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Regulación de la expresión génica: Regulación de la expresión génica: genoma y proteoma
genoma y proteoma
Tipos de genes:
Con trol gén ico:
• Constitutivos
• Qué genes se expresan
• Inducibles
• En qué momento
• Represibles
• Con qué pauta temporal
Esquema de diferenciación tisular
Programas de
diferenciación celular
Regulación:40-50%
2010 Enrique Castro
1
Regulación de la expresión génica
Regulación de la expresión génica
biosíntesis
Estado estacionario
degradación
Expresión
génica
Funciones codificadas por genes
humanos
Gen
Transcripción
nucleótidos
Transcrito primario
Procesamiento
post-transcripcional
mRNA maduro
Hidrólisis
del mRNA
Traducción
Proteína
(inactiva)
Modificaciones
post-traducionales
aminoácidos
Proteolisis
Todos los
procesos son
regulados
Proteína
(activa)
2010 Enrique Castro
Funciones
fisiológicas
2
Control de la expresión génica en procariotas: operones Control de la expresión génica en procariotas: operones bacterianos
bacterianos
Proteína unida:
transcripción bloqueada
Nivel basal de transcripción elevado
Regulación por represión
 Proteínas de control simples
Organización génica en operones:
Disociación:
alivio de la inhibición
Unidad de transcripción policistrónica
Secuencias de control únicas
Control conjunto por represor
Acoplamiento Transcripción/Traducción:
Regulación conjunta
3
2010 Enrique Castro
Control génico en eucariotas: características generales
Control génico en eucariotas: características generales
Nivel basal de transcripción nulo
 Cromatina muy condensada
 Acceso al promotor restringido
Mecanismo principal:
control de la estimulación
de la iniciación
Regulación por activación
 Organización jerárquica
Organización génica dispersa
 unidades de transcripción monocistrónicas
 Control individualizado de genes
 Señales de control múltiples
 Proteínas reguladoras complejas
Integración
Control combinatorio
Control alternativo
Procesamiento del transcrito
 Variabilidad en splicing
proteoma>>genoma
Desacoplamiento transcripción/traducción
 Transporte al citosol regulado
 Regulación de la traducción
Mecanismos de regulación
Histonas
rRNA
Transcripción
(núcleo)
citoplasma
2010 Enrique Castro
 Dosis génica
Silenciamiento génico
(epigenético)
 Metilación del DNA
 Condensación de la cromatina
 Control de la iniciación
 Regulación de la elongación/terminación
 Splicing alternativo
 Edición del mRNA
 Transporte nucleocitoplasmático
 Estabilidad del mRNA
 Interferencia génica (iRNA)
 Regulación de la síntesis de proteínas
4
Condensación de la cromatina y transcripción
Condensación de la cromatina y transcripción
Empaquetamiento DNA/Histonas:
promotores inaccesibles a factores
TAF, RNApol elementos reguladores
El empaquetamiento de los
cromosomas metafásicos
bloquea todo acceso al DNA
Para la transcripción, el
DNA debe remodelarse sin
llegar a desorganizarse
Sensibilidad a la DNasa I
Cromatina activa:
•
•
•
•
(promotor: sitios hipersensibles)
Pobre en H1
Poco metilada (CpG)
Rica en HMGs
Histonas acetiladas
5
2010 Enrique Castro
El código de histonas
El código de histonas
Modificaciones conocidas de histonas
Efectos de la modificación
2010 Enrique Castro
6
Acetilación de histonas: condensación de cromatina
Acetilación de histonas: condensación de cromatina
Acetilación
Acetilación de histonas
• Relaja unión DNA al nucleosoma
• Promueve unión de TFs
• Proporciona sitios de unión para reguladores
(unión a bromodominios)
• Complejos de acetilación/desacetilación
Bromodominios se
unen a Ac-histonas
DNA unido
laxamente
HAT
Cromatina condensada
No hay transcripción
Cromatina relajada
Si hay transcripción
HDAC
7
2010 Enrique Castro
Complejos reorganizadores de la cromatina
Complejos reorganizadores de la cromatina
Actividades enzimáticas
• Reorganización del nucleosoma
• Acetilación de histonas
Reclutados por
• Trans-moduladores
• Co-moduladores
• Mediador
Cambio conformacional
ATP-dependiente
Reclutados por
transactivadores/
mediador/co-mod
oligómero
>20
>10
>11
Subunidades compartidas con
Mediador/THIID
HATs
HDACs
HDAC
actividad
pCAF/SAGA HAT
mSIN3
HDAC
SWI/SNF
Remodelado
mSIN3
HDAC
Represión: Desacetilación
HAT
pCAF
HAT Activación: Acetilación
Ensamblaje: HATs B
CAF1 (H3/H4)
NAP1 (H2A/H2B)
2010 Enrique Castro
8
Silenciamiento génico por metilación del DNA
Silenciamiento génico por metilación del DNA
9
2010 Enrique Castro
Amplificadores: Trans­activación
Amplificadores: Trans­activación
Elementos potenciadores
-10 / -50 kb
-200
Proteínas reguladoras unidas a
elementos de control
Exones
intrones y UTRs
+10 / +50 kb
-30
PIC
Complejo de
preiniciación GTFs + RNApol
Transactivadores
Interacción activadora:
Mediador/TFIID
Unión a surco menor:
curva en DNA dúplex
cooperativas
TFIID:
• TBP
• 11 TAFs
Mediador:
• >20 subunits
• unido a CTD
2010 Enrique Castro
Co-activadores
Co-represores
• Se unen al PIC
• Reclutan transactivadores
• Reclutan remodeladores
10
Amplificadores eucarióticos: elementos cis Amplificadores eucarióticos: elementos cis Núcleo del promotor:
(core promoter)
Próximo a +1
Unión de RNApolII
•TATA
•GC-box
•Inr
Elementos proximales:
Posición cercana (hasta -200 pb)
Siempre 5’
Orientación fija
Afectan al promotor inmediato
• Todos los anteriores +
• Elementos de respuesta
 a hormonas
 choque térmico (HSTF)
Amplificadores:
Elementos distales (0.1-50 kb)
5’, 3’ y en intrones
Orientación bidireccional
Controlan grupos de genes
elemento
s. consenso
factor
CAAT box
GGCCAATCT
GC box
GGGCGG
C/EBP, CTF1
SP1
Octámero
ATTTGCAT
Oct-1
κB
GGGACTTTCC
NF-κB
ATF
GTGACGT
ATF
HRE
CRE
sec. consenso
TRE
SRF
GRE
RARE
2010 Enrique Castro
factor
CREB
AP-1
SRF
AGAACAN3TGTTCT
AGGTCAN5AGGTCA
GR
RAR/RXR
11
Elementos trans: Factores de Transcripción
Elementos trans: Factores de Transcripción
Función:
 Unión a elementos de control cis (DNA)
 Regular iniciación
reclutamiento
activación
represión
Estructura:
N
C
AD
DBD
SP1
 Modulares
 D. unión a DNA (DBD)
 D. de activación (AD)
 Interacción
proteína-proteína
 Diméricos
AD
DBD
DBD
LBD
GR
AD
Gal4
Integración
combinatoria
Dominios de unión a DNA (DBDs):
 α-hélice protrusiva
α-hélice ≈1.2 nm 
 Contactos con surco mayor
Surco 1.2 x 0.6-0.8 nm
 Unión a secuencias específicas
 Sin desaparear bases
(sin desenrollar)
 Muy conservados
80% en tres categorías
•HTH
•Dedos de Zn
•bZIP
2010 Enrique Castro
surco mayor
No existe un código constante
Imposible predecir secuencias
surco menor
12
Estructuras de dominios DBD
Estructuras de dominios DBD
hélice-giro-hélice
(HTH)
Homeodominio
Dedos de Zn
≈60 aa
C2 H2
≈30 aa
SP1
≈20 aa
bZIP:
Cremalleras de leucina básicas
Cx
≈60 aa
≈60 aa
NR
Interacción
proteína-proteína
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2010 Enrique Castro
Dominios de transactivación
Dominios de transactivación
Dominios de transactivación:
 Diversidad estructural
 Cambio conformacional por unión a DNA
 Interacción con co-activadores
Ovillo  α-hélice anfipática
(reclutamiento)
Tipos de dominios
 Acídico
 Rico en Q
 Rico en P
 Rico en S y T
 Hidrofóbicos
 Básicos
muy potente
promiscuo (todo tipo de genes)
Represión
2010 Enrique Castro
Se pueden intercambiar
módulos en proteínas quiméricas
Un dominio AD rico en P
transactiva
desde un elemento GC
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Trans­represión
Trans­represión
Inverso funcional de la trans-activación
Esencial para una red de control
Construcción del complejo
de amplificación impedida
No hay transcripción
Ejemplo: tumores de Wilms
Mecanismos de represión:
Represor
WT-1
 Competición por unión al DNA
 Bloqueo de dominios AD
 Bloqueo del reclutamiento de
• Co-activadores
• TFIID/Mediador
• GTFs
 Reclutamiento de remodeladores
compactación/desacetilación
AP-1
SRF
Elementos de control
-1 kb
Gen EGR-1
Esencial en el desarrollo
Tumores posteriormente
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2010 Enrique Castro
Mediadores del Mediador: Mediadores del Mediador: co­activadores y co­represores
co­activadores y co­represores
Los transactivadores
NO se unen a PIC:
Proteínas de intermediación
Co-moduladores:
 Centros de interacción
(construcción del complejo proteíco)
 Reclutamiento de otros factores
(Remodelamiento/HAT)
Co-activadores:N-CoA, CBP/p300
Co-represores: N-CoR
CBP/
p300
Red compleja de interacciones
proteína-proteína
TFIID/TAFs:
Unión a Histona-Ac
 Similar a histonas
(cromatina activa)
 Bromodominios
 Interacciones proteína-proteína
 Reconocimiento de promotor
 Construcción de PIC
Estabilización
Unión a Inr etc
promotores sin TATA
2010 Enrique Castro
Pa pel
Ce ntral
Subunidades compartidas
entre complejos
TFIID/ Mediator/
pCAF(SAGA) etc
Reclutamiento
Unión a
trans-moduladores
Remodelación
Mediador:
 Multimérico (20 p)
 Interacciones proteína-proteína
 Reclutado sobre PIC-CTD
TAFs
CAF
Med
16
Regulación génica: Regulación génica: Integración cooperativa de señales
Integración cooperativa de señales
Regulación del gen de la transtiretina
en hepatocitos
GTFs
Generales
+
específicos
de tejido
Compleja red de
interacciones
Trans-moduladores
Mediator
RNApol II
PIC
remodelación
co-moduladores
TFIID
2010 Enrique Castro
 Puntos de inicio alternativos
 Construcción por reclutamineto
 Construcción cooperativa
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Integración combinatoria de señales
Integración combinatoria de señales
Aumento factorial de las opciones de regulación
 Diméricos: Homo/Heterodimerización
AP-1: combinaciones
de fos/jun/otros
Complejo multiproteico:
“Enhanceosome”
Potenciosoma?
 Reconocimiento de señales cis
repeticiones
simetría
El orden puede
ser significativo
 Interacciones proteína-proteína
Puede combinarse
con represores
2010 Enrique Castro
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Regulación de los factores de transcripción
Regulación de los factores de transcripción
Regulación de la unión al DNA por:




Unión de ligandos
Expresión diferencial (inducción)
Fosforilación/desfosforilación
Unión de ligandos
Localización/secuestro
Síntesis
proteica
inactivo
activo
fos
jun
La expresión génica
es controlada
por señales celulares
Fosforilación/ desfosforilación
Localización/ secuestro
P
inactivo
ATP
ADP
NR
(ER,TR.RAR)
P
P
P
P
citosol
núcleo
proteolisis
citosol
núcleo
activo
CREB
SRF
E2F/Rb
NF-κB
NF-AT
Notch
19
2010 Enrique Castro
Regulación génica: organización jerárquica
Regulación génica: organización jerárquica
Señal
Organización jerárquica:
 Cascadas de reguladores
Activación del
regulador
primario
Unión
al DNA
(y otras
acciones)
Regulación alternativa:
Expresión de un
nuevo regulador
que controla varios genes
 Varias rutas para cada gen
 Activación/represión coordinadas
Expresión de
reguladores
secundarios
Trans-activación
Proteínas activas
2010 Enrique Castro
Trans-represión
Respuesta
fisiológica
celular
No transcripción
Supresión de proteínas activas
20
SF. de Receptores Nucleares: zonas conservadas
SF. de Receptores Nucleares: zonas conservadas
DBD
AF1
CoA
AF2
LBD
CoR
A/B
H2N-
variable
100-500 aa
C
D
unión DNA
68-68 aa
42-94%
E
F
-COOH
unión ligando
225-285 aa
15-57%
Largos: Homodímeros
>185 aa
1
553
1
1
ER
946
PR
777
GR
408
TR
432
RAR
Cortos: Heterodímeros
1
1
<185 aa
1
427
VDR
21
2010 Enrique Castro
Estructura de Receptores Nucleares
Estructura de Receptores Nucleares
Reconocimiento de
secuencias diana de DNA
específicas
DBD
DNA
Rotación de
homo/herodímeros
Represión
“bisagra”
LBD
Unión de Ligando
Homo/hetero-dimerización
Trasactivación trascripcional
2010 Enrique Castro
22
Estructura de los dominios DBD
Estructura de los dominios DBD
Caja P:
unión a hemi-elemento
hexámero HRE
Caja D:
Dimerización
Dedos de Zn:
C4
Unión al DNA
C5
caja
D
caja
P
H2N-
A/B
C
D
E
F
-COOH
23
2010 Enrique Castro
Unión al DNA: Elementos de Respuesta a Hormonas (HREs)
Unión al DNA: Elementos de Respuesta a Hormonas (HREs)
DR3
(MR, PR, AR)
palindrómicos
GR dimérico
secuencias
consenso HRE
DR3
DR4
RXR
Repetiticiones
directas
DR4
DR5
Espaciado impone
geometría de
dimerización
2010 Enrique Castro
TR
RAR
DR5
RXR
24
Estructura del dominio de unión a ligando
Estructura del dominio de unión a ligando
H9
Activación de receptores nucleares:
Cambios conformacionales
inducidos por ligando
H10
apo-LBD
(desocupado)
Interfaz de
dimerización,
Heptadas hidrofóbicas
H9-H10
H10
H9
holo-LBD
(ocupado)
vista axial
Glu
Lys
AF-2
τc
Bolsillo hidrofóbico
unión LXXLL
φ φ XEφφ
2010 Enrique Castro
25
Reclutamiento de co­moduladores
Reclutamiento de co­moduladores

Familia p160: co-activadores
• N-CoA / SRC1
• GRIP1 / TIF2
Unión de motivos LXXLL / AF-2
efecto hidrofóbico
interacción iónica
Motivos
LXXLL
bHLH

PAS
Unión a NR
Unión a CBP/p300
Familia co-represores
• N-CoR
• SMRT
2010 Enrique Castro
Unión a la bisagra
26
Inhibición por tamoxifen
Inhibición por tamoxifen
ACTIVO
INACTIVO
Motivo φφ XEφφ
fuera de lugar
27
2010 Enrique Castro
Receptores Nucleares: Dimerización
Receptores Nucleares: Dimerización
R. glucocorticoides
DR3
RAR
DR5
RXR
2010 Enrique Castro
28
Receptores nucleares: especificidad
Receptores nucleares: especificidad
RXR silente
 Orientación de hemisitios
 Espaciador
 Desviaciones de la secuencia consenso
RXR activo
29
2010 Enrique Castro
Acciones de los Receptores nucleares
Acciones de los Receptores nucleares
Esteroides:
Glucocorticoides: Reacción estrés, Gluconeogénesis, lipolisis
Activación de
receptores nucleares
Mineralcorticoides: Transporte Na+, K+ y Cl- en riñón
Andrógenos/estrógenos: C. sexuales, ciclo menstrual
Progestágenos: gestación
Tiroideas: Metabolismo basal, desarrollo
Retinoides (Vit. A): Retina, epitelios, morfogénesis
Vitamina D: Metabolismo del Ca2+ (intestino y hueso)
Unión al DNA
transcripción
Acción
Proteínas de
Respuesta secundaria
Proteínas de
Respuesta primaria
Proliferación
Diferenciación
Morfogénesis
2010 Enrique Castro
Factores de
transcripción
represión
activación
30
Regulación transcripcional por R. Nucleares
Regulación transcripcional por R. Nucleares
31
2010 Enrique Castro
Controles de largo alcance
Controles de largo alcance
Controles de grupos génicos
• Afectan a grupos de genes coordinados
• Remodelado de la cromatina
LCR: compactación
de la cromatina
Sólo activado en
células eritroides
ε: saco vitelino
γ:hígado fetal
β,δ:médula ósea adulta
Cada gen tiene
controles individuales
Deleción causa talasemia
Aisladores (elementos frontera)
• Limitan acción de amplificadores
• Previenen efecto de posición
2010 Enrique Castro
Actúan por unión de
proteínas
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Regulación de la expresión génica:
Regulación de la expresión génica:
Edición del mRNA maduro
Edición del mRNA maduro
Edición:
 Cambiar la secuencia del mRNA maduro
 Muy frecuente en mitocondrias y cloroplastos
Mecanismo de edición:
 Modificación de bases in situ
 Reconocimiento de secuencia por RNA
iGluR(AMPA)
Desaminación:
CU
AI
Permeabiliadad al Ca2+
(plasticidad sináptica: memoria)
Apo-B100 (500 kD): hepatocitos
Apo-B48 (240 kD): intestino
Apolipoproteína B
hígado
intestino
conversión en
codón stop
Se une a LDL-R
Cede colesterol a
tejidos periféricos
No se une a LDL-R
No cede colesterol
Dominio de unión
a LDL-R
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2010 Enrique Castro
Estabilidad del mRNA: opciones de regulación
Estabilidad del mRNA: opciones de regulación
Recambio constitutivo:
mRNAs son muy estables en eucariotas
Degradación por sistema enzimático específico
Degradación regulada:
3’ UTR
5’cap
mRNA
Secuencias AUUUA
repetidas en 3’UTR
Reconocimiento por nucleasas
3’ Poli-A
Estable
Lábil
Aumento de degradación: señal 3’UTR
• citoquinas
• Genes inmediatos tempranos
Aumento de estabilidad
• sistema caseina/prolactina
• sistema TfR/Hierro (IREs )
Señal de degradación rápida
Regulacion de la estabilidad
del mRNA de TfR por Fe
Unión específica a
secuencias de bucle
IRE
2010 Enrique Castro
IRE-BP activa (no Fe)
protege de la degradación
34
Degradación citosólica constitutiva del mRNA
Degradación citosólica constitutiva del mRNA
Recambio: vía principal
Degradación lenta
progresiva de cola poli-A
Acelerada por señales
de AUUUA en 3’UTR
Reclutamiento de
endonucleasa específica
Recambio: vía acelerada
Señales codificadas en
5’UTR y 3’UTR
35
2010 Enrique Castro
Regulación de la traducción: represión traduccional
Regulación de la traducción: represión traduccional
Secuestro de eIF2:
 p-eIF2 unido a eIF2B
 Quinasa eIF2: HCR
Co-regulación
globina-hemo
Represores 3'UTR:
 Unión al mRNA, bloqueo de eIFs
Represores 5'UTR:
 Elementos IRE
No modifican
degradación
Unión de IRE-BP
previene iniciación
de traducción
2010 Enrique Castro
Elementos IRE
en 5’ UTR
Fe secuestrado
por ferritina
Fe disponible para
Fe-enzimas
36
Insulina, mTOR y síntesis de proteínas
Insulina, mTOR y síntesis de proteínas
Insulina
PKB
Insulina promueve el
crecimiento celular
estimulación
raptor/rictor:
Especificidad de sustratos
mTOR
GL raptor
GL rictor
actividad
quinasa
p70 S6K
Otras
acciones
mTOR
PP
P
4E-BP
P
P
4E-BP
eEF2-K
eIF-4E
X
eEF2
Desfosfo-eEF2 activo
 elongación de
proteínas
2010 Enrique Castro
P P P
rpS6
Subunidad
40S
 Traducción 5'TOP mRNAs
Biogénesis de ribosomas
eIF-4E
eIF-4A
PAB
eIF-4G
eIF-4E
P
Mnk1
mRNA
ERKs
 Complejo de iniciación (eIF3/mRNA)
Ensamblaje de ribosoma funcional
 Traducción de 5'cap-mRNAs
(genes estructurales: proteínas )
37