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tema libre
No. 206
e STUDIO DE LA FORMACIÓN DE
INTRODUCCIÓN
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RAÍCES LATERALES BAJO CONDICIONES
DE CARENCIA DE FÓSFORO ε↵
Figura 1. Funciones de la raíz y factores ambientales
que afectan su desarrollo
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Las plantas como organismos autótrofos son
los principales productores primarios de los
ecosistemas, las cuales requieren de un nivel adecuado de nutrientes minerales para
su óptimo crecimiento y desarrollo. Los nutrientes son obtenidos principalmente de las
partículas del suelo (capa superficial de la
corteza terrestre, biológicamente activa) la
materia orgánica, los fertilizantes minerales y las aguas subterráneas a través de
la raíz, que es el órgano que permite la
absorción del agua y los nutrimentos, da
soporte estructural, y ancla la planta al sustrato, además de participar en las interacciones con el ambiente biótico del suelo.
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Desafortunadamente, la baja fertilidad
del suelo es un factor crítico que limita el
rendimiento de la mayoría de las tierras cultivadas,
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ε↵ Dra. Claudia Anahí Pérez Torres: Realiza una estancia posdoctoral en
el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO)
en el CINVESTAV Unidad Irapuato. Egresada del Instituto Tecnológico de
Celaya (Ingeniería Bioquímica) con Maestría y Doctorado en Ciencias (Biotecnología de plantas) del CINVESTAV Unidad Irapuato. Premio Agrobio
México 2009 en la categoría de Tesis de Doctorado.
Dirección electrónica: [email protected]
Dr. Luis R. Herrera Estrella: Profesor titular y encargado de la dirección
del Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO), en el CINVESTAV Unidad Irapuato. Ingeniería Bioquímica por la
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional
con Maestría en Ciencias por el Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados del IPN y Doctorado en ciencias por la Universidad Estatal
de Gante en Bélgica (Departamento de Genética). Es investigador de
excelencia del Sistema Nacional de Investigadores (Nivel 3). Pionero
en el desarrollo de marcadores de selección y de genes reporteros en
plantas y fundador del LANGEBIO, el laboratorio de genómica más importante en América Latina. Becario Internacional del Instituto Médico
Howard Hughes desde 1992 a la fecha y miembro extranjero de la
Academia Nacional de Ciencias de los EE.UU., y de la Academia Latino
Americana de Ciencias.
Dirección electrónica: [email protected]
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afectando el desarrollo de la agricultura. Durante décadas, diferentes esfuerzos se han llevado a cabo con
la finalidad de mejorar la fertilidad del suelo, siendo
el más común el uso de fertilizantes. Sin embargo, los
cultivos usualmente utilizan menos del 50 por ciento
del fertilizante aplicado y el resto de los minerales
pueden filtrarse en las aguas superficiales o subterráneas y contribuir de esta manera a la contaminación
ambiental. Las adversas repercusiones ambientales y
económicas que esto conlleva, revelan la importancia
de mejorar la eficiencia de las plantas para capturar
los nutrientes minerales del suelo (1).
La arquitectura del sistema radicular está regulada
genéticamente y es altamente plástica, es decir, puede variar en respuesta a diversos factores ambientales. Por lo que esta plasticidad ha sido considerada
como una capacidad esencial de las plantas que facilita su adaptación a los factores físicos, químicos y
biológicos en el medio ambiente (Figura 1).
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Uno de los nutrientes que limita con mayor frecuencia
el rendimiento de los cultivos es el fósforo (P). Éste,
además de ser un elemento esencial, actúa como señal modificando la fisiología y el desarrollo de las
plantas (2,3). El fósforo es un componente estructural
de numerosas macromoléculas, incluyendo ácidos nucleícos y fosfolípidos. Además, el P juega un papel
esencial en varios procesos importantes como la transferencia de energía, la fotosíntesis, la glicólisis, la respiración, la síntesis de las membranas, la regulación
enzimática, las reacciones redox, el metabolismo de
carbohidratos y la fijación de nitrógeno (4).
Figura 2. Mecanismos adaptativos desarrollados
por las plantas en respuesta a la baja
disponibilidad de fósforo
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Los nutrientes en el suelo tales como el nitrato, el fosfato y el fierro, actúan como señales que pueden ser
percibidas por las plantas, las cuales activan mecanismos moleculares que modifican los procesos de
división y diferenciación celular dentro de la raíz,
y tienen un gran impacto en la arquitectura del sistema radicular. Importantes procesos de desarrollo
tales como la formación de pelos radiculares, el crecimiento de la raíz primaria y la formación de las
raíces laterales (RL) son particularmente sensibles a
cambios en la concentración interna y externa de
nutrientes (1).
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La principal forma asimilable del fósforo por las plantas es el ión ortofosfato (Pi), que en el suelo tiende
fácilmente a precipitarse en formas insolubles que la
planta no puede absorber, por lo que su disponibilidad está reducida en la mayoría de los suelos del
mundo. Dependiendo de las características del suelo, tales como el pH, la abundancia de cationes y la
materia orgánica, el Pi es convertido por microorganismos en moléculas orgánicas, como el ácido fítico
o en sales minerales de aluminio y hierro que no son
fácilmente asimilados por la planta (4). Por lo anterior, se ha propuesto que más del 80 por ciento del P
en el suelo no está disponible para ser asimilado por
las plantas (5) ocasionando bajos rendimientos en la
agricultura a nivel mundial.
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Para poder sobrevivir en condiciones de baja disponibilidad de fósforo en el suelo, las plantas han
desarrollado mecanismos altamente especializados
que les permiten incrementar su disponibilidad y potenciar su adquisición (Figura 2), entre ellas: a) la
liberación y captación de Pi de fuentes orgánicas e
inorgánicas externas (6); b) la optimización del uso
de Pi mediante un amplio rango de alteraciones metabólicas y la movilización del Pi interno dentro de
la célula (7); c) el establecimiento de relaciones simbióticas con hongos micorrícicos arbusculares, ya que
el micelio del hongo provee una superficie adicional
de absorción, lo que ayuda a incrementar la adquisición de Pi, y d) un incremento en la capacidad
exploratoria de la raíz y el área de absorción del
suelo mediante la alteración de la arquitectura del
sistema radicular permitiendo a la planta explorar
extensas áreas del suelo para hacer de esta manera
más eficiente la toma de fósforo (8,9).
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o reguladores de crecimiento vegetal que participan
en una amplia variedad de procesos fisiológicos y del
desarrollo. Sin embargo, no estaba claro como estas
hormonas podrían regular dicha respuesta.
Estudios previos mostraron que plantas crecidas en
condiciones óptimas de fósforo (P+), tratamientos
con auxinas provocan un efecto muy similar al que
ocasiona la deficiencia de fósforo (P-). Además, las
raíces de plantas crecidas en condiciones limitantes
de fósforo son más sensibles a auxinas porque incrementan la formación de raíces laterales a concentraciones más bajas de auxinas que las raíces de
plantas crecidas en condiciones óptimas de fósforo
(9). Esto sugirió que los cambios en la arquitectura
radicular inducidos por la deficiencia de fósforo estaban íntimamente relacionados con los mecanismos de
percepción y activación de respuestas a las auxinas
y probablemente con un cambio en la sensibilidad a
auxinas en las células de la raíz (9).
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A la fecha se han utilizado diferentes especies vegetales para estudiar el efecto de la disponibilidad de
fosfato sobre la arquitectura radicular, tales como el
lupino, el frijol, el maíz, el arroz y la soya. Sin embargo, estas plantas tienen la desventaja de sus largos
ciclos de vida y la dificultad de establecer en ellas
los protocolos para el análisis de los mecanismos que
participan en esta respuesta. Por esta razón, Arabidopsis thaliana se ha considerado un modelo atractivo
para el análisis de la respuesta de la raíz a la disponibilidad de fosfato. Arabidopsis thaliana es una de
las plantas más utilizada por los científicos con la que
se han hecho miles de investigaciones, se reproduce
en sólo 6 semanas, se conoce la secuencia de todos
sus genes y existen mutantes para casi la totalidad de
sus genes. Además, la raíz de Arabidopsis es una de
las más simples y su reducido tamaño y composición
celular la han hecho un sistema ideal para el estudio
de la morfogénesis y del funcionamiento de la raíz en
general (Figura 3).
Por esta razón nos planteamos estudiar los mecanismos que determinan los cambios en la sensibilidad
de auxinas que modulan la proliferación celular y
el aumento en la formación de raíces laterales en
respuesta a la disponibilidad de fósforo.
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Figura 3. Arabidopsis thaliana como modelo de
estudio y su efecto de la disponibilidad de
fósforo sobre su arquitectura radicular
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En Arabidopsis, la deficiencia de fósforo altera el crecimiento de la raíz primaria, así como la formación y
elongación de las raíces laterales y de los pelos radiculares como podemos observar el la figura 3. Se ha
sugerido que este aumento en la formación y emergencia de las raíces laterales en Arabidopsis, está íntimamente relacionado con las auxinas; que son hormonas
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RESULTADOS
Efecto de la disponibilidad de fósforo en la
formación de raíces laterales
Primero analizamos en detalle la formación de primordios de raíces laterales (PRL) y raíces laterales
emergidas (RL) en respuesta a la carencia de fósforo. Plantas de Arabidopsis que crecieron en condiciones óptimas (1 mM) y limitantes (10 µM) de fósforo
(Pi) encontrando que durante las primeras etapas de
desarrollo de la planta, hay tanto una mayor formación como un mayor desarrollo de los primordios
de raíces laterales en condiciones de carencia de
fósforo (P-)(10).
Esto se pudo observar claramente con ayuda de la
línea transgénica CyCB1;1:GUS, la cual nos permite visualizar la actividad del ciclo celular mediante
la tinción en color azul en el tejido de la planta de
aquellas células que se encuentran en división continua, observando mayor actividad en las plantas
creciendo en condiciones de carencia de fósforo (P-)
como podemos ver en la figura 4.
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TABLA 1. EFECTO DE LA DISPONIBILIDAD DE FÓSFORO
EN EL CONTENIDO DE IAA LIBRE EN PLANTAS
DE ARABIDOPSIS
pg IAA libre mg -1 peso fresco
P+
P-
Follaje
28.89 ± 1.37
28.22 ± 3.06
Raíz
23.96 ± 3.22
22.63 ± 2.5
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Figura 4. Formación de RL en plantas de 4 días
después de la germinación crecidas en condiciones contrastantes de fósforo. Plantas de
CyCB1;1:GUS fueron geminadas en medios P+ y
P- y procesadas para tinción histoquímica de GUS
para revelar la ubicación de los PRL, las flechas
negras muestran los PRL en desarrollo y las
rojas las raíces laterales emergidas
Plantas silvestres se crecieron por 6 ddg en medios P+ y P-, se separó la raíz de
la parte aérea y se cuantificó el contenido de IAA libre. Los valores representan el promedio ±SE de tres experimentos independientes (n = 1000).
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Estos resultados demostraron que los cambios en la
formación de RL observados bajo condiciones limitantes de fósforo no se deben a una mayor acumulación
de auxinas libres, lo que sugiere que el incremento
en formación y emergencia de RL puede deberse a
un cambio en la sensibilidad a auxinas en las raíces
de plantas crecidas bajo estas condiciones. Para descartar que los cambios en la formación de RL pudieran deberse a alteraciones en el transporte polar de
auxinas, utilizamos un inhibidor del transporte polar
de las auxinas conocido como NPA.
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Con ayuda de este inhibidor y a altas concentraciones de auxinas exógenas adicionadas al medio encontramos que hay una mayor proliferación celular y
formación de PRL a lo largo de la raíz en condiciones
limitantes de fósforo (Figura 5), y esta proliferación
se localiza en el cilindro central de la raíz incluyendo
al periciclo, que es el tejido en donde comienza la
formación de PRL, lo que nos sugirió fuertemente que
las células del periciclo en plantas crecidas en condiciones limitantes de Pi son más sensibles a las auxinas
acelerando la formación de PRL progresando en su
desarrollo hacia RL maduras.
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Estos resultados muestran que la deficiencia de Pi
acelera la formación de PRL y la emergencia de
RL, comenzando a etapas tempranas del desarrollo
de la planta. Se ha demostrado que la formación
y emergencia de RL son procesos independientes
y que ambos requieren de la participación de las
auxinas (11). Para determinar si la disponibilidad
de Pi afectaba la formación de RL mediante la alteración en la acumulación de auxinas en la raíz, se
cuantificó la concentración de IAA en la parte aérea
y en la raíz de Arabidopsis en condiciones de alto y
bajo fósforo.
Se observó que las plantas crecidas en condiciones limitantes de fósforo ( P-) tenían tanto en la raíz como
en la parte aérea, concentraciones similares de auxinas a las observadas en plantas crecidas en condiciones óptimas de fósforo (P+) (Tabla 1).
El complejo SCFTIR1 de la ruta de señalización de
auxinas está involucrado en la respuesta de las
RL a la carencia de fósforo
Pero, ¿cuál es la razón por la que las plantas en condiciones limitantes de Pi presentan una mayor sensibilidad a las auxinas?
Las auxinas regulan diversos aspectos del crecimiento y desarrollo de la planta promoviendo la degradación de represores transcripcionales denominados
proteínas AUX/IAA mediante la acción del complejo
de la ubiquitina ligasa SCFTIR1.
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de TIR1 se mostró incrementada en plantas crecidas
en condiciones limitantes de fósforo, particularmente
en el periciclo de la raíz primaria antes del incremento en la formación de RL (Figura 7). Estos resultados
sugieren que la expresión de TIR1 incrementada en
plantas expuestas a la carencia de fósforo incrementa a su vez la capacidad de las raíces para iniciar la
formación de RL (10).
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Figura 5. Efecto de la inhibición del transporte
de auxinas en el desarrollo de RL en plantas
de Arabidopsis
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Figura 6. Efectos de la mutación y la
sobreexpresión de TIR1 en la formación de RL
en respuesta a la carencia de fósforo
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Una vez que se determinó que ni la síntesis, ni el transporte polar de auxinas eran los responsables de este
aumento en la sensibilidad a las auxinas en condiciones limitantes de fósforo, restaba analizar la posibilidad de que esto podría deberse a una expresión
alterada de algunos de los genes relacionados con la
percepción de auxinas o a la activación de genes río
abajo de la ruta de señalización. Dado que el receptor de auxinas TIR1 juega un papel importante en la
percepción y ruta de señalización de auxinas (12), fue
factible hipotetizar que TIR1 podría estar involucrado
en la modulación de la arquitectura radicular de Arabidopsis en respuesta a la disponibilidad de fósforo.
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Los resultados mostraron que en la mutante de TIR1,
el incremento en la formación de RL en respuesta a
la carencia de fósforo está notablemente disminuido
(Figura 6); esto sugiere que este proceso requiere de
una proteína TIR1 funcional. Aunado a esto, un hallazgo importante de este trabajo fue que la expresión
La sobreexpresión de TIR1 presenta un fenotipo
similar al observado en plantas crecidas en condiciones limitantes de fósforo
Para determinar si un incremento en la expresión de
TIR1 en respuesta a la carencia de fósforo altera la
formación de RL, se realizó la construcción de una línea transgénica de Arabidopsis que sobreexpresa
TIR1 bajo el control del promotor 35S(10).
Observamos que en plantas crecidas en condiciones
óptimas de fósforo la línea sobreexpresante de TIR1
mostró una reducción en el crecimiento de la raíz pri-
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ñalización de auxinas que permite la formación de RL
y provee evidencia completa de que los cambios en
la expresión de TIR1 en respuesta a factores ambientales alteran la sensibilidad a auxinas en las células
del periciclo, lo cual da como resultado cambios en el
programa de desarrollo post-embrionario del sistema
radicular de Arabidopsis.
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Figura 7. Efecto de la disponibilidad de fósforo
en el patrón de expresión de TIR1. En la
fotografía se muestra la expresión de GUS en el
periciclo (tejido de la raíz en donde
comienza la formación de raíces laterales),
donde Ep(Epidermis), Cx(Córtex),
En(Endodermis) y Pc(Periciclo)
Evidencia reciente muestra que las primeras células
del periciclo en el meristemo basal de la raíz primaria, son las responsables de la iniciación de las RL
(13). Nosotros observamos que el incremento en la
expresión de TIR1 se presenta principalmente en la
parte basal de la raíz (Figura 7), sugiriendo que las
células del periciclo podrían estar activándose en alto
grado en esta zona bajo condiciones limitantes de Pi.
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Nuestros resultados muestran que la deficiencia de
fósforo induce un incremento en la formación de PRL y
la emergencia de las RL, potenciando la expresión de
TIR1 en las células del periciclo. Por lo tanto también
se analizó si este incremento en la expresión de TIR1
provoca un cambio en la degradación de proteínas
AUX/IAA en plantas crecidas en carencia de fósforo, para esto se uso la línea transgénica HS:AXR3NTGUS, la cual contiene los dominios I y II de la proteína
AXR3 fusionados a GUS, bajo el control de un promotor de choque térmico de soya (HS) de manera que se
ha usado ampliamente para estudiar la degradación
de proteínas AUX/IAA moduladas por el proteosoma.
En esta línea, esta proteína sólo se produce durante
tratamientos por choque térmico, por lo que su degradación puede ser monitoreada cuando las plantas se
regresan a temperatura ambiente (14). Se observó
que la proteína AXR3 a los 60 min después del choque térmico es degradada más rápidamente en plantas crecidas en medios P- comparado con P+(Figura
8) confirmando la hipótesis que la carencia de fósforo
modula la sensibilidad a auxinas alterando la degradación de las proteínas AUX/IAA.
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maria y un 75 por ciento de incremento en el número
de RL cuando la comparamos con las plantas control
(Figura 6). En comparación con plantas control crecidas
en condiciones limitantes de fósforo (P-), las plantas
sobreexpresantes mostraron un pequeño incremento
aunque no significativo en el número de RL (Figura 6).
Estos resultados muestran que TIR1 es en efecto un
factor limitante que determina la sensibilidad a auxinas y la formación de RL, y que pequeños cambios
en el nivel de transcripción de este gen puede tener
profundos efectos en el desarrollo de la raíz.
El aumento en la expresión de TIR1 en plantas crecidas
en condiciones limitantes de fósforo en conjunto con los
resultados obtenidos de las líneas sobreexpresantes,
las cuales son incapaces de incrementar la formación
de RL en respuesta a la carencia de fósforo, muestran
que TIR1 es un componente limitante de la ruta de se-
Aunado a esto también encontramos que el factor de
transcripción ARF19 se requiere para incrementar la
formación de RL en respuesta a la disponibilidad de
fósforo, ya que la mutante arf19 no mostró un cambio
estadísticamente significativo en la formación de RL en
las plantas crecidas en medios P- (Figura 8). Basándonos en los resultados obtenidos en este trabajo (10)
nosotros proponemos un modelo para el incremento
en la formación de RL en el cual postula que una incrementada expresión de TIR1 en las células del pe-
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Figura 8. Participación de las proteínas AUX/IAA y ARF de la ruta de percepción y señalización
de auxinas, en la respuesta a la carencia de fósforo
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20
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Número de raíces laterales
25
15
10
5
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Control
16 horas luz - 8 h oscuridad y temperatura 22ºC. Las
placas se colocaron verticalmente en un ángulo de 65º
lo que permitió el crecimiento de la raíz sobre la superficie del agar y el crecimiento del hipocotilo en el aire.
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riciclo permite una rápida degradación de los represores AUX/IAA. El aumento en la degradación de los
AUX/IAA en condiciones limitantes de Pi permite que
ARF19 y probablemente otros ARFs, activen los genes
de respuesta a auxinas que promueven la división celular en el periciclo. Esta respuesta a la carencia de Pi
hace a las células del periciclo más sensibles a auxinas,
permitiendo una formación y emergencia de RL sin la
necesidad de un incremento en el transporte o síntesis
de auxinas. Bajo estas condiciones, un gran número de
células del periciclo podrían llegar a ser células fundadoras comprometidas en la organogénesis. Nuestro
modelo es atractivo para explicar cómo las señales
ambientales pueden regular los procesos de desarrollo
post-embrionarios modulando la expresión o actividad
de diferentes componentes de la señalización de hormonas durante el ciclo de vida de la planta.
arf19
METODOLOGIA
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Material biológico y condiciones de crecimiento
Pu
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Para el estudio de la respuesta a auxinas en Arabidopsis se emplearon plantas control (Col-O), las líneas
transgénicas CyCB1;1:GUS, TIR1:GUS, y HS:AXR3NTGUS; y las líneas mutantes tir1-1 y arf19. La semilla
se sembró en condiciones de esterilidad en cajas de
petri que contenían medio MS modificado (13) utilizando como P- (10 μM KH2PO4) o P+ (1 mM KH2PO4).
Para promover y uniformizar la germinación, las cajas
se incubaron a 4ºC durante 48 horas en oscuridad. Posteriormente, las cajas se trasladaron a cámaras de crecimiento en ambiente controlado, con fotoperiodo de
46
Tratamientos con hormonas
El estudio de la respuesta a reguladores de crecimiento vegetal se realizó bajo las mismas condiciones de
crecimiento en que se estudió la respuesta a Pi, con la
diferencia que se agregaron concentraciones variadas de IAA, para el caso de los medios con inhibidor
del transporte de auxinas se uso 1μM de NPA.
Ensayos histoquímicos de GUS y clareo de tejidos
Para los análisis histoquímicos de GUS, las plántulas se
incubaron toda la noche a 37ºC en buffer de reacción
de GUS que contenía 0.5 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-μ-D-glucuronido en regulador de fosfatos
que también contenía el catalizador de la oxidación
(ferri y ferrocianuro de potasio 5 mM). La clarificación
de las plántulas se realizó de acuerdo al protocolo
de Malamy y Benfey (15), para cada línea marcadora y cada tratamiento al menos 15 plantas fueron
analizadas. Se eligió una planta representativa para
cada tratamiento y se fotografió usando microscopía
de Nomarski en un microscopio Leica DMR.
Análisis de la arquitectura radicular
El sistema radicular de Arabidopsis se analizó con el
estereomicroscopio AFX-II-A (Nikon). Todas las raíces
2)
Determinación del IAA libre
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secundarias emergidas fueron claramente visibles
usando un objetivo 3X y se tomaron en cuenta a la
hora de cuantificar el número de LR. Para todos los experimentos, los datos se analizaron estadísticamente
usando el programa SPSS 10 (9). Las raíces de Arabidopsis se clarearon y observaron al microscopio para
clasificar las etapas de desarrollo de las RL.
López-Bucio, J., Cruz-Ramírez, A. and Herrera-Estrella, L. (2003).
The role of nutrient availability in regulating root architecture.
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determinar el contenido de IAA libre, el cual se llevó a
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Phosphate availability alters architecture and causes changes in
nI
Se generaron plantas transgénicas que sobreexpresan
TIR1 (P35S:TIR1) bajo el control del promotor 35S; esto
se llevó a cabo utilizando el sistema GATEWAY. La tecnología GATEWAY es un método universal de clonación
basado en las propiedades de recombinación sitio específica del bacteriófago λ, y provee una rápida y altamente eficiente alternativa para movilizar secuencias
de DNA para la expresión de proteínas (17).
hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology 129: 244-256.
10) Pérez-Torres, C.A., López-Bucio, J., Cruz-Ramírez, A., IbarraLaclette, E., Dharmasiri, S., Estelle, M. and Herrera-Estrella, L.
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CONCLUSIÓN
oe
by changes in auxin sensitivity modulated by TIR1 receptor. Plant
Cell 20: 3258–3272.
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Este trabajo de investigación describe un mecanismo
molecular que explica como las señales ambientales,
en particular, la carencia de fósforo, modula los mecanismos de percepción y activación de respuestas a
hormonas como las auxinas, alterando los procesos
de desarrollo en plantas como la formación de raíces
laterales. El conocimiento generado a partir de este
estudio, representa una valiosa herramienta en el ámbito de la biotecnología, ya que conocer cómo responden las plantas a la deficiencia de fósforo permitirá
en un futuro poder modular la arquitectura radicular
en especies de importancia económica y alimentaria
generando plantas más eficientes en la absorción de
fósforo incrementando de esta manera la productividad de los cultivos, optimizando al mismo tiempo el
empleo de este recurso no renovable y disminuyendo
los costos económicos y ambientales de su uso actual.
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