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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
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kInt. Cl. : C12N 15/00
11 Número de publicación:
2 155 099
7
51
ESPAÑA
C12N 15/12
C07K 14/47
A01K 67/027
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 94931891.9
kFecha de presentación : 18.10.1994
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 730 643
kFecha de publicación de la solicitud: 11.09.1996
T3
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54 Tı́tulo: Animales transgénicos que albergan alelos APP que presentan una mutación sueca.
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30 Prioridad: 27.10.1993 US 143697
01.11.1993 US 148211
800 Gateway Boulevard
South San Francisco, CA 94080, US
ELI LILLY AND COMPANY
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72 Inventor/es: McConlogue, Lisa C.;
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74 Agente: Curell Suñol, Marcelino
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.05.2001
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.05.2001
ES 2 155 099 T3
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73 Titular/es: Elan Pharmaceuticals, Inc.
Aviso:
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Zhoa, Jun y
Sukanto Sinha
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
1
ES 2 155 099 T3
DESCRIPCION
Animales transgénicos que albergan alelos
APP que presentan una mutación sueca.
Campo técnico
La invención se refiere a animales no humanos
transgénicos y a células transgénicas de mamı́fero
no humano que albergan un transgén que codifica
una proteı́na precursora amiloide (APP) que comprende la mutación sueca [(lisina595 - metionina596) que muta a (asparagina595 - leucina596 )];la
invención se refiere también a animales y células
no humanos que comprenden un transgén que codifica una APP que comprende la mutación sueca
y además loci del gen endógeno APP alterados
funcionalmente, a transgenes y constructos dirigidos utilizados para producir tales células y animales transgénicos, y a transgenes que codifican
secuencias polipeptı́dicas APP humanas con la
mutación sueca. La presente invención proporciona la utilización de animales transgénicos en la
investigación farmacéutica y de animales de investigación comercial para la creación de modelos de
enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo,
la enfermedad de Alzheimer) y de la bioquı́mica
de APP in vivo.
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad progresiva que se conoce generalmente
como demencia senil. Hablando en términos generales, la enfermedad se divide principalmente
en dos tipos, es decir, de comienzo tardı́o y
de comienzo temprano. El de comienzo tardı́o,
que tiene lugar en la ancianidad (más de 65
años), puede estar causada por la atrofia natural del cerebro que se produce a una velocidad
más rápida y a un grado más severo que el normal. La AD de comienzo temprano es mucho
menos frecuente, pero muestra una demencia patológicamente idéntica, con una atrofia cerebral
que se desarrolla bien antes del perı́odo senil, es
decir, entre los 35 y los 60 años de edad.
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza
por la presencia de numerosas placas amiloides
y ovillos neurofibrilares (agregados proteı́nicos
muy insolubles) que se encuentran en los cerebros de los pacientes con AD, particularmente
en aquellas regiones implicadas en la memoria y
la percepción. Mientras que en épocas pasadas
existió un debate cientı́fico significativo respecto
a si las placas y los ovillos eran causa o meramente el resultado de la AD, descubrimientos recientes indican que la placa amiloide constituye
un precursor o factor causante. En particular, se
ha descubierto que la producción del péptido β amiloide, un constituyente principal de la placa
amiloide, puede deberse a mutaciones en el gen
que codifica la proteı́na precursora amiloide, una
proteı́na que cuando se procesa normalmente no
producirá el péptido β - amiloide. Se cree ahora
que un procesamiento normal (no patogénico) de
la proteı́na precursora β - amiloide tiene lugar
mediante la fragmentación entre los aminoácidos
16 y 17 de la proteı́na por una “α secretasa”
putativa. Se cree además que el procesamiento
patológico se realiza a través de una “β secretasa” putativa en el amino terminal del péptido
β - amiloide en el interior de la proteı́na precur2
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sora. Además, el péptido β - amiloide parece ser
tóxico para las neuronas cerebrales, y la muerte
neuronal se asocia con la enfermedad.
El péptido β - amiloide (también denominado
A4, βAP, Aβ, o AβP; véase, la patente estadounidense n◦ 4.666.829 y Glenner y Wong (1984)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:1131)
se deriva de la proteı́na precursora β - amiloide
(βAPP), la cual se expresa en formas de 695,
751 y 770 aminoácidos empalmadas de modo diferente. Véase, Kang et al (1987) Nature 325:
773; Ponte et al (1988) Nature 331: 525; y Kitaguchi et al (1988) Nature 331: 530. El procesamiento normal de la proteı́na precursora amiloide
implica la fragmentación proteolı́tica en un sitio
entre los residuos Lys16 y Leu 17 (tal como se numeran para la región vAP en la que Asp597 es
el residuo 1 en Kang et al (1987)), supra, cerca
del dominio transmembranoso, que da lugar a la
secreción constitutiva de un dominio extracelular
que conserva la porción restante de la secuencia
del péptido β - amiloide (Esch et al (1990) Science
248:1122 - 1124). Esta vı́a aparece ampliamente
conservada entre las especies y se encuentra en
muchos tipos celulares. Véase, Weidemann et al
(1989) Cell 57:115 - 126 y Oltersdorf et al (1990)
J. Biol. Chem 265:4492 - 4497. En esta vı́a normal, se realiza la fragmentación en el interior de la
región de la proteı́na precursora que corresponde
al péptido β - amiloide, evitando aparentemente,
de este modo, su formación. Se ha tenido en
cuenta otra forma de βAPP secretada constitutivamente (Robakis et al Soc. Neurosci, 26 octubre de 1993, Resumen No 15.4, Anaheim, CA)
que contiene más secuencia βAP carboxi terminal
que la forma descrita por Esch et al supra.
Golde et al (1992) Science 255; 728 - 730
preparó diversos mutantes de deleción de la
proteı́na precursora amiloide y observó un sitio
de fragmentación único en el interior de la región
peptı́dica β - amiloide. Basándose en esta observación, se postuló que la formación del péptido
β - amiloide no involucra a una vı́a secretoria.
Estus et al (1992) Science 255:726 - 728, da a
conocer que los dos fragmentos proteolı́ticos terminales carboxı́licos más grandes de la proteı́na
precursora amiloide encontrados en las células cerebrales contienen la región peptı́dica β - amiloide
entera.
Recientes informes muestran que el péptido
β - amiloide soluble es convertido por células sanas en medios de cultivo (Haass et al (1992) Nature 359:322 - 325) y en el CSF animal y humano (Seubert et al (1992) Nature 359:325 - 327).
Palmert et al (1989) Biochem. Biophys. Res.
Comm. 165: 182 - 188, describe tres posibles mecanismos de fragmentación para β APP y presenta evidencias de que la fragmentación de β
APP no tiene lugar en la metionina596 en la producción de derivados solubles de βAPP. El documento de patente estadounidense n◦ 5.200.339
considera la existencia de cierto o ciertos factores
proteolı́ticos que son putativamente capaces de
fragmentar βAPP en un sitio cercano al extremo
amino de βAPP.
Se sabe que el gen APP se localiza en el cromosoma humano 21. Se ha elaborado el mapa en
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el cromosoma 21 de un locus que se segrega con
la enfermedad familiar de Alzheimer (St. George
Hyslop et al (1987) Science 235: 885), cercano
al gen APP. Anteriormente, se habı́a informado
de recombinantes entre el gen APP y el locus
AD (Schellenberg et al (1988) Science 241: 1507;
Schellenberg et al (1991) Am.J.Hum.Genetics
48:563; Schellenberg et al (1991) Am.J.Hum. Genetics 49:511, que se incorpora en la presente memoria como referencia).
La identificación de las mutaciones en el gen
de la proteı́na precursora amiloide que causan la
enfermedad de Alzheimer familiar de comienzo
temprano, evidencia que el metabolismo amiloide
es el evento central en el proceso patogénico que
subyace en la enfermedad. Se ha informado de 4
mutaciones que causan la enfermedad, que incluyen, respecto a la isoforma 770, valina 717 a isoleucina (Goate et al (1991) Nature 349: 704), valina
717
a glicina (Chartier Harlan et al (1991) Nature
353:844), valina717 a fenilalanina (Murrell et al
(1991) Science 254:97); y respecto a la isoforma
695, una mutación doble transforma lisina595 metionina596 a asparagina595 - leucina596 (Mullan et al (1992) Nature Genet 1: 345; Citron et
al (1992) Nature 360: 672), a la que se alude como
la mutación sueca. Los alelos APP que se correlacionan positivamente con la AD se denominan
“alelos asociados con la enfermedad”.
Serı́a muy deseable el desarollo de modelos experimentales de la enfermedad de Alzheimer que
pudieran utilizarse para definir posteriormente los
eventos bioquı́micos subyacentes implicados en su
patogénesis. Tales modelos podrı́an emplearse
presumiblemente, en una aplicación, para la evaluación de agentes que alteraran el curso degenerativo de la AD. Por ejemplo, un sistema modelo
de la enfermedad de Alzheimer podrı́a utilizarse
para evaluar los factores del entorno que inducen o aceleran su patogénesis. Contrariamente
a esto, podrı́a utilizarse un modelo experimental
para evaluar agentes que inhibieran, evitaran, o
invirtieran la progresión de la AD. Presumiblemente, tales modelos podrı́an utilizarse para desarrollar fármacos que fueran efectivos en la evitación, la detención o la inversión de la AD.
Desafortunadamente, sólo el hombre y los primates no humanos de edad desarrollan cualquiera
de las caracterı́sticas patológicas de la AD; el
gasto y la dificultad de utilizar primates y la cantidad de tiempo que es necesario para desarrollar la patologı́a de la AD hace que la investigación extensa en tales animales se convierta en
prohibitiva. Los roedores no desarrollan la AD,
incluso a edad avanzada. Se ha informado que
la inyección de la proteı́na β - amiloide (βAP)
o los fragmentos βAP citotóxicos en el cerebro
del roedor lleva a la pérdida celular e induce un
marcador antigénico para los componentes de ovillo neurofibrilar (Kowall et al (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci (USA) 88:7247). Los ratones que portan una copia extra del gen APP como resultado
de la trisomı́a parcial del cromosoma 16, mueren antes de nacer (Coyle at al (1988) Trends in
Neurosci. 11: 390). Desde la clonación del gen
APP, han habido varios intentos para producir un
modelo murino para la AD utilizando transgenes
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que incluyen la totalidad o parte del gen APP,
pero desafortunadamente, mucho del trabajo no
se ha publicado, todavı́a pues los ratones no fueron viables o no mostraron la patologı́a de tipo
AD. Como mı́nimo, dos informes publicados se
retiraron a causa de irregularidades en los resultados emitidos (Marx J Science 255: 1200; Wirak
et al (1991) Science 253: 323; Kawabata et al
(1991) Nature 354: 476; Kawabata et al. Nature
356: 23; Quon et al (1991) Nature 352: 239; Marx
Science 259: 457).
El documento de patente WO 94/23049 considera la introducción del gen humano APP entero
y no adaptado en la progenie germinal de ratones,
para utilizarlo en la formación de ratones transgénicos que expresen la proteı́na humana APP
completamente entera.
El documento WO 91/19810 describe también
ratones transgénicos, que expresan proteı́nas relacionadas con la patologı́a de la enfermedad de
Alzheimer, es decir, proteı́nas precursoras nucleares β - amiloides, proteı́nas precursoras relacionadas con el β - amiloide e inhibidores de la serı́n
proteasa.
Esta solicitud de patente describe procedimientos y composiciones para transferir transgenes y constructos homólogos de recombinación a células de mamı́feros, especialmente a
células troncales embrionales. Asimismo, describe células no humanas transgénicas y animales no humanos transgénicos que albergan uno o
más transgenes APP de la mutación sueca. Un
objetivo de la presente invención es la aplicación
de tales animales transgénicos como sistemas in
vivo para investigar posibles fármacos en cuanto
a su capacidad para inhibir o evitar la producción
de la placa β - amiloide patogénica. Serı́a deseable proporcionar procedimientos y sistemas para
investigar compuestos de prueba en cuanto a su
capacidad para inhibir o evitar la conversión de la
proteı́na precursora amiloide al péptido β - amiloide patogénico. En particular, serı́a deseable
basar tales procedimientos y sistemas en las vı́as
metabólicas que se han encontrado implicadas en
tal conversión, en la que el compuesto de prueba
serı́a capaz de interrumpir o interferir con la vı́a
metabólica que lleva a la conversión. Tales procedimientos y animales transgénicos deberı́an ser
rápidos, económicos y apropiados para la investigación de grandes cantidades de compuestos de
prueba.
Sumario de la invención
Según el mencionado objetivo, en un aspecto,
la presente invención proporciona la utilización
de un animal no humano o célula troncal transgénicos que comprende un genoma diploide compuesto de un transgén que codifica un polipéptido
APP heterólogo que incluye la mutación sueca, en
el que los residuos aminoácidos en las posiciones
que corresponden a las posiciones 595 y 596 en
la APP685 humana son respectivamente la asparagina y la leucina, para evaluar un agente en
cuanto a su actividad para evitar, inhibir o invertir la enfermedad de Alzheimer. En este aspecto, al animal puede ser murino, y el transgén
puede no estar integrado homologamente. Opcionalmente, el animal no humano transgénico
expresa un polipéptido APP humano que com3
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prende la mutación sueca tal como se describó
anteriormente. El polipéptido APP heterólogo
que comprende la mutación sueca puede ser expresado bajo el control transcripcional de un promotor enolasa neuro - especı́fico.
Los animales no humanos utilizados en la invención albergan por tanto como mı́nimo, una
copia de un transgén que comprende un secuencia polinucleótida que codifica un polipéptido
APP heterólogo que comprende la mutación
sueca (asparagina595 - leucina596) unida operativamente a una secuencia reguladora transcripcional capaz de producir la expresión del polipéptido
APP heterólogo en el animal transgénico no humano. Dicho polipéptido APP heterólogo que
comprende la mutación sueca, se expresa generalmente en células que expresan normalmente el gen
APP endógeno que se encuentra de forma natural
(si se encuentra presente). Tı́picamente, el animal
no humano es un ratón y el gen APP heterólogo es
un gen APP humano con la mutación sueca. Tales transgénes comprenden generalmente un cassette de expresión del APP con la mutación sueca,
en la que un promotor unido y, preferentemente,
un potenciador, guı́an la expresión de secuencias
estructurales que codifican un polipéptido APP
heterólogo que comprende la mutación sueca.
En una forma de realización preferida, los animales no humanos y las células transgénicos utilizados en la invención albergan un gen APP asociado a la enfermedad intacto, bien un alelo humano asociado a la enfermedad tal como un polinucleótido que codifique una proteı́na APP humana que comprenda la mutación sueca, o una copia genómica completa (o minigen) del gen APP
de la mutación sueca.
En otra forma de realización preferida, un
alelo de roedor mutado (por ejemplo, murino)
que comprende modificaciones secuenciales que
corresponden a una secuencia APP humana que
comprende la mutación sueca, puede ser sustituı́do. Las cepas y las progenies celulares (por
ejemplo, las células astrogliales) derivadas de tales animales transgénicos poseen una amplia aplicación en la técnica como modelos experimentales para el desarrollo de terapéutica para la
AD y como una fuente conveniente de proteı́na
APP que comprende la mutación sueca. Además,
los animales transgénicos no humanos que comprenden un transgén que codifica una proteı́na
APP con la mutación sueca, y al que le faltan locis génicos APP endógenos funcionales (esto es,
con antecedentes APP “de alcance de objetivo y
huı́da”) constituyen un origen conveniente de la
proteı́na APP con la mutación sueca cuando faltan otras proteı́nas APP que no incluyen dicha
mutación sueca.
En otro aspecto, la presente invención proporciona la utilización de un transgén que codifica un polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca, en el que los residuos
aminoácidos en las posiciones que corresponden a
las posiciones 595 y 596 en la APP595 humana son
asparagina y leucina, respectivamente, para obtener un animal no humano transgénico con objeto
de evaluar un agente en cuanto a su actividad
para prevenir, inhibir o invertir la enfermedad de
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Alzheimer.
Los transgénes que son necesarios para practicar la invención comprenden, por tanto, un gen
que codifica una APP con una mutación sueca,
estando unido operativamente dicho gen a una
secuencia reguladora de la transcripción que es
funcional en el animal transgénico huésped (por
ejemplo, un promotor especı́fico neural). Tales
transgénes están tı́picamente integrados en una
localización cromosómica del huésped mediante
integración no homóloga. Los transgénes pueden
comprenden además un marcador seleccionable,
tal como un gen neo o gpt unido operativamente
a un promotor constitutivo, tal como un promotor de la fosfoglicerato quinasa (pgk) o un promotor del gen HSV tk unido a un potenciador (por
ejemplo, potenciador SV40).
En formas de realización preferidas de la invención, cuando se practican utilizando animales
transgénicos no humanos, tı́picamente mamı́feros
no humanos, como ratones, los animales albergan como mı́nimo una copia de un transgén o
constructo dirigido tal como se describe en la
presente memoria, integrado bien homóloga o no
homólogamente en una localización cromosómica
endógena, de forma que codifique un polipéptido
APP con una mutación sueca. Tales animales
transgénicos se producen habitualmente introduciendo el transgén o el constructo dirigido en un
huevo fertilizado o en células troncales embrionales (ES), tı́picamente mediante microinyección,
electroporación, lipofección, o biolı́stica. Los animales transgénicos expresan el gen APP de la mutación sueca del transgén (o del constructo dirigido homólogamente recombinado), tı́picamente
en el tejido cerebral. Tales animales son apropiados para uso en diversos modelos de enfermedades
y en la evaluación de fármacos, ası́ como en otras
aplicaciones.
También se describen en la presente memoria animales y células no humanas que albergan
como mı́nimo un constructo dirigido integrado
que altera funcionalmente un locus del gen APP
endógeno, suprimiendo o mutando tı́picamente
un elemento genético (por ejemplo, secuencia
exónica, señal de empalme, promotor, potenciador) que es necesario para la expresión funcional
eficiente de un producto génico completo.
Se describen asimismo en la presente memoria los animales transgénicos no humanos, tales
como un mamı́fero no primate, que poseen como
mı́nimo un alelo APP endógeno inactivado, y
son preferentemente homocigóticos para los alelos
APP inactivados, y que son sustancialmente incapaces de dirigir la expresión eficiente del APP
endógeno (es decir, de tipo salvaje). Por ejemplo, un ratón transgénico es homocigótico para
los alelos APP endógenos inactivados y es sustancialmente incapaz de producir APP murino codificado mediante un gen APP endógeno (es decir,
que se encuentra de modo natural). Tal ratón
transgénico, con genes APP endógenos inactivados, constituye un huésped receptor preferido
para un transgén que codifica un polipéptido APP
heterólogo, preferentemente un polipéptido APP
humano con la mutación sueca. Por ejemplo, el
APP humano que comprende la mutación sueca
puede ser codificado y expresado a partir de un
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transgén (o transgénes) heterólogo (s) en tal ratón
transgénico. Tales transgénes heterólogos pueden integrarse en una localización no homóloga
en un cromosoma del animal no humano, o pueden integrarse mediante recombinación homóloga
o conversión génica en un locus del gen APP no
humano, poniendo de este modo simultánemente
“fuera de combate” al gen APP endógeno (o su
segmento) y reemplazándolo con el gen APP humano (o su segmento).
Descripción breve de las figuras
Figura 1, los cuadros A y B son mapas
plasmı́dicos de pNSEAPPsw∆3’ y pNSEAPPsw,
respectivamente, que se utilizan para producir ratones transgénicos tal como se describe en la presente memoria.
Figura 2, es una transferencia Western de fracciones solubles de cerebros de animales control y
transgénicos sondeados en cuanto a la presencia
de fragmentos βAPP secretados que reaccionan
con el anticuerpo sueco 192. Carril 1: marcadores de peso molelcular; carril 2: progenie no
transgénica; carril 3: progenie transgénica.
Figura 3, los cuadros A y B son transferencias
Western de homogenados cerebrales de animales
transcripcional (+) y no transgénicos ( - ) vaciados de formas βAPP reactivas con anticuerpos
6C6 sondeadas con el anticuerpo 8E5 (cuadro A)
y con el anticuerpo sueco 192 (cuadro B).
Fig 4 muestra una inmunotransferencia que
demuestra la especificidad del anticuerpo sueco
192. Los carriles 1,3,5 contienen mateiral eluı́do
a partir de heparina agarosa. Los carriles 2,4,6
contienen material eluı́do a partir de resina 6C6.
Los carriles 1 y 2 se sondearon con el anticuerpo
8E5; los carriles 3 y 4 se sondearon con el anticuerpo sueco 192; los carriles 5 y 6 se sondearon
con el anticuerpo 6C6.
Definiciones
Si no se definen de otro modo, todos los
términos cientı́ficos y técnicos utilizados en la presente memoria poseen el mismo significado que
el que es entendido habitualmente por los expertos en la materia a la que esta invención pertenece. Aunque pueden utilizarse cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes
para llevar a la práctica o ensayar la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos. Se definen seguidamente los
términos siguientes respecto a los objetivos de la
presente invención.
El término “corresponde a ” se utiliza en la
presente memoria para dar a entender que una secuencia polinucleótida es homóloga (es decir, que
es idéntica, que no está estrictamente relacionada
de modo evolutivo) a la totalidad o a una porción
de una secuencia polinucleótida de referencia, o
que una secuencia polipéptida es idéntica a una
secuencia polipéptida de referencia. En contraste,
el término “complementario a” se utiliza en la
presente memoria para significar que la secuencia
complementaria es homóloga a la totalidad o a
una parte de una secuencia polinucleótida de referencia. Como ejemplo, la secuencia nucleótida
“TATAC” corresponde a una secuencia “TATAC”
de referencia y es complementaria a una secuencia
de referencia “GTATA”.
Los términos “corresponde sustancialmente
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a”, “sustancialmente homólogo” o “identidad sustancial” tal como se utilizan en la presente memoria, aluden a una caracterı́stica de una secuencia
ácido nucleica, en la que una secuencia ácido nucleica posee por lo menos una identidad secuencial
del 70 % comparada con una secuencia de referencia, tı́picamente, una identidad secuencial del
85 % por lo menos, y preferentemente, por lo menos, una identidad secuencial del 95 %, comparada con una secuencia de referencia. El porcentaje de identidad secuencial se calcula excluyendo
pequeñas deleciones o adiciones cuyo total sea menor que el 25 % de la secuencia de referencia. Esta
puede constituir un subconjunto de una secuencia
más grande, tal como una porción de un gen o secuencia flanqueante, o una porción repetitiva de
un cromosoma. Sin embargo, la secuencia de referencia tiene por lo menos 18 nucleótidos de largo,
tı́picamente por lo menos 30 nucleótidos de largo,
y preferentemente de 50 a 100 nucleótidos, por lo
menos, de largo. “Sustancialmente complementario”, tal como se utiliza en la presente memoria,
se refiere a una secuencia que es complementaria
a una secuencia que corresponde sustancialmente
a una secuencia de referencia.
La hibridación especı́fica se define en la presente memoria como la formación de hı́bridos entre una secuencia transgénica dirigida (por ejemplo, un polinucleótido de la invención que puede
incluir sustituciones, deleciones, y/o adiciones)
y una secuencia especı́fica del ADN diana (por
ejemplo, una secuencia del gen APP humano),
en el que una secuencia transgénica dirigida marcada se hibridiza preferentemente a la diana de
tal forma que, por ejemplo, una banda única que
corresponde a un fragmento de restricción de un
gen, puede identificarse en una transferencia Southern de ADN preparado a partir de células que
utilizan dicha secuencia transgénica dirigida marcada como una sonda. Es evidente que las condiciones de hibridación óptimas variarán dependiendo de la composición secuencial y de la longitud (o longitudes) del transgén (o transgénes)
dirigido(s) y de la diana (o dianas) endógena
(s) y del método experimental seleccionado por
el médico. Pueden utilizarse directrices diversas para seleccionar las condiciones de hibridación
apropiadas (véase, Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1989), 2a¯ edición,
Cold Spring Harbor, N.Y. y Berger y Kimmel,
Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to
Molecular Cloning Techniques (1987), Academic
Press, Inc., San Diego, CA., que se incorpora en
la presente memoria como referencias.
El término “se encuentra de modo natural”
tal como se utiliza en la presente memoria aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que se le
puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo,
una secuencia polipeptı́dica o polinucleótida que
se encuentra en un organismo (incluyendo virus)
que puede ser aislada de un origen en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente
por el hombre en el laboratorio, se encuentra de
modo natural. Tal como se utiliza en la presente
memoria, las cepas de laboratorio de los rumiantes que pueden haber sido criados selectivamente
según la genética clásica se consideran animales
que se encuentran de modo natural.
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El término “similar” tal como se utiliza en
la presente memoria, se refiere a una secuencia
génica que está relacionada evolucionaria y funcionalmente entre especies. Por ejemplo pero sin
restricción, en el genoma humano, el locus del
gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina
humana es el gen similar al locus génico de la cadena pesada de la inmunoglobulina del ratón, ya
que las secuencias y estructuras de estos dos genes indican que son homólogos en alto grado y
los dos genes codifican una proteı́na que funciona
para unir antı́genos especı́ficamente.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
el término “xenogénico” se define respecto a una
célula huésped receptora de mamı́fero o de animal no humano, y significa que una secuencia
aminoácida o polinucleótida no está codificada
por o no se encuentra en, respectivamente, el genoma que se encuentra de modo natural de la
célula huésped receptora de mamı́fero o del animal no humano. Las secuencias del ADN xenogénico son secuencias de ADN extraño; por
ejemplo, un gen APP humano es xenogénico respecto a las células ES murinas; igualmente, como
ejemplo, un alelo CFTR asociado a la fibrosis
quı́stica humana es xenogénico respecto a una
progenie celular humana que sea homocigótica
para los alelos CFTR de tipo salvaje (normal).
Ası́, una secuencia ácido nucleica murina clonada
que se ha mutado (por ejemplo, mediante mutagénesis puntual dirigida), es xenogénica respecto al genoma murino del cual la secuencia se
derivó originariamente, si la secuencia mutada no
se encuentra de forma natural en el genoma murino.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un “gen heterólogo o “secuencia polinucleótida heteróloga” se define respecto al organismo no humano transgénico que produce tal
producto génico. Un polipéptido heterólogo, al
que también se alude como a un polipéptido xenogénico, se define como un polipéptido que posee una secuencia aminoácida, o una secuencia
codificante ADN que corresponde a la de un gen
similar encontrado en un organismo que no consiste en el animal transgénico no humano. Ası́,
un ratón transgénico que alberga un gen APP
humano puede describirse como que alberga un
gen APP heterólogo. Un transgén que contenga
varios segmentos génicos que codifiquen una secuencia proteı́nica heteróloga, puede identificarse
fácilmente, por ejemplo, mediante hibridación
o secuenciación del ADN, siendo de una especie distinta del organismo que el animal transgénico. Por ejemplo, la expresión de secuencias aminoácidas del APP humano puede detectarse en los animales no humanos transgénicos de
la invención con anticuerpos especı́ficos para los
epı́topos APP humanos codificados por los segmentos del gen humano AP. Un gen heterólogo
similar se refiere a una gen correspondiente de
otra especie; ası́, si la APP murina es la referencia, el APP humano es un gen heterólogo similar
(como es la APP porcina, ovina, o de rata, junto
con los genes AP de otras especies). Se puede
aludir a una secuencia génica endógena mutada
como un gen heterólogo; por ejemplo, un transgén que codifique una APP murina que incluya
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una mutación sueca (que no se conoce en los genomas murinos que se encuentran de modo natural)
es un transgén heterólogo respecto a las especies
murinas y no murinas.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
el término “constructo dirigido” se refiere a un
polinucleótido que comprende: (1) una región
homóloga, por lo menos, que posee una secuencia que es sustancialmente idéntica o substancialmente complementaria a una secuencia que se encuentra en un locus génico endógeno de una célula
huésped, y (2) una región dirigida que se integra en un locus génico endógeno de una célula
huésped mediante recombinación homóloga entre
una región homóloga del constructo dirigido y dicha secuencia del locus génico endógeno. Si el
constructo dirigido es un constructo del tipo “alcanza un objetivo y huye” o “de entrar y salir”
(Valancius y Smithies (1991) Mol. Cell. Biol 11:
1402; Donehower et al. (1992) Nature 356: 215;
(1991) J. NIH Res. 3: 59; Hasty et al. (1991)
Nature 350; 243, que se incorporan como referencia en la presente memoria), la región dirigida se incorpora sólo de forma transitoria en el
locus génico endógeno y se elimina del genoma
del huésped mediante selección. Una región dirigida puede comprender una secuencia que es
sustancialmente homóloga a una secuencia génica
endógena y/ o puede comprender una secuencia
no homóloga, tal como un marcador seleccionable
(por ejemplo neo, tk, gpt). El término “constructo dirigido” no indica necesariamente que el polinucleótido comprende un gen que va a integrarse
en el genoma del huésped, ni indica que el polinucleótido incluye una secuencia génica estructural completa. Tal como se utiliza en la técnica,
el término “constructo dirigido” es sinónimo del
término “transgén dirigido” tal como se utilizó en
la presente memoria.
Los términos “región de homologı́a” y “pinza
de homologı́a” tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a un segmento (es decir, una parte) de un constructo dirigido que posee una secuencia que corresponde substancialmente o es complementaria sustancialmente con
una secuencia génica endógena predeterminada,
que puede incluir secuencias que flanqueen dicho gen. Una región homóloga tiene generalmente como mı́nimo alrededor de 100 nucleótidos
de largo, alrededor como mı́nimo preferentemente
de 250 a 500 nucleótidos de largo, y tı́picamente,
como mı́nimo alrededor de 1000 nucleótidos de
largo o más larga. Aunque no se ha demostrado
una longitud mı́nima teórica para que una pinza
de homologı́a medie la recombinación homóloga,
se cree que la eficiencia de ésta aumenta generalmente con la longitud de la pinza de homologı́a.
De modo similar, la eficiencia de recombinación
aumenta con el grado de homologı́a secuencial entre una región de homologı́a del constructo dirigido y la secuencia diana endógena, con una
eficiencia de recombinación óptima que se produce cuando una pinza de homologı́a es isogénica
con la secuencia diana endógena. Los términos
“pinza de homologı́a” y “región de homologı́a”
son intercambiables tal como se utilizan en la
presente memoria, y la terminologı́a alternativa
se ofrece en aras de la claridad, en vista de la
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utilización inconsistente de términos similares en
la técnica. Una pinza de homologı́a no implica
necesariamente la formación de una estructura
hı́brida de bases emparejadas con una secuencia
endógena. En la presente memoria, a las secuencias génicas endógenas que corresponden substancialmente o son complementarias sustancialmente
a una región transgénica de homologı́a se alude
como “secuencias diana de entrecruzamiento” o
“secuencias diana endógenas”.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
el término “minigen” se refiere a un constructo génico heterólogo en el que uno o más segmentos no esenciales de un gen son suprimidos
respecto al gen que se encuentra de forma natural. Tı́picamente, los segmentos suprimidos son
secuencias intrónicas de por lo menos de alrededor de 100 pares de bases hasta varias kilobases, y pueden abarcar hasta varias decenas de
kilobases o más. El aislamiento y la manipulación de grandes constructos dirigidos (esto es,
mayores que alrededor de 50 kilobases) es frecuentemente difı́cil y puede reducir la eficiencia de
transferencia del constructo dirigido a una célula
huésped. Por tanto, es deseable con frecuencia reducir el tamaño de una constructo dirigido suprimiendo una o más de las partes no esenciales del
gen. Tı́picamente, pueden suprimirse las secuencias intrónicas que no abarcan elementos reguladores esenciales. Frecuentemente, si sitios convenientes de restricción se unen a una secuencia
intrónica no esencial de una secuencia génica clonada, puede producirse una deleción de la secuencia intrónica mediante: (1) digestión del ADN
clonado con los enzimas de restricción apropiados, (2) separación de los fragmentos de restricción (por ejemplo, mediante electroforesis), (3)
aislamiento de los fragmentos de restricción que
abarcan los exones esenciales y los elementos de
regulación, y (4) uniendo los fragmentos que pue
de restricción para formar un minigen en el que
los exones se encuentran en el mismo orden lineal que hay en la copia de la progenie germinal
del gen que se encuentra de forma natural. Para
los expertos en la materia se evidenciarán procedimientos alternativos para producir un minigen
(por ejemplo, la unión de clones genómicos parciales que abarquen exones esenciales pero a los
que faltan partes de secuencias intrónicas). Más
tı́picamente, los segmentos génicos que comprenden un minigen se dispondrán en el mismo orden
lineal que se encuentra en el gen de la progenie
germinal, pero sin embargo, no se tratará siempre
de eso. Algunos elementos reguladores deseados
(por ejemplo, potenciadores, silenciadores) pueden ser posicionalmente insensibles de modo relativo, de forma que el elemento regulador funcionará correctamente incluso si se posiciona de
modo diferente en un minigén que en el correspondiente gen de la progenie germinal. Por ejemplo,
un potenciador puede localizarse a una distancia
distinta de un promotor, en una orientación diferente, y/o en un orden lineal distinto. Por ejemplo, un potenciador que se sitúe en el extremo 3’
de un promotor en una configuración de progenie germinal, podrı́a localizarse en el extremo 5’
del promotor en un minigén. De modo similar,
algunos genes pueden tener exones que se em-
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palmen alternativamente al nivel de ARN, y por
tanto un minigen puede tener menos exones y/o
exones en un orden lineal diferente que el correspondiente gen de la progenie germinal y todavı́a
codifica un producto del gen funcional. Un cADN
que codifica un producto génico puede utilizarse
también para construir un minigen. Sin embargo,
ya que a menudo es deseable que el minigen heterólogo sea expresado de modo parecido al gen similar no humano que se encuentra naturalmente,
la transcripción de un minigen cADN es gobernada tı́picamente mediante un promotor y potenciador del gen ligados procedentes del gen que
se encuentra naturalmente. Frecuentemente, tal
minigen puede comprender una secuencia reguladora transcripcional (por ejemplo, promotor y/o
potenciador) que confiere la transcripción CNS
especı́fica o neuro - especı́fica de las secuencias
codificantes del APP minigen.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
el término “unidad transcripcional” o “complejo
transcripcional” se refiere a una secuencia polinucleótida que comprende un gen estructural (exones), un promotor unido actuante cis y otras secuencias actuantes cis necesarias para la transcripción eficiente de las secuencias estructurales,
elementos reguladores distales necesarios para la
apropiada transcripción histo - especı́fica y del
desarrollo de las secuencias estructurales, y secuencias cis adicionales importantes para la transcripción y la traducción eficientes (por ejemplo,
sitio de poliadenilación, secuencias de control de
la estabilidad del ARNm).
Tal como se utiliza en la presente memoria,
“unido” significa en ligamiento polinucleótido (es
decir, ligamiento fosfodiéster). “No unido” significa que no existe ligamiento a otra secuencia
polinucléotida; por tanto, dos secuencias no están
unidas si cada secuencia posee un extremo 5’ libre
y un extremo 3’ libre.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
el término “unido operativamente” se refiere a
un ligamiento de elementos polinucleótidos en
una relación funcional. Un ácido nucleico está
“unido operativamente” cuando se sitúa en una
relación funcional con otra secuencia ácido nucleica. Por ejemplo, un promotor o potenciador
está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de ésta. Unido
operativamente significa que las secuencias del
ADN que están unidas son tı́picamente contiguas
y, donde es necesario unir dos regiones codificantes proteı́nicas, son contiguas en el marco de lectura.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
el término “constructo dirigido correctamente” se
refiere a una parte del constructo dirigido que
se integra en el interior o adyacentemente a una
secuencia diana endógena de entrecruzamiento,
tal como una parte de un locus endógeno del
gen APP. Por ejemplo pero sin restricción, una
porción de un transgén dirigido que codifica neo
y está flanqueado por regiones homólogas que
muestran una identidad sustancial con las secuencias endógenas del gen APP que flanquean el primer exón, se dirige correctamente cuando dicha
porción transgénica se integra en una localización
cromosómica de forma que reemplaza, por ejem7
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plo, el primer exón del gen PP endógeno. En
contraste y asimismo por ejemplo, si el transgén
dirigido o una porción del mismo se integra en
una región no homóloga y/o en una región que
no forma parte de un entorno de 50 kb aproximadamente de una secuencia del gen APP, el producto resultante es un transgén dirigido incorrectamente. Es posible generar células que posean
tanto un transgén o transgénes dirigidos correctamente como un transgén o transgénes dirigidos
incorrectamente. Las células y los animales que
poseen un transgén o transgénes dirigidos correctamente y/o un transgén o transgénes dirigidos
incorrectamente pueden identificarse y resolverse
mediante PCR y/o análisis de transferencia Southern del ADN genómico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término “región dirigida” se refiere a una porción
de un constructo dirigido que se ha llegado a integrar en una localización cromosómica endógena
después de recombinación homóloga entre una
pinza de homologı́a y una secuencia del gen APP
endógeno. Tı́picamente, una región dirigida está
flanqueada a cada lado por una pinza de homologı́a, de forma que una recombinación de doble entrecruzamiento entre cada una de las pinzas de homologı́a y sus correspondientes secuencias del gen APP endógeno da lugar al reemplazo
de la porción del locus del gen APP endógeno
por la región dirigida; en tales constructos dirigidos de reemplazamiento de doble entrecruzamiento del gen, se puede aludir a la región dirigida como “región de reemplazamiento”. Sin
embargo, algunos constructos dirigidos pueden
utilizar sólo una única pinza de homologı́a (por
ejemplo, algunos vectores de tipo “alcance de objetivo y huı́da”, véase, Bradley et al. (1992)
Bio/Technology 10: 534, que se incorpora aquı́
como referencia).
Tal como se utiliza, el término “región de
reemplazamiento” se refiere a una porción de
un constructo dirigido flanqueado por regiones
de homologı́a. Después de la recombinación
homóloga de doble entrecruzamiento entre las regiones homólogas flanqueantes y sus correspondientes secuencias diana de entrecruzamiento del
gen APP endógeno, la región de reemplazamiento
se integra en el cromosoma de la célula huésped
entre las secuencias diana endógenas de entrecruzamiento. Las regiones de reemplazamiento
pueden ser homólogas (por ejemplo, tienen una
secuencia similar a la secuencia del gen APP
endógeno, pero presentan una mutación puntual
o una mutación sin sentido), no homóloga (por
ejemplo, un cassette de expresión del gen neo),
o una combinación de regiones homólogas y no
homólogas. La región de reemplazamiento puede
convertir el allelo APP endógeno en un alelo APP
que comprende una mutación sueca; por ejemplo,
la región de reemplazamiento puede abarcar la
región del gen APP que codifica los residuos 595
y 596 de la isoforma APP de 695 aminoácidos
de longitud (o de su equivalente no humano) y
la región de reemplazamiento puede comprender una secuencia que codifica la asparagina595 leucina596 en las posiciones 595 y 596 (según la
numeración de Kang et al. (1987) (en el trabajo
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citado).
Los términos “alteración funcional” o “alterado funcionalmente” tal como se utilizan en la
presente memoria, significan que un locus génico
comprende al menos una mutación o alteración
estructural de forma que el gen alterado funcionalmente es incapaz de dirigir la expresión eficiente del producto génico funcional. Por ejemplo pero sin restricción, un gen APP endógeno
que posee un cassette génico neo integrado en
un exón (por ejemplo, el tercer exón) de un gen
APP, no es capaz de codificar una proteı́na funcional (isoforma) que comprenda el exón inactivado
y constituye, por tanto, un locus del gen APP
alterado funcionalmente. También, por ejemplo, una mutación dirigida a los exones de un
gen APP endógeno puede dar lugar a un gen
endógeno mutado que puede expresar una isoforma proteı́nica APP truncada. La alteración
funcional puede incluir la sustitución completa
de un locus génico APP heterólogo en lugar de
un locus APP endógeno, por lo que, por ejemplo, se dice que un transgén dirigido que reemplaza al locus entero del APP de ratón con
un alelo APP humano de mutación sueca, que
puede ser funcional en el ratón, ha funcionalmente alterado el locus APP murino endógeno
al reemplazarlo. Preferentemente, un exón como
mı́nimo que se incorpore a los ARNm que codifican la mayorı́a o la totalidad de las isoformas
APP, hace que éstas se alteren funcionalmente.
La deleción o interrupción de elementos reguladores transcripcionales esenciales, de la señal o
señales de poliadenilación, de secuencias de sitio de empalme, producirá también un gen alterado funcionalmente. La alteración funcional
de un gen APP endógeno, puede producirse asimismo por otros procedimientos (por ejemplo, supresión génica debida a polinucleótidos antisentido). El término “alterado estructuralmente” se
refiere a un gen diana en el que por lo menos
una secuencia estructural (es decir, exon) ha sido
alterada mediante el direccionamiento de genes
homólogos, inserciones, deleciones, mutación(es)
puntual(es) y/o reajuste. Tı́picamente, los alelos APP que están alterdados estructuralmente
se alteran consecuentemente de forma funcional,
pudiendo también, sin embargo, alterarse funcionalmente los alelos APP sin ser alterados estructuralmente de forma concomitante, es decir, mediante la alteración dirigida de una secuencia no
exónica, como la ablación de un promotor. A
un alelo que posee una alteración dirigida que interfiere con la expresión eficiente de un producto
génico funcional suyo, se alude en la técnica como
un “alelo nulo” o un alelo “fuera de combate”.
El término “agente” se utiliza en la presente
memoria para indicar un compuesto quı́mico,
una mezcla de compuestos quı́micos, una macromolécula biológica, o un extracto fabricado a
partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos, o animales (particularmente
mamı́feros), células o tejidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
“isoforma”, “APP”, e “isoforma APP” se refieren
a un polipéptido que es codificado al menos por
un exón del gen APP (Kitaguchi et al. (1988)
Nature 331: 530; Ponte et al., ibid., p. 525; R.E.
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Tanzi, ibid., p. 528; de Sauvage y Octave (1989)
Science 245: 651; Golde et al. (1990) Neuron
4:253). Una isoforma APP puede ser codificada
por un alelo APP (o su exón) que está asociado
con una forma de la enfermedad de Alzheimer o
que no está asociado con un fenotipo de dicha
enfermedad.
El término “gen β - amiloide” se utiliza
en la presente memoria como sinónimo para el
gen APP, puesto que β - amiloide es un producto proteı́nico producido por una fragmentación post - traduccional de un producto del gen
APP.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
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“APP695 ”, “APP751 y “APP770 , se refieren,
respectivamente, a los polipéptidos con una longitud de 695, 751 y 770 residuos aminoácidos codificados por el gen APP humano (Ponte et al.,
en el lugar citado; Kitaguchi et al., en el lugar
citado; Tanzi et al., en el lugar citado).
Tal como se utiliza en la presente memoria,
“codon 595” y “codon 596” se refieren a los codones (es decir, las secuencias trinucleótidas) que
codifican las posiciones enésimas aminoácidas 595
y 596 en APP695 , o la posición aminoácida en
una isoforma APP o fragmento que corresponde a
las posiciones enésimas aminoácidas 595 y 596 en
APP695 según la convención numérica en Kang et
al. (1987) (en el trabajo citado) Por ejemplo pero
sin restricción, un fragmento de 600 residuos de
largo que es producido truncando APP695 , eliminando los 95 aminoácidos N - terminales, posee
las posiciones aminoácidas 500 y 501 que corresponden con los codones 595 y 596 de APP695 . De
hecho, tal como se utiliza en la presente invención,
la mutación sueca se caracteriza por residuos asparagina y leucina, respectivamente, en las posiciones aminoácidas 595 y 596 en APP695 que
corresponden a las posiciones aminoácidas 670 y
671 en APP770 .
Descripción detallada
Generalmente, la nomenclatura que se utiliza
de ahora en adelante y los procedimientos de
laboratorio en cultivo celular, genética molecular y quı́mica de ácidos nucleicos e hibridación
que se describen seguidamente son los que se
conocen bien y se utilizan habitualmente en la
técnica. Se utilizan técnicas estándar para procedimientos recombinantes de ácidos nucleicos,
sı́ntesis de polinucleótidos, cultivos celulares, e incorporación de transgénes (por ejemplo, electroporación, microinyección, lipofección). Generalmente, las reacciones enzimáticas, la sı́ntesis de
oligonucleótidos y las etapas de purificación, se
llevan a cabo según las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se realizan
generalmente según procedimientos convencionales en la técnica y diversas referencias generales
que se proporcionan mediante este documento. Se
cree que estos procedimientos son bien conocidos
en la técnica y se proporcionan para comodidad
del lector. Toda la información que está contenida en la presente memoria se incorpora como
referencia.
Se derivan ratones quiméricos diana según Hogan, et al., Manipulating the Mouse Embryo: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora-
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tory (1988) y Teratocarcinomas and Embryonic
Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Roberston, editor, IRL Press, Washington, D.C., (1987),
que se incorporan en la presente memoria como
referencia.
Las células troncales embrionales se manipulan según procedimientos publicados (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical
Approach, E.J. Roberston, ed., IRL Press, Washington, D.C. (1987); Zjilstra et al., Nature 342:
435 - 438 (1989); y Schwartzberg et al., Science
246:799 - 803 (1989), cada de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia).
Los oligonucleótidos pueden sintetizarse en un
sintetizador oligonucleótido de Applied Bio Systems según las especificaciones proporcionadas
por el fabricante.
En general, de ahora en adelante se describen
procedimientos y constructos polinucleótidos que
se utilizan para generar animales transgénicos no
humanos que expresan un polipéptido APP que
comprende la mutación sueca. Algunos animales
transgénicos no humanos que expresan una mutación sueca APP pueden también tener alterado
funcionalmente el locus del gen APP endógeno.
Ventajosamente, la mutación sueca da lugar a una
expresión potenciada de Aβ, expresando generalmente los animales o las células la mutación Aβ
sueca codificada por el transgén, a un nivel significativamente más alto que la Aβ normal. Se
cree que la Met596 a Leu596 posee una importancia particular en la expresión preferente de la Aβ
sueca cuando se compara con la Aβ normal (tipo
salvaje).
Fragmentos que se secretan, identificados nuevamente, comprenden la porción amino terminal
de βAPP (Aβ) que permanece después de la fragmentación y a la que se aludirá de ahora en adelante como forma del fragmento amino - terminal de βAPP (ATF - βAPP). Se cree que ATF βAPP es el producto de una vı́a de procesamiento secretorio alternativo para Aβ, la cual vı́a
se encuentra incluso en las células normales (no
enfermas). Se cree además, sin embargo, que la
vı́a secretora alternativa puede ser responsable de
un suceso esencial en la producción de Aβ en las
células enfermas en los pacientes, y que la producción anormal de ATF - βAPP puede estar implicada en enfermedades relacionadas con la placa
Aβ, particularmente la enfermedad de Alzheimer
y el sı́ndrome de Down.
Modelos animales particularmente preferidos
para la fragmentación mediante la β - secretasa
de Aβ son animales transgénicos que expresan
la mutación sueca del gen Aβ, tal como se describió anteriormente. Se ha encontrado que tales
animales transgénicos, particularmente los ratones transgénicos, producen grandes cantidades de
ATF - βAPP que puede detectarse según los procedimientos de la presente invención. En particular, se ha encontrado que la mutación sueca de Aβ
produce cantidades de ATF - βAPP que son habitualmente, por lo menos, dos veces superiores a la
βAPP humana de tipo salvaje que se expresa en
los animales. Habitualmente, la producción será
significativamente más alta, tı́picamente, por lo
menos, de dos veces superior. Con tales elevados
niveles de producción de ATF - βAPP, se faci9
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lita mucho la monitorización de la actividad de la
β - secretasa bajo distintas condiciones. En particular, la investigación de medicamentos y otras
terapias para inhibir la actividad de la β - secretasa (y por tanto de la inhibición de la producción
de βAPP), se simplifican mucho en los modelos
animales que expresan la mutación sueca de la
βAPP humana.
Se administran agentes a los animales de
prueba tales como ratones de ensayo, que son
transgénicos y que expresan la mutación sueca
de la βAPP humana. Se describen de aquı́ en
adelante, técnicas particulares para la producción
de ratones transgénicos que expresan la forma
sueca de βAPP. Se observará que pueden prepararse fácilmente otros animales transgénicos que
expresen la βAPP humana sueca, incluyendo ratas, hamsters, cobayas, conejos y análogos. El
efecto de los compuestos de prueba sobre la producción de ATF - βAPP en los animales de ensayo
puede medirse en varias muestras de éstos.
El efecto de los agentes de prueba sobre la
producción de ATF - βAPP en los animales de
ensayo puede medirse en varias muestras a partir
de éstos. En todos los casos, será necesario obtener un valor de control que es caracterı́stico del
nivel de producción de ATF - βAPP en el animal
de ensayo en ausencia del compuesto o compuestos de prueba. En los casos en que el animal se
sacrifica, será necesario basar tales valores de control en un promedio o valor tı́pico de otros animales de ensayo que se hayan modificado transgénicamente para expresar el mutante sueco de la
βAPP humana, pero que no hayan recibido la administración de cualquier compuesto de prueba o
de cualquier otra sustancia que se espera afecte el
nivel de producción de ATF - βAPP. Una vez tal
nivel de control se ha determinado, los compuestos de prueba pueden administrarse a animales de
ensayo adicionales, en los que la desviación del valor del control promedio indica que el compuesto
de prueba tenı́a un efecto sobre la actividad β secretasa en el animal. Las sustancias de prueba
que se consideran positivas, es decir, susceptibles
de ser beneficiosas en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o de otras condiciones relacionadas con el β - amiloide, serán aquéllas que
sean capaces de reducir el nivel de producción de
ATF - βAPP, preferentemente en un 20 % por lo
menos, más preferentemente en un 50 % por lo
menos, y más preferentemente en un 80 % por lo
menos.
Los agentes de prueba pueden ser cualquier molécula, compuesto, u otra sustancia que
pueda añadirse al cultivo celular o administrarse al animal de ensayo, sin interferir sustancialmente con la viabilidad celular o del animal. Agentes de prueba apropiados pueden ser
pequeñas moléculas, polı́meros biológicos, tales
como polipéptidos, polisacáridos, polinucleótidos,
y análogos. Los compuestos de prueba se administrarán tı́picamente a los animales transgénicos
a una dosis de entre 1 ng/kg a 10 mg/kg, habitualmente de entre 10 µg/kg a 1 mg/kg.
Los compuestos de prueba que son capaces
de inhibir la secreción o la producción animal de
ATF - βAPP se consideran candidatos para determinaciones ulteriores de la capacidad para blo10
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quear la producción de β - amiloide en los animales y en el hombre. La inhibición de la secreción
o de la producción, indica que la fragmentación
de βAPP en el amino terminal de βAP se ha
bloqueado posiblemente al menos de forma parcial, reduciendo la cantidad de un intermediario
del procesamiento disponible para la conversión
al péptido β - amiloide.
La presente invención permite composiciones
farmacéuticas que incorporen un compuesto seleccionado mediante el procedimiento anteriormente descrito y que se incluye en un vehı́culo
farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas deberı́an contener una cantidad
terapéutica o profiláctica de por lo menos un compuesto identificado por el procedimiento anteriormente descrito. El vehı́culo farmacéuticamente
aceptable puede ser cualquier sustancia compatible y no tóxica, apropiada para suministrar los
compuestos a un huésped deliberado. Pueden utilizarse como el vehı́culo agua estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos inertes. Pueden también incorporarse a las composiciones farmacéuticas adyuvantes farmacéuticamente aceptables, tampones, agentes dispersantes, y análogos. La preparación de condiciones farmacéuticas que incorporen agentes activos está bien descrita en la literatura médica y cientı́fica. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack
Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 16a
¯
edición, 1982.
Las composiciones farmacéuticas recién descritas son apropiadas para la administración sistémica al huésped, incluyendo la administración
parenteral, tópica, y oral. Las composiciones
farmacéuticas pueden administrarse parenteralmente, es decir, subcutánea, intramuscular o intravenosamente. Ası́, la presente invención permite composiciones para la administración a un
huésped, en las que se incluya una solución farmacéuticamente aceptable del compuesto identificado en un vehı́culo aceptable, tal como se describió anteriormente.
Transgenes que codifican proteı́nas APP heterólogas con la mutación sueca
En un procedimiento preferido, un transgén
que codifica una proteı́na APP heteróloga que incluye la mutación sueca (asparagina595 - leucina
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) se transfiere a un embrión fertilizado o a una
célula ES para producir un animal transgénico
no humano que expresa el polipéptido o los polipéptidos APP que incluye(n) la mutación sueca.
Un transgén que codifica una proteı́na APP heteróloga con la mutación sueca comprende secuencias estructurales que codifican una proteı́na
APP heteróloga con la mutación sueca y también
generalmente elementos reguladores unidos que
gobiernan la expresión de la proteı́na APP heteróloga con la mutación sueca en el huésped no
humano. Sin embargo, los elementos reguladores
endógenos en el genoma del huésped no humano
pueden aprovecharse integrando las secuencias
transgénicas en una localización cromosómica que
contiene elementos reguladores endógenos funcionales que son apropiados para la expresión de
las secuencias estructurales heterólogas. Tal integración dirigida se lleva a cabo habitualmente
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mediante las secuencias diana del gen homólogo
tal como se describió antes supra, en la que el
transgén heterólogo comprenderı́a al menos una
pinza de homologı́a.
Cuando un transgén heterólogo depende de
sus propios elementos reguladores, se incluyen elementos apropiados de transcripción y secuencia
o secuencias de poliadenilación. Por encima de
la primera secuencia estructural, se une, al menos, un promotor, con una orientación tal que
gobierna la transcripción de las secuencias estructurales heterólogas. A veces se utiliza el promotor del gen heterólogo que se encuentra naturalmente (por ejemplo, un promotor APP humano
se utiliza para gobernar la expresión de un transgén APP humano con la mutación sueca). Alternativamente, puede utilizarse el promotor del
gen APP similar endógeno (por ejemplo, se utiliza el promotor APP murino para gobernar la
expresión de un transgén APP humano con la
mutación sueca). Alternativamente, puede utilizarse un elemento regulador transcripcional heterogéneo, tanto respecto a las secuencias codificantes del transgén como a los animales huéspedes
no humanos (por ejemplo, un promotor y/o un
potenciador de rata unido operativamente a una
secuencia nucleótida que codifica la APP humana
con la mutación sueca, en el que se introduce el
transgén en los ratones).
En algunas formas de realización, es preferible que las secuencias transgénicas que codifican
el polipéptido APP con la mutación sueca, estén
bajo el control transcripcional de los promotores y/o de los potenciadores (y/o silenciadores)
que no están unidos operativamente en los genes APP que se encuentran de forma natural (es
decir, promotores y/o potenciadores no - APP).
Por ejemplo, algunas formas de realización utilizarán secuencias reguladoras transcripcionales
que confieren un alto nivel de expresión y/o un
patrón de expresión especı́fico de un tipo celular (por ejemplo, un promotor neuro - especı́fico).
El promotor enolasa especı́fico neural de la rata
(NSE) (Forss - Petter (1990) Neuron 5; 187) constituye un elemento regulador transcripcional preferido para la unión operativa a una secuencia
nucleótida que codifica un polipéptido APP con
la mutación sueca. Son preferidos generalmente
otros promotores y/o potenciadores que confieren
una expresión eficiente a la secuencia APP codificada por el transgén en el tejido cerebral.
Varios promotores que muestran diversas intensidades de potencia (por ejemplo, pgk, tk,
dhfr) pueden sustituirse según criterio facultativo,
siendo esencial, sin embargo que el promotor funcione en el huésped no humano; y en algunas formas de realización, es deseable que el promotor
gobierne la expresión en un patrón de desarrollo
o en un patrón especı́fico de tipo celular (y a niveles de expresión) similar a un gen APP que se encuentra de forma natural, en un animal huésped
paralelo al que le falte el transgén.
Un transgén heterólogo codifica generalmente
como mı́nimo una isoforma APP de longitud completa (por ejemplo, una isoforma 695 aa). El
transgén heterólogo puede comprender un polinucleótido que abarca el gen APP genómico
completo o una porción del mismo, puede com-
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prender un minigén, puede comprender un segmento codificante contiguo único (por ejemplo,
cADN) o puede comprender una combinación de
los mismos. Frecuentemente, el transgén codifica una secuencia polipeptı́dica APP humana
que incluye la mutación sueca, pudiéndose utilizar también, sin embargo, transgénes que codifiquen polipéptidos APP no humanos que incluyan la mutación sueca. Generalmente, el transgén
codificará una isoforma APP, de longitud completa, que se encuentra de modo natural (por
ejemplo, APP695 , APP751 , o APP770 ) que comprende además la mutación sueca.
Los transgénes que codifican los polipéptido
APP que incluyen la mutación sueca comprendrán asimismo frecuentemente uno o más
marcadores seleccionables unidos (infra).
Los transgénes que codifican polipéptidos
APP heterólogos que incluyen las moléculas de
la mutación sueca pueden transferirse al genoma
del huésped no humano de varias formas. Un
transgén heterólogo puede dirigirse a una localización cromosómica predeterminada especı́fica
mediante las secuencias diana del gen homólogo,
tal como se describe supra para la diana génica.
Los transgénes heterólogos pueden transferirse a
un huésped en porciones, dirigiéndolos secuencialmente a una diana homóloga, para reconstituir un
gen heterólogo completo en una localización cromosómica endógena del huésped. En contraste,
un transgén heterólogo puede integrarse separadamente al azar utilizando o no un constructo
dirigido del gen APP. Un transgén heterólogo
puede ser co - transferido con un constructo dirigido del gen APP y, si se desea, ser seleccionado con un marcador seleccionable, distinguible y separado y/o ser evaluado mediante PCR o
análisis por transferencia Southern de las células
seleccionadas. Alternativamente, un transgén heterólogo puede ser introducido en las células ES
antes o después de introducir un constructo dirigido del gen APP y la selección del mismo. Más
convenientemente, un transgén heterólogo se introduce en la progenie germinal de un animal
no humano mediante integración transgénica no
homóloga mediante inyección pronuclear, y las
progenies transgénicas resultantes se crian en un
medio homocigótico que “deja fuera de combate”,
con un gen APP endógeno similar alterado funcionalmente. Los ratones homocigóticos “fuera de
combate” pueden también ser criados, y el transgén APP heterólogo con la mutación sueca, puede
ser introducido en los embriones de éstos directamente mediante inyección pronuclear estándar u
otros medios conocidos en la técnica.
El direccionamiento de genes
Los alelos APP endógenos no humanos pueden alterarse funcionalmente, de forma que la
expresión de la APP codificada endógenamente
sea suprimida o eliminada, de modo que no interfiere o contamina la APP que incluye la mutación sueca, codificada por el transgén. En una
variante, un alelo APP endógeno es convertido
para incluir la mutación sueca, mediante el direccionamiento de genes homólogos.
El direccionamiento de genes, que es un procedimiento de utilizar la recombinación homóloga
para modificar un genoma de mamı́fero, puede
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utilizarse para introducir cambios en células cultivadas. Dirigiendo un gen de interés a células
troncales embrionales (ES), pueden introducirse
estos cambios en las progenies germinales de animales de laboratorio para estudiar los efectos de
las modificaciones en los organismos enteros, entre otras utilizaciones. El procedimiento de direccionamiento de genes se lleva a cabo introduciendo en células de cultivo hı́stico un constructo dirigido del ADN, que posee un segmento
homólogo respecto a un locus diana y que incluye
también una modificación secuencial proyectada
(por ejemplo, inserción, deleción, mutación puntual). Las células tratadas se evalúan entonces en
cuanto al direccionamiento preciso de la diana,
para identificar y aislar aquéllas en las que el direccionamiento ha tenido éxito. Una estrategia
habitual para alterar la función génica mediante
el direccionamiento de genes en las células ES
es construir un constructo dirigido que se diseña
para experimentar una recombinación homóloga
con su complemento cromosómico en el genoma
de las células ES. Los constructos dirigidos se
organizan tı́picamente de forma que insertan secuencias adicionales, tales como marcadores de
selección positiva, en los elementos codificantes
del gen diana, alterándolo por tanto, funcionalmente. Los constructos dirigidos son habitualmente de tipo de inserción o de reemplazamiento
(Hasty et al. (1991) Mol. Cell. Biol.11:4509).
El direccionamiento al gen APP endógeno
Los animales no humanos (por ejemplo, los
mamı́feros no primates) que poseen el gen APP
endógeno inactivado por el direccionamiento de
dianas con un constructo dirigido de recombinación homóloga, pueden producirse mediante el
procedimiento general siguiente. Tı́picamente,
una secuencia del gen APP no humano se utiliza como base para producir iniciadores PCR
que flanquean una región que se utilizará com un
pinza de homologı́a en un constructo dirigido. Los
iniciadores PCR se utilizan entonces para amplificar, mediante amplificación PCR de alta fidelidad, (Mattila et al. (1991) Nucleic acids Res.
19:4967; Eckert, K.A. y Kunkel, T.A. (1991) PCR
Methods and Applications 1;17; patente estadounidense n◦ 4, 683.202) una secuencia genómica
a partir de una biblioteca de clones genómicos o
a partir de una preparación de ADN genómico,
preferentemente de la cepa de animal no humano
que es diana del constructo dirigido. El ADN
amplificado se utiliza entonces como una pinza
de homologı́a y/o una región dirigida. Ası́, las
pinzas de homologı́a para dirigir un gen APP no
humano pueden producirse fácilmente basándose
en la información secuencial nucleótida disponible en la técnica y/o mediante la clonación de rutina. Los principios generales respecto a la construcción de constructos dirigidos y procedimientos de selección se revisan en Bradle et al. (1992)
Bio/Technology 10: 534.
Los genes APP endógenos no humanos pueden
alterarse funcionalmente y, opcionalmente, reemplazarse mediante transgénes que codifiquen APP
que incluya la mutación sueca.
Los constructos dirigidos pueden ser transferidos a células troncales pluripotentes, tales
como células troncales embrionales murinas, en
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las que los constructos dirigidos se recombinan
homólogamente con una porción de un locus del
gen APP endógeno y crean una mutación o mutaciones (es decir, inserciones, deleciones, reajustes, reemplazamientos secuenciales y/o mutaciones puntuales) que evitan la expresión funcional
del gen APP endógeno.
Un procedimiento preferido es suprimir, mediante recombinación homóloga dirigida, elementos estructurales esenciales del gen APP
endógeno. Por ejemplo, un constructo dirigido
puede recombinarse homólogamente con un gen
APP endógeno y suprimir una porción que abarca
sustancialmente la totalidad de uno o más de los
exones para crear un alelo vacı́o de éstos, insertando tı́picamente una región de reemplazamiento
a la que le falta el exón o exones correspondientes.
Los animales transgénicos homocigóticos para el
alelo vaciado del exón (por ejemplo, mediante
el criado de heterocigotos entre ellos) producen
células que son esencialmente incapaces de expresar un polipéptido APP endógeno funcional (preferentemente incapaces de expresar cualquiera de
las isoformas que se encuentran de modo natural). De forma similar, puede utilizarse el direccionamiento de genes homólogos, si se desea, para
alterar funcionalmente un gen APP suprimiendo
sólo una porción de un exón.
Los constructos dirigidos pueden utilizarse
asimismo para suprimir elementos reguladores
esenciales de un gen APP endógeno, tales como
promotores, potenciadores, sitios de corte y empalme, sitios de poliadenilación, y otras secuencias reguladoras, que incluyen secuencias actuantes cis que se situan por encima o por debajo del
gen estructural APP pero que participan en la
expresión del gen APP endógeno. La deleción
de elementos reguladores se realiza tı́picamente
insertando, mediante recombinación homóloga de
doble entrecruzamiento, una región de reemplazamiento a la que le falta el elemento o los elementos
reguladores correspondientes.
Un procedimiento alternativo preferido es interrumpir elementos reguladores y/o estructurales esenciales de un gen APP endógeno mediante
la inserción dirigida de una secuencia polinucleótida, y por tanto, alterar funcionalmente el
gen APP endógeno. Por ejemplo, un constructo
dirigido puede recombinarse homólogamente con
un gen APP endógeno e insertar una secuencia no
homóloga, tal como un cassette de expresión neo,
en un elemento estructural (por ejemplo, un exón)
y/o regulador (por ejemplo, un potenciador, un
promotor, un sitio de corte y empalme, un sitio
de poliadenilación) para dar lugar a un alelo APP
convertido en diana que posee una interrupción
insercional. La secuencia insertada puede tener
un tamaño del orden de entre 1 nucleótido aproximadamente (por ejemplo, para dar lugar a un
desplazamiento del marco de lectura en una secuencia exónica) a varias kilobases o más, estando
limitado por la eficiencia de direccionamiento de
genes homólogos con constructos dirigidos que
posean una larga región de reemplazamiento no
homóloga.
Los constructos dirigidos pueden también utilizarse para reemplazar una porción de un gen
APP endógeno con un secuencia exógena (es de-
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cir, una porción de un transgén dirigido); por
ejemplo, el primer exón de un gen APP puede
ser reemplazado con una porción sustancialmente
idéntica que contiene una mutación sin sentido o
que lo ha perdido.
La inactivación de un locus APP endógeno
del ratón se obtiene mediante la alteración dirigida del gen apropiado mediante la recombinación
homóloga en las células troncales embrionales del
ratón. Para la inactivación, puede utilizarse cualquier constructo dirigido que produzca una alteración genética en el locus del gen APP diana,
que evite la expresión efectiva de un producto
génico funcional de ese locus. Si han constituı́do
la diana sólo elementos reguladores, puede tener
lugar algún tipo de expresión de bajo nivel del
gen (es decir, el alelo diana “hace agua”), pudiendo ser el nivel de expresión suficientemente
bajo como para que el alelo diana “que hace agua”
se altere funcionalmente.
Generación de alelos APP nulos y ratones “fuera
de combate”
Un gen APP endógeno en un huésped no humano puede alterarse funcionalmente mediante
la recombinación homóloga con un constructo dirigido que no incluya un segmento similar del gen APP heterólogo que comprenda la
mutación sueca. En este procedimiento, una
porción del constructo dirigido se integra en
un elemento estructural o regulador esencial del
locus del gen APP endógeno, alterándolo por
lo tanto funcionalmente, para generar un alelo
nulo. Tı́picamente, los alelos nulos se producen mediante la integración de una secuencia no
homóloga que codifica un marcador seleccionable
(por ejemplo, un cassette de expresión del gen
neo) en una secuencia estructural esencial y/o
reguladora de un gen APP mediante la recombinación homóloga de las pinzas de homologı́a
del constructo dirigido con las secuencias del gen
APP endógeno, aunque pueden utilizarse otras
estrategias (véase seguidamente).
Más habitualmente, un constructo dirigido
es transferido mediante electroporación o microinyección a una progenie celular troncal embrional (ES) totipotente, tal como las progenies
murinas AB - 1 o CCE. El constructo dirigido
se recombina homólogamente con las secuencias
endógenas que se encuentran en o flanquean un
locus del gen APP y altera funcionalmente un
alelo, por lo menos, del gen APP. Tı́picamente, la
recombinación homóloga del constructo dirigido
con las secuencias del locus APP endógeno da lugar a la integración de una secuencia no homóloga
que codifica y expresa un marcador seleccionable,
tal como neo, en forma habitualmente de una cassette de selección positiva (infra). El alelo alterado funcionalmente se denomina un alelo APP
nulo. Las células ES que poseen al menos un
alelo APP nulo son seleccionadas para propagarse
en un medio que permita la propagación preferente de células que expresen el marcador seleccionable. Las células ES seleccionadas son examinadas mediante análisis PCR y/o análisis de
transferencia Southern, para comprobar la presencia de un alelo APP convertido correctamente
en diana. Puede llevarse a cabo la crı́a de animales no humanos que son heterocigóticos para
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un alelo nulo, para producir animales no humanos homocigóticos para dicho alelo nulo, denominándose animales “fuera de combate” (Donehower et al. (1992) Nature 256: 215; Science
256: 1392. Alternativamente, pueden producirse
en cultivo células ES homocigóticas para un alelo
nulo, que posean un marcador seleccionable integrado, seleccionándolas en un medio que contenga
niveles altos del agente de selección (por ejemplo, G418 o higromicina). La heterocigosidad y/o
la homocigosidad para un alelo nulo convertido
correctamente en diana, puede comprobarse con
análisis PCR y/o análisis de transferencia Southern del ADN aislado de una alı́cuota de un clon
seleccionado de células ES y/o de las biopsias de
la cola (del animal).
Si se desea, un transgén que codifica un polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca puede ser transferido a un huésped
no humano que posea un alelo nulo APP, preferentemente a una célula ES no humana que sea
homocigótica para el alelo nulo APP. Es generalmente ventajoso que el transgén incluya un
promotor y un potenciador que gobiernen la expresión de las secuencias estructurales que codifican un producto heterólogo funcional del gen
APP que contiene la mutación sueca. Ası́, por
ejemplo y sin restricción, un ratón “fuera de combate” homocigótico para los alelos nulos en el
locus APP, es preferentemente un huésped para
un transgén que codifica y expresa una proteı́na
APP funcional humana que comprende la mutación sueca. Los transgénes APP con la mutación sueca comprenden secuencias estructurales APP heterólogas que codifican polipéptidos
APP que incluyen la mutación sueca, bien en
forma de exones que presentan secuencias de
unión de corte y empalme, como un segmento
codificante contiguo (por ejemplo, un cADN),
o como una combinación de estas. Más habitualmente, los transgénes APP con la mutación
sueca codifican polipéptidos APP de longitud
completa, aunque los transgénes pueden codificar isoformas APP truncadas, polipéptidos APP
quiméricos (por ejemplo, parte humana/parte de
ratón), y/o variantes de APP aminosustituı́das
(es decir, muteı́nas) que comprenden además la
mutación sueca. Tı́picamente, los transgénes
comprenden también elementos reguladores, tal
como un promotor y, para la expresión óptima,
un potenciador.
Reemplazamiento del gen APP homólogo
Alternativamente, un gen APP endógeno en
un huésped no humano puede ser alterado funcionalmente mediante integración homóloga de
un gen APP heterólogo similar que comprende
la mutación sueca, de forma que el gen APP
heterólogo similar reemplaza sustancialmente al
gen APP endógeno, abarcando por lo menos las
posiciones aminoácidas 595 - 596 según el convenio de numeración en el trabajo antes citado
Kang et al. (1987), y preferentemente, reemplaza
completamente las secuencias codificantes del gen
APP endógeno. Preferentemente, el gen APP heterólogo con la mutación sueca se une, como consecuencia de integración homóloga, a secuencias
reguladoras (por ejemplo, un potenciador) del gen
APP endógeno, de forma que el gen heterólogo
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con la mutación sueca se expresa bajo el control
transcripcional de elementos reguladores del locus del gen APP endógeno. Los huéspedes no
humanos que son homocigóticos para tales alelos de reemplazamiento (es decir, un locus APP
cromosómico del huésped que codifica un producto del gen APP heterólogo similar con la mutación sueca) pueden producirse según los procedimientos descritos en la presente memoria. Tales
huéspedes no humanos homocigóticos expresarán
generalmente una proteı́na APP heteróloga con
la mutación sueca pero no expresarán la proteı́na
APP endógena. Más habitualmente, el patrón
de expresión del gen APP heterólogo con la mutación sueca imitará sustancialmente el patrón de
expresión del gen APP endógeno en el huésped no
humano que se encuentra de forma natural (no
transgénico). Por ejemplo pero sin restricción,
un ratón transgénico que posea las secuencias del
gen APP humano con la mutación sueca, que reemplacen a las secuencias del gen APP murino
endógeno y que estén controladas transcripcionalmente por las secuencias reguladoras murinas
endógenas, se expresará de modo similar al APP
murino en ratones no transgénicos que se encuentran de modo natural.
Generalmente, se utiliza un constructo dirigido de tipo reemplazamiento para el reemplazamiento génico homólogo. La recombinación
homóloga de doble entrecruzamiento entre las secuencias del gen APP endógeno y las pinzas de
homologı́a que flanquean la región de reemplazamiento (es decir, la región codificante de la mutación sueca del APP heterólogo) del constructo
dirigido, dan lugar a la integración dirigida de
los segmentos del gen APP heterólogo con la mutación sueca. Habitualmente, las pinzas de homologı́a del transgén comprenden secuencias que
flanquean a los segmentos del gen APP endógeno,
de forma que la recombinación homóloga da lugar
a la deleción concomitante de los segmentos del
gen APP endógeno y a la integración homóloga
de los segmentos del gen heterólogo. Un gen APP
endógeno entero puede ser reemplazado sustancialmente con un gen APP heterólogo que comprende la mutación sueca, mediante un único o
un múltiple evento de direccionamiento de genes
(por ejemplo, reemplazamiento secuencial de exones individuales). Uno o más marcadores seleccionables, habitualmente en forma de cassettes de
expresión de selección negativa o positiva, pueden
situarse en la región de reemplazamiento del constructo dirigido; se prefiere habitualmente que los
marcadores seleccionados se localicen en regiones
intrónicas de la región heteróloga de reemplazamiento.
Las células ES que albergan un gen APP heterólogo con la mutación sueca, tal como un alelo
de reemplazamiento, pueden seleccionarse de diversas maneras. En primer lugar, un marcador
seleccionado (neo, gpt, tk), puede unirse al gen
APP heterólogo con la mutación sueca (por ejemplo, en un intrón o secuencia flanqueante) en el
constructo dirigido, de forma que las células que
poseen un alelo de reemplazamiento, pueden ser
seleccionadas. Muy habitualmente, un constructo
dirigido del gen APP heterólogo incluirá tanto un
cassette de expresión de selección positiva como
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un cassette de expresión de selección negativa, de
manera que las células dirigidas homologamente
puedan seleccionarse mediante un esquema de selección positivo - negativo (Mansour et al. (1988),
en el trabajo antes citado).
Generalmente, un cassette de expresión de selección positiva se sitúa en una región intrónica
de la región de reemplazamiento del gen APP heterólogo con la mutación sueca, mientras que un
cassette de expresión de selección negativa se sitı́a
distalmente respecto a una pinza de homologı́a,
de modo que la recombinación homóloga de doble entrecruzamiento dará lugar a la integración
del cassette de selección positiva y a la pérdida
del cassette de selección negativa.
Constructos dirigidos
Se han descrito diversas técnicas de direccionamiento de genes, que incluyen pero no se limitan a: co - electroporación, “alcance de objetivo y
huı́da”, integración de entrecruzamiento único, y
recombinación de entrecruzamiento doble (Bradley et al. (1992) Bio/Technology 10:534). La
invención puede llevarse a la práctica utilizando
esencialmente cualquier estrategia de direccionamiento de un gen homólogo aplicable, que se conozca en la técnica. La configuración de un constructo dirigido depende de la técnica de direccionamiento especı́fica que se seleccione. Por ejemplo, un constructo dirigido para la integración de
entrecruzamiento único o el constructo dirigido
para el “alcance de objetivo y huı́da”, necesita
sólo tener una pinza única de homologı́a unida
a la región dirigida, mientras que un constructo
dirigido de tipo reemplazamiento de doble entrecruzamiento, requiere dos pinzas de homologı́a,
cada una flanqueando cada lado de la región de
reemplazamiento.
Por ejemplo y sin restricción, un constructo
dirigido preferido comprende, en este orden: (1)
una primera pinza de homologı́a que posea una
secuencia sustancialmente idéntica a una secuencia dentro de aproximadamente 3 kilobases aproximadamente por encima (esto es, en el sentido
opuesto al marco de lectura traduccional de los
exones) de un exón de un gen APP endógeno, (2)
una región de reemplazamiento que comprende un
cassette de selección positiva que tiene un promotor pgk que gobierna la transcipción de un gen
neo, (3) una segunda pinza de homologı́a que
tiene una secuencia sustancialmente idéntica a
una secuencia dentro de aproximadamente 3 kilobases por debajo de dicho exón de dicho gen
APP endógeno, y (4) un cassette de selección negativa, que comprende un promotor HSVtk que
gobierna la transcripción de un gen HSVtk. Tal
constructo dirigido es apropiado para la recombinación de reemplazamiento de doble entrecruzamiento que suprime una porción del locus APP
endógeno que abarca dicho exón y lo reemplaza
con la región de reemplazamiento que posee el
cassette de selección positiva. Si el exón suprimido es esencial para la expresión de un producto
funcional del gen APP, el alelo resultante vaciado
del exón está funcionalmente alterado y se denomina alelo nulo. Los constructos dirigidos útiles
para la práctica de la invención pueden comprender al menos una pinza de homologı́a APP unida
en ligamiento polinucleótido (es decir, mediante
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enlaces fosfodiéster) a una región dirigida. Una
pinza de homologı́a posee una secuencia que corresponde a, o es sustancialmente complementaria a una secuencia del gen APP endógeno de un
animal huésped no humano, y puede incluir secuencias que flanqueen al gen APP.
Aunque en la técnica no se han determinado
de manera concluyente lı́mites de tamaño más
grande o más pequeño para las pinzas de homologı́a recombinogénica, se cree que lo mejor para
las pinzas de homologı́a es que tengan del orden
de entre 50 pares de bases y varias decenas de
kilobases. Consecuentemente, los constructos dirigidos tienen generalmente, al menos, de 50 a 100
nucleótidos de largo aproximadamente, preferentemente, al menos, entre 250 y 500 nucleótidos de
largo, más preferentemente, al menos, entre 1000
y 2000 nucleótidos de largo aproximadamente, o
son más largos. Las regiones de homologı́a de los
constructos (pinzas de homologı́a) tienen generalmente, al menos, de aproximadamente 50 a 100
bases de largo, preferentemente, al menos, aproximadamente entre 100 y 500 bases de largo, y
más preferentemente, al menos, entre aproximadamente 750 y 2000 bases de largo. Se cree que
son preferidas las regiones de homologı́a de aproximadamente 7 a 8 kilobases de largo, con una
forma de realización preferida que posee una primera región de homologı́a de 7 kilobases aproximadamente que flanquea un lado de una región
de reemplazamiento y una segunda región de homologı́a de 1 kilobase aproximadamente que flanquea el otro lado de dicha región de reemplazamiento. La longitud de la homologı́a (es decir, de
identidad sustancial) para una región de homologı́a puede seleccionarse según criterio facultativo, basándose en la composición secuencial y en
la complejidad de la secuencia o secuencias diana
del gen APP endógeno y en la orientación proporcionada en la técnica (Hasty et al. (1991) Mol.
Cell. Biol. 11: 5586; Shulman et al. (1990)
Mol. Cell. Biol. 10: 4466). Los constructos
dirigidos tienen por lo menos una región de homologı́a que posee una secuencia que corresponde
substancialmente a, o es complementaria sustancialmente a una secuencia del gen APP endógeno
(por ejemplo, una secuencia exónica, un potenciador, un promotor, una secuencia intrónica, o una
secuencia flanqueante dentro de de alrededor de
3 a 20 kb de un gen APP). Tal región de homologı́a del transgén dirigido sirve como matriz para
el apareamiento y la recombinación homólogos
con una secuencia o secuencias sustancialmente
idénticas del gen APP endógeno. En los constructos dirigidos, tales regiones de homologı́a flanquean tı́picamente la región de reemplazamiento,
que es una región del constructo dirigido que va a
experimentar un reemplazamiento con la secuencia diana del gen APP endógeno (Berinstein et al.
(1992) Mol. Cell. Biol 12:360). De este modo,
un segmento del constructo dirigido flanqueado
por las regiones de homologı́a puede reemplazar
a un segmento de una secuencia del gen APP
endógeno mediante recombinación homóloga de
doble entrecruzamiento. Las regiones de homologı́a y las regiones dirigidas se unen conjuntamente en un ligamiento polinucleótido lineal convencional (estructura fosfodiéster extremos 5’ a
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extremos 3’). Los constructos dirigidos son generalmente moléculas de ADN bicatenarias, más
habitualmente lineales.
Sin querer limitarse a ninguna teorı́a particular de la recombinación homóloga o de la conversión génica, se cree que en tal recombinación
de reemplazamiento de doble entrecruzamiento,
una primera recombinación homóloga (por ejemplo, cambio, emparejamiento, escisión y unión
de las cadenas) entre una primera región de homologı́a del constructo dirigido y una primera
secuencia del gen APP endógeno, se acompaña
por una segunda recombinación homóloga entre
una segunda región de homologı́a del constructo dirigido y una segunda secuencia del gen APP
endógeno, dando lugar por tanto a la porción del
constructo dirigido que se situó entre las dos regiones de homologı́a, reemplazando la porción del
gen APP endógeno que se situó entre la primera
y segunda secuencias del gen APP endógeno. Por
esta razón, las regiones homólogas se utilizan generalmente en la misma orientación (es decir, la
dirección “corriente arriba” es la misma para cada
región homóloga de un transgén, para evitar reorganizaciones). La recombinación de reemplazamiento de doble entrecruzamiento puede utilizarse, de este modo, para suprimir una porción
de un gen APP endógeno y transferir concomitantemente una porción no homóloga (por ejemplo,
un cassette de expresión del gen neo) a la correspondiente localización cromosómica. La recombinación de doble entrecruzamiento puede asimismo
utilizarse para añadir una porción no homóloga a
un gen APP endógeno sin suprimir las porciones cromosómicas endógenas. Sin embargo, la
recombinación de doble entrecruzamiento puede
también utilizarse simplemente para suprimir una
porción de una secuencia del gen APP endógeno
sin transferir una porción no homóloga al gen
APP endógeno (véase Jasin et al. (1988) Genes Devel 2:1353). La porción “corriente arriba”
y/o “corriente abajo” de porción no homóloga,
puede ser un gen que identifica si una recombinación homóloga de doble entrecruzamiento ha
tenido lugar; tal gen es tı́picamente el gen HSV
tk que puede utilizarse para la selección negativa.
Tı́picamente, los constructos dirigidos de la
invención se utilizan para alterar funcionalmente
los genes APP endógenos y comprenden, al menos, dos regiones de homologı́a separadas por una
secuencia no homóloga que contiene un cassette
de expresión que codifica una marcador seleccionable, tal como neo(Smith y Berg (1984) Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 49:171; Sedivy y Sharp (1989) Proc. Natl. Acad. Sci;
(U.S.A.) 86:227; Thomas y Capecchi (1987) en
el trabajo antes citado). Sin embargo, algunos
transgénes dirigidos de la invención pueden tener
la región o regiones homólogas flanqueando sólo
un lado de una secuencia no homóloga. Los transgénes dirigidos de la invención pueden ser también
del tipo al que se alude en la técnica como transgénes de “alcanza un objetivo y huye” y “ entrar
y salir” (Valancius y Smithies (1991) Mol. Cell.
Biol 11: 1402; Donehower et al. (1992) Nature
356: 215; (1991) J.NIH Res 3: 59.
El cassette de selección positiva codifica un
marcador seleccionable que proporciona medios
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para seleccionar las células que presentan secuencias del transgén dirigido integradas que abarcan
el cassette de expresión de selección positiva. El
cassette de expresión de selección negativa codifica un marcador seleccionable que proporciona
medios para seleccionar células que no poseen una
copia integrada del cassette de expresión de selección negativa. Por tanto, mediante un protocolo combinado de selección positiva - negativa, es
posible seleccionar células que han experimentado
una recombinación de reemplazamiento homóloga
y que han incorporado la porción del transgén situada entre las regiones homólogas (es decir, la
región de reemplazamiento) en una localización
cromosómica, seleccionando la presencia del marcador positivo y la ausencia del marcador negativo.
Los cassettes de expresión preferidos para inclusión en los constructos dirigidos codifican y expresan un marcador seleccionable de resistencia a
las drogas y/o un enzima HSV timidı́n - quinasa.
Los genes apropiados de resistencia a las drogas
incluyen, por ejemplo: gpt (xantina - guanina fosforibosiltransferasa), que puede ser seleccionada
con ácido micofenólico; neo (neomicinfosfotransferasa), que puede ser seleccionada con G418 o
higromicina; y DFHR (dihidrofolato reductasa),
que puede ser seleccionada con metotrexato (Mulligan y Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 78: 2072; Southern y Berg (1982) J. Mol.
Appl. Genet. 1: 327.
La selección para los recombinantes convertidos correctamente en diana, utilizará generalmente, al menos, la selección positiva, en la que
una cassette de expresión no homóloga codifica
y expresa una proteı́na funcional (por ejemplo,
neo o gpt) que confiere un fenotipo seleccionable
a las células diana que albergan el casette de expresión integrada endógenamente, de forma que,
añadiendo un agente de selección (por ejemplo,
G418 o ácido micofenólico), tales células diana
presentan ventajas de desarrollo o de supervivencia respecto a las células que no poseen un cassette de expresión integrado.
Es preferible que la selección para los recombinantes homólogos convertidos correctamente en
diana utilice también la selección negativa, de
forma que las células que albergan sólo la integración no homóloga del transgén sean seleccionadas otra vez. Tı́picamente, tal selección negativa
emplea un cassette de expresión que codifica el
gen timidina quinasa del virus del herpex simplex
(HSVtk) que se sitúa en el transgén de forma que
se integrará solamente mediante recombinación
no homóloga. Tal posicionamiento tiene lugar generalmente uniendo el cassette de expresión HSV
tk (u otro cassette de selección negativa) de forma
distal a las regiones homólogas recombinogénicas,
de manera que la recombinación de reemplazamiento de doble entrecruzamiento de éstas transfiera el cassette de expresión de selección positiva,
pero no el gen HSVtk (u otro cassette de selección
negativa), a una localización cromosómica. Un
análogo de nucleósido, ganciclovir, que es preferentemente tóxico para las células que expresan
HSVtk, puede utilizarse como el agente de selección negativo, pues selecciona las células que
no poseen un cassette de expresión HSV tk inte16
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grado. Asimismo, puede utilizarse FIAU como un
agente selectivo para seleccionar las células a las
que les falta HSV tk.
Con objeto de reducir el ruı́do de fondo de
las células que poseen secuencias del constructo dirigido incorrectamente integradas, se utiliza
tı́picamente un esquema de selección de combinaciones positivas - negativas (Mansour et al.
(1988) (en el trabajo antes citado).
Generalmente, los constructos dirigidos incluyen preferentemente: (1) un cassette de expresión
de selección positiva flanqueado por dos regiones
homólogas que son sustancialmente idénticas a
las secuencias del gen APP endógeno de la célula
huésped, y (2) un cassette de expresión de selección negativa situado distalmente. Sin embargo, pueden asimismo utilizarse constructos dirigidos que incluyen sólo un cassette de expresión
de selección positiva. Tı́picamente, un constructo dirigido contendrá un cassette de expresión de
selección positiva que incluye un genneo unido
“corriente abajo” (es decir, hacia el carboxilo del
polipéptido codificado en el sentido del marco de
lectura de la traducción) de un promotor tal como
el promotor HSV tk o el pgk. Más tı́picamente, el
transgén dirigido contendrá también una cassette
de expresión de selección negativa que incluye un
gen HSV tk unido “corriente abajo” de un promotor HSV tk.
Es preferible que los constructos dirigidos
posean regiones de homologı́a que sean muy
homólogas respecto a la secuencia o secuencias diana predeterminadas del ADN endógeno,
preferentemente isogénicas (esto es, secuencias idénticas). Pueden obtenerse secuencias
isogénicas o casi isogénicas mediante la clonación
genómica o la amplificación PCR de alta fidelidad
del ADN genómico procedente de la cepa de animales no humanos que constituyen el origen de
las células ES utilizadas en el procedimiento de
direccionamiento de los genes.
Para alterar el gen APP murino, puede utilizarse un constructo dirigido basado en el diseño
utilizado por Jaenisch y colaboradores (Zjilstra
et al. (1989) en el trabajo antes citado) para alterar con éxito el gen de la β2 - microglobulina
del ratón. El gen de resistencia a la neomicina
(neo), se inserta, a partir del plásmido pMC1NEO
en la región codificante del gen APP diana. La
inserción pMC1NEO utiliza una secuencia promotora/potenciadora vı́rica hı́brida para gobernar la expresión neo. Este promotor es activo en
las células troncales embrionales. Por tanto, neo
puede utilizarse como un marcador seleccionable
para la integración del constructo “fuera de combate”. El gen HSV timidina quinasa (tk) se añade
al extremo del constructo como un marcador de
selección negativa contra los eventos de inserción
al azar (Zjilstra, et al., en trabajo antes citado).
Los vectores que contienen un constructo
dirigido se desarrollan tı́picamente en E.coli
y se aislan entonces utilizando procedimientos
estándares de biologı́a molecular, o pueden sintetizarse como oligonucleótidos. Puede también
llevarse a cabo la inactivación dirigida directa que
no necesita vectores procarióticos o eucarióticos.
Los transgénes dirigidos pueden ser transferidos a células huésped mediante cualquier técnica
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apropiada, que incluye microinyección, electroporación, lipofección, biolı́stica, precipitación con
fosfato de calcio, y vectores sustentados en virus,
entre otras. Otros procedimientos utilizados para
transformar las células de los mamı́feros incluyen
la utilización de Polybreno, fusión protoplástica,
y otros (véase, generalmente, Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a¯
edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y).
Para obtener animales no humanos transgénicos (que incluyen animales no humanos convertidos homólogamente en diana), se prefieren
células troncales enbrionales (células ES). Las
células ES murinas, tales como la progenie AB 1 desarrollada sobre capas celulares proveedoras
SNL76/7 mitóticamente inactivas (McMahon y
Bradley (1990) Cell 62: 1073) tal como se describe esencialmente (Robertson, E.J. (1987) en
Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A
Practical Approach. E.J. Roberston, ed. (Oxford:
IRL Press), p. 71 - 112) pueden utilizarse para el
direccionamiento de genes homólogos. Otras progenies ES apropiadas incluyen, pero no se limitan
a la progenie E14 (Hooper et al. (1987) Nature
326:292 - 295), la progenie D3 (Doetschman et al.
(1985) J.Embryol. Exp. Morph. 87: 27 - 45) y
la progenie CCE (Robertson et al. (1986) Nature
323:445 - 448). El éxito de generar una progenie
murina a partir de las células ES que albergan una
mutación diana especı́fica depende de la pluripotencia de las células ES (es decir, de su capacidad,
una vez inyectadas en un blastocisto huésped,
para participar en la embriogénesis y contribuir
a las células germinales del animal resultante).
Se permite que los blastocistos que contienen las
células ES inyectadas se desarrollen en los úteros
de las hembras no humanas pseudoembarazadas
y nacen como ratones quiméricos. Los ratones
transgénicos resultantes son quiméricos para las
células que tienen loci APP endógenos inactivados, y se retrocruzan y se evalúan en cuanto a
la presencia del transgén o transgénes convertidos correctamente en diana mediante análisis
PCR o de transferencia Southern sobre el ADN
biópsico de la cola de la descendencia, de forma
que se identifiquen los ratones transgénicos heterocigóticos para el locus APP inactivado. Realizando los cruces apropiados, es posible producir
un animal no humano transgénico homocigótico
para los alelos APP funcionalmente alterados, y
que albergue también opcionalmente un transgén
que codifique un polipéptido APP heterólogo que
incluya la mutación sueca. Tales animales transgénicos son sustancialmente incapaces de producir un producto del gen APP endógeno, pero expresan la APP heteróloga con la mutación sueca.
Investigación comercial y utilizaciones de la evaluación
Los animales no humanos que comprenden
transgénes que codifican la APP con la mutación
sueca (y por tanto la mutación sueca Aβ), pueden
utilizarse comercialmente para evaluar agentes
que posean el efecto de disminuir la producción
y/o acumulación de Aβ. Tales agentes pueden
desarrollarse como medicamentos para tratar el
procesamiento anormal de APP y/o la enfermedad de Alzheimer, entre otras condiciones neuro-
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degenerativas. Por ejemplo, los ratones “fuera de
combate” p53 de Donehower et al. (1992) Nature
356: 215 han encontrado una amplia aceptación
como productos comerciales para la evaluación
carcinogénica y similares. Los animales transgénicos que se describen en la presente memoria,
exhiben un procesamiento y expresión de APP
anormales, y pueden utilizarse para la evaluación
farmacéutica y como modelos patológicos para las
enfermedades neurodegenerativas y la bioquı́mica
del APP. Tales animales tienen muchos usos, que
incluyen pero no se limitan a identificar compuestos que realicen o afecten al procesamiento de
Aβ; en una variante, los agentes son identificados
de este modo como agentes farmacéuticos candidatos. Los animales transgénicos pueden utilizarse asimismo para desarrollar agentes que modulen la expresión y/o la estabilidad de APP (o
de Aβ); tales agentes pueden servir como agentes
terapéuticos para tratar enfermedades neurodegenerativas. Los animales “fuera de combate” de la
invención pueden también servir como modelos de
enfermedad para la investigación de las condiciones patológicas relacionadas con APP (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer y análogas). Tales animales transgénicos pueden comercializarse
para los investigadores, entre otros usos.
Anticuerpos para la APP con la mutación sueca
Utilizando polipéptidos APP que comprendan la mutación sueca, es posible entonces preparar antisueros y anticuerpos monoclonales, utilizando,por ejemplo,el procedimiento de Kohler y
Milstein ((1975) Nature 256: 495). Tales anticuerpos monoclonales podrı́an entonces constituir
la base para un ensayo diagnóstico que detecte la
presencia de la mutación sueca, entre otros usos.
Los polipéptidos APP con la mutación sueca
pueden utilizarse para inmunizar a un animal con
el objeto de producir anticuerpos especı́ficos. Estos anticuerpos pueden comprender un antisuero
policlonal o un anticuerpo monoclonal producido
por células de hibridoma. Para los procedimientos generales de preparación de anticuerpos, véase
Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) E. Harlow y D.Lane, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor.
Por ejemplo pero sin restricción, un fragmento
polipéptido APP695 con la mutación sueca producido de forma recombinante puede inyectarse
en un ratón junto con un adyuvante, de forma
que se genere una respuesta inmunitaria. Las inmunoglobulinas murinas que se unen al fragmento
recombinante con una afinidad de unión de por
lo menos 1 x 107 M − 1 pueden recuperarse del
ratón inmunizado como un antisuero, y pueden
purificarse ulteriormente mediante cromatografı́a
de afinidad u otros medios. Además, células del
bazo se recuperan del ratón y se fusionan con las
celulas de mieloma para producir un banco de
células de hibridoma que secretan anticuerpos. El
banco de hibridomas puede evaluarse en cuanto a
los clones que secretan las inmunoglobulinas, las
cuales se unen al fragmento producido de modo
recombinante con una afinidad de, como mı́nimo,
1 x 106 M − 1 . Más especı́ficamente, las inmunoglobulinas que se unen al polipéptido APP con la
mutación sueca pero presentan una reactividad
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cruzada limitada con un polipéptido APP de tipo
salvaje, son seleccionadas, bien mediante preabsorción con el APP de tipo salvaje o mediante
evaluación de las progenies celulares de hibridoma
para idiotipos especı́ficos que se unen preferentemente a la variante de la mutación sueca, cuando
se comparan a la del tipo salvaje.
Los ejemplos que siguen se proporcionan como
ilustración, y no tienen la intención de limitar la
invención al ejemplo especı́fico que se adjunta.
Ejemplos Experimentales
El anticuerpo 6C6 reconoce un epı́topo en el
interior de los residuos 1 - 16 de βAP.
Ratones transgénicos que expresan la APP con la
muatación sueca
Se generaron ratones transgénicos utilizando
los plásmidos que se muestran en la Fig 1
(NSEAPPsw y NSEAPPsw∆3’). Estos plásmidos
contienen la forma 751 de βAPP que contiene la
mutación sueca (KM a NL a la posición 595 y 596
de la forma 695). El promotor enolasa especı́fico
neural gobierna la expresión y proporciona una
secuencia de corte y empalme. El promotor NSE
de la rata y las secuencias de corte y empalme se
derivaron de pNSE6 (Forss - Petter et al. (1990)
Neuron 5: 187). Este vector contiene el fragmento
BglII de 4,2 kb de la región promotora NSE de
la rata (que empieza a partir del sitio BglII corriente arriba y continua hasta el sitio BglII en
el segundo intrón) clonado en el sitio BamHI del
vector pSP65 (Promega). El sitio XbaI derivado
del vector en el extremo 5’ del promotor utilizado
y el ATG de iniciación de la traducción NSE, contenido en el interior del segundo intrón, se fusionó
con el ATG que iniciaba βAPP.
NSEAPPsw contiene asimismo una secuencia
de corte y empalme del SV40 en la región del
extremo 3’ del gen. La secuencia de corte y empalme se derivó del vector pL1 de Okayama/Berg,
y constituye una fusión de las últimas secuencias
de corte y empalme mensajeras 16s y 19s. La
poliadenilación está proporcionada por secuencias
SV40.
Los ratones transgénicos que incorporan estas secuencias plasmı́dicas se generaron utilizando
técnicas estándar. El fragmento NotI que contiene el cassette de expresión anteriormente descrito se purificó e inyectó en óvulos obtenidos a
partir del ratón hı́brido C57B1/DBA. Los óvulos
se implantaron en ratones hembra pseudoembarazadas y la descendencia se evaluó en cuanto a la
expresión de la βAPP humana mediante análisis
de su descendencia F1 transgénica. Los cerebros
de los animales F1 se homogenizaron con un homogenizador manual (Polytron PT122B, Kinematica AG) bien en un tampón SDS (SDS al
2 %, 20 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10
mM EDTA) u homogenizado en tampón NP 40 (NP40 al 1 %, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM
EDTA, y una mezcla de inhibidores de la proteasa que contenı́an 5 - 10 µg/ml leupeptina, 2 - 4
µg/ml de Pepstatina A, 5 - 10 µg/ml Aprotinina,
y 1 - 2 mM PMSF). Los lisados SDS se cargaron directamente en geles para análisis Western.
Los homogenados NP40 se centrifugaron a 44.000
rpm durante 10 minutos en una ultracentrı́fuga
Beckman (rotor Tl100.3) y los sobrenadantes se
cargaron en geles para análisis Western. Este se
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llevó a cabo mediante procedimientos estándar
utilizando bien anticuerpos anti - 5 (0,4 µg/ml) o
8E5 (5 µg/ml) para detectar la βAPP especı́fica
humana. Aquellas progenies que expresaron niveles relativamente altos de βAPP se escogieron
para análisis ulterior. Este incluı́a las progenies
Hillary 14, Chelsea 32 y Chelsea 58. Los experimentos que se describen se llevaron a cabo en
animales heterocigóticos de estas progenies derivados mediante cruzamientos de animales que
contenı́an transgénes con animales de tipo salvaje
y realizando una evaluación de la descendencia en
cuanto a la presencia de un transgén. De modo
similar, pueden utilizarse animales homocigóticos
a partir de diversas progenies seleccionadas.
Las fracciones solubles de los cerebros animales transgénicos se sondearon en cuanto a la presencia de la forma “92” de la APP secretada (Fig
2). Esta forma se produce como producto de desecho de la producción de βAP y la inhibición de
la producción de esta forma en células cultivadas
acompaña a la inhibición de la fragmentación del
extremo N - terminal de βAP, el sitio fragmentado por la β - secretasa.
Cerebros de ratones transgénicos (Sueco Hillary 14) o no transgénicos, se homogenizaron en
50 mM Tris, 10 mM EDTA más la mezcla de inhibidores proteásicos anteriormente descrita, centrifugándose a 55K rpm durante 10 minutos, tal
como se describió antes. El sobrenadante se analizó mediante Western, utilizando el anticuerpo
sueco “192” que reacciona sólo con la forma secretada de APP producida por la β - secretasa.
Para el análisis Western, las proteı́nas se separaron en un gel SDS PAGE al 6 % (de Novex),
transfiriéndose entonces a inmobilon P mediante
técnicas estándar. El filtro se incubó con 2 µg/ml
del anticuerpo sueco “192” utilizando otra vez
técnicas estándar y visualizándose el anticuerpo
unido utilizando el equipo de AmershamECL. Tal
como se muestra en la Fig 2, carril 3, existió un
material reactivo “92” fuertemente detectable en
el sobrenadante del animal transgénico. Los homogenados cerebrales de los animales no transgénicos contenı́an una cantidad escasa de material inmunoreactivo que se mostró ligeramente
más rápida al moverse en el gel que el material
especı́fico para el animal transgénico (carril 1).
Este material no se relaciona probablemente con
βAPP, ya que no se hibridiza con otros anticuerpos βAPP (por ejemplo, anti - 5).
En los sistemas de cultivo de tejidos, el anticuerpo sueco 192 (infra) no reacciona cruzadamente con la βAPP secretada que es fragmentada
en el sitio alfa - secretasa en la posición 17 en
medio de la secuencia del β - péptido. Para comprobar que esto es también cierto en los homogenados cerebrales, éstos se vaciaron de las formas
secretadas más largas de βAPP utilizando resina
unida al anticuerpo 6C6, el cual es especı́fico para
los primeros 16 aminoácidos de βAP, y por tanto
reacciona con la βAPP secretada y fragmentada
por la alfa - secretasa, pero no con la βAPP más
corta secretada y fragmentada por la beta secretasa. La resina se produjo utilizando Actigel ALS acoplado en suspensión, tal como se describe por el fabricante (Sterogene). Se incubó un
exceso de resina - anticuerpo con los homogena-
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dos cerebrales de los animales que contenı́an o no
contenı́an el transgén para una incubación inicial
de 3 horas a 4◦ C con agitación, separándose material unido y no unido mediante centrifugación a
14000 durante 1 minuto. El sobrenadante se incubó otra vez con un exceso de resina acoplada al
6C6 durante 16 horas a 4◦ C, y se centrifugó otra
vez para separar el material no unido. El material que se unió durante la primera incubación y
el material que no se unió a la resina acoplada
al 6C6, se analizó mediante Western utilizando
anticuerpos anti - 5 y sueco 192 (Fig 3). Se sondearon con 8E5 (cuadro A) o el Sueco 192 (cuadro B) homogenados de ratones transgénicos (+)
o no transgénicos ( - ). Los carriles 1 se refieren
al homogenado total, los carriles 2 a la fracción
que no se unió a la resina 6C6 y los carriles 3
a la fracción que se unió a la resina acoplada al
6C6. Ninguna de las βAPP unidas, identificadas
por su reactividad al anticuerpo anti - 5, reaccionaron cruzadamente con el anticuerpo sueco 192.
Material no unido, identificado por su reactividad
al anti - 5, reaccionó con el anticuerpo sueco 192.
Esto demuestra que el ratón transgénico con
la mutación sueca proporciona un modelo animal
viable para la evaluación de inhibidores directos o
indirectos de la actividad β - secretasa o de medicamentos que modulen a ésta. Tales agentes pueden desarrollarse como medicamentos para tratar
enfermedades asociadas con la expresión y/o el
metabolismo anormal de APP (por ejemplo, la
enfermedad de Alzheimer).
Anticuerpos que reaccionan especı́ficamente con
la APP con la mutación sueca
El anticuerpo monoclonal 6C6 se produjo y
evaluar de la misma forma que el anticuerpo 10D5
(Hyman et al. (1992) J.Neuropath.Exp.Neurol.
51:76) utilizando un péptido sintético que contenı́a los residuos 1 - 28 de βAP conjugados con
la albúmina sérica de conejo, como inmunógeno.
Ambos 10D5 y 6C6 reconocen un epı́topo en el
interior de los primeros 16 aminoácidos de la secuencia βAP. 6C6 fue más eficiente que 10D5 en
inmunoprecipitación y se utilizó como un anticuerpo de captura. Para preparar la resina 6C6,
se lavaron 4 mls de AffigelR 10 (Bio - Rad Laboratories, Hercules, CA) con agua fria y se combinaron con 3 mls de 6C6 (12,5 mg/ml en PBS (2,7
mM KCl, 1,5 mM KH2 PO4 , 8,1 mM Na2 HPO4 ,
137 mM NaCl, pH 7,5) 0,5 M NaCl. El acoplamiento tuvo lugar durante la noche a 4◦ C con
agitación suave. 400 µl de 1M Tris, pH 8,0, se
añadieron entonces, y se continuó la agitación durante 40 minutos. La resina se lavó exhaustivamente con TTBS antes de usarla (137 mM NaCl,
5 mM KCl, 25 mM Tris, TweenR 20 al 0,5 %,pH
7,5). El anticuerpo 7H5 se describe también en
Hyman et al. (1992), supra. Los anticuerpos
anti - 5 se produjeron contra βAPP 444 - 592.
Se produjeron anticuerpos (denominados anticuerpos 92) contra un péptido sintético que incluı́a los residuos 591 - 596 de βAPP (tal como
se numera en Kang et al. (1987), supra). El
péptido (N - acetil - CISEVKM) se conjugó a
albúmina sérica de conejo que se habı́a activado
con el éster de sulfo - maleimido benzoil - N hidroxisuccinimida para formar un inmunógeno.
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Se produjeron anticuerpos contra el inmunógeno
en los conejos mediante metodologı́a estándar.
Durante cada inoculación, los conejos recibieron 5 µg de inmunógeno en inyecciones subcutáneas de 0,1 ml, en aproximadamente 10 sitios (50 µg/revacunación). El mismo péptido se
acopló al gel Sulfo - linkT M (Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL) para la purificación por afinidad de
los anticuerpos de la fracción IgG.
Una descripción más detallada de la preparación del anticuerpo 92 es la siguiente. Se incubó albúmina sérica de conejo (12,3 mg) con 13
mg de éster sulfo - maleimido benzoil - N - hidroxisuccinimida en 1,25 mls de 0,05 M KH2 PO4 , pH
7,0, durante 20 minutos a 0◦ C. La mezcla se sometió entonces inmediatamente a filtración en gel
en una columna Sephadex G - 10 de 1 x 75 cm
equilibrada con el tampón fosfato. La proteı́na
eluyente en el volumen excluido se agrupó y se
combinó inmediatamente con 30 mg del péptido
N - acetil - CISEVKM que se sintetizó mediante
metodologı́as estándares automatizadas de fase
sólida. Se dejó que la reacción de acoplamiento
(volumen de 20 ml) se realizara por la noche y se
envió entonces a unas instalaciones comerciales
para la generación de los anticuerpos. El protocolo de inyección consistió en la emulsificación del
antı́geno en un volumen igual del adyuvante completo de Freund y en inyectar subcutáneamente
un total de 50 µg del antı́geno en alı́cuotas de
0,1 ml en 10 sitios aproximadamente. Después,
cada tres semanas, se administró una inyección
de recuerdo mediante un protocolo idéntico, excepto en que el adyuvante incompleto de Freund
se utilizó como emulsificador. Los conejos se sangraron una semanas después de cada inyección
y se tituló el suero mediante reacción con los
péptidos en ELISA. La IgG se purificó a partir de
los sueros reaccionantes positivos mediante precipitación con (NH4 )2 SO4 al 50 %, (2 x’s) y se
dializó contra PBS. El péptido N - acetil - CISEVKM se conjugó al gel Sulfo - linkT M (Pierce
Chemical Co., Rockford, IL) utilizando las recomendaciones del fabricante para generar una resina de afinidad para purificar los anticuerpos especı́ficos del péptido. La fracción IgG se aplicó a
la columna y, después de lavar a través de material unido no especı́ficamente con PBS, los anticuerpos se eluyeron con 0,1 M glicina pH 2,5, 0,5
NaCl y se dializaron entonces contra PBS antes
de congelación.
El anticuerpo sueco 192 se produjo contra un
péptido sintético compuesto de los residuos 590 596 de la secuencia sueca de βAPP. Además
de la secuencia βAPP, se añadieron dos glicinas y una cisteı́na como espaciador, y además
un enlazador, dando lugar a la secuencia siguiente:CGGEISEVNL. El péptido se conjugó a
una albúmina sérica bovina cationizada activada
con maleimida disponible comercialmente (Pierce
Imject Supercarrier Immune Modulator, al que
se alude seguidamente como cBSA). El antisuero
se produjo siguiendo el esquema de la inyección
descrito anteriormente para el anticuerpo 92.
El anticuerpo sueco 192 se produjo contra
un péptido sintético compuesto de los residuos
590 - 596 de la secuencia Sueca de βAPP.
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Además de la secuencia βAPP, se añadieron
dos glicinas y una cisteı́na como espaciador, y
además un engarce, dando lugar a la secuencia siguiente:CGGEISEVNK. El péptido se conjugó a
una albúmina sérica bovina cationizada activada
con maleimida disponible comercialmente (Pierce
Imject Supercarrier Immune Modulator, al que
se alude seguidamente como cBSA). El antisuero
se produjo siguiendo un esquema estándar de la
inyección.
En general, cBSA se volvió a suspender en
agua desionizada a una concentración de 10
mg/ml. Se añadió al vehı́culo una cantidad
idéntica de miligramos del péptido, y se mezcló
durante cuatro horas a temperatura ambiente. El
conjugado se dializó entonces extensamente contra una solución salina tamponada de fosfato de
Dulbecco sin calcio y magnesio.
El conjugado se comparó al cBSA de partida
sobre un gel Novex al 6 % de Tris - glicina que
se habı́a vertido anteriormente. El éxito en la
conjugación fue indicado por un cambio visible a
un peso molecular más alto.
Se recuperó medio condicionado a partir de
las células renales 293, que se han transfectado establemente para sobreexpresar la proteı́na βAPP
sueca. Se añadieron alı́cuotas de un mililitro a 100
µl de resina con afinidad por 6C6, inmovilizada, o
a 100 µl de heparina agarosa (Sigma). La reacción
con la resina 6C6 se realizó durante 5 horas a 4◦ C;
la heparina - agarosa reaccionó durante 30 minutos a 42 C. Después de la incubación, las resinas
se lavaron con TTBS y entonces se añadieron a
cada muestra 100 µl de un tampón muestra 2 X
SDS - PAGE, hirviéndose las muestras (5 minutos) y centrifugándolas brevemente. Veinte µl de
las muestras se cargaron en geles de SDS - poliacrilamida al 6 % y se sometieron a electroforesis.
Las proteı́nas se transfirieron a membranas
ProBlotR tal como se describió anteriormente.
Las muestras se sondearon con los anticuerpos si-
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guientes: 6C6, Sueco 192, o 8ES (un anticuerpo
monoclonal que reconoce un epı́topo de βAPP en
la región de los aminoácidos 444 - 592, utilizando
la numeración de la forma 695). Todos los anticuerpos se utilizaron a 2 µg/ml durante el sondeo
de la inmunotransferencia. La visualización del
material inmunoreactivo se obtuvo utilizando el
sistema ECLR de Amersham según las recomendaciones del fabricante. El bloqueo y las diluciones del anticuerpo se realizaron utilizando leche
seca sin grasa al 5 % (Carnation) en TTBS.
La Figura 4 muestra una inmunotransferencia que demuestra la especificidad del anticuerpo
sueco 192. Los carriles 1,3,5 contienen material
eluı́do a partir de la heparina agarosa. Los carriles 2,4,6 contienen material eluı́do a partir de la
resina 6C6. Los carriles 1 y 2 se sondearon con
el anticuerpo 8E5; Los carriles 3 y 4 se sondearon
con el anticuerpo sueco 192; los carriles 5 y 6 se
sonderaron con el anticuerpo 6C6.
Como puede apreciarse en la Figura 4, carril
4, el anticuerpo sueco 192 no reconoce apreciablemente la forma reactiva 6C6 de βAPP, a pesar del
hecho de que se encuentra más βAPP total en el
carril 4 comparado con el carril 3 (compárense los
carriles 1 y 2). La falta de reactividad con las formas βAPP que contienen la secuencia βAP parcial (reactiva con 6C6) sugiere que el anticuerpo
sueco 192 reconoce βAPP fragmentado en o cerca
del extremo amino de Aβ.
La descripción anterior de las formas de realización preferidas de la presente invención se ha
presentado con el propósito de ilustrar y describir. No tienen el propósito de ser exhaustivas o
de limitar la invención a la forma precisa que se
muestra, siendo posibles muchas modificaciones y
variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores.
Tales modificaciones y variaciones que pueden
ser evidentes para el experto, tienen el propósito
de formar parte del alcance de la presente invención.
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REIVINDICACIONES
1. Utilización de un animal transgénico no
humano o de una célula troncal que comprende
un genoma diploide que comprende un transgén
que codifica un polipéptido APP heterólogo que
incluye la mutación sueca, en el que los residuos
aminoácidos en las posiciones que corresponden a
las posiciones 595 y 596 en la APP695 humana,
son asparagina y leucina, respectivamente, para
evaluar un agente en cuanto a su actividad para
evitar, inhibir o invertir la enfermedad de Alzheimer.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el animal es murino.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en
la que el transgén no se integra homólogamente.
4. Utilización de un animal transgénico no
humano según la reivindicación 1, en la que di-
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cho animal transgénico no humano expresa un
polipéptido APP humano que comprende la mutación sueca de la revindicación 1.
5. Utilización de un animal transgénico no humano según la reivindicación 1, en el que el polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca de la reivindicación 1 se expresa bajo
el control transcripcional de un promotor enolasa
especı́fico neural.
6. Utilización de un transgén que codifica
un polipéptido APP heterólogo que comprende la
mutación sueca en el que los residuos aminoácidos
en las posiciones que corresponden a las posiciones 595 y 596 en la APP695 humana son asparagina y leucina, respectivamente, para hacer que
un animal transgénico no humano para evaluar
un agente en cuanto a su actividad para evitar,
inhibir o invertir la enfermedad de Alzheimer.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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