Download composicion enzimatica para retardar el ranciamiento de productos

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
ES 2 073 632
kInt. Cl. : A21D 8/04
11 N.◦ de publicación:
6
51
ESPAÑA
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 91115135.5
kFecha de presentación : 06.09.91
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 476 462
kFecha de publicación de la solicitud: 25.03.92
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Composición enzimática para retardar el endurecimiento de los artı́culos horneados.
k
73 Titular/es: Enzyme Bio-Systems Ltd.
k
72 Inventor/es: Bowles, Linda K.
k
74 Agente: Elzaburu Márquez, Fernando
30 Prioridad: 12.09.90 US 581290
International Plaza P.O. Box 8000
Englewood Cliffs, N.J. 07632, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.08.95
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.08.95
Aviso:
k
k
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 073 632 T3
DESCRIPCION
Antecedentes de la invención
5
Campo de la invención
Esta invención se refiere al uso de ciertas composiciones enzimáticas que pueden incorporarse a una
masa o masa esponjosa para mejorar la blandura y retardar el endurecimiento de los artı́culos horneados.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Descripción de la técnica anterior
El fenómeno del endurecimiento del pan no se comprende completamente. El endurecimiento del pan
se refiere generalmente a la retrodegradación del almidón o a la asociación de las moléculas de almidón
formando áreas de cristalinidad que dan como resultado un aumento de la firmeza del pan con el paso del
tiempo. El endurecimiento es de importancia económica considerable para las panaderı́as al por mayor
puesto que limita la vida de almacenamiento de los artı́culos horneados en las tiendas hasta aproximadamente 3 ó 4 dı́as, más varios dı́as en el domicilio del consumidor después de su adquisición. La corta vida
de almacenamiento de los artı́culos horneados ha hecho que las panaderı́as al por mayor tengan sistemas
de distribución separados que trabajan independientemente de los canales usuales para la distribución de
los alimentos envasados. Además, el área de mercado de una panaderı́a está generalmente limitada por
el radio máximo que puede cubrir el sistema de distribución en 24 horas.
Los quı́micos de cereales y tecnólogos en panaderı́a han encontrado que diversos emulsionantes
quı́micos tienen influencia para ampliar la vida de almacenamiento de artı́culos horneados, tales como
el pan. Sin embargo, los emulsionantes quı́micos son sólo eficaces parcialmente para reducir el endurecimiento del pan. Se han añadido al pan monoglicéridos y otros emulsionantes para mejorar su blandura.
Aunque estos emulsionantes producen un pan más blando, tienen poca influencia en reducir el grado
de endurecimiento del pan. La expresión “artı́culos horneados” también connota aplicación a productos
tales como panecillos, molletes, bollos, “donuts”, galletas y bizcochos.
En los artı́culos horneados se han utilizado enzimas de varios tipos y algunas se han usado con el fin
especı́fico de inhibir el endurecimiento.
Generalmente se añade enzima alfa-amilasa de cereales en forma de cebada malteada a la harina de
trigo para pan para normalizar su comportamiento en el horno. La alfa-amilasa de cereales es más activa
a un pH de aproximadamente 6 y a una temperatura de aproximadamente 70 a 75◦C.
Enzima “alfa-amilasa fúngica”, que es la expresión que se utiliza en las industrias de panaderı́a y
enzimas, se refiere en general a enzimas procedentes de Aspergillus oryzae, y puede también utilizarse
para normalizar el comportamiento en el horno. La enzima es más activa a un pH de aproximadamente
6 y a una temperatura de aproximadamente 50 a 55◦ C.
Enzima “alfa-amilasa bacteriana”, que es la expresión que se utiliza en las industrias de panaderı́a y
enzimas, se refiere más frecuentemente a enzimas procedentes de Bacillus subtilis, que se emplean para
inhibir el endurecimiento. La enzima es más activa a un pH de aproximadamente 7 y a una temperatura
de aproximadamente 75 a 80◦C.
La solicitud de patente de EE.UU. n◦ de serie 07/419.980, presentada el 11 de octubre de 1989, describe una enzima alfa-amilasa microbiana estable a los ácidos que puede proceder de un hongo pero que
se distingue de las alfa-amilasas de cereales, fúngicas y bacterianas antes citadas. Tiene una actividad
óptima a un pH de aproximadamente 3,0 a 5,0 y una temperatura de aproximadamente 60 a 75◦ C. Es
una de las enzimas utilizadas en la composición enzimática de la presente invención.
Un procedimiento enzimático para retardar el endurecimiento de pan está descrito en la patente de
EE.UU. n◦ 2.615.810 de Stone e implica el uso de una enzima alfa-amilasa bacteriana estable al calor
para atacar los gránulos de almidón gelatinizados durante el horneado.
Un perfeccionamiento del procedimiento de Stone está descrito en la patente de EE.UU. n◦ 4.299.848
de DeStefanis et al., que describe un procedimiento para la inactivación de las enzimas proteolı́ticas presentes en las preparaciones enzimáticas comercialmente disponibles de alfa-amilasa bacteriana estable
al calor obtenidas a partir de extractos de Bacillus subtilis, Bacillus sterothermophilis u otras fuentes
microbianas.
2
ES 2 073 632 T3
5
Un perfeccionamiento más se da en la patente de EE.UU. n◦ 4.654.216 de Carroll et al. que describe el
uso de amilasa bacteriana estable al calor junto con pululanasa para superar los problemas de los procedimientos de Stone y DeStefanis et al. Carrol et al., describen además que la técnica de panaderı́a clasifica
generalmente las alfa-amilasas de acuerdo con su fuente, como bacterianas, fúngicas y de cereales, observando también que las amilasas fúngicas presentan estabilidad térmica relativamente baja y se desactivan
rápidamente por encima de 65◦ C. Ası́, las amilasa fúngicas no son consideradas para la práctica de la
invención de Carroll et al. que comprende la adición de una mezcla enzimática de alfa-amilasa de cereales
o bacteriana y una pululanasa a una masa en proporciones de 0,25 a 5 SKB (unidades de alfa-amilasa)
y 5 a 75 PUN (unidades de enzimas des-ramificadoras) por 100 gramos de harina.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Un inconveniente de los procedimientos de Stone, DeStefanis et al. y Carroll et al. es la tendencia de
las alfa-amilasas bacterianas y de cereales térmicamente estables a permanecer activas demasiado tiempo
durante el horneado y provocar gomosidad en el producto acabado. Como resultado, estos procedimientos
requieren un grado de control de las dosificaciones y relaciones enzimáticas que comercialmente puede no
ser práctica a la hora de su aplicación.
La patente de EE.UU. 4.320.151 de Cole describe que se aumenta sustancialmente la estabilidad
térmica de una alfa-amilasa fúngica dispersando soluciones acuosas de la enzima en soluciones concentradas de azúcar. La enzima alfa-amilasa fúngica protegida por azúcar sobrevive a su incorporación a
una masa y permanece activa hasta que se consigue una temperatura a la que ocurre la gelatinización
del almidón. Ası́, las soluciones de alfa-amilasas fúngicas protegidas por azúcar retienen su actividad
hidrolizante del almidón, incluso cuando se calientan a temperaturas muy por encima de aquéllas a las
que normalmente la enzima serı́a normalmente desnaturalizada. Sin embargo, los cambios de tratamiento
e ingredientes requeridos hacen que este procedimiento sea inadecuado para varias aplicaciones en panaderı́a.
La patente rusa 659.617 describe la producción de una cepa de microorganismos a partir de la cual se
obtienen enzimas alfa-amilasa y glucoamilasa resistentes a los ácidos. La cepa Aspergillus niger 147-A,
se obtiene tratando Aspergillus niger 475 con radiación ultravioleta. En un ejemplo en la patente, se
horneó pan utilizando una preparación enzimática de alfa-amilasa y glucoamilasa resistentes a los ácidos
procedentes de A. niger 147-A y se encontró que se obtenı́a un procedimiento de endurecimiento más
lento. La alfa-amilasa es el producto de una cepa mutante de A. niger, no de una libremente disponible
en la naturaleza, y la alfa-amilasa resistente a los ácidos producida a partir de A. niger 147-A pierde
irreversiblemente su actividad a un pH de 3,0.
La patente canadiense n◦ 880.703 de Grampp et al. describe una alfa-amilasa bacteriana termolábil
que no serı́a propensa al problema de gomosidad de la alfa-amilasa bacteriana convencional. Sin embargo,
esta enzima no es suficientemente estable a la temperatura para inhibir el endurecimiento y no es estable
a los ácidos.
Vidal, patente de EE.UU. n◦ 4.160.848, describe una composición anti-endurecimiento que contiene
una combinación de un éster de glicerol de un ácido graso y otros ácidos grasos sustituidos y no sustituidos que se combinan preferiblemente con una enzima seleccionada de alfa-amilasa, amiloglucosidasa y
lipasa derivada de moho. Se describen como ejemplo alfa-amilasas derivadas de Aspergillus oryzae. La
referencia describe la adición de la composición a una masa o masa esponjosa.
G. Bussiere et al. en “The Utilization of Alpha-Amylasa and Glucoamylase in Industrial Baking Technology”, Annales De Technologie Agricole, volumen 23 (2), páginas 175 a 189 (1974) describe estudios
sobre el papel de las alfa-amilasas de origen bacteriano y la glucoamilasa en la tecnologı́a de fabricación
de pan. Esta referencia enseña que sólo las alfa-amilasas de origen bacteriano son eficaces para retardar
el endurecimiento.
M. Maleki et al. en “Getreide, Mehl und Brot”, Vol. 26, N◦ 8, 1972, p. 221-224, realizaron una
investigación sobre el retraso del endurecimiento de artı́culos horneados utilizando mezclas de enzimas
alfa-amilasas fúngicas y bacterianas. Encontraron que la adición de amilasa fúngica a amilasa bacteriana
no disminuı́a la concentración más eficaz de la alfa-amilasa bacteriana.
El documento WO 89/08403 y EP-A-0 273 268 se refiere a enzimas alfa-amilasas microbianas y enzimas alfa-amilasas bacterianas modificadas, respectivamente. Ambos documentos enseñan el uso de sólo
una de las enzimas para retardar el endurecimiento de artı́culos horneados.
Sumario de la invención
3
ES 2 073 632 T3
5
10
15
20
La presente invención se basa en el descubrimiento de que combinaciones de ciertas enzimas alfaamilasas microbianas estables a los ácidos, que pueden derivarse de hongos, con ciertas enzimas alfaamilasas bacterianas permiten obtener ventajas de las propiedades deseables de ambas enzimas evitando
al mismo tiempo algunas de sus desventajas. Se ha encontrado también que la combinación de enzimas
es eficaz para retardar el endurecimiento a una dosificación enzimática total menor que la requerida para
cada enzima utilizada por separado. Esto puede dar como resultado un ahorro de coste significativo para
el panadero, particularmente debido al coste relativamente alto de la enzima fúngica. La composición
enzimática de la invención retarda el endurecimiento de los artı́culos horneados sin afectar adversamente
las caracterı́sticas organolépticas de los artı́culos horneados. La gomosidad que se asocia normalmente al
uso de composiciones anti-endurecimiento enzimáticas también es minimizada por las bajas dosificaciones
utilizadas de acuerdo con la invención.
Más especı́ficamente, la presente invención proporciona un procedimiento para fabricar productos de
panaderı́a que proporcionarı́a resistencia al endurecimiento añadiendo a la masa o masa esponjosa una
enzima alfa-amilasa microbiana estable a los ácidos y una enzima alfa-amilasa bacteriana, en el que se
añaden de 0,05 a 1,0 unidades de alfa-amilasa por gramo de harina total de la enzima alfa-amilasa microbiana estable a los ácidos y de 0,005 a 0,1 unidades de alfa-amilasa por gramo de harina total de
enzima alfa-amilasa bacteriana y la enzima alfa-amilasa microbiana estable a los ácidos tiene una actividad óptima a un pH de 3,0 a 5,0 a una temperatura de 60 a 75◦ C y la enzima alfa-amilasa bacteriana
tiene una actividad óptima a un pH de 5,0 a 7,0 a una temperatura de 100 a 110◦C.
Breve descripción de los dibujos
25
La Figura 1 ilustra gráficamente el resultado de los ensayos de firmeza de la miga tomados de la Tabla
1 en el Ejemplo 1 que se describe más adelante en esta memoria.
La Figura 2 ilustra gráficamente los resultados de los ensayos de firmeza de la miga tomados de la
Tabla 3 del Ejemplo 2 que se describe más adelante en esta memoria.
30
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
35
De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que la composición enzimática retarda el
endurecimiento de los artı́culos horneados sin afectar adversamente las propiedades organolépticas de los
artı́culos horneados y sin gomosidad significativa.
Los artı́culos horneados que tienen mejores propiedades antiendurecimiento de acuerdo con esta invención incluyen panes, panecillos, molletes, “bageles” y similares; pasteles, bizcochos y otros productos
horneados.
40
45
50
La enzima estable a los ácidos utilizada en la composición de esta invención tiene una actividad
óptima a un pH de 3 a 5, preferiblemente 3,5 a 4,5, a temperaturas de 60 a 75◦ C, preferiblemente 65
a 70◦ C. La enzima sobrevive a su incorporación en una masa y permanece activa a temperaturas por
encima de aproximadamente 60◦ C a la que tiene lugar la gelatinización del almidón, sin necesidad de
protección de azúcar como se ha descrito en la Patente de EE.UU. 4.320.151 de Cole. A temperaturas
superiores a aproximadamente 70◦ C, que se dan más adelante durante el proceso de horneado, la enzima
es completamente inactivada y por consiguiente no tiene tendencia a hidrolizar excesivamente el almidón
ni a causar gomosidad en el producto horneado acabado.
La enzima estable a los ácidos puede proceder de un hongo, tal como Aspergilli negro. Ejemplos de
Aspergilli negro incluyen Aspergillus awamori, Aspergillus usami, Aspergillus niger, Aspergillus saitoi,
Aspergillus inui, Aspergillus aureus y Aspergillus nakazawai. Una enzima estable a los ácidos adecuada
para esta aplicación es la carbohidrasa de panaderı́a MULTIFRESHR proporcionada por Enzyme BioSystems Ltd., Sylvan Avenue, Englewood Cliffs, New Jersey 07632, EE.UU.
55
60
Corrientemente se sabe que el Aspergilli antes citado produce también una enzima glucoamilasa ası́
como una enzima alfa-amilasa que pierde su actividad en condiciones ácidas. En 1963, Y. Minoda et al.,
describieron que cuando se cultivaba Aspergilli negro en condiciones apropiadas, no podı́an producir una
enzima alfa-amilasa estable a los ácidos que mostrara una actividad dextrinizante incluso después de
tratamiento ácido a un pH de 2,5 a 37◦C durante 30 minutos (Agr. Biol. Chem., volumen 27, n◦ 11,
páginas 806 a 811, 1963 (parte 1); volumen 32, n◦ 1, páginas 104 a 109, 1968 (parte 2); volumen 32,
n◦ 1, páginas 110 a 113 (parte 3). Métodos para producir alfa-amilasas estables a los ácidos cultivando
4
ES 2 073 632 T3
diferentes Aspergilli negros están descritos en la solicitud de patente europea 138.428 de Heidt-Hanson
et al. y la patente canadiense 673.274 de Yamada et al.
5
10
Las propiedades de la alfa-amilasa estable a los ácidos en diversas especies de Aspergilli negro han
recibido amplia atención y estudio, por ejemplo, G. K. Kvesitadze et al., “Acid-Stable and Acid-Labile
Alpha Amylases of Mold, fungi Aspergillus”, BIOCHEMISTRY USSR, 43 (9) parte 2, páginas 1330 a
1336 (1978); Y. Minoda et al. “The Structure And The Function Of The Acid-Stable Alpha-Amylase of
Black Aspergilli”, DENPUN KAGAKU (Journal of the Japanese Society of Starch Science, volumen 21,
n◦ 3, páginas 172 a 189 (1974); L. B. Wingard Jr. et al., compilador “Applied Biochemistry and Bioengineering” volumen 2, Enzyme Technology, página 61, (Academic Press 1979); T. T. Hansen, “Industrial
Application Possibilities for an Acid-Stable Alpha-Amylase from Aspergillus Niger”, NEW APPROACHES TO RESEARCH ON CEREAL CARBOHYDRATES, páginas 211 a 216 (Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985).
15
La solicitud de patente europea 140.410 de Ducroo et al. describe el aislamiento de una amilasa ácida
microbiana de una amiloglucosidasa, preferiblemente Aspergillus niger. La amilasa ácida efectúa una
sacarificación óptima a un pH entre 3,5 y 5,0 a temperaturas de aproximadamente 60 a 75◦ C y es estable
durante un perı́odo de varios meses en condiciones de almacenamiento ordinarias.
20
La actividad de la enzima estable a los ácidos se determina por el siguiente método de ensayo iterativo.
Se prepara una solución acuosa de la alfa-amilasa estable a los ácidos que contiene 0,04-0,10 unidades
de alfa-amilasa (UA) estimadas por mililitro (ml). Se añade un ml de la solución enzimática a 4,0 ml
de una solución de almidón al 1,25% a 60◦ C que contiene tampón de acetato 0,125 molar (M) a pH 3,8.
Después de exactamente 3 minutos, se separa una parte alı́cuota de 1,0 ml de la mezcla de reacción, se
añade inmediatamente a 3,0 ml de una solución de yodo al 0,100% y se diluye hasta 100 ml con agua
destilada. La solución de yodo se prepara añadiendo 2,0 ml de una solución de yodo al 5,00% (10 gramos
de yoduro potásico más 5,00 gramos de yoduro resublimado diluido hasta 100 ml con agua destilada) a
4 ml de ácido acético 5M y diluyendo hasta 100 ml con agua destilada. Exactamente a los 13 minutos se
separa una segunda parte alı́cuota de 1,0 ml de la mezcla de reacción y se trata como antes. Se determina
la absorbancia de cada muestra a 650 nanómetros (nm) en una celdilla de 1 centı́metro. La actividad se
calcula como sigue:
25
30
Absorbancia, 3 min
UA/(ml o gramo) = 0,2303 log Absorbancia, 13 min FD
35
40
45
50
55
60
en donde FD =
el factor de dilución utilizado al preparar la
enzima diluida, determinado dividiendo el volumen
final de la muestra de enzima diluida por el peso
en gramos de la muestra de enzima inicialmente
añadida. Los siguientes son ejemplos:
Actividad estimada
(unidades de alfa-amilasa
por ml o gramo)
Dilución
Factor de
dilución
(FD)
0,1 o menor
0,11 - 0,25
0,26 - 0,50
0,51 - 1,0
1,1 - 2,5
2,6 - 5,0
5,1 - 10,0
–
40
20
10
40
20
10
1
2,5
5
10
25
50
100
a
a
a
a
a
a
100 ml
100 ml
100 ml
1000 ml
1000 ml
1000 ml
La enzima bacteriana utilizada en la composición de esta invención tiene una actividad óptima a un
pH de 5 a 7 a temperaturas de 100 a 110◦ C. Esta enzima puede derivarse de Bacillus stearothermophilus.
Una enzima bacteriana adecuada para esta aplicación es G-ZYMER G995 proporcionada por Enzyme
Bio-Systems Ltd., Sylvan Avenue, Englewood Cliffs, New Jersey 07632, EE.UU.
5
ES 2 073 632 T3
La actividad de la enzima bacteriana se determina por el siguiente procedimiento.
5
Se deja reaccionar la enzima con una solución patrón de almidón en condiciones controladas. La
actividad enzimática se determina por el grado de hidrólisis de almidón, reflejada por una disminución
de la capacidad de tinción del yodo, que se mide espectrofotométricamente. La unidad de actividad de
alfa-amilasa bacteriana es la cantidad de enzima requerida para hidrolizar 10 miligramos de almidón por
minuto en las condiciones del procedimiento.
10
De 0,3 a 0,5 gramos de muestra sólida o de 0,3 a 1,0 mililitros de una muestra lı́quida se disuelven
en una cantidad suficiente de cloruro cálcico acuoso 0,0025 molar dando una solución enzimática que
contiene aproximadamente 0,25 unidades de actividad por mililitro.
15
20
Una mezcla de 10 mililitros de solución de almidón soluble al 1%, equilibrada a 60◦C, y 1 mililitro
de la muestra de enzima que ha de ensayarse se mezcla y mantiene en un baño a temperatura constante
de 60◦C durante exactamente 10 minutos. Se separa una muestra de 1 mililitro y se añade a una mezcla
de 1 mililitro de ácido clorhı́drico acuoso 1 molar y aproximadamente 50 mililitros de agua destilada.
A continuación se determina la capacidad de tinción del yodo de dicha muestra acidificada añadiendo
3,0 mililitros de solución acuosa de yodo al 0,05%, diluyendo hasta 100 mililitros con agua destilada
y mezclando bien. La absorbancia de la solución, con relación a la del agua destilada, se mide a 620
nanómetros, en una celdilla de 2 centı́metros. Se realiza una medida similar de la solución patrón de
almidón (a la que se añade agua en lugar de la solución enzimática) para proporcionar un absorbancia
de la muestra en blanco denominada en lo sucesivo absorbancia del blanco.
La actividad enzimática, en unidades/gramo o /mililitro es igual a
25
(Absorb. del blanco - Absorb. de la muestra)xFDx50
Absorb. del blanco x 10 x 10
donde Absorb. = absorbancia
30
35
40
45
50
55
60
Al realizar la invención, las composiciones enzimáticas se emplean como aditamento de la harina
utilizada para panaderı́a. Las relaciones de dosificación relativas de la enzima estable a los ácidos a la
enzima bacteriana son desde 0,05:0,005 unidades de alfa-amilasa por gramo de harina hasta 1,0;0,1 de
unidades de alfa-amilasa por gramo de harina. Las relaciones preferidas son de 0,1:0,01 de unidades de
alfa-amilasa por gramo de harina a 0,5:0,05 de unidades de alfa-amilasa por gramo de harina. El peso
de la harina se refiere a la harina total utilizada para preparar el producto horneado. Ası́, por ejemplo,
cuando se utiliza una masa esponjosa el peso de la harina en la masa esponjosa se añade al peso de la
harina en la masa y la suma se utiliza como denominador para calcular las unidades de alfa-amilasa por
gramo de harina.
La composición enzimática de la presente invención puede prepararse mezclando la enzima estable a
los ácidos con la enzima bacteriana antes de emplearlas en el proceso de horneado o pueden añadirse individualmente en la relación deseada a un ingrediente utilizado en el proceso de horneado. La composición
comprende la enzima alfa-amilasa microbiana estable a los ácidos y la enzima alfa-amilasa bacteriana en
una relación de 5 a 100 unidades de alfa-amilasa de la enzima estable a los ácidos y de 0,5 a 10 unidades
de alfa-amilasa de la enzima bacteriana.
La composición enzimática, o sus componentes enzimáticos, puede emplearse como una solución acuosa
concentrada o como un sólido. En el proceso de horneado, la composición enzimática, o sus componentes
enzimáticos, puede añadirse a cualquier ingrediente de la masa esponjosa o masa, tal como harina, levadura o agua, o puede añadirse después de los demás ingrediente durante la operación de mezcladura.
Los artı́culos horneados preparados utilizando la composición de la presente invención presentan excelentes propiedades antiendurecimiento con menores niveles de dosificación de enzimas que los utilizados
generalmente en la técnica. Los productos horneados permanecen más blandos durante mayor tiempo
basándose en el ensayo de firmeza de la miga como se describe en los ejemplos recogidos en esta memoria.
Otro beneficio de la enzima es su capacidad para reducir o eliminar la adición de otros ingredientes,
tales como acondicionadores, es decir, estearil-lactilato sódico, y agentes ablandadores, tales como monoglicéridos, diglicéridos y otros emulsionantes.
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones especı́ficas de la presente invención. En los ejemplos y
durante la memoria, todas las partes y porcentajes son en peso, a menos que se indique otra cosa.
6
ES 2 073 632 T3
Ejemplo 1
5
Las enzimas se sometieron a ensayo en un laboratorio de ensayo de panaderı́a comercial utilizando un
proceso de masa esponjosa y masa. Se utilizó la siguiente fórmula:
Ingredientes
Peso (g)
Harina de pan (11,5% de proteı́na)
Alimento de levadura mineral (bromado)
Estearil-lactilato sódico
Levadura comprimida
Agua
Harina de pan
Leche desnatada en polvo
Sal
Propionato cálcico
Aceite de soja
Ablandador de la miga (GMS-90)
42% de jarabe de maı́z con alto contenido en fructosa
Agua e hielo
2100
3
11,2
75
1260
900
60
60
3
60
30
255
466
10
Masa esponjosa
15
Masa
20
25
30
35
40
45
50
Se mezclaron los ingredientes de la masa esponjosa y se dejaron fermentar durante 3,5 horas (temperatura final 84◦ C). Se añadieron los ingredientes de la masa y ésta se dividió en porciones de 526 g/barra.
Las barras se dejaron subir hasta una altura de 100 +/- 1 milı́metros antes de hornear a 224◦ C durante
18 minutos. Se enfriaron las barras durante una hora a temperatura ambiente y se introdujeron en bolsas
para almacenamiento. (El ablandador de miga GMS-90 es un monoglicérido hidratado proporcionado
por Breddo Inc., Kansas City, Missouri, EE.UU.).
Al dı́a siguiente del horneado, se partieron mecánicamente en rodajas tres barras y se evaluaron sus
cualidades externas, internas y de degustación. Se midió la firmeza de la miga con un aparato de ensayo
de alimentos Instron de acuerdo con la American Association of Cereal Chemists, método 74-09. Se
representa la firmeza de la miga como los gramos de fuerza requeridos para comprimir 6,2 milı́metros dos
rodajas de pan con un disco plano de 36 milı́metros de diámetro a una velocidad de compresión de 100
milı́metros por minuto. Se repitieron las medidas de la firmeza de la miga al cuarto y séptimo dı́a del
horneado.
Las enzimas se obtuvieron de Enzyme Bio-Systems Ltd., Englewood Cliffs, NJ. Las enzimas ensayadas
eran una preparación de alfa-amilasa bacteriana de Bacillus stearot-hermophilus y una preparación de
alfa-amilasa fúngica derivada de Aspergillus niger. La amilasa bacteriana se vende como alfa-amilasa
G-ZymeR G995 y la alfa-amilasa fúngica se vende como alfa-amilasa MultifreshR . Las enzimas lı́quidas
se añadieron con los ingredientes de la masa esponjosa. La Tabla 1 y la Figura 1 muestran que la adición
de niveles muy bajos de la alfa-amilasa bacteriana era por sı́ misma ineficaz para reducir el grado de
firmeza del pan. Cuando este nivel de enzima bacteriana se incluı́a con bajos niveles de alfa-amilasa
fúngica, la reducción en el grado de firmeza del pan era mayor que con cada enzima sola, y comparable
a la observada con una cantidad cuatro veces mayor de adición de alfa-amilasa fúngica.
55
60
7
ES 2 073 632 T3
Tabla 1
Enzima
u de enzima/g de harina total
5
Firmeza de la miga
Dı́as después del horneado
α-amilasa fúngica
α-amilasa bacteriana
Dı́a 1
Dı́a 4
Dı́a 7
1,1
0,27
0,27
0
0
0
0,02
0,02
126+/-2
143+/-4
124+/-2
150+/-1
193+/-4
199+/-3
174+/-4
225+/-6
236+/-4
284+/-6
254+/-3
318+/-5
10
15
La puntuación del pan indicó que todas las barras eran de calidad similar (Tabla 2).
Tabla 2
20
α-amilasa fúngica/α-amilasa bacteriana
u/g de harina
25
1,1/0
0,27/0
0,27/0,02
0/0,02
10
5
10
5
8,5
5
8
4,25
7,75
7
8
4,25
8,75
4,25
8
4,5
7,5
4
8
4,25
10
15
10
10
15
10
7,5
13
9
9
13
9
7,5
12,5
9
9
13
9
7,25
12,5
9
9
13
9
7,25
12,5
9
9
13
9
Calidades externas (puntuación máxima)
Volumen
Simetrı́a
Color de la corteza
Rotura y desmenuzamiento
30
35
Calidades internas
Grano
Textura
Color de la miga
Aroma
Sabor
Sensación gustativa
40
45
Ejemplo 2
50
Ingredientes, fórmulas y procesos de ensayo fueron idénticos a los del ejemplo 1 excepto que en este
ejemplo el agente ablandador de la miga (GMS-90) se añadió sólo cuando se indica.
55
En el Ejemplo 2, las enzimas eran de las mismas dos fuentes que en el Ejemplo 1; sin embargo, ambas
enzimas se añadieron como un polvo liofilizado. La relación y dosificación de la alfa-amilasa fúngica a
la alfa-amilasa bacteriana eran las encontradas óptimas en el Ejemplo 1: 0,027 unidades de alfa-amilasa
fúngica/g de harina: 0,02 unidades de alfa-amilasa bacteriana/g de harina.
60
Las Tablas 3 y 4 y la Figura 2 muestran que la mezcla de enzimas solas (sin agente ablandador de la
miga) era más eficaz que el agente ablandador de la miga para reducir el grado de endurecimiento del pan
sin efectos negativos sobre la calidad del pan. La adición del agente ablandador de la miga a la mezcla
de enzimas proporcionaba pocas ventajas más.
8
ES 2 073 632 T3
Tabla 3
5
Adición de GMS-90
Adición de enzimas
Firmeza de la miga
Dı́as después del horneado
Dı́a 1
Dı́a 4
Dı́a 7
166+/-3
155+/-4
123+/-2
121+/-3
305+/-7
259+/-8
206+/-4
204+/-3
364+/-7
337+/-6
292+/-6
286+/-7
10
15
Ninguna
0,25%
Ninguna
0,25
Ninguna
Ninguna
Mezcla
Mezcla
Tabla 4
20
Agente ablandador de la miga/enzima
Ninguno/ 0,25%/ Ninguno/ 0,25%/
ninguna ninguna mezcla
mezcla
25
30
35
40
Calidades externas (puntuación máxima)
Volumen
10
7,25
Simetrı́a
5
4
Color de la corteza
10
8
Rotura y desmenuzamiento 5
4,25
8
4,25
8
4,25
9
4
8
4,25
8
4
8
4,25
Calidades internas
Grano
Textura
Color de la miga
Aroma
Sabor
Sensación gustativa
7,5
12,75
9
9
13
9
7,5
12,75
9
9
13
9
7,5
12,75
9
9
13
9
10
15
10
10
15
10
7,5
12,75
8,75
9
13
9
45
50
55
60
9
ES 2 073 632 T3
REIVINDICACIONES
5
1. Una composición para retardar el endurecimiento de artı́culos horneados, que comprende en unidades relativas de actividad enzimática de 5 a 100 unidades de alfa-amilasa de una enzima alfa-amilasa
microbiana estable a los ácidos y de 0,5 a 10 unidades de alfa-amilasa de una enzima alfa-amilasa bacteriana, en la que la enzima alfa-amilasa microbiana tiene actividad óptima a un pH de 3,0 a 5,0 a una
temperatura de 60 a 75◦C y la enzima alfa-amilasa bacteriana tiene actividad óptima a un pH de 5,0 a
7,0 a una temperatura de 100 a 110◦C.
10
2. La composición de la reivindicación 1, en la que la enzima alfa-amilasa microbiana procede de un
hongo.
3. La composición de la reivindicación 2, en la que el hongo es Aspergilli negro.
15
20
4. La composición de la reivindicación 3, en la que el Aspergilli negro se selecciona del grupo que
consiste en Aspergillus awamori, Aspergillus usami, Aspergillus niger, Aspergillus saitoi, Aspergillus inui,
Aspergillus aureus y Aspergillus nakazawai.
5. La composición de la reivindicación 2, en la que la enzima alfa-amilasa bacteriana procede de
Bacillus stearothermophilus.
6. La composición de la reivindicación 3, en la que la alfa-amilasa bacteriana procede de Bacillus
stearothermophilus.
25
7. La composición de la reivindicación 4, en la que la alfa-amilasa bacteriana procede de Bacillus
stearothermophilus.
8. La composición de la reivindicación 7, en la que el Aspergilli negro es Aspergillus niger.
30
35
40
45
9. Un procedimiento para fabricar artı́culos horneados que tienen propiedades de endurecimiento
retardadas, que comprende añadir a una masa una enzima alfa-amilasa microbiana estable a los ácidos
y una enzima alfa-amilasa bacteriana, a el que se añaden de 0,05 a 1,0 unidades de alfa-amilasa por
gramo de harina de la enzima alfa-amilasa microbiana estable a los ácidos y de 0,005 a 0,1 unidades de
alfa-amilasa por gramo de harina de enzima alfa-amilasa bacteriana y la enzima alfa-amilasa microbiana
estable a los ácidos tiene actividad óptima a un pH de 3,0 a 5,0 a una temperatura de 60 a 75◦C y
la enzima alfa-amilasa bacteriana tiene actividad óptima a un pH de 5,0 a 7,0 a una temperatura de
100 a 110◦C. 10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la enzima alfa-amilasa microbiana
estable a los ácidos procede de Aspergillus niger y la enzima alfa-amilasa bacteriana procede de Bacillus
stearothermophilus.
11. Un procedimiento para fabricar artı́culos horneados que tienen propiedades de endurecimiento
retardadas que comprende añadir a una masa esponjosa una enzima alfa-amilasa microbiana estable a
los ácidos y una enzima alfa-amilasa bacteriana y mezclar la masa esponjosa con una masa en la que se
añaden 0,05 a 1,0 unidades de alfa-amilasa por gramo de harina total de la enzima alfa-amilasa microbiana
estable a los ácidos y de 0,005 a 0,1 unidades de alfa-amilasa por gramo de harina total de la enzima
alfa-amilasa bacteriana y la enzima alfa-amilasa microbiana estable a los ácidos tienen actividad óptima
a un pH de 3,0 a 5,0 a una temperatura de 60 a 75◦C y la enzima alfa-amilasa bacteriana tiene actividad
óptima a un pH de 5,0 a 7,0 a una temperatura de 100 a 110◦C.
50
55
60
10
ES 2 073 632 T3
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la enzima alfa-amilasa microbiana estable a
los ácidos procede de Aspergillus niger y la enzima alfa-amilasa bacteriana procede de Bacillus stearothermophilus.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
11
ES 2 073 632 T3
12
ES 2 073 632 T3
13