el Ru(II).
Una de las características más notables de estos complejos es su alta absorción de luz
de longitudes de onda del rango entre los 400 y los 600 nm, en el rango de luz visible. La
absorción de un fotón de luz produce la promoción de un electrón del átomo de Ru a un
orbital vacío del ligando bpy (Figura 2.4). Esta transferencia se denomina Transferencia
de carga metal ligando (1MLCT de sus siglas en inglés). A partir de este estado excitado
existen dos posibilidades: que el electrón vuelva al estado basal de energía (ya sea de
forma radiativa o no radiativa) o que caiga a un estado de menor energía, triplete,
denominado 3MLCT.
2+
Figura 2.4: diagrama de los niveles de energía de [Ru(bpy)2py2] . Las líneas sólidas indican procesos
radiativos, mientras que las punteadas indican procesos no radiativos.
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Desde este segundo estado, si tiene la energía suficiente, puede pasar a un estado de
mayor energía (d-d), en el cual la carga electrónica se centra en el metal (MC), lo que
conlleva a la disociación de los ligandos. Como el estado d-d suele caer a una energía
algo mayor, esta transición está activada, y es más probable a mayor temperatura,
aumentando la eficiencia cuántica de fotoliberación a temperaturas más altas.
De esta manera, cuanto menor sea la diferencia de energía entre el estado 3MLCT y el
estado d-d, mayor será la probabilidad de disociación. Como esta diferencia entre los
niveles energéticos depende de la capacidad de los ligandos para modificar la densidad
electrónica del metal central, la cual también modifica la posición de la banda 1MLCT, es
necesario buscar una buena combinación de los mismos para lograr la disociación con
longitudes de onda correspondientes al espectro de luz visible. En general, ligandos mas
aceptores π o menos básicos, corren el espectro de absorción a mayores energías y
aumentan la eficiencia cuántica de fotoliberación.
2.3 Modelos biológicos
2.3.1 Ganglio de sanguijuela
Uno de los modelos biológicos elegidos para probar los compuestos enjaulados
sintetizados en el laboratorio es la sanguijuela Hirudo medicinalis. Este modelo presenta
ciertas ventajas a la hora de realizar electrofisiología (Baylor et al., 1969): su anatomía
es sencilla (Figura 2.5), la disección de sus ganglios es fácil de realizar, se conoce la
disposición de las neuronas dentro de los ganglios (Figura 2.6) y a qué compuestos
responde cada una, las neuronas son grandes, el análisis de datos es sencillo, entre
otras.
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Figura 2.5: esquema representativo del sistema nervioso de la sanguijuela (adaptado de Zayat, 2003)
Todas estas ventajas hacen de la sanguijuela un buen modelo para probar los
compuestos enjaulados del laboratorio in vitro a través de registros electrofisiológicos
intracelulares.
El sistema nervioso central de este anélido cuenta con dos cerebros y un ganglio por
segmento. Uno de los dos cerebros se ubica en la parte anterior del animal, mientras
que el otro está ubicado en el otro extremo. Entre los dos cerebros se encuentran los 21
ganglios, unidos entre sí por nervios conectores. A su vez, desde cada ganglio salen las
raícen que inervan piel y músculo. Dentro de los ganglios la cantidad y la disposición de
las neuronas es siempre la misma (Figura 2.6).
Figura 2.6: vista ventral de un ganglio. (Tomado de The Journal of Neuroscience, 10 Febrero 2010)
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En particular, en este trabajo, se tomaron registros de las motoneuronas
denominadas M3 y M5 (ver Figura 3.1 en la sección de materiales y métodos). Estas
células fueron elegidas debido a que presentan en su membrana receptores de GABA,
neurotransmisor que se utilizará enjaulado durante todo el trabajo. En la Figura 2.7
puede verse un registro de una motoneurona M5, a la cual se le suministra GABA
mediante una pipeta (Cline , 1986).
Figura 2.7: registro de una motoneurona M5. La flecha indica el momento en el que una solución de
-4
GABA (10 M) fue aplicada por medio de una pipeta. Se observa una rápida hiperpolarización después de
la aplicación del neurotransmisor. (Adaptado de Cline, 1986).
Para probar el compuesto de glutamato, se utilizaron neuronas Retzius (Rz), ya que
presentan receptores de glutamato en su membrana (James et al., 1980). Estas
neuronas se muestran en la figura 3.1 de la sección materiales y métodos. En la Figura
2.8 se muestra un registro de una neurona Rz a la cual se le agrega con una pipeta una
solución de Glutamato.
Figura 2.8: registro de una neurona Retzius. La flecha indica el momento en el que una solución de
Glutamato (0,67 mM) fue aplicada por medio de una pipeta. Se observa un rápido aumento de la
frecuencia de disparos de potenciales de acción después de la aplicación del neurotransmisor. (Adaptado
de James, 1980).
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2.3.2 Corteza cerebral de ratón
Otro de los grandes modelos utilizados en la biología son los roedores murinos.
Debido a que el ratón pertenece al grupo de los mamíferos, los resultados obtenidos a
partir de los experimentos que los utilizan como modelo son más extrapolables al ser
humano, y por este motivo han sido tan utilizados en investigaciones que tienen
aplicaciones clínicas.
En el caso de este trabajo, se buscó un modelo que permitiera hacer electrofisiología
in vivo, para poder aplicar los compuestos enjaulados. En los últimos años ha habido un
gran desarrollo de técnicas para hacer electrofisiología in vivo en ratones y en ratas
(Yuste et al., 2005). Para esta tesis de licenciatura se desarrolló una cirugía que consiste
en limar el hueso del cráneo para dejar expuesta un área de la corteza cerebral, lo cual
no sólo permite poner un electrodo para obtener registros electrofisiológicos sino
también fotoliberar un compuesto enjaulado previamente aplicado sobre la misma
zona. De esta manera se puede registrar qué ocurre con el potencial de campo local
(LFP, según sus siglas en inglés; ver Anexo) cuando se libera el ligando debido a la
irradiación con un láser.
Los experimentos con este modelo se realizaron con el objetivo de demostrar que los
compuestos enjaulados pueden ser utilizados in vivo. Todos los experimentos en
modelos biológicos que utilizan compuestos enjaulados (Molnár et al., 2000 y Rial Verde
et al., 2008) los aplican in vitro, porque al intentar aplicarlos in vivo surge el obstáculo
de fotoliberar el compuesto una vez que el mismo se halla dentro del cuerpo del animal.
Luego de más de 40 años desde la aparición del primer compuesto enjaulado, en este
trabajo se mostrará que es posible su aplicación in vivo con el uso de una técnica
desarrollada para ese propósito.
16
2.4 Neurotransmisores
2.4.1 Ácido γ-amino butírico
El ácido gamma-amino butírico es un derivado del ácido glutámico (Figura 2.9). Es el
neurotransmisor inhibitorio más importante en vertebrados, ya que la unión del mismo
a sus receptores específicos produce la apertura de canales de Cl- . La entrada de estos
iones provoca un cambio en el potencial de membrana de la célula, hiperpolarizándola.
Figura 2.9: estructura del ácido γ-amino butírico.
Este neurotransmisor tiene mucha importancia en la investigación clínica debido a
que agonistas y antagonistas del mismo se utilizan como tratamiento para varios
desórdenes neuropsiquiátricos (Foster et al., 2006).
Dado que muchos de estos desórdenes se asocian a una deficiencia relativa de
mecanismos de inhibición en una zona del cerebro (epilepsia, desordenes de la
ansiedad), el uso de GABA enjaulado puede llegar a ser una buena herramienta para
tratarlos, debido a que podría aplicarse sólo en el área afectada sin involucrar al resto
del cerebro que sufriría un exceso.
Por todo esto y porque sus propiedades químicas permiten su unión al grupo
protector de Rutenio, es que se decidió no sólo enjaularlo (Figura 2.10) sino también
utilizarlo en este trabajo.
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Figura 2.10: estructura del compuesto enjaulado de GABA, [Ru(bpy)2(PMe3)(GABA)], utilizado en este
trabajo. En naranja se muestra el GABA unido por medio de su grupo amino al grupo protector.
2.4.2 Receptores de GABA
Se conocen tres tipos de receptores de GABA, denominados GABAA, GABAB y GABAC.
Los receptores GABAA y GABAC son ionotrópicos, es decir, forman canales iónicos y la
sola unión del ligando es suficiente para que aumente la conductancia de un ion.
El receptor de GABAB, en cambio, es un receptor metabotrópico, lo cual implica que
está asociado a otra proteína que cuando se activa desencadena una cascada de señales
que termina con la activación o la inactivación de un canal (Squire et al., 2008).
La respuesta desencadenada por el ligando cuando se une a un receptor ionotrópico
es mucho más rápida que cuando se une a un metabotrópico, sin embargo en el
segundo caso suele ser más duradera.
2.4.3 Glutamato
La importancia del glutamato en vertebrados en cuanto a la cantidad de procesos en
los que está involucrado y la cantidad de neuronas que poseen receptores que lo
reconocen es similar a la del GABA. Sin embargo, su efecto es el opuesto, es decir, tiene
un efecto excitatorio. La unión de una molécula de glutamato con sus receptores
específicos produce directa o indirectamente la apertura de canales de sodio, lo cual
genera una corriente entrante de estos iones, despolarizando la célula. Esta
despolarización se traduce en potenciales de acción por parte de la célula, lo cual hace
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que en algunos casos se libere algún otro neurotransmisor que actuará sobre la célula
post-sináptica.
Así como en el caso del GABA, desequilibrios en los niveles normales de glutamato
también causan desórdenes y enfermedades (Meldrum, 2000).
Figura 2.11: estructura del glutamato.
Debido a que el glutamato posee un grupo amino (Figura 2.11), también puede ser
enjaulado (Figura 2.12). Este compuesto enjaulado de Glutamato es la segunda
molécula utilizada en este trabajo.
Figura 2.12: estructura del compuesto enjaulado de Glutamato, [Ru(bpy)2(PMe3)(Glu)], utilizado en este
trabajo. En naranja se muestra el Glutamato unido por medio de su grupo amino al grupo protector.
2.4.4 Receptores de glutamato
El glutamato se une al menos a cuatro tipos de receptores, de los cuales tres son
ionotrópicos y uno es metabotrópico. Uno de los receptores ionotrópicos es el activado
por N-metil-D-aspartato (que funciona como agonista), razón por la cual se lo denomina
NMDA (Lareo, 2006). Cuando este receptor (y los receptores AMPA y kainato que
también son ionotrópicos) se activa se produce la apertura de canales iónicos no
selectivos, para toda clase de cationes. La diferencia fundamental entre los receptores
de tipo NMDA y los otros dos receptores ionotrópicos es que los primeros son
19
dependientes tanto de voltaje como de ligando, en cambio los otros dos sólo responden
a la unión del ligando. Cuando el potencial de una célula se encuentra cerca del
potencial de reposo, aunque haya moléculas de glutamato unidas a receptores NMDA,
éstos sólo dejarán pasar una baja cantidad de iones. Esto se debe a que hasta que la
célula alcanza un potencial determinado, un ion Mg2+ se encuentra unido a un sitio del
receptor, manteniéndolo inactivo. Sin embargo, cuando la célula se despolariza (a causa
de la entrada de Na+ dada por la unión de glutamato a los receptores AMPA y kainato) el
receptor se libera del ion Mg2+ permitiendo, principalmente, la entrada de calcio. Si bien
la respuesta es más lenta también es más duradera. Los receptores NMDA están
involucrados en procesos relacionados con la plasticidad neuronal que han sido muy
estudiados porque podrían favorecer la consolidación de la memoria (Rosenzweig et al.
2001).
2.5 Ketamina
La ketamina es una anestésico disociativo que actúa uniéndose a los receptores
NMDA de glutamato (Harrison et al., 1985), sin desencadenar la respuesta biológica que
produce la unión del ligando específico (es un antagonista). De esta forma, disminuye la
actividad neuronal (especialmente la probabilidad de disparos de potenciales de acción).
Se sabe que la ketamina no compite con el glutamato por el sitio de unión al receptor
pero su efecto se ve revertido por altas concentraciones del ligando específico.
Aprovechando estas características se hicieron pruebas con compuestos enjaulados de
glutamato, descriptos en la sección materiales y métodos.
2.6 Hipótesis y objetivos
En los últimos años, se han realizado numerosas modificaciones en la química de los
grupos protectores desarrollados en el laboratorio con el fin de mejorarlos. Estas
mejoras no sólo se buscaban desde el punto de vista químico, sino también desde el
punto de vista biológico. Dos de los objetivos principales de estas modificaciones fueron
20
aumentar la eficiencia cuántica y la biocompatibilidad de los compuestos. Al aumentar
la eficiencia cuántica, no sólo es necesaria una menor cantidad de compuesto por
experimento, sino que además, se necesita menor intensidad de luz para liberar una
cantidad buscada de ligando. Esto siempre es una ventaja porque la irradiación con láser
puede dañar las células. Por otro lado, los últimos compuestos desarrollados tienen
grupos que reducen su lipofilicidad, lo cual hace que el grupo protector sea menos afín a
la membrana plasmática de las células y por lo tanto, menos tóxico.
La caracterización química de estos compuestos ya ha sido realizada (Noval, 2010) así
como también se ha demostrado que las últimas modificaciones han logrado aumentar
la biocompatibilidad de los compuestos enjaulados. Además, estos compuestos fueron
probados en experimentos con oocitos de Xenopus laevis (Noval, 2010) y se encontraron
los resultados esperados.
Por lo tanto, una de las hipótesis que se plantea ahora es que la aplicación de
compuesto enjaulado de GABA producirá una disminución de la actividad neuronal (ya
sea disminución de la frecuencia de disparo de potenciales de acción en el caso de
registros intracelulares, o del potencial de campo local en el caso de extracelulares). Sin
embargo, esta inhibición sólo será observada cuando se ilumine con luz de la longitud
de onda correspondiente y no antes, ya que el compuesto enjaulado no debería tener
ningún efecto por sí solo.
La segunda hipótesis es en relación al compuesto de glutamato y plantea que al ser la
ketamina un antagonista de los receptores NMDA de glutamato, una liberación de una
alta concentración del ligando específico en un tiempo muy corto desplazará al
antagonista, produciendo que los animales recuperen en menos tiempo los reflejos que
pierden con la anestesia. Al igual que para el caso del compuesto de GABA este efecto
sólo debería observarse una vez que el compuesto haya sido expuesto a una fuente de
luz, mientras que los ratones tratados con compuesto pero en oscuridad no deberían
sufrir este efecto.
21
Una tercera hipótesis plantea que, dadas las modificaciones que se realizaron en la
química del grupo protector para hacerlo menos lipofílico, los compuestos enjaulados
no resultarán tóxicos para un animal vivo.
Los objetivos principales de este trabajo fueron tres:
1) Aplicar los compuestos enjaulados en experimentos de biología y dar de esta
manera una pequeña muestra de todas las aplicaciones posibles que tiene esta
herramienta brindada por la química.
2) Mostrar la utilidad de los compuestos con un experimento sencillo y en un
modelo que viene siendo utilizado en el laboratorio desde hace años.
3) Estudiar la toxicidad de los compuestos y encontrar una técnica para poder
aplicarlos in vivo, algo que aún no se ha desarrollado en ningún laboratorio.
22
3. Materiales y métodos
En esta sección se describen los experimentos realizados y la síntesis de los
compuestos enjaulados utilizados.
Se realizaron los siguientes experimentos:

Pruebas de toxicidad in vivo:
o Prueba de toxicidad del compuesto enjaulado de GABA en ratones.
o Prueba de toxicidad del compuesto enjaulado de Glutamato en
ratones.

Pruebas funcionales in vitro e in vivo:
o Prueba del compuesto enjaulado de GABA en motoneuronas de
sanguijuela.
o Prueba del compuesto enjaulado de Glutamato en neuronas Rz de
sanguijuela.
o Prueba del compuesto enjaulado de GABA en ratones mediante
electrofisiología in vivo.
o Prueba del compuesto enjaulado de Glutamato en ratones mediante
su competencia con el anestésico Ketamina.
3.1 Compuestos enjaulados
3.1.1 Precursor
Los
compuestos
enjaulados
se
sintetizaron
a
partir
del
precursor
cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)Cl)]PF6 (bpy = 2,2’bipiridina y PMe3 = trimetilfosfina) (Salierno et al.,
2009). La síntesis de este precursor se llevó a cabo a partir de 520 g de Ru(bpy)2Cl2
(Viala, 2006) suspendidos en 20 ml de una mezcla 1:1 etanol agua. La reacción se hizo
23
calentando en reflujo durante 30 minutos y bajo atmósfera de N 2 para evitar la
oxidación de la fosfina. Con una jeringa se agregaron 1,2 ml de trimetilfosfina (Aldrich
324108) 1M disuelto en THF. La reacción se siguió tomando espectros UV-Visible cada
30 minutos con un espectrofotómetro de arreglo de diodos Ocean Optics CHEM2000.
Una vez que el espectro dejó de presentar cambios, se removió el exceso de fosfina y
metanol mediante destilación por vacío, dando como resultado una solución acuosa que
fue filtrada para remover sólidos no disueltos. Luego se agregó KPF 6 en exceso con el fin
de producir la precipitación del precursor a 0ºC. Esto dio como resultado un sólido de
color naranja oscuro que fue lavado tres veces con agua fría y luego secado. El
rendimiento de la reacción fue del 93%. El resto de la reacción se realizó bajo un filtro
de luz que sólo permite pasar luz de longitudes de onda mayores a 580 nm.
3.1.2 Compuesto enjaulado de GABA
Para la síntesis del compuesto enjaulado de GABA cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(GABAH)](PF6)2
se partió de 110 mg precursor disueltos en 2 ml de acetona, a la cual se le agregó una
suspensión de 2 ml de agua con una resina de intercambio aniónico (DOWEX-Cl 2x8)
para intercambiar el PF6- por Cl-. El resultado de este intercambio fue una la molécula
[Ru(bpy)2(PMe3)Cl]Cl en solución, la cual fue filtrada para remover la resina. Luego se
agregaron 500 mg de ácido γ-aminobutírico y 1,8 ml de NaOH 1 M. La mezcla obtenida
se calentó durante 5 horas. Pasado este tiempo se agregó 1 ml de solución saturada de
KPF6 y se descartó el precipitado. El sobrenadante se llevó a 0ºC y se acidificó con una
solución de HCl 5 M hasta quedar en pH 2. Posteriormente se volvió a agregar una
solución saturada de KPF6 que hizo que precipitara el compuesto buscado. El sólido de
color amarillo-naranja se lavó con agua y se redisolvió por agregado de NaOH, tras lo
cual fue liofilizado. El rendimiento de la reacción fue del 46% y la pureza se determinó
por 1H-RMN.
24
3.1.3 Compuesto enjaulado de Glutamato
Para llevar a cabo la síntesis de cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(GluH2)](PF6)2 se partió de 110 mg
de precursor disueltos en 2 ml de acetona. Esta solución fue mezclada con una
suspensión de 2 ml de agua con resina de intercambio aniónico (DOWEX-Cl 2x8) para
intercambiar el PF6- por un Cl-. Luego de 10 minutos con agitación, se filtró para retirar la
resina y se agregaron 500 mg de glutamato monosódico y 2,4 ml de NaOH 1 M. La
mezcla obtenida se calentó durante 3 horas. Pasado este tiempo se agregó 1 ml de
solución saturada de KPF6 y se descartó el precipitado. El sobrenadante se llevó a 0ºC y
se acidificó con una solución de HCl 5 M hasta quedar en pH 2. Luego se volvió a agregar
una solución saturada de KPF6 que hizo que precipitara el compuesto buscado. El sólido
de color amarillo-naranja se lavó con agua fría y se volvió a disolver por agregado de
NaOH. La solución fue liofilizada.
El rendimiento de la reacción fue del 52% y la pureza se determinó por 1H-RMN.
3.1.4 Preparación de los compuestos para los experimentos biológicos
Para los experimentos con ganglios de sanguijuela, el compuesto fue disuelto en
solución salina “Ringer leech” baja en calcio y alta en magnesio (en mM NaCl 102, KCl 4,
CaCl2 1, MgCl 10, Tris base 5,4, pH a 7,4 con H2SO4). La concentración utilizada fue de
100 µM.
Para los experimentos con ratones, el compuesto se disolvió en solución fisiológica
humana (Parafarm®). La concentración utilizada fue de 250 µM en todos los casos.
3.2 Animales
3.2.1 Sanguijuelas
Se utilizaron sanguijuelas adultas de entre 2 y 5 gramos de peso, obtenidas de
Leeches USA (Westbury, NY, USA). Hasta el momento de la disección fueron mantenidas
25
a 15ºC en agua marina artificial y privadas de alimento durante al menos un mes
(Rodríguez et al., 2009).
Para los experimentos se anestesió a los animales con hielo y luego se les realizó una
disección para separar un ganglio. Posteriormente fue colocado en una cápsula con
fondo revestido de un polímero inerte (Sylgard, Down Corning) y fijado al mismo con
alambres de acero inoxidable. La cubierta que recubre el ganglio fue cortada para tener
mejor acceso a las neuronas (Rela et al., 2003).
Las neuronas utilizadas para estos experimentos, como ya se mencionó, son las
motoneuronas M3 y M5 debido a que presentan receptores de GABA y las Rz (Figura
3.1), que presentan receptores de Glutamato.
Figura 3.1: esquema de un ganglio de sanguijuela (vista dorsal a la izquierda y vista ventral a la
derecha). Sombreadas se muestran las motoneuronas 3 y 5 y las neuronas Rz utilizadas en este trabajo.
3.2.2 Ratones
Se utilizaron ratones de ambos sexos de la cepa CF1, de entre 30 y 40 gramos de
peso, obtenidos del Bioterio Central de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
(UBA). Luego de los experimentos los animales fueron sacrificados mediante una
sobredosis de anestesia.
26
3.2.2.1 Pruebas de toxicidad in vivo
Para las pruebas de toxicidad in vivo se inyectaron intraperitonealmente 10 µl por
gramo de peso corporal de compuesto enjaulado (ya sea de GABA o de Glutamato)
disuelto en solución fisiológica a una concentración de 250 µM, ya que esta es la
concentración utilizada en los experimentos. La solución se preparó en oscuridad y la
jeringa utilizada se cubrió previamente con papel aluminio para evitar la fotoliberación
del ligando. Esto se hizo porque lo que se deseaba probar era si el compuesto enjaulado
tenía algún efecto por sí mismo sin GABA o Glutamato libre. Aunque se tomaron estas
precauciones, al momento de inyectarles el compuesto los ratones fueron trasladados a
un cuarto oscuro.
Primero se realizó la prueba para el compuesto enjaulado de GABA, para lo cual se
dividió al azar a los seis ratones entre los dos tratamientos (compuesto o solución
fisiológica). Cuatro días después se utilizaron los mismos ratones para probar el
compuesto enjaulado de Glutamato. Nuevamente los seis ratones fueron repartidos al
azar entre los dos tratamientos, sin importar cuál de los dos había recibido cada uno en
la prueba anterior.
Dos horas antes de inyectarlos se les retiró el alimento para ver si la inyección
provocaba un cambio en su apetito y poder tomar esto como parámetro de su estado
de salud.
Durante las dos horas siguientes a la inyección los ratones se mantuvieron bajo
vigilancia, controlando principalmente su comportamiento y su apetito.
3.2.2.2 Pruebas de funcionalidad in vivo
Antes de la cirugía se anestesió a los ratones con una mezcla de 150 mg/kg de
ketamina (Ketamina 50 mg/ml, Holliday S.A.) y 10 mg/kg de xilacina (2%, Alfasan,
Woerden-Holland) inyectada intraperitonealmente. Cuando fue necesario, se
administraron suplementos de ketamina de 25 mg/kg (un cuarto de la dosis inicial) para
27
mantenerlos anestesiados a lo largo del experimento. Los suplementos normalmente
fueron administrados intramuscularmente.
También se colocó lidocaína con un hisopo en las orejas para colocar al ratón en el
sujetador (holder). El sujetador fue fabricado en el laboratorio con el propósito evitar
movimientos de la cabeza por la respiración en el momento de tomar el registro. De
este modo se logró que la pipeta con el electrodo queden firmes. En la figura 3.2 se
muestra una foto del mismo.
Figura 3.2: foto del sujetador y el calentador hechos en el laboratorio.
Inmediatamente después de la anestesia y durante todo el experimento se mantuvo
la temperatura corporal del ratón en aproximadamente 37ºC con un calentador,
también fabricado en el laboratorio (figura 3.2)
La cirugía consiste en limar el hueso del cráneo con un torno (Modelo 1100, Dremel
Stylus, México) hasta dejar expuesta una zona de la corteza cerebral (Esakov et al.,
2000). Una vez que ya no hay hueso, se retiran las membranas que están entre el
cráneo y el cerebro (meninges: duramadre, aracnoides y piamadre) con una pinza para
que la pipeta de vidrio no tenga que atravesarlas y evitar de esta forma que se rompa la
punta de la misma. El área expuesta tiene forma aproximadamente circular y mide unos
3 mm2 y se ubica aproximadamente a 3 mm hacia posterior de bregma y a 3 mm hacia
la derecha de la línea medial.
28
En el caso de los experimentos para probar la funcionalidad del glutamato enjaulado
se anestesiaron cuatro ratones al mismo tiempo y a todos se les realizó la cirugía
previamente descripta. Sobre la zona de corteza cerebral expuesta de dos de los cuatro
ratones se colocó solución fisiológica mientras que a los dos restantes se les colocó una
solución de compuesto enjaulado de glutamato 250 µM. Luego se separaron en dos
grupos: a dos de ellos se los expuso a luz blanca (uno con solución fisiológica y uno con
compuesto) y a los otros dos se los mantuvo en oscuridad (figura 3.3). Desde ese
momento se contó el tiempo que pasaba antes de que aparecieran reflejos al apretar
suavemente la pata trasera con una pinza. Se tomó el momento en el que se colocaron
las correspondientes soluciones como tiempo inicial debido a que sólo a partir de este
momento las condiciones empezaron a diferir entre los cuatro ratones. Se controló el
estado de anestesia a intervalos regulares de tiempo de 2 minutos.
El reflejo de retirada de la pata es un indicio de cuán anestesiado está el animal. En
general, por efecto de la ketamina ese reflejo desaparece y vuelve a aparecer sólo
cuando se está yendo el efecto de la droga.
Figura 3.3: esquema del diseño experimental de la prueba del compuesto de Glutamato in vivo. Los
círculos de color naranja indican compuesto de Glutamato, los blancos indican solución fisiológica.
29
Este experimento se realizó cuatro veces, en cada una de las cuales se utilizaron
ratones distintos y una vez terminadas las pruebas se calculó el promedio de los cuatro
datos para cada tratamiento y el desvío estándar de los datos. En total se utilizaron 16
ratones.
3.3 Electrofisiología
Se tomaron registros con electrodos de vidrio (A-M Systems, Inc., Carlsborg, WA.,
USA) preparados con un estirador vertical de pipetas (Modelo 700C, David Kopf
Instruments, Tujunga, California). Los capilares resultantes diferían en su resistencia
según el uso. En el caso de los registros intracelulares de sanguijuela, se utilizaron
pipetas de más de 10 MΩ de resistencia y se rellenaron con una solución saturada de
KCl. Para los registros extracelulares, la resistencia buscada fue en todos los casos
menor a 7 MΩ y el contenido de la pipeta cambiaba por solución fisiológica. Como
electrodo de referencia se utilizó un alambre de plata clorurado.
Para amplificar la señal se contó con un amplificador diferencial de corriente
continua (Neuroprobe 1600, A-M Systems Inc., Carlsborg, WA., USA) y se digitalizó la
señal con una placa A/D-D/A (RTX-03B (II), Costronic Co., LTD, Taiwán, China) y un
programa desarrollado en el laboratorio utilizando Visual Basic.
Durante los experimentos, la imagen del ganglio o del cerebro fue continuamente
filmada con una cámara infrarroja, también utilizada para colocar el electrodo en el
lugar deseado (figura 3.4).
30
Figura 3.4: esquema del set-up electrofisiológico (adaptado de Ayling et al., 2009)
La posición del electrodo pudo manejarse gracias a un micromanipulador de perilla
(You Ltd. U-3FC, Narishige Scientific Intrument Lab., Tokio, Japón).
El set-up está montado sobre una mesa antivibratoria y rodeado por una jaula de
Faraday para atenuar el efecto de los campos electromagnéticos externos.
Para la aplicación de las soluciones se contó con un sistema de jeringas (sin el
émbolo) colgadas a una altura mayor que la del ratón o la cápsula, conectadas a una
manguera de goma. Ésta, a su vez, está conectada a una aguja. El flujo se controló por
medio de una llave tipo Mohr conectada a la manguera. Para los experimentos de
sanguijuela, donde era necesario cambiar el medio, se utilizó un aireador de pecera
invertido para que sacara el líquido de la cápsula y lo vertiera a un recipiente preparado
para recibirlo.
Dentro del set-up se posicionó un láser azul de 4 mW de potencia y de 473 nm de
longitud de onda de manera tal que apuntara directo al ganglio de sanguijuela o a la
zona de la corteza cerebral expuesta en el ratón. El láser se mantuvo encendido durante
todo el experimento, pero desde la computadora se podía controlar una tapa de
aluminio que según su posición dejaba llegar o no la luz del láser hasta el lugar donde
estaba el ganglio o el ratón.
31
3.4 Análisis de datos
Para evaluar el efecto del Glutamato enjaulado sobre la duración de la anestesia con
ketamina se realizó un ANOVA y un Test de comparaciones múltiples de Tukey
utilizando el programa Infostat versión 2010e (Di Rienzo et al., 2010). Se utilizó un nivel
de significancia del 5%.
Para evaluar el efecto de la aplicación del compuesto sobre el potencial de campo
local se utilizó el programa Matlab 7.6.0 (Mathworks).
Para el análisis de datos, entre otras cosas, se contó con la colaboración de Vítor dos
Santos, del Instituto de Neurociencia de Natal y del Departamento de Ingeniería
Electrónica de la Universidad de Río Grande do Norte.
Primero se filtró la señal con un filtro “pasabajos” (ver Anexo) a 300 Hz (Butterworth,
1930) para que la señal sólo represente el potencial de campo local y no tenga
componentes aportados por potenciales de acción (Rasch et al., 2008).
Luego se realizó una transformada wavelet (Graps, 1995; Kaiser, 2011; Torrence et
al., 1998 y Vidakovic et al., 1991) para descomponer la señal (ver Anexo) en cuatro
bandas de frecuencia: delta (0,5 a 3,9 Hz), theta (3,9 a 7,8 Hz), alfa (7,8 a 15, 6 Hz) y beta
(15,6 a 31,25 Hz). Se considera que estas bandas son de interés para el estudio de
ritmos generados en redes neuronales (Gloveli et al., 2005). Seguidamente, se calculó la
energía instantánea (ver Anexo) de cada una de las bandas mediante una transformada
de Hilbert. Esto permite evaluar cuánto contribuye cada banda de frecuencia en cada
tiempo a la señal. Para visualizar mejor esto último se hizo un estudio de la energía
instantánea normalizada para cada banda (a cada curva se la divide por su máximo
valor, de modo que sólo puede tomar valores entre 0 y 1 ya que 0/máximo = 0 y
máximo/máximo = 1). El motivo por el cual se normalizó la señal de esta manera es que
no es de interés para este trabajo estudiar la contribución relativa de cada banda de
frecuencias sino que se pretende estudiar cómo se ve afectada cada banda luego de
momentos específicos (la aplicación del compuesto y del pulso de luz).
Otra forma de realizar este mismo análisis es mediante un espectrograma wavelet. A
diferencia del análisis anterior, en este caso no se separa en bandas de frecuencias
32
arbitrarias, sino que se puede ver a cada tiempo cuánto contribuye cada frecuencia a
explicar la señal original en un momento determinado. Esa contribución se cuantifica
mediante la energía instantánea y está codificada por un color (siendo roja cuando es
alta y azul cuando es baja, pasando por colores intermedios). La energía instantánea fue
normalizada para cada tiempo.
Para evaluar los efectos del pulso de luz azul a corto plazo se tomó una ventana
temporal de un segundo previo al momento del pulso y otra ventana de la misma
duración posterior a dicho momento. Para obtener la amplitud de la envolvente de la
señal en cada banda se filtró la señal por medio de una transformada wavelet.
Para evaluar los efectos de largo término de la aplicación del compuesto y del pulso
de luz azul se tomaron los 25 minutos anteriores a la irradiación y los 25 posteriores a la
misma, se los dividió en 10 intervalos de 2,5 minutos no superpuestos y a cada uno de
ellos se les realizó una transformada de Fourier (Fast Fourier Transform, ver Anexo).
Para poner a prueba la significancia estadística de los efectos encontrados se utilizó
una prueba estadística no paramétrica: Wilcoxon-Mann-Whitney, con la corrección de
Dunn-Šidák para comparaciones múltiples. En todos los casos se utilizó un nivel de
significancia del 5%.
33
4. Resultados
4.1 Sanguijuelas
4.1.1 Prueba de funcionalidad de los compuestos enjaulados de GABA
([Ru(bpy)2(PMe3)(GABA)]+)
Los experimentos en sanguijuela fueron realizados en conjunto con Oscar Filevich.
Para probar los compuestos enjaulados de GABA se tomaron registros intracelulares
de las motoneuronas 3 y 5. Una vez que se logró colocar el electrodo dentro de la célula
y se identificó a la misma como una de estas dos motoneuronas, se dejó pasar un
tiempo hasta que el registro se estabilizara. El compuesto fue disuelto en solución
“Ringer leech” y agregado al baño, cubriendo a todo el ganglio. Pasados unos minutos se
encendió el láser azul apuntado directamente al ganglio.
En la figura 4.1 se muestra el resultado obtenido con una prueba, donde se ve que
luego del pulso de luz hay una disminución del potencial de membrana
(hiperpolarización de la célula) y de la frecuencia de disparos de potenciales de acción.
Figura 4.1: registro de una motoneurona 3 a la que se le aplica compuesto enjaulado del GABA. La
flecha roja indica el momento en el que se aplicó el pulso de luz para fotoliberar el GABA. Se considera
tiempo = 0 el momento del pulso de luz azul.
34
Es importante notar en este experimento que luego del lavado la célula se recupera,
es decir, llega al potencial de membrana desde el cual partió y la frecuencia de disparos
de potenciales de acción es aproximadamente igual al de antes de la liberación del
GABA.
4.1.2 Prueba de funcionalidad de los compuestos enjaulados de Glutamato
([Ru(bpy)2(PMe3)(Glu)]+)
Con el objetivo de probar los compuestos enjaulados de glutamato se tomaron
registros intracelulares de neuronas Retzius. El procedimiento fue el mismo que para el
caso anterior, con la única diferencia de que en este caso se utilizó un láser verde.
En la figura 4.2 se muestra el resultado obtenido con una prueba, donde se ve que
luego del pulso de luz hay un aumento del potencial de membrana (despolarización de
la célula) y de la frecuencia de disparos de potenciales de acción.
Figura 4.2: registro de una neurona Retzius a la que se le aplica compuesto enjaulado de glutamato. La
flecha roja indica el momento en el que se aplicó el pulso de luz para fotoliberar el glutamato. Se considera
tiempo = 0 el momento del pulso de luz verde.
35
4.2 Ratones
4.2.1 Prueba de toxicidad in vivo de los compuestos enjaulados de Glutamato y de
GABA
Tres ratones fueron inyectados con una solución de compuesto de Glutamato y otros
tres con una de compuesto de GABA o Glutamato.
No se observó ningún efecto inmediatamente después de inyectar (sólo durante los
primeros segundos se notó el efecto de la manipulación). Durante las siguientes dos
horas el comportamiento de los ratones inyectados con compuesto fue indistinguible de
los inyectados con solución fisiológica. Todos los ratones se alimentaron y tomaron
agua, excepto uno de los utilizados como control (inyectado con solución fisiológica)
después de la segunda prueba (en la prueba anterior, dos días antes, había recibido
compuesto enjaulado de GABA).
4.2.2 Prueba de funcionalidad del compuesto enjaulado de Glutamato
En las cuatro réplicas del experimento realizado para probar la eficiencia del
compuesto de Glutamato se obtuvieron resultados similares. Los individuos utilizados
como control tardaron casi el doble de tiempo (o más en algunos casos) en comparación
con el expuesto a luz con el compuesto enjaulado en recuperar los reflejos en las patas.
En la figura 4.3 pueden verse las medias en minutos de cada tratamiento.
36
*
Figura 4.3: tiempo medio (en minutos) en recobrar el reflejo de la pata para cada uno de los tratamientos.
Se grafica la media del tiempo para los cuatro ratones expuestos al mismo tratamiento. Las barras de
error representan la desviación estándar. El asterisco indica diferencias significativas (p < 0,05).
Los resultados del Análisis de la varianza (ANOVA) y del Test de Tukey se muestran en
la Tabla 4.1.
Análisis de la varianza
F.V.
SC
gl
CM
F
p-valor
Tratamiento
7490,19 3
2496,73 10,24
0,0013
Error
2925,75 12
243,81
Total 10415,94
15
Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=32,78264
Error: 243,8125 gl: 12
Tratamiento
Medias n
E.E.
LC
47,25 4
7,81
A
OS
92,50 4
7,81
B
LS
98,50 4
7,81
B
OC
99,50 4
7,81
B
Letras distintas indican diferencias significativas (p< 0,05)
Tabla 4.1: resultados del ANOVA y del test de Tukey.
De los resultados del ANOVA se deduce que la media del tiempo en recuperar los
reflejos de los ratones pertenecientes a al menos uno de los tratamientos difiere de los
demás (p = 0,023) ya que el p-valor es menor al α.
37
Con el fin de ver cuáles son los tratamientos cuyo efecto es significativo se hizo el
Test de Tukey. El mismo indica que la media de los tiempos en que los ratones
recuperaron el reflejo estando expuestos a luz y con compuesto enjaulado es
significativamente menor que el tiempo que tardaron los ratones expuestos a los otros
tratamientos. Además, tal como se esperaba, los otros tres tratamientos, realizados a
modo de control, no difieren significativamente entre ellos.
Antes de realizar el ANOVA se verificó el cumplimiento de los supuestos: distribución
normal de los errores (Prueba de Shapiro-Wilks) y homocedasticidad (Prueba de
Levene). Los resultados se muestran en la Tabla 4.2.
Shapiro-Wilks
Variable n
Tiempo 16
Media D.E.
84,44 26,35
W*
0,91
p(Unilateral D)
0,2878
F
50,83
p-valor
0,3941
Prueba de Levene
F.V.
SC
Tratamiento
Error 564,25
Total 716,75
gl
152
12
15
CM
3
47,02
Tabla 4.2: Resultados de la Prueba de Normalidad (Shapiro-Wilks) y de Homocedasticidad (Levene) para
verificar el cumplimiento de los supuestos del ANOVA.
En esta tabla se ve que los supuestos de normalidad y de homocedasticidad se
cumplen (p = 0,1326 y p = 0,7581 respectivamente) ya que el p-valor es mayor al α.
4.2.3 Prueba de funcionalidad del compuesto enjaulado de GABA
Con la aplicación del compuesto enjaulado de GABA se logró observar una caída de la
actividad neural luego de iluminar con un láser azul la zona de la corteza cerebral
expuesta a compuesto enjaulado de GABA. En la figura 4.4 A se muestra cómo la energía
instantánea de las cuatro bandas de frecuencias decae inmediatamente después del
pulso de luz azul (línea vertical celeste). La figura 4.4 B muestra el espectrograma de
38
wavelet obtenido con un ratón (el mejor caso) para evaluar los efectos de la aplicación
del compuesto y del pulso de luz. La primera línea vertical indica el momento de la
aplicación del compuesto de GABA, mientras que la segunda indica el momento en el
que se ilumina con el láser. Nótese que la caída en la actividad se da inmediatamente
después del pulso de luz y se mantiene por, al menos, 40 minutos.
A
B
Figura 4.4: A) Energía instantánea para las cuatro bandas de frecuencias. La línea celeste indica el
momento en el que se irradió con luz azul. B) Espectrograma de wavelet. La primera línea blanca indica el
momento en el cual fue aplicado el compuesto enjaulado de GABA; la segunda el momento en el que se
encendió el láser azul. Los distintos colores indican la contribución de cada frecuencia a explicar la señal
original (desde rojo: grande, hasta azul: pequeña).
39
Se evaluaron los efectos de corto plazo tanto de la aplicación del compuesto como
del pulso de luz azul. Los resultados de este análisis se muestran en la figura 4.5. Todos
las diferencias resultaron ser estadísticamente significativos (p < 0,000001) según la
prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney.
Figura 4.5: gráfico de cajas (Boxplot) para evaluar los efectos a corto plazo de la aplicación del
compuesto y del pulso de luz azul. Se muestran los resultados de grupo. Todos los casos presentaron
diferencias significativas antes y después de la aplicación del compuesto y de la luz (p<0,000001).
40
Al evaluar los efectos de largo término de la aplicación del compuesto y del pulso de
luz azul se obtuvieron los resultados mostrados en la figura 4.6. Todas las distribuciones
mostraron diferencias significativas luego de la corrección de Dunn-Sidàk para
comparaciones múltiples (p < 0,0043) según la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney.
Figura 4.7: gráfico de cajas (Boxplot) para evaluar los efectos a largo plazo de la aplicación del
compuesto y del pulso de luz azul. Se muestran los resultados de grupo. Todos los casos presentaron
diferencias significativas antes y después de la aplicación del compuesto y de la luz (p<0,0043).
41
5. Conclusiones
Desde la aparición de los compuestos enjaulados, hace alrededor de 40 años, su
utilización se ha ido incrementando de a poco y ha alcanzado muchas ramas de la
biología. Esto se debe a que son herramientas muy útiles a la hora de realizar
experimentos. La resolución espacial y la precisión temporal con la cual se puede liberar
una biomolécula hacen de los compuestos enjaulados un instrumento insuperable a la
hora de estudiar, por ejemplo, el efecto de una molécula determinada.
Sin embargo, como ya se mencionó al comienzo de este trabajo, recién en los últimos
años fueron superadas ciertas desventajas que tenían estos compuestos en cuanto a su
biocompatibilidad. Gracias al diseño de una molécula que pueda formar una unión más
débil con el ligando ya no es necesario irradiar sistemas biológicos con luz ultravioleta ni
utilizar solventes orgánicos debido a que las propiedades químicas también han sido
modificadas.
En esta tesis de licenciatura se intentó demostrar que estos compuestos enjaulados a
base de Rutenio no sólo presentan esta y otras ventajas sino que además no hay
características que los hagan de menor calidad que los compuestos previamente
existentes.
Para esto se utilizó un modelo usado desde hace varios años en el laboratorio, que si
bien es un invertebrado cuenta con muchos de los receptores que están presentes en
las neuronas de vertebrados (específicamente los requeridos para estos experimentos
fueron los de GABA y los de Glutamato). Los resultados obtenidos con esta parte del
trabajo fueron los esperados: una inactivación de las motoneuronas tras el desenjaulado
de GABA y una excitación de las neuronas Retzius luego de la fotoliberación de
glutamato. Pero además, ambos experimentos muestran que es posible la recuperación
luego de un lavado, es decir, una vez retirado el compuesto y los productos de la
42
fotólisis, la neurona se recupera y continúa disparando potenciales de acción a una
frecuencia normal.
Cabe destacar también que se logró desenjaular Glutamato utilizando luz verde (532
nm) en lugar de luz azul (473 nm). Esto es una ventaja ya que la luz de longitudes de
onda cortas sufre más el fenómeno de dispersión de Rayleigh, debido a que el mismo es
inversamente proporcional a la longitud de onda. De esta manera, cuanto mayor sea la
longitud de onda de la luz que se utiliza para fotoliberar, mayor será la precisión espacial
de la liberación del ligando, ya que la dispersión producida por el tejido biológico será
menor. Si bien en estos experimentos no era necesario tener tanta precisión en cuanto
a la zona donde se libera el ligando, la resolución espacial es una de las características
que hace que los compuestos enjaulados sean una buena herramienta para estudios de
diversos tipos. Por lo tanto, si se utiliza luz de longitud de onda corta se estaría
desaprovechando una de las principales ventajas de los compuestos enjaulados.
Además está muy discutido el efecto perjudicial que la luz tiene sobre los tejidos vivos.
Ya se conoce el efecto que la luz ultravioleta tiene sobre el material genético, por lo cual
fotoliberar con luz azul en lugar de hacerlo con luz UV ya es una gran ventaja. Pero
mucho mejor sería poder fotoliberar con luz de longitudes de onda cada vez mayores
por los motivos ya mencionados.
Luego de realizar las últimas modificaciones en el grupo protector apuntadas a
aumentar la biocompatibilidad del compuesto enjaulado, se realizaron pruebas de
citotoxicidad en una línea celular de hámster (Baby hámster kidney, BHK-21) que
arrojaron buenos resultados (Noval, 2010). Estos estudios indican que los clorocomplejos [Ru(bpy)2PMe3Cl]+ no reducen significativamente el porcentaje de
supervivencia de las células cuando se los aplica en concentraciones menores a 500 µM.
Sin embargo, estos resultados no son extrapolables a un animal vivo, debido no sólo a
que se obtuvieron a partir de un solo tipo celular sino que además fueron hechas en una
línea celular, algo que está bastante alejado de ser una situación fisiológica normal. Por
43
esto es que estas pruebas fueron preliminares y en este trabajo se buscó extenderlas a
un animal vivo. De acuerdo con los resultados obtenidos a partir de estas últimas
pruebas, estos complejos tampoco presentarían una toxicidad tan elevada como para
no permitir la supervivencia de un animal que reciba una dosis de 10 µL/ gr de peso de
una solución 250 µM de compuesto. Estos resultados fueron suficientes para llevar a
cabo las pruebas funcionales in vivo ya que la concentración utilizada para las mismas
fue igual a la usada para las pruebas de toxicidad (250 µM).
Si bien ha pasado ya mucho tiempo desde que se empezaron a utilizar, la aplicación
de los compuestos enjaulados estuvo siempre limitada a cultivos celulares, rodajas de
cerebro y otros sistemas in vitro. Esto se debe a que al intentar utilizarlos in vivo se
presenta la dificultad de fotoliberar el compuesto una vez que el mismo se encuentra
dentro del cuerpo del animal. Uno de los objetivos de este trabajo estaba relacionado
precisamente con esto. Buscar una técnica para poder aplicar los compuestos
enjaulados in vivo planteaba varios desafíos: encontrar un anestésico que no interfiriera
con los procesos que iba a desencadenar el ligando, realizar una cirugía que permitiera
mantener vivo al animal durante algunas horas y aplicar el compuesto, elegir un modelo
animal que permitiera realizar todo esto y buscar una forma de medir la respuesta al
desenjaulado del ligando. Se decidió trabajar con ratón debido a que ofrecía la
posibilidad de realizar electrofisiología in vivo, lo cual a su vez solucionaba dos
problemas: la forma de medir la respuesta al desenjaulado del ligando (ya que en este
trabajo se utilizaron compuestos enjaulados con ligandos neuroactivos) y la forma de
aplicar el compuesto de forma tal que permitiera la posterior fotólisis del mismo.
Lo primero que se hizo para llevar a cabo este novedoso proyecto fue poner a prueba
un protocolo de anestesia que mantuviera a los animales dormidos durante un tiempo
considerable, ya que por el diseño del experimento era necesario conservar el estado
anestésico durante al menos dos horas. Este fue el motivo por el cual se escogió utilizar
la mezcla de ketamina y xilacina. Aunque se tuvo en cuenta al momento de la elección
44
de la anestesia el modo de acción de la ketamina, no se esperaba que el mismo
representara un problema para los experimentos, ya que al estar afectados los
receptores NMDA pero no los receptores AMPA ni los Kainato, estos últimos podrían
activarse al liberarse pequeñas cantidades de Glutamato. Sin embargo, liberando bajas
concentraciones de Glutamato no se observó ningún efecto, por lo cual se hizo
necesario aumentar la concentración de compuesto enjaulado aplicado y esto sí afectó
el estado de anestesia del animal. Por este motivo se diseñó el experimento descripto
para poder poner a prueba la funcionalidad del compuesto enjaulado de Glutamato.
Según un trabajo reciente (Li et al., 2009) sería suficiente la estimulación de una sola
neurona para afectar el estado global del cerebro. Esto es precisamente lo que pudo
haber ocurrido: al estimular las neuronas que estaban en contacto con el compuesto y
recibieron luz (en el caso del grupo tratado con compuesto y luz) se pudo haber
inducido el pasaje de un plano de anestesia profundo a otro más superficial. Por otro
lado, existe también la posibilidad de que al liberar altas concentraciones de Glutamato,
el neurotransmisor desplace a la ketamina unida a los receptores dejándola sin efecto.
A pesar de que los resultados fueron los esperados, esta prueba no es totalmente
concluyente acerca de la funcionalidad de este compuesto, debido a que, no sólo es
indirecta, sino que además parte de una hipótesis que no ha sido puesta a prueba.
Queda pendiente entonces poner a punto otro protocolo de anestesia para así poder
llevar a cabo el mismo experimento que se realizó con el compuesto de GABA sin el
inconveniente de sacar al ratón de su estado anestésico.
A pesar de que los resultados obtenidos con las pruebas de funcionalidad del
compuesto enjaulado de GABA sean preliminares, debido a que sólo se obtuvieron
resultados con tres ratones, el hecho de que la disminución de la actividad cerebral se
de inmediatamente después del pulso de luz no deja lugar a dudas de que es producida
por el desenjaulado de GABA. Así, estos resultados dan por cumplido el objetivo más
importante del presente trabajo: aplicar un compuesto enjaulado en un animal vivo.
45
Si bien en ganglios de sanguijuela se ha logrado que las neuronas recuperaran su
actividad normal luego del lavado, no puede decirse lo mismo de las pruebas in vivo. A
pesar de haber realizado numerosos lavados con solución fisiológica, luego de la
fotoliberación de GABA no se ha logrado una recuperación total, ya que se sigue viendo
una inhibición de la actividad cortical durante un tiempo muy largo (más de 40 minutos).
Cortes del cerebro de los ratones utilizados para los experimentos realizados con
criostato luego de los mismos han arrojado algo de luz a este problema: fue necesario
hacer varios cortes para dejar de ver la marca del compuesto. Es decir, el compuesto
penetra varias capas de tejido y debido a que la luz también lo hace y que los lavados
sólo pueden remover los productos remanentes de la fotólisis de la superficie, en las
capas más profundas el GABA sigue ejerciendo su efecto. Por otro lado, la recaptación
de GABA por parte de las neuronas presinápticas es un proceso rápido, por lo cual el
efecto del neurotransmisor dura muy poco tiempo. Sin embargo, esto sucede en
condiciones fisiológicas, y no puede decirse que la liberación de grandes cantidades de
GABA en un tiempo muy corto imite una situación normal. El estar liberando mucha
cantidad de neurotransmisor en un tiempo tan corto podría llevar a que las proteínas
transportadoras de GABA (GAT-1) que llevan a cabo la recaptación en el espacio
sináptico se saturen, dejando libre una alta concentración de GABA que podría seguir
ejerciendo su efecto hasta que las proteínas vuelvan a estar disponibles para unir otra
molécula. Otra explicación es que haya más de un tipo de receptor de GABA
involucrado. Utilizando un sistema de expresión heteróloga de oocitos de Xenopus laevis
que expresaban receptores de GABAC se vio que el efecto de la liberación de GABA a
partir
de
un
compuesto
enjaulado
similar
al
utilizado
en
este
trabajo
([Ru(bpy)2PPh3GABA]+) duraba aproximadamente unos 200 segundos (Zayat et al.,
2007). Este tiempo es muy corto cuando se lo compara con los 40 minutos que dura el
efecto de la fotoliberación del GABA en la corteza cerebral de ratón. Existe la posibilidad
de que en este último caso estén involucrados los receptores GABAB que, como ya se
mencionó, median procesos de mayor duración que los receptores GABAA y GABAC. Esto
sería compatible con el hecho de que el efecto del GABA sea menos duradero en oocitos
46
que expresan sólo receptores de GABAC. Asimismo, a partir de estos resultados, se
puede pensar que los receptores de GABA de las motoneuronas de la sanguijuela son
del tipo de los ionotrópicos, aunque no hay una descripción muy detallada sobre los
mismos. Por último, otra posible explicación para la duración del efecto del GABA en el
ratón tiene que ver con que, según se ha reportado (Nelson et al., 2002), muchas drogas
con efectos sedativos actúan mediante la activación del receptor de GABAA. Es posible
entonces que la liberación de altas concentraciones de GABA produzca una transición de
un estado de anestesia más superficial (producido por la ketamina) a uno más profundo
mediada por estos receptores. Si esto fuera así, no haría falta que el GABA esté
disponible durante los 40 minutos que dura el efecto ya que, una vez que se indujo ese
estado anestésico, éste tendría una dinámica propia que podría durar más que el sólo
efecto del neurotransmisor.
Aunque todavía queda mucho por mejorar, este experimento deja las puertas
abiertas para otra serie de experimentos bastante variados, posibles gracias a la
diversidad de ligandos que se han podido enjaular en el laboratorio. Una vez que se
encuentre una técnica menos invasiva podrán realizarse estudios de comportamiento, el
cual podría verse afectado simplemente por la exposición a luz visible. Llevar a cabo
estudios comportamentales utilizando compuestos enjaulados era una de las ideas
originales para este trabajo, pero esto no pudo lograrse debido a que la técnica usada
para aplicar los compuestos in vivo es muy invasiva como para que el animal se recupere
de la cirugía y pueda despertarse.
Por último, algunos problemas técnicos deben ser resueltos con el propósito de
continuar con esta línea dentro del laboratorio. Por un lado, se usaron soluciones del
compuesto en muy altas concentraciones (250 µM) para poder lograr una inhibición
detectable en la corteza cerebral. Esto trae aparejada la necesidad de realizar el
experimento en rigurosas condiciones de oscuridad, lo cual no es siempre posible. Es
decir, al estar el compuesto más concentrado, es más probable que algunas moléculas
47
fotoliberen el ligando por efecto de la luz ambiental, aún cuando se tomen las
precauciones necesarias para evitarlo. Probablemente sea esta la causa de la
disminución de la energía del LFP después que se aplica el compuesto pero antes del
pulso de luz que se observó en 2 de los experimentos realizados con éxito. Cuando esto
sucede el efecto de la fotoliberación es mucho menor, por lo cual es realmente
importante evitar que haya ligando libre al momento de aplicar el compuesto sobre la
corteza cerebral. Sería bueno entonces encontrar cuál es la concentración óptima para
lograr que no sea tan alta como para que haya fotoliberación indeseada ni tan baja
como para que no se pueda detectar su efecto.
Por otro lado, en la figura 4.2 B (ratón 1) se puede observar que luego de aplicar el
compuesto hay un leve incremento de la potencia del LFP. Este efecto ha sido ya
reportado y se debe a un posible antagonismo del grupo protector de los receptores de
GABA (Ríal Verde, 2008). Si bien esto puede sonar contradictorio, a la hora de liberar el
GABA enjaulado mediante un estímulo lumínico el efecto del neurotransmisor es tan
fuerte que no sólo compensa el antagonismo del grupo protector sino que además
ejerce una inhibición neta.
A pesar de que quedan aún muchos puntos que mejorar, se considera que los
objetivos de esta tesis de Licenciatura han sido exitosamente alcanzados.
48
6. Anexo
Potencial de campo local (LFP, de sus siglas en inglés): cuando se coloca un electrodo
extracelular se puede medir la actividad eléctrica de varias neuronas al mismo tiempo.
La cantidad de neuronas que contribuyan a la señal dependerá del alcance del
electrodo, ya que éste puede detectar la actividad de células que se encuentran dentro
de un radio determinado.
Figura 6.1: esquema de un electrodo extracelular registrando el potencial de campo local. Figura tomada
de Quian Quiroga et al., 2009.
A pesar de que el electrodo no está colocado dentro de una célula, puede detectar las
altas frecuencias debidas a los disparos de potenciales de acción de las células más
cercanas. Debido a que el LFP no debe contener componentes de potenciales de acción,
se filtra la señal original (ver “Filtro”) para purificar la señal de frecuencias altas.
Filtro: un filtro digital es un sistema que realiza una operación sobre una señal
reduciendo o aumentando cierta característica de la misma. Los filtros más
comúnmente utilizados son los que reducen significativamente ciertas frecuencias de la
señal. Este tipo de filtros se conocen como filtros pasa-bajos, filtros pasa-altos y filtros
pasa-banda. Los pasa-bajos y los pasa-altos reducen sustancialmente a las frecuencias
49
mayores y menores a cierta frecuencia de corte respectivamente (figura 6.2). Los pasabanda son una combinación de los dos anteriores.
Figura 6.2: muestra de 65596 datos, tomados con una frecuencia de muestreo de 10 KHz (6,5596
segundos de registro). Arriba se muestran los datos crudos. Abajo se puede observar el resultado de
aplicar un filtro “pasa-bajos” (filtro de Butterworth) a los datos originales. Estos registros fueron tomados
en el laboratorio.
Transformada Wavelet: al igual que la Transformada de Fourier, es una descomposición
de una señal en una combinación lineal de funciones ortogonales. La principal diferencia
es que las funciones wavelet tienen la propiedad de estar localizadas en el tiempo (a
diferencia de las funciones seno y las funciones coseno que utiliza la Transformada de
Fourier). Esta propiedad permite tener una resolución temporal acorde a cada
50
frecuencia de descomposición. Las frecuencias altas tendrán una alta resolución
temporal y las frecuencias bajas tendrán poca resolución temporal (figura 6.3).
Figura 6.3: esquema comparativo de una transformada de Fourier (izquierda) y una transformada de
Wavelet (derecha). Nótese que los cuadrados (resolución temporal) en el caso de la transformada de
Fourier son todos iguales; en cambio el ancho de los rectángulos en el caso de la transformada wavelet
varían dependiendo de la frecuencia (va disminuyendo a medida que aumenta la frecuencia). Figura
tomada de Graps et al., 1995.
Energía instantánea: en procesado de señales la energía instantánea se entiende como
la integral para todos los tiempos del módulo del valor de la señal al cuadrado. La
energía instantánea es, por ende, el valor al cuadrado de cada elemento de la señal.
Este parámetro indica cuánto hay de señal (sin importar si es positiva o negativa) a cada
tiempo. En el caso de electrofisiología, la energía instantánea está ligada a la energía
eléctrica.
Fast Fourier Transform (FFT): es un algoritmo para implementar la Discrete Fourier
Transform (DFT) que tiene la propiedad de ser mucho más rápido que otros algoritmos.
La DFT es una transformada que hace una descomposición en frecuencias de Fourier
(combinación lineal de senos y cosenos) pero de una señal que es discreta (ver figura
6.3).
51
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