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Regulación de la transcripción en
eucariontes.
El control génico en eucarióticos
• En organismos multicelulares su propósito es
la ejecución de decisiones evolutivas precisas
– Los genes convenientes se expresan en células
adecuadas durante el desarrollo y la
diferenciación.
• Es el medio principal para regular la
expresión génica en eucariontes.
• Los elementos de control se encuentran a
varias kilobases del sito de inicio de
transcripción.
El control génico en eucarióticos
• Poseen tres tipos de RNA polimerasas.
• Tiene subunidades grandes que tienen homología
con b y b´y pequeñas que tiene homología con la a
de la RNA pol de bacterias.
• Presentan otras subunidades pequeñas.
• La RNA pol I sintetiza pre-RNA ribosomal
• La RNA pol II sintetiza mensajeros, RNA pequeños
nucleares
• La RNA pol III sintetiza RNAr 5S, tRNA y RNAs
estables y cortos.
• RNA
polimerasas
Subunidad L´ de Pol II
• Contiene un extremo carboxilo terminal que
es una repetición de la secuencia
Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
• Conocido como el dominio carboxiterminal o CTD.
• Levaduras contiene 26 repeticiones o más,
mamíferos 52 repeticiones otros eucariontes
intermedia.
CTD
• Se fosforila durante la iniciación de la
transcripción
• Permanece fosforilada durante la
transcripción.
Foto fosforilación de CTD
•
•
Polimerasa
no
fosforilada
verde
Polimerasa
fosforilada
roja
• Núcleos aislados se
incuban con 32P-NTP
(periodo corto).
• Se marcan entre 300-500
nucleótidos del RNA
naciente.
• Hibridizando el RNA
marcado con el DNA
clonado para un gen
específico, se puede saber
cual es la fracción de
transcripción de un gen.
Identificación de RNA
polimerasas de eucariontes
• Cromat
ografía
en
DEAE
sefadex
.
Inicio de transcripción.
• La RNA pol II suele iniciar la transcripción
en un par de bases específicos o alternativos
cercanos a una plantilla.
• El nucleótido 5´que tienen el capuchón en
un mRNA es el nucleótido en dónde inición
la transcripción.
Iniciador en vez de caja TATA
• Algunos genes no
presentan caja TATA.
• Presentan una
secuencia
relativamente
degenerada con A en
+1, Y es una
pirimidina, N es
cualquier base.
5’Y-Y-A+1-NT/A-Y-Y-Y(3’)
Hay genes que no presentan ni
caja TATA ni Iniciador
• Se presenta en genes de mantenimiento
(housekeeping).
• Es una región de 20 a 200 pares de base
• Da origen a mensajeros con extremos 5´ múltiples.
• Son genes que generalmente se transcriben a bajas
tasas.
• Presentan un segmento de 20 a 50 pb rico en GC
• Este sitio es reconocido por un factor de
transcripción llamado SP1
Islas CpG
• Las secuencias ricas en CG son pocas en el
genoma eucariótico
• Estas regiones justo antes de un gen presentan una
distribución no al azar.
• Pueden ser identificadas por su susceptibilidad a la
enzima de restricción HpaII.
• La presencia de islas CpG sugiere una zona de
iniciación de transcripción.
El enhancer del SV40
• Estimula la transcripción de proteínas virales en la
infección.
• Estimula la transcripción de todos los genes
eucariontes en que se ha probado.
• Funciona en cualquier orientación
• Funciona hasta a miles de pares de bases de sitio
de iniciación
• Está compuesto de muchos elementos individuales
que contribuyen individualmente a la actividad.
Características de los enhancers
• Se han encontrado a más de 50 kilobases del
promotor que controlan.
• Pueden estar río arriba del promotor, río abajo del
promotor, dentro de un intrón o de un exón o hasta
después del último exón.
• Algunos son específicos de un tipo celular.
– En los genes de las inmunoglobulinas en los linfocitos
B, hay un enhancer dentro del segundo intrón pero
funciona solo en linfos B.
Elementos de control cercanos y
lejanos
• Se creía que eran diferentes
• Se pueden invertir su colocación y siguen
estimulando la transcripción.
• Son célula específico
• Ahora se piensa que son un espectro de
elementos de control que regulan la
transcripción.
Resumen
• La expresión de los genes que codifican para
proteínas en eucariontes están regulado por
múltiples regiones de control que actúan en cis.
• Algunos de estos elementos de control son
cercanos al sitio de inicio y otros lejanos.
• Los promotores determinan el sitio de inicio de
transcripción y dirigen la unión de la RNA
polimentasa II.
Resumen
• Se han identificado tres tipos de
secuencias promotoras en eucariontes.
– Caja TATA
– Promotores diferentes poco frecuentes
– Islas CpG
Los elementos proximales
• Están dentro de los ≈200 pares de bases.
Contiene hasta 20 pares de bases cada uno.
•
Los enhancers,
• Usualmente contienen entre 100 y 200 pb
de longitud. Tienen elementos de control
individuales de 8 a 20 pb.
• Se localizan a más de 200 y hasta decenas
de kilobases río arriba o abajo del promotor.
• Puede estar dentro de un intron o más lejos
del último exón del gen.
Aislamiento bioquímico de los
factores de transcripción
• Una vez que el elemento regulatorio se ha
identificado por análisis mutacional,
• Se puede:
– Identificar a la proteína cognada que se une
específicamente a ella.
• En esta técnica, un extracto del núcleo se pasa por
varias cromatografías y se realiza un footprinting
con Dnasa tipo I o un ensayo de cambio en la
movilidad electroforética (EMSA)
• Las fracciones que contienen proteínas que se
unen a elementos regulatorios probablemente
contienen factores putativos de transcripción.
• La técnica más poderosa para purificar factores de
transcripción es la cromatografía de afinidad en
dónde se inmovilizan las secuencias de los
elementos regulatorios a un soporte.
• Si la transcripción del
gen reportero es
mayor en presencia de
l plásmido que
codifica para la
proteína X, esta es un
activador. Si es menor,
X es un represor.
Clasificación de los dominios de
unión al DNA
• Proteínas con:
–
–
–
–
–
Homeodominio
Proteínas con dedos de zinc
Hélice alada (en lengüeta de flecha)
Con cremallera o zipper de leucina
Con hélice-bucle-hélice
Homeodominio
• Proteína de Engrailed de Drosophila
• Nombre de genes homeóticos (produce la
transformación de una parte del cuerpo en
otro en el desarrollo.
• Región de 60 residuos de aa muy conservada
Proteínas con dedos de zinc
• Dominio estructurado con un ion Zn2+ en el
centro de un plegamiento de residuos de aa.
• Secuencia consenso
Tyr/Phe-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe/Tyr-X5-Leu-X2-His-X3-4-His
• La forma de dedo se ve en un diagrama
bidimensional
• El zinc se fija entre las 2 Cys y la 2 His.
• Se le llama dedo C2H2
Proteínas con dedos de zinc
• El alfa-hélice que se forma es muy compacto
• Se inserta en el surco mayor del DNA
• Otro tipo de dedos de zinc C4 se encuentra en
otros factores de trascripción (receptores a
esteroides-nucleares)
• Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys-X14-15-Cys-X5-CysX9-Cys-X2-Cys
Proteínas con dedos de zinc
• Los dominios C2H2 y C4 son estructuralmente
distintos.
• Los C2H2 tienen tres dedos repetitivos o más y se
fijan como monómeros.
• Los C4 tienen en general dos dedos y se fijan
como homodímeros o heterodímeros.
• Con simetría rotacional doble (fig. siguiente b)
Dedos de zinc C2H2 (a)y C4(b)
Proteína GL1
Receptor a glucocorticoides
Interacción
entre Gal4 y el
DNA
• Proteína con dedos de
zinc C6 .
• Es un homodímero
que se forma por una
hélice enrollada .
Proteínas con hélice alada
• Dominios de fijación de la histona H5
• Se unen al DNA como monómeros
• Pueden unirse al DNA Z.
Estructura cristalina del dominio de unión al
DNA Z de la proteína Dlm-1 unida al DNA.
Cremallera o zipper de leucina
• Hay un residuo de leucina cada 7 aminoácidos en
la región C terminal del dominio de unión.
• Se unen al DNA en forma de dímeros, la leucina
es necesaria para la dimerización.
• Presenta dos a-hélices extendidas que agarran al
DNA como pinzas en dos surcos mayores en la
región N terminal.
• Pueden ser homodímeros o heterodímeros.
Interacción de Gnc4 con el DNA
Hélice bucle hélice
• Un bucle no helicoidal de la cadena
polipeptídica separa dos regiones ahelicoidales.
• Tienen aminoácidos básicos para aumentar
la interacción con el DNA.
Interacción de un dominio hélicebucle-hélice con el DNA
Los factores de transcripción heterodiméricos
aumentan las opciones de control génico.
• Cada monómero tiene un dominio de
fijación al DNA con especificidad de
secuencia equivalente.
• No influye en la unión al DNA.
• Permite que los dominios de activación
asociados con cada monómero se reúnan
para formar un solo factor de transcripción.
Dominios de activación
• Secuencia polipeptídica que activa la transcripción
cuando está fusionada a un dominio de fijación del
DNA
• Muchos dominios pueden activar la transcripción.
• Casi el 1% de las proteínas de fusión resultantes
(Gal4 y segmento al azar) activaron la
transcripción de un gen con UASgal en 5´.