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17/07/2012
TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
CURSO DE BIOTECNOLOGÍA ELEMENTAL
“Biotechnology Explorer”
Julio 2012
Qué es un gen
y
g
Técnicas de aislamiento y estudio de los genes
La PCR como técnica alternativa
Aplicaciones adicionales de la PCR
La nueva generación de la Genómica
PCR
Punto de No Retorno de la Biología
g Molecular
Ricardo Ramos Ruiz
Unidad de Genómica, Cantoblanco
Parque Científico de Madrid
BIOTECNOLOGÍA BASADA EN LAS TÉCNICAS DE LA
TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Qué es un gen
y
g
Técnicas de aislamiento y estudio de los genes
La PCR como técnica alternativa
Aplicaciones adicionales de la PCR
La nueva generación de la Genómica
BIOLOGÍA MOLECULAR
Genoma
DESCODIFICADA
CODIFICADA
P
Proteína:
í función
f ió celular
l l
UNIDAD GENÉTICA: UN GEN (UN GEN - - - UNA FUNCIÓN)
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GENOMICS
las tres funciones esenciales de los ácidos nucleicos
Finalidad:
<<The study of genes and their function>>
1. REPLICACIÓN
PERPETUACIÓN
DNA paterno
DNA hijo
2. TRANSCRIPCIÓN
EXPRESIÓN GÉNICA
3. TRADUCCIÓN
Ó
DNA GENÓMICO
Cells organize their genetic material in genes
that can be investigated at the molecular level
proteína
RNA intermediario
transcripción
traducción
ESTRUCTURA DEL DNA:
Bases nitrogenadas
A number of 20,000 genes is estimated in humans
Most cells are supposed to actively express some thousands
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DNA: Enlaces de hidrógeno
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
DNA: Enlaces de hidrógeno
G
C
C
G
A
T
T
A
DNA: Doble hélice
LA ESTRUCTURA DETERMINA LA FUNCIÓN
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
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LA HIBRIDACIÓN / DESNATURALIZACIÓN ES UN PRCESO REVERSIBLE
Factores que afectan
la eficacia de hibridación:
• Longitud de bases (tramo que se aparea)
• Temperatura
• Presencia de mismatches
• Porcentaje de G
G-C
C
Especificidad /
Efi
Eficacia
i
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
CARACTERIZACIÓN DE UN GEN
TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Qué es un gen
g
Cómo describimos un gen
Técnicas de aislamiento y estudio de los genes
La PCR como técnica alternativa
Aplicaciones adicionales de la PCR
La nueva generación de la Genómica
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
LOCALIZACIÓN DENTRO DEL GENOMA
DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA
CONOCIMIENTO DE LOS ELEMENTOS REGULADORES
PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA
GENES REGULADORES, GENES ASOCIADOS, GENES RELACIONADOS
VARIANTES PRESENTES EN LA POBLACIÓN
VARIANTES ASOCIADAS A ENFERMEDAD
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CÓMO SE CARACTERIZA UN GEN
AISAMIENTO DEL RESTO DEL GENOMA
PURIFICACIÓN
PERPETUACIÓN (COPIAR,
(COPIAR CRECER,
CRECER MANTENER)
CÓMO SE “AISLA” UN GEN
RECORTAR NUCLEÓTIDOS

PURIFICAR
PERPETUAR (COPIAR, CRECER, MANTENER)


GENOMA HUMANO: 3x 10 9
GEN ((DNA):
) ~ 10 5
GEN (RNA): ~ 10 3
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
(endonucleasas)
ORIGEN BIOLÓGICO DE LAS
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
46 = 4096
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA CON DNA EXÓGENO
PROMEDIO DE APARICIÓN DE UNA SECUENCIA CUALQUIERA
DE HEXANUCLEÓTIDOS
procedente de otra bacteria
o de un origen distinto
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MAPAS DE RESTRICCIÓN
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DEFIENDEN
A LAS BACTERIAS DE UN “ATAQUE” EXCESIVO
DE DNA EXÓGENO
=
CÓMO SE CARACTERIZA UN GEN


AISAMIENTO DEL RESTO DEL GENOMA
PURIFICACIÓN

PERPETUACIÓN (COPIAR
(COPIAR, CRECER,
CRECER MANTENER)
…
LOS DOS COMPONENTES DEL CLONAJE
Fragmentos (específicos)
Vector (No específico)
PLÁSMIDOS
OBTENCIÓN DE UN CLON (UNA COLONIA) DE BACTERIAS
“TRANSFORMADAS” (HAN INTEGRADO) DNA EXÓGENO
( RECOMBINANTES )
(“RECOMBINANTES”)
OTROS VECTORES: virus, YACs…
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SELECCIÓN DE UN CLON RECOMBINANTE
MEDIANTE HIBRIDACIÓN
COLONIA POSITIVAS :
Crecen en Amp
Blancas en X-Gal
Positivas para una sonda específica
Selección de clones positivos
CARACTERÍSTICAS DEL CLONAJE
DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN
TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Algunos resultados
ESTABLE
DNA VIAJA DENTRO DE
OTRO DNA
AUTOPERPETUACIÓN
REQUIERE PURIFICACIÓN
MATERIAL BIOLÓGICO
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Qué es un gen
g
Cómo describimos un gen
Técnicas de aislamiento y estudio de los genes
La PCR como técnica alternativa
Aplicaciones adicionales de la PCR
La nueva generación de la Genómica
UNA ALTERNATIVA AL CLONAJE
DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN
PCR
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LA PCR
ES UNA COPIA DEL MECANISMO NATURAL
DE REPLICACIÓN
(POLIMERIZACIÓN DE NUCLEÓTIDOS COPIANDO UN MOLDE)
Semiconservativa: cada cadena sirve de molde
La incorporación se basa en la complementariedad de bases
Elongación a partir de un cebador
Síntesis en condiciones de fidelidad (reparación de errores)
Baja especificidad (nulo efecto de secuencia ni organismo)
enzima (catalizador): polimerasa termoestable
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¿Cómo funciona la PCR?
OLIGOS, PRIMERS, CEBADORES
cada producto es molde de la siguiente reacción
MÁXIMA SENSIBILIDAD
DIDEOXINUCLEOTIDOS
COMPARACIÓN PCR - CLONAJE
ESTABLE
DNA VIAJA DENTRO DE
OTRO DNA:
AUTOPERPETUACIÓN
REQUIERE PURIFICACIÓN
MATERIAL BIOLÓGICO
NO REQUIERE
PURIFICACIÓN
NO SE AUTOPERPETÚA
SENSIBILIDAD
EXCEPCIONAL
SUJETO A ERRORES DE
COPIA
REACCIÓN IN VITRO
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LA PCR RESUELVE EL PROBLEMA DE ENCONTRAR UNA AGUJA EN UN PAJAR:
MILES DE MILLONES DE AGUJAS SE LOCALIZAN CON FACILIDAD
PRINCIPALES APLICACIONES
Técnicas preparativas:
Clonaje de fragmentos reacciones de secuenciación
Clonaje de fragmentos, reacciones de secuenciación
Técnicas analíticas:
Detección de patógenos
Colonias positivas en un clonaje
Cuantificación génica
VENTAJAS
Amplificación hasta millones de veces:
productociclo n= sustratociclo n+1
Sensibilidad
S
ibilid d desde 1 copia
Automatización por cambios de temperatura
enzimas termoestables
Sencillez: componentes: buffer, primers molde, dNTPs
Modificable por: composición de primers, aditivos del buffer,
ppolimerasa,, temperatura
p
REQUISITOS PREVIOS
Conocimiento previo de secuencia LIMITADO
HOMOLOGÍA con otras especies
Estandarización componentes controlados
Adaptable a múltiples necesidades (hot start, XL-PCR
nucleótidos modificados...)
INCONVENIENTES
Introducción de errores que quedan fijados
productociclo n= sustratociclo n+1
S ibilid d desde 1 copia, también detecta contaminantes
Sensibilidad
Limitaciones inherentes a la reacción de polimerización
longitud, agotamiento, reparación de errores
Sistema in vitro No es ilimitada
TÉCNICAS AVANZADAS
BASADAS EN PCR
BASADAS EN PCR
… a pesar de los cuales se ha transformado en la técnica de elección
para clonar fragmentos, detectar variantes, buscar positivos …
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96-replicate - Real Time
PCR experiment
PCR a tiempo real
Reacción exponencial
END
POINT
1.6
Finalización:
Agotamiento de reactivos (oligos,dNTPs)
Inhibición por producto
Competición de los productos amplificados
con los primers
Normalized R
Reporter signal
1.4
+
1.2
1
+/-
0.8
06
0.6
-
PCR-Q
0.4
+
0.2
0
10
20
30
40
Number of cycles
SEQUENCING: Revealing the primary structure of DNA
Sanger sequencing on ≈ 1,000 base pairs
… C G T G T [A/G] T C C C T …
Perfiles de expresión asociados
a procesos biológicos
patient #28
[G/G]
patient #21
[A/G]
patient #202
[A/A]
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MÚLTIPLES APLICACIONES DE SECUENCIACIÓN:
SE DEFINE REGIÓN DE INTERÉS PERO NO SE RESTRINGE SU LOCALIZACIÓN
Identify contaminant bacteria or fungi
La nueva Generación de la genómica
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Qué es un gen
g
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Técnicas de aislamiento y estudio de los genes
La PCR como técnica alternativa
Aplicaciones adicionales de la PCR
La nueva generación de la Genómica
PREPARACIÓN DE GENOTECAS
SIN ETAPA DE CLONAJE EN BACTERIAS
NGS or MASIVE PARALLEL SEQUENCING
consists in ultra‐high throughput sequencing of whole genomes
Based on PCR‐amplification
Demanding high capacities in
DNA or cDNA library preps
Enrichment
Computing
Offering:
No previous knowlwdge
No matter how complex
> 1 Gb per day
> 1 Gb per day
Binding to primer‐specific beads
or to primer‐bound surfaces
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RESULTADO:
LECTURA DE ALTÍSIMA PRODUCTIVIDAD
(HASTA 4 Gb al DÍA)
DOS EJEMPLOS
CANCER ATLAS
READ ASSEMBLY
1.000 GENOMES
MEDICINA PERSONALIZADA
GENOME SEQUENCING
¡Gracias por vuestra atención!
Clinical application:
Acceso al genoma individual al alcance de la mano
= LA VERDADERA MEDICINA PERSONALIZADA
www.fpcm.es
[email protected]
[email protected]
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