Download uso de una enzima para preparar un agente para el tratamiento y/o

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : A23K 1/165
11 Número de publicación:
7
51
ESPAÑA
k
2 164 724
A61K 38/46
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 95106817.0
kFecha de presentación: 05.05.1995
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 681 787
kFecha de publicación de la solicitud: 15.11.1995
T3
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87
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k
54 Tı́tulo: Uso de una enzima para preparar un agente para el tratamiento y/o la profilaxis de la
coccidiosis.
k
73 Titular/es:
k
72 Inventor/es: Bedford, Michael R.;
k
74 Agente: Dı́ez de Rivera de Elzaburu, Alfonso
30 Prioridad: 10.05.1994 GB 9409336
FINNFEEDS INTERNATIONAL LTD.
Market House, Ailesbury Court, High Street
Marlborough, Wiltshire SN8 1AA, GB
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.03.2002
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 164 724 T3
01.03.2002
Aviso:
k
k
Morgan, Andrew John;
Taylor, Michael Anthony y
Catchpole, Janet
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 164 724 T3
DESCRIPCION
Uso de una enzima para preparar un agente para el tratamiento y/o la profilaxis de la coccidiosis.
5
El presente invento se refiere al uso de ciertas enzimas para la fabricación de un agente para el tratamiento y/o profilaxis de la coccidiosis.
10
La coccidiosis es una causa común de enfermedad en ganado de ganaderı́a extensiva, particularmente
en aves de corral. La coccidiosis es causada por un protozoo, un parásito unicelular, del subfilo Apicomplexa. Muchas de las especies que causan la enfermedad en animales domésticos pertenecen al género
Eimeria. Los parásitos se multiplican en el epitelio del intestino. En pollos, han sido descritas siete
especies de Eimeria, cinco de las cuales se considera que son patógenas. Estas son la E. acervulina, E.
maxima, E. necratrix, E. tenella y E. brunetti.
15
20
Las coccidias son organismos ubicuos y son generalmente endémicos dondequiera que se crı́en pollos.
El brote de la enfermedad puede variar desde infecciones severas a infecciones muy leves. Como muchos
protozoos parásitos, el ciclo de vida de la Eimeria es relativamente complejo. La multiplicación tanto
sexual como asexual ocurre dentro de los intestinos de los pollos. Durante este proceso de multiplicación
y desarrollo del parásito, se destruye el tejido hospedante, lo que provoca las diversas manifestaciones
clı́nicas observadas en los brotes de coccidiosis. Los oocistos producidos y excretados se desarrollan adicionalmente fuera del hospedante, donde pueden sufrir un desarrollo adicional e infectar a otros pollos.
Los oocistos pueden, de hecho, sobrevivir fuera del hospedante durante un largo perı́odo de tiempo, lo
que les permite infectar subsiguientes buches de pájaros. También pueden extenderse entre las manadas
por otros agentes incluyendo personas, animales domésticos, insectos, roedores, polvo y otros pajáros.
25
Los
zoides.
pollos.
especie
30
Aunque hay diferencias en la patogenicidad entre especies y cepas de Eimeria, los sı́ntomas generales
pueden ser uno o más de los siguientes: heces sanguinolientas, alta mortalidad, letargo generalizado,
demacración, una caı́da marcada en el consumo de alimentos, diarrea y una disminución en la producción
de huevos. Se ha estimado que la coccidiosis es probablemente la responsable de alrededor de 6-10 % de
la mortalidad no deseada entre manadas de aves de granja. Adicionalmente, la enfermedad subclı́nica
aumenta las relaciones de conversión de pienso y reduce el rendimiento. Consecuentemente, las consecuencias económicas de esta enfermedad son considerables.
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40
45
50
55
60
oocistos esporulados contienen cuatro esporocistos, cada uno de los cuales contiene dos esporoEstos esporozoides son liberados por acción mecánica y enzimática en el tracto digestivo de los
Esto les permite invadir las células epiteliales en el intestino o en el ciego dependiendo de la
de Eimera implicada.
Se han probado diversos métodos en un intento de combatir la coccidiosis. Se han realizado intentos
para controlar la enfermedad a través de estrategı́as de control basadas en altas medidas de higiene junto
con el uso de desinfectantes quı́micos en el entorno de las aves de granja. Sin embargo, aún bajo condiciones de higiene extremadamente altas, no ha sido posible erradicar la coccidiosis pese a que se encontró
que tales medidas disminuı́an la presión inicial de la infección en una granja de aves. Se han investigado
tanto vacunas vivas como atenuadas como métodos de control, pero éstas sólo han estado disponibles
recientemente y son relativamente caras.
Actualmente, la coccidiosis en aves de granja se controla rutinariamente por el uso de programas
preventivos de fármacos anticoccidiales. Tales programas intentan restringir las infecciones coccidiales,
limitando de este modo los efectos de los comienzos subclı́nicos de la enfermedad. Esto se lleva a cabo
generalmente por la inclusión continua de agentes anticoccidiales en el pienso desde muy temprano en
la vida de la manada hasta cerca de la matanza de pollos asaderos o por la retirada controlada de las
ponedoras. Cuando se desarrollaron primeramente, tales agentes se usaron individualmente. Esto tuvo
como resultado frecuentemente cepas de parásitos que desarrollaron resistencia a los fármacos. Actualmente se intenta controlar la coccidiosis por la introducción continua de nuevos fármacos o por el uso de
programas de fármacos que implican el uso rotacional de agentes anticoccidiales de diferentes estructuras
bioquı́micas o bien durante el perı́odo de crecimiento (programas lanzadera) o a intervalos frecuentes
(programas de rotación). Pese al uso rutinario de agentes anticoccidiales en piensos de aves, la cocidiosis
subclı́nica se encuentra todavı́a en la mayorı́a de las granjas avı́colas. Además, el uso de fármacos anticoccidiales incrementa significativamente los costes de la producción de aves. Serı́a una ventaja si las
cantidades de tales agentes anticoccidiales, los cuales actualmente tienen que ser incluidos en el pienso
para el control de la coccidiosis, pudieran ser reducidas, o incluso eliminadas totalmente.
El documento WO 93/13786 describe una formulación de microorganismos adecuados para la admi2
ES 2 164 724 T3
5
nistración a un animal. La formulación comprende un primer microorganismo capaz de producir ácido
láctico en el tracto gastrointestinal del animal, un segundo microorganismo capaz de producir un bactericida, al cual los otros microorganismos en la formulación son resistentes, y una enzima degradadora de
fibras o un microorganismo capaz de producir una enzima degradadora de fibras tal como la arabinasa y
la xilanasa.
Consecuentemente, un propósito del presente invento es proporcionar una nueva clase de compuestos
que puedan ser usados para el tratamiento y/o profilaxis de la coccidiosis.
10
Consecuentemente, el presente invento proporciona el uso de una carbohidrasa para la fabricación de
un agente para el tratamiento y/o profilaxis de la coccidiosis.
15
Se ha encontrado lo más sorprendentemente que la inclusión de una carbohidrasa en la dieta de un
animal tiene el efecto de tratar o prevenir la coccidiosis. Si tal enzima es incluida en la dieta de un
animal, entonces las cantidades de fármacos anticoccidiales, que han sido previamente incorporadas rutinariamente en su dieta, pueden ser reducidas o en algunos casos omitidas totalmente. Esto permite
conseguir considerables ahorros económicos en vista del gasto relativo en fármacos anticoccidiales.
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25
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35
40
Cuando se omiten los fármacos anticoccidiales de la dieta de un animal, hay varios beneficios potenciales adicionales. Ası́, previamente ha sido necesario retirar los fármacos anticoccidiales de la dieta
del animal durante un cierto perı́odo de tiempo previo a la matanza. Esto asegura que la carne esté
relativamente libre de tales fármacos y sea ası́ apropiada para el consumo humano. Por el contrario, si
los fármacos anticoccidiales son omitidos totalmente de la dieta normal del animal, como puede lograrse
de acuerdo con el presente invento, entonces el animal puede ser sacrificado a cualquier edad mejor que
tras un cierto perı́odo de retirada. Esto da al granjero una flexibilidad mejorada, y elimina el riesgo de
que las aves lleguen a estar infectadas poco antes de la matanza. Además, puede ası́ garantizarse que la
carne y los huevos están libres de restos de fármacos anticoccidiales. Tales carnes y huevos tienen una
ventaja comercial en comparación con los productos que no pueden aportar tal garantı́a.
Incluso si la enzima añadida a la dieta de los animales sólo permite reducir la cantidad de fármacos
anticoccidiales, el coste total de controlar la coccidiosis se reducirá. La sinergia o potenciación puede
extender la vida útil de los fármacos anticoccidiales.
En un aspecto adicional del presente invento, una o más carbohidrasas pueden ser incluidas en la dieta
de un animal junto con una concentración convencional de fármacos anticoccidiales. Se ha encontrado
que esta combinación da lugar a una sinergia particularmente ventajosa ya que el efecto anticoccidial
resultante es mayor que la mera adición de los efectos individuales de la(s) enzima(s) y fármacos anticoccidiales usados por separado.
La enzima puede ser formulada como una premezcla junto con otras enzimas cualesquiera a ser incluidas en el pienso. La premezcla puede ser añadida a las materias primas antes de la fabricación del
pienso, durante la fabricación del pienso o como un paso final una vez que el pienso esté de otro modo
listo para usar. También es posible añadir la enzima directamente como un lı́quido a un material de
pienso preformado como pastillas o como una masa.
45
También es posible incluir la enzima en la dieta del animal incorporándola en un segundo (y diferente) pienso o en agua para beber a la que el animal también tenga acceso. Consecuentemente, no es
esencial que la enzima sea incorporada en el propio pienso, si bien, tal incorporación forma un aspecto
particularmente preferido del presente invento.
50
Si la enzima es incorporada en el pienso, entonces éste comprende preferiblemente al menos 25 % en
peso de un cereal, y más preferiblemente al menos 35 % en peso del cereal. El cereal puede ser uno cualquiera o más de trigo, centeno, tritical, cebada, avena, sorgo, arroz o maı́z. Es particularmente preferido
que el cereal sea trigo.
55
60
Aunque el componente cereal de una dieta basada en cereales constituya una fuente de proteı́nas,
normalmente es necesario incluir fuentes de proteı́nas suplementarias en la dieta, tales como aquellas
derivadas de harina de pescado, harina de carne o vegetales. Estas fuentes de proteı́nas suplementarias
pueden constituir hasta un 50 % en peso del pienso animal. Fuentes de proteı́nas vegetales incluyen al
menos una de semilla de soja rica en grasa, semilla de colza, canola, harina de soja, harina de colza y
harina de canola.
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Si la enzima se incorpora en el pienso, entonces esto se hace preferiblemente en una cantidad relativa
de 0,00001 - 10 g de la proteı́na enzimática por kilo de pienso, más preferiblemente 0,0001-1 g/kg, y lo
más preferiblemente 0,001-0,1 g/kg.
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10
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30
35
En el caso de que la enzima usada sea una carbohidrasa, entonces ésta es preferiblemente una polisacaridasa tal como una xilanasa, una celulasa, una α-amilasa o una pectinasa. Una celulasa preferida es
la β-glucanasa.
Si la polisacaridasa es una xilanasa, entonces ésta puede ser obtenida de una fuente fúngica tal como
Trichoderma, Aspergillus, Humicola o Neocallimastix. Es particularmente preferido que la xilanasa sea
la xilanasa de bajo pI y/o la xilanasa de alto pI obtenible de Trichoderma longibrachiantum, tal como
la descrita en el documento WO 92/06209. Alternativamente, la xilanasa puede también ser obtenida de
una bacteria tal como Bacillus, Streptomyces, Clostridium o Ruminococcus. También es posible que la
xilanasa puede ser obtenida de un hospedante que haya sido sometido a manipulación genética tal como
por la inclusión de un gen apropiado dentro de una bacteria o cepa fúngica hospedante.
Según un aspecto preferido del presente invento, el agente terapéutico no incluye ningún agente anticoccidial no enzimático. Sin embargo, si tal agente está presente, por ejemplo para contrarrestar un
brote de coccidiosis, entonces puede utilizarse un agente anticoccidial convencional tal como salinomicina,
monensina, narasina, lasalocido, nicarbazina, maduramicina, nicarbazina y narasina en combinación, diclazurilo, dinitolmida, halofuginona, robenidina, amprolium o clopidol. Tales agentes anticoccidiales no
enzimáticos pueden ser incluidos en un pienso animal preferiblemente en una cantidad de 0-100 ppm, y
más preferiblemente 0-50 ppm. Esta última cantidad en particular está muy por debajo de las cantidades
normales de 50-200 ppm usadas para la mayorı́a de agentes anticoccidiales incluidos en piensos animales.
Esto proporciona una de las ventajas del presente invento de ahorro económico resultante del uso de
cantidades inferiores a lo convencional de tales agentes anticoccidiales relativamente costosos.
Como se mencionó anteriormente, se prefiere que el agente proporcionado por el presente invento esté
en la forma de un pienso animal. Un pienso adecuado puede ser obtenido preparando una premezcla de
la carbohidrasa en un vehı́culo cereal, y luego añadir una cantidad apropiada, por ejemplo 1 parte en
peso de esta premezcla a 1000 partes en peso de un pienso animal convencional.
La coccidiosis puede ser tratada o prevenida, de acuerdo con el presente invento, en una diversidad
de ganados. Ası́, la enzima del presente invento puede ser proporcionada en la forma de un agente, tal
como un pienso animal, a ganados tales como pollos, pavos, gansos, patos, cerdos, ovejas o vacas. Sin
embargo, es particularmente preferido que el agente sea administrado a pollos asaderos.
El presente invento se explica adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos.
40
Ejemplo 1
Cuatro grupos separados (A-D), consistiendo cada uno en diez polluelos hembra Lohmann Brown,
fueron alimentados con la siguiente dieta a base de maı́z y trigo durante sus primeros doce dı́as de vida:
45
50
Dieta a base de maı́z y trigo
Trigo
Maı́z
Harina de soja
Harina de pescado
Vitaminas y mezcla mineral
25 %
42 %
20 %
10 %
3%
en
en
en
en
en
peso
peso
peso
peso
peso
Cada uno de los grupos fueron luego alimentados siguiendo la siguiente dieta a base de trigo durante
los dı́as 13-21:
55
60
Dieta a base de trigo
Trigo
Harina de soja
Harina de pescado
Vitaminas y mezcla mineral
67 %
20 %
10 %
3%
en
en
en
en
peso
peso
peso
peso
La dieta de los polluelos en los grupos C y D fue suplementada por una mezcla de enzimas incluyendo
4
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5
xilanasa obtenida de Trichoderma longibrachiatum y β-glucanasa también obtenida de Trichoderma longibrachiatum. De este modo, una premezcla que contenı́a xilanasa sin purificar y β-glucanasa sin purificar
fue preparada y revestida sobre un vehı́culo cereal. Este fue luego añadido al pienso a base de trigo anterior, tal que los piensos resultantes comprendı́an alrededor de 0,0025 g de proteı́na xilanasa y alrededor
de 0,005 g de proteı́na β-glucanasa por kilo de pienso. Las dietas alimentadas a los polluelos de los grupos
A y B no fueron suplementadas con enzimas.
10
Los polluelos de los grupos B y D fueron infectados con oocistos en el dı́a 14. Esta infección tomó la
forma de 5.000 oocistos de E. tenella y 50.000 oocistos de E. acervulina por polluelo. Los polluelos de los
grupos A y C no fueron infectados.
15
En el dı́a 21, siete dı́as tras la infección, se sacrificaron los polluelos y se midió la ganancia en peso
corporal y la evaluación de lesiones según el sistema de Johnson y Reid (Exp. Parasitol. (1970) Vol. 28,
pp 30-36) tanto en el duodeno como en el ciego. Los resultados obtenidos están expuestos en la siguiente
Tabla 1:
TABLA 1
Grupo
Enzima
Infección
Ganancia media de
peso corporal (g)
Evaluación de
lesiones
A
-
-
89,2
0,00
B
-
+
42,4
3,78
C
+
-
91,4
0,00
D
+
+
63,5
3,00
20
25
30
35
40
Se puede entender a partir de los resultados anteriores que la infección coccidial en el grupo B conduce a una pérdida significativa en la ganancia media de peso corporal y un aumento desventajoso en
las lesiones en comparación con el grupo testigo A. Por otro lado, está claro que cuando la dieta a base
de trigo de los polluelos se suplementa con enzimas en el caso del grupo D, entonces los efectos de la
infección coccidial son marcadamente reducidos. En particular, la ganancia media de peso corporal para
los polluelos del grupo D es significativamente mayor que para los polluelos del grupo B.
Además, la evaluación de lesiones para los polluelos del grupo D fue inferior que la evaluación de
lesiones para los polluelos del grupo B.
Ejemplo 2
45
50
Cuatro grupos (E-H), consistiendo cada uno en veinte polluelos macho asaderos de Ross, fueron alimentados con la dieta a base de trigo expuesta en el Ejemplo 1 anterior durante sus primeros veintiocho
dı́as. Las dietas de los polluelos de los grupos F y H fueron suplementadas con xilanasa obtenida de
Trichoderma longibrachiatum. De este modo se preparó una premezcla que contenı́a xilanasa sin purificar
y fue revestida sobre un vehı́culo cereal. Este fue luego añadido al pienso a base de trigo anterior, de
tal manera que los piensos resultantes comprendı́an alrededor de 0,0025 g de proteı́na xilanasa por kg de
pienso. Las dietas alimentadas a los polluelos de los grupos E y G no fueron suplementadas con xilanasa.
Los polluelos de los grupos G y H fueron infectados con oocistos en el dı́a 14 de la misma manera que
los grupos B y D fueron infectados en el Ejemplo 1 anterior.
55
En el dı́a 21, siete dı́as después de que fuera introducida la infección, se midieron la ganancia media
en peso corporal, la ingesta media de pienso y la relación de conversión de pienso de los polluelos de
cada grupo. Además, se sacrificaron 10 polluelos de cada grupo y se midió su viscosidad intestinal. Estos
polluelos fueron también sometidos a una evaluación de lesiones según el sistema de Johnson y Reid tanto
en el duodeno como en el ciego. Los resultados están expuestos en la Tabla 2 siguiente:
60
5
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TABLA 2
Grupo
Enzima
Infección
Ganancia media de
peso
corporal
(g)
Ingesta media de
pienso
(g)
Relación
de
conversión
de
pienso
Evaluación
de
lesiones
Viscosidad
(N.s/m2 )
E
-
-
318
670
2,11
0
0,0184
F
+
-
347
670
1,93
0
0,00625
G
-
+
242
610
2,52
1,9
0,00607
H
+
+
244
500
2,05
2
0,00266
5
10
15
20
25
Los diez polluelos restantes en cada uno de los grupos E-H fueron alimentados durante siete dı́as
más, esto es, por un perı́odo que acababa 14 dı́as después de la infección. A estos polluelos se les estimó
después su ganancia media de peso corporal, la ingesta media de pienso y la relación de conversión de
pienso. Los resultados obtenidos están expuestos en la siguiente Tabla 3.
TABLA 3
30
Grupo
Enzima
Infección
Ganancia
media de
peso corporal (g)
Ingesta
media de
pienso
(g)
Relación
de conversión de
pienso
E
-
-
430
920
2,14
F
+
-
426
880
2,06
G
-
+
396
740
1,87
H
+
+
467
940
2,01
35
40
45
Los resultados expuestos en la Tabla 2 anterior indican que la ganancia media de peso corporal fue
significativamente disminuida por la infección coccidial con o sin suplemento de enzima. Por otro lado,
la ganancia de peso corporal para los polluelos del grupo H se elevó marcadamente en el perı́odo 7-14
dı́as después de la infección como puede verse a partir de los resultados de la Tabla 3.
50
De estas Tablas, también está claro que hay un efecto negativo en la relación de conversión de pienso
(RCP) debida a la infección coccidial. Debe mencionarse que el RCP de un pienso es la relación de la
cantidad de pienso consumida en relación a la ganancia de peso del animal. Un bajo RCP indica que
una cantidad dada de pienso tiene como resultado un animal en crecimiento que gana proporcionalmente
más peso. Esto significa que el animal es capaz de utilizar el pienso más eficientemente. La adición de
la enzima tiene numéricamente un impacto significativo en los resultados de RCP en la Tabla 2. De este
modo, el RCP se mejora alrededor de un 19 % en el caso de las aves infectadas cuya dieta es suplementada
con las enzimas. En comparación, para las aves que no son infectadas, el RCP de los polluelos cuyas
dietas son suplementadas por enzimas mejora sólo un 8,5 % comparado con los polluelos de los grupos
cuyas dietas no son ası́ suplementadas.
55
60
Volviendo a los resultados expuestos en la Tabla 3, se verá que la ganancia en peso corporal fue sustancialmente aumentada por la adición de enzimas en el grupo H infectado en comparación con el grupo
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G que no fue provisto de suplementos de enzimas. Este es un resultado completamente inesperado pero
ventajoso. Por el contrario, puede verse comparando los resultados para los grupos E y F en la Tabla 3,
que la adición de enzimas en ausencia de infección no tiene un efecto significativo.
5
Los datos de RCP expuestos en la Tabla 3 muestran aparentemente el mejor valor para el grupo G. Sin
embargo, esto es engañoso porque los polluelos de este grupo crecieron tan lentamente que no cumplieron
el peso corporal final requerido, tras el perı́odo de crecimiento habitual, y la pérdida económica causada
por esta desventaja contrarrestó cualquier ventaja en la conversión de pienso mejorada.
10
Ejemplo 3
15
Pollos machos asaderos Ross fueron alimentados con el pienso a base de trigo expuesto en el Ejemplo
1 anterior durante sus primeros 12 dı́as. En el dı́a 12, las aves fueron distribuidas aleatoriamente por
peso dentro de ocho grupos, conteniendo cada uno 20 pollos asaderos. Estos ocho grupos “I”-“L” fueron
provistos con piensos de acuerdo con la siguiente Tabla 4:
TABLA 4
Grupo
Pienso
I-
Trigo solo
J-
Trigo + 5 ppm de Cygro
K-
Trigo + enzima
L-
Trigo + enzima + 5 ppm de Cygro
I+
Trigo solo
J+
Trigo + 5 ppm de Cygro
K+
Trigo + enzima
L+
Trigo + enzima + 5 ppm de Cygro
20
25
30
35
40
45
En la Tabla 4 anterior, el pienso proporcionado al Grupo I es el pienso inicial a base de trigo. Los
piensos proporcionados a los Grupos J y L son cada uno suplementados con 5 ppm de Maduramicina (el
nivel de inclusión recomendado) que es un ionóforo anticoccidial comercializado como Cygro por Cyanamid. La enzima que esta incluida en cada uno de los piensos proporcionados a los Grupos K y L es una
xilanasa obtenida de Trichoderma longibrachiatum. Esta es añadida como una premezcla, que contiene
0,375 % de proteı́na xilanasa, al pienso en una cantidad de 0,6 g de la premezcla por kg de pienso.
50
En el dı́a 14, los cuatro grupos “+” fueron infectados oralmente con 50.000 oocistos de E. acervulina y
5.000 oocistos de E. tenella. Se midieron las relaciones de conversión de piensos (para algunos grupos) y
la evaluación de lesiones. Los resultados para la medida de las relaciones de conversión de pienso durante
el ensayo están expuestos en la siguiente Tabla 5:
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60
7
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TABLA 5
Grupo
5
10
Dı́as 0 a 7
Dı́as 7 a 14
Dı́as 0 a 14
I-
2,27
2,85
2,49
K-
2,49
2,94
2,67
I+
2,63
2,48
2,56
K+
2,51
2,11
2,50
15
De los resultados anteriores, se observará que la inclusión de la enzima en el pienso proporcionado al
Grupo K+ mejoró la relación de conversión de pienso por encima del perı́odo crı́tico de 7 dı́as tras la
infección, en comparación con el Grupo I+ alimentado con la dieta de trigo sin suplementar. Este efecto
fue mantenido durante toda la duración del ensayo.
20
Siete dı́as después de la infección, se sacrificaron 10 aves de cada grupo y se examinaron las lesiones
causadas por E. acervulina y E. tenella según el método de Johnson y Reid. Los resultados obtenidos
están expuestos en la siguiente Tabla 6:
TABLA 6
25
Grupo
E. acervulina
E. tenella
I-
0
0
J-
0
0
K-
0
0
L-
0
0
I+
2,5
2,6
J+
2,2
2,2
K+
2,1
2,8
L+
2,0
1,7
30
35
40
45
50
55
De los resultados expuestos arriba, se puede ver que la evaluación de lesiones para E. acervulina fue
significativamente inferior para los grupos cuyos piensos fueron suplementados con la enzima, en comparación con los grupos testigo comparables más próximos. La inclusión de la enzima en los piensos mejoró
la evaluación de lesiones, y también dio lugar a una mejora adicional cuando se usó en combinación con
el agente anticoccidial. La evaluación de lesiones causada por E. tenella no mejoró con la sola suplementación de la enzima en comparación con la dieta de trigo sin suplementar. Por otro lado, la presencia
de la enzima mejoró significativamente el rendimiento del agente anticoccidial, como puede verse de una
comparación entre los Grupos J+ y L+.
Ejemplo 4
60
Pollos macho asaderos Ross fueron alimentados con el pienso a base de trigo expuesto en el Ejemplo 1
anterior durante sus primeros 12 dı́as. En el Dı́a 12, las aves fueron distribuidas aleatoriamente por peso
en dos grupos, conteniendo cada uno 66 pollos asaderos. Estos dos Grupos “M” y “N” fueron provistos
de piensos como sigue.
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5
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El pienso del Grupo N fue la dieta inicial a base de trigo sin ningún suplemento. El pienso del grupo
M fue el mismo pienso suplementado con una enzima xilanasa obtenida de Trichoderma longibrachiatum.
Esta enzima fue añadida como una premezcla, que contenı́a 0,187 % de proteı́na xilanasa, al pienso en una
cantidad de 1 g de la pre-mezcla por kg de pienso. La premezcla también incluı́a una proteasa obtenida
de Bacillus sp. Esto está presente en la premezcla en una cantidad de 0,06 % de proteı́na proteasa.
En el Dı́a 14, los dos grupos fueron infectados oralmente con 30.000 oocistos de E. acervulina, 15.000
oocistos de E. maxima y 3.000 oocistos de E. tenella. Siete dı́as después de la infección, aves de cada
grupo fueron sacrificadas y examinadas en lo que se refiere a las lesiones causadas por E. acervulina, E.
maxima y E. tenella según el método de Johnson y Reid. Los resultados obtenidos están ilustrados en la
siguiente tabla 7:
TABLA 7
15
Dieta
20
25
30
Evaluación de
lesiones
E. acervulina
Evaluación de
lesiones
E. maxima
Evaluación de
lesiones
E. tenella
Grupo N
1,8
0,8
2,5
Grupo M
1,8
0,6
1,7
De estos resultados, se puede observar que la evaluación de lesiones se redujo en el Grupo M alimentado con el pienso suplementado con la enzima en el caso de lesiones causadas tanto por E. maxima como
E. tenella.
El efecto demostrado anteriormente de tratar la coccidiosis en el caso de dietas a base de trigo puede
obtenerse también en piensos basados en centeno, tritical, cebada, avena, sorgo, arroz o maı́z. Adicionalmente, pueden ser obtenidos resultados similares cuando los piensos que incorporan el suplemento de
la enzima de acuerdo con el presente invento alimentados a otros animales infectados o infectables por
coccidiosis, tales como pavos, gansos, patos, cerdos, ovejas y vacas.
35
40
45
50
55
60
9
ES 2 164 724 T3
REIVINDICACIONES
1. Uso de una carbohidrasa para la fabricación de un agente para el tratamiento y/o profilaxis de la
coccidiosis.
5
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el agente está en la forma de un pienso animal.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que el pienso animal comprende al menos 35 % en peso de
cereal.
10
4. Uso según la reivindicación 3, en el que el cereal es trigo.
5. Uso según las reivindicaciones 2-4, en el que el pienso comprende adicionalmente harina de pescado,
harina de carne o una proteı́na vegetal como una fuente suplementaria de proteı́na.
15
20
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que el pienso animal comprende 0,00001-10
g/kg de proteı́na carbohidrasa.
7. Uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la carbohidrasa es una o más polisacaridasas.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que la polisacaridasa es una xilanasa, una celulasa, una αamilasa o una pectinasa.
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
10