Download El agotamiento del meristemo en repuesta a estímulos ambientales
Document related concepts
no text concepts found
Transcript
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS CAMPUS GUANAJUATO UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERIA GENÉTICA Caracterización genética de las respuestas morfo-fisiológica del sistema radical de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., a la deficiencia de fósforo. Tesis que presenta Biólogo Lenin Sánchez Calderón Para Obtener el Grado de Doctor en Ciencias En la especialidad de Biotecnología de Plantas Director de Tesis: Luis Rafael Herrera Estrella Irapuato, Guanajuato Septiembre de 2006 1 Agradecimientos Al Dr. Luis Rafael Herrera Estrella por el apoyo, la confianza y la amistad que me ha brindado Al Dr. José López Bucio por las múltiples discusiones que fueron indispensables para el inicio, el desarrollo y la culminación de esta tesis, así como de los artículos derivados de la misma. También por la motivación y el carácter propositivo que lo han caracterizado. A la Dra. June Simpson Williamson y a los Drs. Plinio A. Guzmán Villate, Jean Philippe Vielle Calzada y Joseph G. Dubrovsky por la revisión crítica y las valiosas sugerencias en la elaboración éste trabajo. A toda la planta académica del CINVESTAV A los laboratorios de los Drs. Jean Philippe Vielle Calzada, Joseph G. Dubrovsky, Jorge Molina Torres y Juan José Peña Cabriales por haber brindado la infraestructura y la asesoria necesaria para el desarrollo de algunos experimentos. Así como al CIBNOR (La Paz, B.C.S.,México) por el permiso para el uso del ultra micrótomo leica. A Juan Gabriel Ramírez, Andrés Zurita, Enrique Ramírez, Verónica Limones, Antonio Vera, Liana Contreras y Selene Napsucialy por su excelente ayuda técnica en algunos experimentos. A Esmeralda Hernández Abreu, Fernanda Nieto, Osvaldo Gutiérrez, Víctor González que con su trabajo enriquecieron esta tesis y especialmente a Alejandra Chacón con quien pase largas y cansadas horas analizando raíces. Muchas gracias por su esfuerzo y empeño. A el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la asignación de la beca N° 165103 A todos los compañeros que durante mi estancia en el laboratorio han estado Miguel, Andrés, Fernanda, Pime, Tztziqui, Nayelli, Verenice, Vero, Aída, Gustavo, Silvia, Aileen, Enrique, Araceli, Francisco. A los que en su tiempo éramos los novatos Juan, Carlos, Alfredo. A los no tan nuevos Alejandra, Gabriela, Anahí, Víctor y a los nuevos Fulgencio, Juan José, Jessica, Marco y el otro Lenin. A todos los trabajadores de CINVESTAV que gracias a ellos sigue caminando esta unidad y especialmente a Dora Anguiano, Leticia Chong, Marta Corona y Laura Camacho. 2 A mis compañeros de generación y amigos Vero, Bety, Rayo, el Vicky, Carlitos, la Net@, EL MATATOR, el Hobbit, Luis David Alcaraz, Ginita, Gloria, Chio, Miriam, Ivan y los que falten por hacer placentera mi estancia en Irapuato 3 A mamá y papá Agripina Calderón Mejía y Abel Sánchez Juárez Las dos personas que con su ejemplo han demostrado que la combinación entre trabajo y principios es la mejor manera de vivir, a ustedes les dedico este trabajo, siempre están presentes en mí. A mi familia Obed, Lourdes, Sua, Andrea, Judith, Betsaida, Edgar, Abdias y Marx. Sigamos adelante A la mujer con la que compartimos intensamente esta aventura, te amo Marcha 4 ÍNDICE Índice i Índice de tablas y figuras v Resumen vii Summary viii Introducción 1 1.1 Generalidades 1 1.2 El sistema radical 1 1 1.2.1 El sistema radical de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh como modelo de estudio 2 1.2.1.1 Morfología 2 1.2.1.2 Anatomía 3 1.2.1.3 Desarrollo del sistema radical 4 El meristemo 5 Mantenimiento del meristemo apical de la raíz 6 Arquitectura del sistema radical 7 1.2.2 1.2.2.1 1.2.3 1.2.3.1 Efecto de la disponibilidad de nutrimentos en el desarrollo del sistema radical 8 El P y las plantas 9 1.3.1 La importancia del P para la productividad vegetal 9 1.3.2 Toma y transporte de P por las plantas 10 1.3.3 Homeostatis del P 11 1.3.3.1 Respuestas que presentan las plantas a la baja disponibilidad de P 11 1.3.3.2 Respuestas que presenta Arabidopsis thaliana a la baja disponibilidad 1.3 de P 1.3.3.3 12 Percepción y regulación del sistema de rescate a la baja disponibilidad de P 13 Percepción de la carencia de P a nivel local y sistémico 13 El sistema de rescate a la baja disponibilidad de P y su regulación 14 1.3.3.4.1 El sistema de rescate a la baja disponibilidad de P en plantas 15 1.3.3.4.2 Regulación del sistema de rescate a la baja disponibilidad de P en 1.3.3.3.1 1.3.3.4 plantas 1.3.3.4.3 16 Papel de las hormonas en el sistema de rescate a la baja disponibilidad 5 de P 17 2. Antecedentes 19 3. Objetivos 21 3.1 Objetivo General 21 3.2 Objetivos Particulares 21 4. Materiales y métodos 22 4.1 Material vegetal 22 4.2 Condiciones de crecimiento 22 4.2.1 Crecimiento in vitro 22 4.2.2 Crecimiento en suelo 23 4.3 Estudio de los componentes de la arquitectura radical y pelos radicales 24 4.4 Análisis anatómico e histológico del sistema radical 24 4.4.1 Cortes histológicos 24 4.4.2 Clareo de tejidos 25 4.4.3 Ensayos histoquímicos 25 4.4.4 Medición y cuantificación celular 26 4.5 Evaluación cualitativa de la exudación de fosfatasas 26 4.6 Selección y caracterización de las mutantes afectadas en los cambios en la arquitectura radical evocados por la baja disponibilidad de P 27 4.6.1 Selección de las mutantes 27 4.6.2 Análisis genético y cruzas con líneas trasgénicas marcadoras 27 4.6.3 Cuantificación del contenido total de P en los tejidos vegetales 28 4.6.4 Medición del contenido total de antocianinas en los tejidos vegetales 29 4.6.5 Extracción de RNA y ensayos de hibridación tipo Northern 29 4.7 Mapeo posicional de los genes mutados 31 4.8 Análisis estadísticos 32 Resultados 33 5. 5.1 Cambios genéticos, morfológicos y fisiológicos, que ocurren en el sistema radical y el meristemo de la raíz primaria, en respuesta a la baja 33 disponibilidad de P 5.1.1 La disponibilidad del P altera la arquitectura del sistema radical y la 33 estructura del meristemo de la raíz primaria 5.1.2 5.1.3 Los cambios en la arquitectura de la raíz son evocados específicamente por la disponibilidad de P 36 La disponibilidad de P afecta el crecimiento de la raíz primaria y el 38 6 número de raíces laterales 5.1.4 Los procesos de elongación y división celular se modifican en respuesta a la disponibilidad de P 5.1.5 La deficiencia de fósforo altera la expresión del marcador de respuesta auxinas en la raíz primaria 5.1.6 39 42 El agotamiento del meristemo de la raíz primaria correlaciona con el incremento en la expresión de genes que participan en el sistema de rescate al estrés por P 5.1.7 43 La pérdida de la actividad mitótica en el meristemo no es la causa del incremento en la expresión de genes que codifican para transportadores de P de alta afinidad y la exudación de fosfatasas durante el estrés por P. 46 47 5.1.9 La pérdida de la actividad proliferativa del meristemo de la raíz primaria no es la causa del aumento del número de raíces laterales durante el estrés por P La disponibilidad P regula la emergencia de raíces laterales 5.1.10 El proceso de desarrollo determinado y el incremento en la expresión de 5.1.8 48 genes que codifican para transportadores de P de alta afinidad, también ocurre en las raíces laterales 5.2 Caracterización de un grupo de mutantes de A. thaliana que manifiestan una respuesta radical alterada 5.2.1 53 Selección de un grupo de mutantes que no detiene el crecimiento de su raíz primaria en bajo P 5.2.2 50 53 El fenotipo de las mutantes lpi solamente varía en condiciones limitantes de P 54 5.2.3 Análisis genético 55 5.2.4 Las alteraciones en al desarrollo del sistema radical de las mutantes lpi son especificas a la disponibilidad de P 57 5.2.5 Las mutantes lpi no son hiperacumuladoras de P 60 5.2.6 En las mutantes lpi los procesos de elongación y división celular no se ven afectados cuando crecen en condiciones limitantes de P 5.2.7 Las mutantes lpi están parcialmente afectadas en sus respuestas al estrés por P 5.2.8 64 Las mutantes lpi presentan una respuesta aminorada en la expresión de genes inducibles por la carencia de P 5.2.9 61 65 Los meristemos de las raíces laterales de las mutantes lpi pierden su 7 5.2.10 6. 6.1 actividad mitótica 69 Ubicación de los genes mutados en los cromosomas 70 Discusión 73 La deficiencia de P induce un programa de crecimiento determinado en el sistema radical de A. thaliana 6.2 74 El mantenimiento de los meristemos es importante en crecimiento determinado del sistema radical de A. thaliana durante el estrés por P 76 6.3 La disponibilidad de P regula el mantenimiento de los meristemos 77 6.4 La disponibilidad de P influye en el establecimiento del gradiente 79 máximo de auxinas en los meristemos 6.5 El aumento en el número de raíces laterales durante el estrés por P, es independiente del agotamiento del meristemo 6.6 El agotamiento del meristemo esta relacionado con el 80 incremento temporal y espacial de la expresión de genes que permiten a la planta tomar el P eficientemente 6.7 82 Los genes LPI afectan solamente un subgrupo de respuestas evocadas por la baja disponibilidad de P 83 Importancia biológica 85 7 Conclusiones 87 8 Perspectivas 90 9 Bibliografía 91 Anexo1 100 Anexo 2 103 6.8 8 ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS Tabla 1 Tabla 2. Tabla 3. Marcadores usados para el análisis de segregantes mezcladas “bulked segregant analysis” Características del sistema radical de A. thaliana creciendo en condiciones limitantes (1 µM) y óptimas (1 mM) de P. 34 Agotamiento de los meristemos del sistema radical de A. thaliana creciendo en condiciones limitantes (1 µM) y óptimas (1 mM) de P. Tabla 4. 31 Tasa de segregación de la progenie resultante de las cruzas de cada una de las líneas mutantes lpi con las plantas silvestres (WT). Tabla 5. Segregación de la progenie de las cruzas entre las mutantes lpi. Tabla 6. Efecto de la disponibilidad de P en las plantas WT y en las mutantes lpi en el contenido total de P (% del tejido seco ) 50 55 56 60 Figura 1. Esquema de un sistema radical (SR) pivotante 2 Figura 2. Regiones de la raíz primaria 3 Figura 3. Anatomía de la raíz de Arabidopsis thaliana. 4 Figura 4. Esquema del desarrollo postembrionario del sistema radical de Arabidopsis 5 thaliana, Figura 5. Regulación de las respuestas del sistema de rescate a la baja disponibilidad de 16 P. Figura 6. Efecto de la disponibilidad de fosfato en la arquitectura de la raíz. 20 Figura 7. Efecto de la disponibilidad de fósforo en la arquitectura del sistema radical. 33 Figura 8. Efectos de la disponibilidad de P en el meristemo de la raíz primaria. 35 Figura 9. Cambios en la arquitectura del sistema radical de A.thalianas en respuesta a la Figura 10. carencia de algunos nutrimentos 37 Efecto de la disponibilidad de P en el crecimiento del sistema radical y en la 38 formación de raíces laterales. Figura 11. Cambios temporales de los parámetros celulares de la raíz de Arabidopsis 40 thaliana durante el estrés por P. Figura 12. Cambios temporales en la expresión del gen reportero GUS en las líneas 41 marcadoras de mitosis CycB1;1:uidA y de respuesta a auxinas DR5:uidA en respuesta a la disponibilidad de P Figura 13. Efecto de la disponibilidad de P en: La exudación de fosfatasas ácidas en plantas de Arabidopsis 44 9 Figura 14. Efecto de la perdida de la actividad meristemática de la línea DT-AtsM en la expresión transportadores de P de alta afinidad y exudación de fosafatasas 46 ácidas. Figura 15. Efecto de la perdida de la actividad meristematica en el número de raíces laterales. 48 Figura 16. Efecto de la disponibilidad de fósforo en el desarrollo de las raíces laterales. 49 Figura 17. Efecto de la disponibilidad de fósforo en el patrón de CycB1;1:uidA, DR5:uidA, pAtPT2:uidA y expresión de pAtPT1:uidA, en las raíces laterales de A. thaliana creciendo en meio limitante de P. 52 Figura 18. Escrutinio y caracterización fenotípica. 54 Figura 19. Respuesta de las mutantes lpi ante el estrés salino 58 Figura 20. Especificidad de fenotipo de las mutantes lpi 59 Figura 21. Efecto de la disponibilidad de P en algunos parámetros celulares de la raíz 61 primaria. Figura 22. Efecto de la disponibilidad de P en la expresión de los marcadores 63 CycB1;1:uidA y DR5:uidA en las mutantes lpi1, lpi2, lpi3 y lpi4 Figura 23. El efecto de la disponibilidad de P en algunas respuestas del sistema de 64 rescate a la baja disponibilidad de P. Figura 24. Expresión de AtPT1:uidA y AtPT2:uidA en la transgénica y en las mutantes 66 lpi1 y 2. Figure 25. Efecto de la disponibilidad de fósforo en la expresión de genes inducibles por 68 su carencia en las mutantes lpi 1 y 2. Figura 26. Efecto de la disponibilidad de fósforo en el agotamiento de las raíces laterales 69 y en la expresión de genes de específicos a la carencia de P. Figura 27. Análisis de segregantes mezcladas “Bulked Segregant Analysis”. 71 Figura 28. Definiendo el intervalo de mapeo. 79 Figura Modelo de la regulación de las respuestas del sistema de rescate a la baja 29. disponibilidad de P. 84 ABREVIATURAS 10 RESUMEN Las plantas presentan una amplia gama de respuestas adaptativas, que dada su naturaleza sésil, les han permitido sobrevivir en condiciones ambientales adversas tales como deficiencia de agua y nutrimentos. La baja disponibilidad de fósforo (P) en el suelo evoca un proceso de rescate que incluye cambios a nivel morfológico, metabólico y fisiológico, encaminados a hacer más eficiente el uso del P de la planta, así como incrementar la movilidad y la toma de este nutrimento desde el suelo. Estas condiciones de estrés afectan de manera drástica la arquitectura del sistema radical de Arabidopsis thaliana. Estos cambios se reflejan en un aumento de la densidad de las raíces laterales y en la disminución de la elongación de la raíz primaria. En el presente trabajo hemos encontrado que en condiciones de deficiencia de fósforo el sistema radical presenta un programa de desarrollo determinado que incluye la diferenciación tisular y pérdida de la división celular en el meristemo, y por tanto, el detrimento de su función (agotamiento del meristemo). Así mismo, los meristemos agotados se convierten en tejido diferenciado y expresan transportadores de P de alta afinidad y la exudan de fosfatasas. Se determinó que el aumento en la cantidad de raíces laterales durante la deficiencia de fósforo en los primeros días después de la germinación, se da por el incremento en la formación de primordios y por la rápida emergencia de los mismos para formar raíces laterales. Con la finalidad de identificar algunos genes que participan en el control del desarrollo determinado, se efectuó un escrutinio en una población 25000 semillas de A. thaliana mutagenizadas con EMS (etil metano sulfonato), buscando plantas que alargaran su raíz en condiciones limitantes de P. Se aislaron un grupo de mutantes lpi (low phosphorous insensitive) que no mostraban el programa típico de desarrollo determinado evocado por la carencia de P. Sin embargo, algunos de los componentes del sistema de rescate a la baja disponibilidad de P permanecen inalterados, como la acumulación de antocianinas, la exudación de fosfatasas y el aumento en la longitud y la densidad de los pelos radicales. Cuando caracterizamos genéticamente al grupo de mutantes lpi encontramos representados 4 genes, LPI1 al LPI4; el fenotipo es provocado por una mutación monogénica siendo tres de ellas recesivas (lpi1,3 y 4) y una dominante (lpi 2). Nuestros resultados sugieren que el P esta actuando como una señal importante para el desarrollo postembrionario evocando un programa de desarrollo determinado el cual esta encaminado aumentar la superficie de contacto entre la el suelo y la raíz de tal forma que hace eficaz y eficiente la toma del fósforo desde la rizosfera. 11 SUMMARY Plants present an ample variety of adaptive responses that, given their sessile nature, had allowed them to survive under adverse environmental conditions such as water and nutrient deprivation. Low phosphorus (P) availability in soil elicits a recovery process that includes morphological, metabolic and physiological changes, oriented to increase the efficiency of P usage in the plant, and moreover to improve its mobility and uptake from the soil. These stressing conditions affect drastically the root system architecture of Arabidopsis thaliana. These changes reflect on an increase of the lateral root density and the diminishing of the primary root length. In this work we have found that in low P conditions the root system presents a determinate developmental program that includes tissue differentiation and the loss of cell division at the meristem, and thus, the detrimental of its function (meristem exhaustion). Additionally, those exhausted meristems become into differentiated tissue, express high-affinity P transporters and exude phosphatases. It was determined that the increase in the number of lateral roots during phosphorus deprivation in the early days after germination is due the increase in the formation of primordia and due the early emergency of those for lateral root formation. In order to identify some genes having a role in the control of determinate development, an scrutiny was performed to a 25000 EMS (ethyl methane sulphonate)-mutagenized Arabidopsis seeds population, looking for plants that kept their roots long even when grown under low P conditions. A group of lpi (low phosphorus insensitive) mutants was isolated, and they did not show the typical determinate developmental program caused by P deprivation. However, some of the components of the recovery system to low P availability remain unaltered, as being the antocyanin accumulation, phosphatase exudation and the increase in the lateral root length and density. As we genetically characterized the lpi mutant group we found represented 4 genes, LPI1, LPI2, LPI3 and LPI4; the phenotype is caused by monogenic mutations, 3 of them being recessive (lpi1, 3 and 4) and one dominant (lpi2). Our results suggest that P is acting as an important signal for post-embryo development eliciting a determined developmental program that is oriented to augment the contact surface between root and soil in a way such that it improves the efficiency and effectiveness of P uptake from rhizosphere. 12 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Generalidades En todos los ecosistemas del mundo las condiciones ambientales son fluctuantes, por lo que los organismos que los habitan se encuentran frecuentemente en condiciones de estrés. Para sobrevivir en este escenario, varios organismos simplemente se mudan a lugares donde el medio es favorable, sin embargo, las plantas, por su naturaleza sésil, no pueden escapar de las adversidades que se presentan en su ambiente. Dada esta presión de selección, durante la evolución vegetal se han fijado características que les han permitido sobrevivir en un entorno cambiante. Hay plantas que presentan cambios específicos en su morfología, fisiología y metabolismo que les permiten sobrevivir y mantener una población reproduciéndose únicamente en ambientes muy particulares, tal es el caso de las plantas xerófitas que están adaptadas para vivir en ambientes áridos donde la disponibilidad de agua es un factor limitante para su subsistencia. Así mismo hay plantas que alteran su homeostasis o estado basal fisiológico y metabólico, así como su programa de desarrollo postembrionario en función del estrés que enfrentan. Estas alteraciones dependerán de manera directa de la intensidad y la duración del estimulo ambiental estresante así como de la especie y la edad de la planta, de tal forma que le permitan sobrevivir durante el periodo estresante (Hirt y Shinozaki, 2004). Son precisamente estas alteraciones de interés particular para el desarrollo del presente trabajo. Sin embargo, iniciaremos con algunas consideraciones generales del sistema radical antes de abordar este tipo de respuestas. 1.2 El sistema radical El sistema radical (SR; figura 1) está formado por la raíz primaria (RP) la cual se origina a partir de la raíz embrionaria, las raíces laterales (RLs) y por las raíces adventicias (RA). Estas últimas, a diferencia de las RL, se forman de órganos 13 diferentes a la raíz, principalmente de tallos. El SR constituye la porción inferior del eje principal de la planta, generalmente se desarrolla de manera subterránea y está presente en las plantas vasculares (Cronquist, 1971). Sus funciones más conservadas son el anclaje al sustrato, la síntesis de hormonas y la toma y transporte de agua y nutrimentos de la rizósfera. La forma y estructura del SR Figura 1. Esquema de un sistema radical (SR) pivotante, mostrando únicamente la raíz primaria (RP) y raíces laterales (RL) son muy variables y están directamente relacionadas con la especie y la función particular que se encuentran desempeñando (Cronquist, 1971; Fahn, 1974). 1.2.1 El sistema radical de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh como modelo de estudio Esta planta pertenece a la familia Brassicaceae. En los últimos años ha sido utilizada como modelo de estudio, dado que presenta varias ventajas para trabajar con ella tanto in vitro como en invernadero. Además, la morfología y anatomía del SR son relativamente “simples” y han sido estudiadas ampliamente (Meyerowitz, 1987; Schiefelbein y Benfey, 1994). 1.2.1.1 Morfología El SR de A. thaliana es de tipo pivotante, es decir que todo o gran parte de él se origina a partir de la RP, la cual es el eje principal de crecimiento (figura 1). A lo largo del eje apical-basal de la raíz, se pueden distinguir tres regiones en las que ocurren varios procesos fundamentales para desarrollo de la raíz (figura 2). La región meristemática que está localizada en el ápice de la raíz y está cubierta por la cofia e incluye un grupo de células proliferativamente activas (figura 2 A). La región de elongación, adyacente a la región meristemática, presenta células que están expandiendo de manera controlada (figura 2 B). La región de diferenciación o 14 especialización contiene células que se están diferenciando a su forma y función finales (figura 2 C). Las regiones mencionadas anteriormente no están separadas estrictamente, sino que con frecuencia se encuentran sobrelapadas (Dolan et al., 1993; Schiefelbein y Benfey, 1994). Figura 2. Regiones de la raíz primaria: (A) meristemática, (B) de elongación y (C) de diferenciación. 1.2.1.2 Anatomía La figura 3 muestra esquemas de cortes de la raíz de A. thaliana, donde se pueden apreciar las distintas capas celulares que conforman su anatomía. El orden en que se presenta cada capa de la externa a la interna es la epidermis, el córtex, la endodermis y el periciclo. Dichas capas rodean al cilindro provascular central (figura 3 A). Las células presentes en cada una de estas forman columnas a lo largo de la raíz (figura 3 C). En la epidermis se pueden apreciar dos tipos celulares, los atricoblastos y los tricoblastos (figura 3 A y C). Solamente los tricoblastos dan origen a los pelos radicales (Dolan,1994). En la representación esquemática de la región meristemática (figura 3 B y C), rodeando al ápice radical, se encuentra la cofia que consta de las células de la columela y las células laterales de la cofia. La región central del meristemo está compuesta de tres capas de células madres o iniciales, de las cuales se generarán los diferentes tipos celulares (figura 3 B y C). Las células iniciales presentes en la capa superior darán origen a la estele o cilindro provascular, formada por el periciclo y los tejidos vasculares xilema y floema. En la capa inferior están las células iniciales de la columea, la cofia lateral y la epidermis. En la capa de células que se encuentran entre las dos anteriormente mencionadas, se localizan las 15 células del centro quiescente (QC) y las iniciales del córtex y endodermis (Dolan et al., 1993). Figura 3. Anatomía de la raíz de Arabidopsis thaliana. Patrón de organización radial, se muestran capas celulares organizadas concéntricamente (A). Vista longitudinal que muestra la organización celular del meristemo (B). Proyección tridimensional del meristemo, mostrando la organización en columnas de las células (C). Modificada de van den Berg, et al. (1998). 1.2.1.3 Desarrollo del sistema radical El desarrollo del SR está dado por un programa genético en el que pueden distinguirse dos etapas bien marcadas, la embrionaria y la postembrionaria. En la primera conocida también como embriogénesis, a partir del cigoto se desarrollan los meristemos apicales, tanto el de la raíz como el del brote y en algunas especies también se pueden desarrollar éstos para formar la radícula y la plúmula respectivamente antes de entrar en dormancia ya formada la semilla (Leyser y Day, 2003). Una vez que las condiciones ambientales son favorables comienza la germinación, iniciando así el programa de desarrollo postembrionario. Durante la germinación la primera estructura en emerger de la semilla es la radícula, la cual formara la RP que será el eje principal de crecimiento. A partir de la RP, particularmente de las células del periciclo, se generan los primordios que se desarrollarán y crecerán para formar las RL y de esta manera conformar el sistema radical (figura 4; Dolan et al., 1993; Schiefelbein y Benfey, 1994). El crecimiento de las raíces se da en su región apical, por el aporte de nuevas células producto de las divisiones celulares en la zona meristemática y la expansión controlada de las 16 células en la zona de elongación (figura 1 A y B; Leyser y Day, 2003; Dolan y Davies, 2004). Figura 4. Esquema del desarrollo postembrionario del sistema radical de Arabidopsis thaliana, modificada de Schiefelbein y Benfey (1994). 1.2.2 El meristemo Después de que la semilla ha germinado, el meristemo de la raíz primaria (MRP) es fundamental en el desarrollo del sistema radical. En el meristemo se lleva a cabo la proliferación de las células iniciales. Cada célula inicial presenta un patrón de división característico que dará origen a cada uno de los tejidos de la raíz, por lo que cada uno de estos tejidos se origina específicamente de un tipo de célula inicial en el meristemo (figura 3 B y C; Dolan et al, 1993; Meyerowitz, 1997). El patrón de división celular, así como el destino de estas células está dado por su posición en el plano radial del meristemo y no por su origen, por lo que se postula que la información que 17 controla la diferenciación y división es propagada a través de cada capa celular hacia el ápice (van den Berg et al., 1995). Las células iniciales rodean a un grupo de 4 células mitóticamente inactivas, el centro quiescente (QC), por lo que cada uno de los tejidos de la raíz convergen en este punto (figura 3 B). A éste tipo de organización del meristemo se le conoce como cerrada (Dolan et al., 1993; Meyerowitz, 1997). 1.2.2.1 Mantenimiento del meristemo apical de la raíz La zona meristemática mantiene el crecimiento indeterminado de la raíz, dada su actividad proliferativa. Sin embargo en algunas especies de la familia Cactaceae la raíz presenta como parte de su programa de desarrollo postembrionario un crecimiento determinado, en donde las células meristemáticas están en proliferación durante un período de tiempo limitado y se diferencian (Dubrovsky, 1997). El QC presenta un papel importante en el mantenimiento del crecimiento indeterminado de la raíz, ya que no permite la diferenciación de las células iniciales que están en contacto directo con él, de tal forma que les permite mantenerse en estado proliferativo (van den Berg et al., 1997). Se ha reportado que las auxinas además de ser hormonas, podrían estar actuando como un morfógeno en el meristemo dado que se ha detectado la formación de un gradiente de respuesta a auxinas en la columela , con su máximo en sus iniciales (figura 12 F; Friml, 2003; Sabatini et al., 1999), el cual actúa como un organizador del patrón y la polaridad en el meristemo (Sabatini et al., 1999). Para que este gradiente esté presente son necesarias las proteínas codificadas por los genes de la familia PIN que son componentes de la maquinaria de eflujo que media el transporte polar de auxinas (Blilou et al., 2005). En maíz se ha observado que el gradiente de respuesta a auxinas correlaciona con el estatus de oxido-reducción del QC el cual esta intimamente ligado con su mantenimiento (Jiang et al., 2003). Asimismo se ha reportado que algunas proteínas que participan en procesos como: La regulación del ciclo celular (Cak1At, una cinasa activadora de cinasas dependientes de ciclina; HOBBIT un homologo de CDC27; RBR, proteína relacionada a retinoblastoma; Umeda, et al., 2000; Blilou et al., 2002; Wildwater et al., 2005), la degradación de proteínas (HRL, una subunidad del proteosoma 26S; 18 Ueda et al., 2004;) y la regulación de la transcripción (PLT1 y 2, factores de transcripción con dominio AP2; los factores de transcripción de la familia GRAS SHR y SCR; Aida et al., 2004) son necesarias para el mantenimiento del meristemo apical de la raíz. Además se ha reportado CLE19 miembro de la familia CLE es necesario para le el mantenimiento de el meristemo y algunos miembros de esta familia suprimen la diferenciación y promueven la división celular pudiendo ser esta su función en el meristemo (Casamitjana-Martínez et al., 2003; Ito et al., 2006) 1.2.3 Arquitectura del sistema radical Se entiende por arquitectura del sistema radical (ASR) al arreglo tridimensional en el espacio del conjunto de raíces que forman el SR (Lynch, 1995; Williamson et al., 2001). Dadas las funciones del sistema radical, los cambios en su arquitectira pueden afectar de manera drástica la capacidad de las plantas para tomar agua y nutrimentos del suelo. Los procesos que contribuyen a la formación de la ASR son: a) La proliferación y elongación celular, los cuales permiten el crecimiento indeterminado de la raíz, b) Formación de las RLs, lo cual determina la ramificación y por ende la capacidad de explorar su entorno y c) La formación de pelos radicales, lo cual incrementa la superficie total de contacto entre la superficie de la raíz y la rizósfera (Dolan et al., 1993; Celenza et al., 1995). Estos procesos están regulados por un programa de desarrollo postembrionario controlado genéticamente. Sin embargo dicho programa es altamente plástico y puede presentar cambios en función de las condiciones ambientales prevalecientes, facilitándole a la planta el adaptarse a los cambios ambientales que se le presenten (Schiefelbein y Benfey, 1991; López-Bucio et al., 2003). Por ejemplo se ha descrito que la ASR se ve afectada por estímulos bióticos y abióticos dentro de los cuales destacan las raíces de plantas adyacentes, las interacciones con microorganismos, los gradientes de temperatura, la aeración, el contenido de agua y la disponibilidad de nutrimentos en el suelo (Feldman, 1984; Schiefelbein y Benfey, 1991; Okada y Shimura, 1994). 19 1.2.3.1 Efecto de la disponibilidad de nutrimentos en el desarrollo del sistema radical La distribución y la disponibilidad de los nutrimentos en el suelo es un factor limitante para el crecimiento y el desarrollo vegetal. La disponibilidad de cada nutrimento dependerá de su naturaleza físico-química. Para poder adaptarse de manera exitosa, las plantas han adquirido mecanismos que les permiten percibir qué tan abundante es un nutrimento en el medio y responder apropiadamente modificando su desarrollo, con el fin de hacer más eficiente la toma de éste. Se ha postulado que la disponibilidad del fierro (Fe), nitrógeno (N) y fósforo (P) evoca cambios en el programa de desarrollo postembrionario del SR (Schmidt et al., 2000; Malamy y Ryan, 2001; Forde, 2002; López-Bucio et al., 2003). La deficiencia de Fe promueve el aumento en la longitud y la densidad de pelos radicales en A. thaliana (Schmidt et al., 2000), así como la formación de raíces proteoides en Lupinus consentinii y Casuarina glauca (Watt y Evans, 1999). La disponibilidad y la distribución del N afectan el crecimiento y desarrollo de las RL. Los efectos en A. thaliana pueden operar por distintas rutas y alterar diferentes estados de desarrollo de las RLs. Se ha reportado que si se aplican parches de NO3- (50 µM) a la RP, se estimula el crecimiento de las RL presentes en esa zona, por lo que se postula que la actividad meristemática de las RLs maduras, responde directamente a la concentración local externa de NO3- (Zhang et al., 1999). Para esta vía de transducción de señales se identificó recientemente uno de sus componentes, el gen ANR1, que codifica para un factor de transcripción de la familia MADS-box (Zhang y Forde, 1998). Asimismo, hay evidencias de que esta ruta está relacionada con la ruta de señalización mediada por auxinas, ya que la mutante axr4 no responde a la respuesta localizada de NO3(Zhang et al., 1999). Otro de los nutrimentos que evocan cambios en el desarrollo postembrionario del SR de A. thaliana es el P (Williamson et al., 2001; López-Bucio et al., 2002), el cual discutiremos con más detalle. 20 1.3 El P y las plantas El P es uno de los nutrimentos más importantes para el desarrollo y productividad de las plantas, representando alrededor del 0.2% de su peso seco. Este elemento forma parte estructural de biomoléculas como los ácidos nucleicos, los fosfolípidos y el ATP (Rausch y Bucher et al., 2002). También es importante en procesos fisiológicos como la fotosíntesis, la respiración, el metabolismo energético y en la regulación de diversas enzimas (Raghothama, 1999). Las plantas toman el P del suelo como fosfato (Pi). A pesar de que la cantidad de Pi en el suelo en algunas regiones puede ser alto, este nutrimento no se encuentra disponible para ser tomado por las plantas dadas sus características físico-químicas, como: su bajo coeficiente de difusión (10-13-10-15m2/s), alta reactividad, gran capacidad de adsorción y alta tasa de conversión a materia orgánica (Holford, 1997; Schachtman et al., 1998). El Pi del suelo puede encontrarse formando parte de compuestos orgánicos e inorgánicos; los primeros pueden representar del 20 al 80% del Pi total contenido en el suelo. El Pi restante se encuentra mineralizado y dependiendo principalmente del pH del suelo se encontrará formando complejos principalmente con aluminio y fierro en suelos ácidos y con calcio y magnesio en suelos alcalinos, quedando insoluble y por tanto no disponible para ser tomado por la planta (Hinsinger, 2001). 1.3.1 La importancia del P para la productividad vegetal La baja disponibilidad de Pi es uno de los mayores problemas para la productividad vegetal en muchos ecosistemas y agroecosistemas. A nivel mundial, afecta un área estimada en más de dos billones de hectáreas, que comprenden suelos desgastados y volcánicos de las regiones tropicales, suelos ácidos de las regiones subtropicales húmedas, suelos arenosos semiáridos de las regiones subtropicales y suelos alcalinos (Raghothama, 1999; Oberson et al., 2001). Para disminuir el impacto en la producción agrícola generada por la deficiencia de este nutrimento, se ha recurrido al uso intensivo de fertilizantes. Sin embargo, en estudios recientes, se ha encontrado que aproximadamente el 80% del P aplicado como fertilizante queda insoluble en el 21 suelo (Holford, 1997), lo que implica una demanda alta de fosfatos para poder mantener una producción agrícola rentable. El uso excesivo de fertilizantes fosfatados tiene como consecuencia un incremento en los costos de producción y repercusiones en el ambiente por la contaminación de mantos acuíferos, ríos y lagos (Raghothama, 1999). 1.3.2 Toma y transporte de P por las plantas El Pi es tomado desde la rizósfera por la raíz y es transportado por las células de la epidermis al simplasto, generando en su área circundante una disminución drástica en la concentración de dicho nutrimento. El transporte a través de la membrana de las células se efectúa en contra de un gradiente de concentración ya que las concentraciones en el suelo rara vez rebasan los 10 µM, mientras que en las células es mil veces mayor. La energía requerida para el transporte de Pi en contra de un gradiente de concentración es proporcionada por ATPasas que generan un gradiente de protones en la membrana celular, el cual es utilizado para cotransportar el Pi al interior celular. Se ha postulado la existencia de un mecanismo dual para la toma de fosfato que está caracterizado por la activación de transportadores de alta afinidad que operan a concentraciones bajas (de orden micromolar) y transportadores de baja afinidad que funcionan a concentraciones altas (de orden milimolar; Schachman et al., 1998; Raghothama, 1999). El siguiente paso es la translocación del Pi a las células del parénquima del xilema para posteriormente llenar el xilema y así llevar este nutrimento con dirección al follaje. En este paso se ha identificado que la proteína PHO1, la cual no es un transportador, está implicada en el transporte del Pi, dado que las mutantes pho1 no son capaces de cargar el Pi al xilema (Hamburger et al., 2002). Finalmente, el Pi es transportado a las hojas, sale del xilema y se distribuye al resto de los tejidos. En condiciones de senescencia y de carencia de este nutrimento, el P es translocado a hojas más jóvenes y órganos donde se requiera como la raíz. En este proceso se ha visto que la proteína PHO2 está interviniendo porque las mutantes son incapaces de translocar el Pi hacia la raíz, acumulándose en el follaje (Dong et al.,1998). Ya en las células, el Pi puede seguir 22 distintas rutas como: a) Ser usado en rutas biosinteticas de fósfolipidos, DNA y RNA; b) pasar a plástidos y/o mitocondrias para usarse en procesos metabólicos o bien a vacuola para ser almacenado (éste transporte se da generalmente por intercambiadores de otros solutos o protones); c) ser transportado a otras células (Rausch y Bucher, 2002). 1.3.3 Homeostatis del P El mantener estable la concentración de Pi tiene un papel preponderante en las células vegetales ya que en el citoplasma dicha condición es esencial para que se lleven a cabo muchas reacciones enzimáticas. El monitoreo del contenido de este nutrimento en varios compartimentos celulares como vacuola, plástidos, mitocondrias y citoplasma es necesario para mantener su homeostasis (Schachtman et al., 1998). Cuando las plantas crecen en condiciones donde hay abundancia de Pi, éste es absorbido a tasas que exceden su demanda, acumulándose en las células. Para que la alta concentración de Pi celular no llegue a ser tóxica, éste puede ser convertido a compuestos orgánicos de almacenaje, reducida su entrada, sacado de la células por eflujo y almacenado en la reserva no metabólica de la vacuola (Lee et al.,1990; Lee y Ratcliffe, 1993). Cuando se encuentra en carencia de Pi, las células mantienen la concentración constante del nutrimento incrementando su entrada al citoplasma por la membrana plasmática y haciendo uso de las reservas internas, principalmente de la vacuola. Sin embargo, a nivel global en la planta se presentan una serie de estrategias perfectamente bien coordinadas con la finalidad de mantener la homeostasis de este nutrimento (Lee y Ratcliffe, 1993). 1.3.3.1 Respuestas que presentan las plantas a la baja disponibilidad de P Cuando las plantas crecen en condiciones limitantes de P presentan varias respuestas que les permiten aclimatarse. Se pueden encontrar por un lado procesos encaminados a hacer más eficiente el uso del Pi presente en la planta, usando rutas alternativas para glicólisis y el transporte de electrones en la mitocondria (Theodorou 23 y Plaxton, 1993). Con este mismo objetivo, se reemplazan biomoléculas fosfatadas por no fosfatadas, como es el caso de los fosfolípidos (Essigmann et al., 1998; Härtel et al., 2000; Yu, et al., 2002). Por otro lado también presentan procesos tendientes a hacer disponible el Pi presente en la rizósfera tales como el incremento en la síntesis y exudación de aniones orgánicos como el citrato y el malato que ayudan a solubilizar el Pi de compuestos inorgánicos (Jones, 1998; Watt y Evans, 1999; Raghothama, 1999) así como de nucleasas y fosfatasas ácidas que pueden liberar el Pi de compuestos orgánicos presentes en el suelo (Nürnberger et al., 1990; Löffler et al., 1992; Duff et al., 1994; Chen et al., 2000). Dentro de estos últimos procesos podemos encontrar los destinados a acrecentar la toma de Pi del suelo como aumento de transportadores de alta afinidad de P en las membranas celulares (Muchhal, et al., 1996; Raghothama, 1999; Karthikeyan et al., 2002). Finalmente, hay también una redistribución diferencial de los fotosintatos entre la raíz y el brote además de modificaciones del programa de desarrollo postembrionario (Raghothama, 1999) 1.3.3.2 Respuestas que presenta Arabidopsis thaliana a la baja disponibilidad de P En A. thaliana están presentes varias de las respuestas comunes a la baja disponibilidad de P, varios genes se han clonado y algunas mutantes han sido aisladas. Una de estas respuestas es la exudación de fosfatasas ácidas por las raíces (Trull y Deikman, 1998). Se ha reportado que durante este estrés varios miembros de la familia de fosfatasas ácidas (PAP) son inducidas trasncripcionalmente. Dos de los miembros de esta familia que se han clonado son: la fosfatasa ácida de A. thaliana 5 (ACID PHOSPHATASE 5, AtACP5) y la fosfatas ácida purpura (PURPLE ACID PHOSPHATASE 1, PAP 1; Li et al., 2002; del Pozo et al., 1999; Haran et al., 2000). Además, se han aislado las mutantes pup1(phosphatase under-producer) y pho3 (phosphorus-deficient) en las cuales la secreción de fosfatasas ácidas se encuentra afectada (Trull y Deikman, 1998; Zakhleniuk et al., 2001). Otra de las respuestas que muestra A. thaliana es la exudación y sobreacumulación de las ribonucleasas (RNasas S-like) RNS1 y RNS2 24 (Taylor et al., 1993; Bariola et al., 1994). Los genes SQD1 y SQD2 (SULFOQUINOVOSYL DIACYLGLYCEROL 1 Y 2), que codifican para proteínas que participan en la síntesis de sulfolipidos y DGD2, que codifica para una digalactosildiasilglicerol sintasa, participan en el intercambio de fosfolípidos por sulfolípidos y están fuertemente regulados por la disponibilidad de P (Essigmann et al., 1998; Härtel et al. 2000; Yu, et al., 2002). También la expresión de los genes miembros de la familia Pht1 (Phosphorus transporter1) de transportadores de P de alta afinidad se incrementa considerablemente cuando se presenta el estrés por P (Mudge et al., 2002). Todos los miembros de esta familia se han clonado y su patrón de expresión se ha descrito a detalle, como es el caso de AtPT1 y AtPT2 (Arabidopsis thaliana PHOSPHORUS TRANSPORTER1 y 2; Muchal et al. 1996; Karthikeyan et al., 2002). En respuesta a la carencia de P, A. thaliana presenta cambios muy marcados en su programa de desarrollo. La longitud y densidad de los pelos radicales se incrementa y el sistema radical es más corto y ramificado (Bates y Lynch, 1996; Williamson et al., 2001; López-Bucio et al., 2002 ). 1.3.3.3 Percepción y regulación del sistema de rescate a la baja disponibilidad de P En este contexto, hipotéticamente, las respuestas al estrés por P pueden iniciar cuando la planta sensa el contenido de P interno y/o externo, su reconocimiento a nivel celular y/o sistémico, activa cascadas de transducción de señales encaminadas a regular transcripcional y postranscripcionalmente genes y proteínas que son necesarias para la adaptación a la baja disponibilidad de P (Raghothama, 1999); de tal forma que la planta modifica su fisiología, metabolismo y programa de desarrollo e incluso puede influir en su capacidad reproductiva para poder enfrentarse a este estrés. 1.3.3.3.1 Percepción de la carencia de P a nivel local y sistémico Por medio del estudio de la inducción de genes específicos a la carencia de Pi en cultivos de células de tomate, se ha demostrado que la percepción del Pi es a nivel 25 interno. Köck et al. (1998) en sus experimentos encontraron que los niveles de RNAm de las ribonucleasas aumentan de manera específica en medio libre de Pi en un período de tiempo muy corto (2 h) y que dicho nivel se reduce hasta no ser detectado cuando las células se pasan a un medio de cultivo con condiciones óptimas de Pi, demostrando que el P ésta regulando negativamente la transcripción de genes que codifican para ribonucleasas. Sin embargo, cuando las células son cultivadas en un medio rico en Pi, pero adicionado con un compuesto que secuestra al P y no le permite entrar a las células, aumenta de manera pronunciada los niveles de RNAm de ribonucleasas. Esto sugiere que el contenido interno de Pi es importante para la regulación transcripcional de los genes que codifican para ribonucleasas, por lo que existe un sensado del Pi a nivel intracelular (Köck et al., 1998). Sin embargo, en plantas completas el mecanismo de sensado intracelular está poco implicado en el control de la expresión de los genes regulados por la disponibilidad de Pi (Abel et al., 2002). A nivel de planta completa parecen estar operando tanto señales sistémicas controladas a larga distancia por el contenido total de Pi en la planta, como señales locales dependientes de Pi externo a nivel local (Franco-Zorrilla et al., 2004). Lo anterior es postulado porque en experimentos con raíces divididas varios de los genes inducibles por la carencia de Pi son reprimidos de manera sistémica en las raíces expuestas a medio con bajo Pi cuando se aplica Pi en otras regiones distantes del sistema radical (Burleigh y Harrison 1999; Martin et al., 2000; Baldwin et al., 2001). Dado que la represión de la expresión de los genes precede al incremento de Pi en las raíces que crecen en carencia de este nutrimento, el Pi per se probablemente no sea la señal sistémica (Burleigh y Harrison 1999). 1.3.3.4 El sistema de rescate a la baja disponibilidad de P y su regulación En microorganismos como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae la respuesta a la baja disponibilidad de Pi ha sido ampliamente estudiada y caracterizada. Se han reportado varios genes que son inducibles por la carencia de Pi como los que codifican para las fosfatasas ácidas y los transportadores de P. Éstos genes se encuentran regulados de manera coordinada formando regulones. En E. coli el 26 regulón Pho comprende a un grupo de aproximadamente 15 genes que participan en la toma de Pi (Torriani, 1990). Estos genes están controlados por un sistema de dos componentes codificados por el operón phoB-phoR. Mientras que en S. cerevisiae, dicho regulón ésta formado por un grupo de al menos 22 genes (Ogawa, 2000), los cuales están regulados por el factor de transcripción Pho4, éste se une a una secuencia consenso (caja Pho 4) que ésta presente en los promotores de los genes que forman el regulón. La localización subcelular de Pho4 depende de su estatus de fosforilación; cuando no hay estrés por Pi, Pho4 se encuentra en el citoplasma hipofosforilado y cuando se presenta la carencia de Pi, es fosforilado y entra al núcleo activando la trancripción de los genes del regulón. Esta fosforilación es dependiente de las proteínas Pho80-Pho85 que son un complejo de ciclina-cinasa dependiente de ciclina (CDK) y éstos a su vez pueden ser regulados por Pho81, que es un inhibidor de CDKs (Raghothama, 1999). 1.3.3.4.1 El sistema de rescate a la baja disponibilidad de P en plantas En las plantas se han identificado genes que codifican proteínas con funciones similares a las reportadas en los microorganismos y que su expresión es inducida por la carencia de Pi, dentro de los cuales podemos encontrar transportadores de alta afinidad de Pi (Karthikeyan, et al., 2002), fosfatasas con un amplio espectro de sustratos (Duff et al., 1994; del Pozo et al., 1999; Baldwin et al., 2001), ribonucleasas (Taylor, et al., 1993; Bariola et al., 1994) y algunos marcos de lectura abierta que codifican para RNAs o péptidos de función desconocida como MAt1, At4 y AtIPS1(INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1; Liu et al., 1997; Burleigh y Harrison 1999; Martin et al., 2000). Por lo anterior fue postulado primeramente por Goldstein et al. (1988) que en las plantas existe un sistema de rescate a la baja disponibilidad de Pi que actúa de manera coordinada ante éste estrés. 27 1.3.3.4.2 Regulación del sistema de rescate a la baja disponibilidad de P en plantas De la regulación genética de dicho sistema de rescate se han encontrado en A. thaliana las mutantes psr1 (phosphate starvation response) y pdr2 (phosphate deficiency response), las cuales están afectadas en varias de las respuestas evocadas por la baja disponibilidad de P por lo cual se postula que estas mutantes podrían estar afectadas en un componente de la señalización o percepción ante la carencia de P (Chen et al., 2000; Ticconi et al., 2004). Por otra parte, el único factor Figura 5. Regulación de las respuestas del sistema de rescate a la baja disponibilidad de P. (1) La baja disponibilidad de P induce el aumento en la formación de pelos radicales y altera la arquitectura del sistema radical, las modificaciones morfológicas incrementan la exploración del suelo y la toma de P. En este punto el papel de las auxinas y el etileno no es muy claro aun pero está presente. (2) El estrés por P induce un grupo de genes responsivos a la carencia de P y sus productos promueven el reciclaje intracelular, la solubilización y adquisición de P. La inducción de algunos de estos genes esta regulada por PHR1 e influenciada por el estatus de P en la planta y posiblemente por citocininas. (3) Pi reprime las respuestas morfológicas y moleculares evocadas por su carencia. Modificado de Abel et al. (2002) 28 de transcripción que se ha clonado y comprobado experimentalmente que participa en la regulación de dicho sistema es PHR1 (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE). Este factor de transcripción del tipo MYB, fue encontrado en un escrutinio efectuado en una población de mutantes químicas generadas en la línea transgénica AtIPS1::GUS. La mutante phr1 se seleccionó porque al crecer en condiciones limitantes de P, se carecia de la inducción del gen AtIPS1. La mutante phr1 también presentó defectos en la activación de algunos genes inducibles por bajo P y en la acumulación de antocianinas, pero las respuestas de arquitectura de la raíz se mantuvieron intactas (Rubio et al., 2001). Se ha reportado que PHR1 se une como dimero y de manera específica a una secuencia palindrómica imperfecta de 8 bp presente en el promotor de IPS y al hacer búsqueda de estas secuencias en los promotores de los genes que responden a la baja disponibilidad de P, se encontraron presentes en un gran número de ellos (Rubio et al., 2001; Franco-Zorrilla et al., 2004). La regulación de PHR1 al parecer no es a nivel transcripcional, sino postranscripcional por un proceso de sumoilación (Miura et al., 2005). Lo anterior sitúa a PHR1 en un punto crucial de la regulación del sistema de rescate a la baja disponibilidad de Pi (figura 5). 1.3.3.4.3 Papel de las hormonas en el sistema de rescate a la baja disponibilidad de P Se ha demostrado que las citocininas afectan las respuestas a la carencia de P dado que la aplicación exógena de citocininas a plantas que crecieron en bajo P reprime la expresión de genes como AtIPS1 y At4 que son inducibles por este estrés sin afectar la formación de pelos radicales (Martin et al., 2000); además, en mutantes que están afectadas en el receptor de citocininas CRE1, no se presentan los cambios antes mencionados (Franco-Zorrilla et al., 2002). Aunado a lo anterior, las concentraciones de esta hormona en las plantas estresadas disminuyen en respuesta a la carencia de P (Salama y Wareing 1979). Por lo tanto, Abel et al, (2002) postularon que esta hormona podría ser parte de la señal sistémica. Se ha reportado que las auxinas y el etileno controlan respuestas a nivel local como el aumento en la densidad de pelos 29 radicales y su alargamiento (Bates y Lynch 1996; Ma et al. 2003; Schiefelbein, 2000). Por su parte, las auxinas tienen un papel preponderante en los cambios de arquitectura durante el estrés por P (López-Bucio et al., 2002; Nacry et al., 2005) y recientemente se ha reportado que hay una sensibilidad mayor a las auxinas en las células del periciclo que darán origen a las RL (López-Bucio et al., 2005). 30 2. ANTECEDENTES La ASR determina la exploración tridimensional del suelo por la planta y el área de contacto entre la raíz y el suelo (Lynch, 1995). En estudios recientes se ha demostrado que la baja disponibilidad de fósforo altera la arquitectura de la raíz en A. thaliana. Cuando ésta planta crece en medio nutritivo con concentraciones menores que 100 µM de P, se ve favorecido el crecimiento de las raíces laterales con relación al crecimiento de la RP. En parte, éstos cambios están dados por la reducción de la longitud de la RP, que causa un aumento en la densidad de las RLs (Williamson et al., 2001). En nuestro grupo de trabajo estamos interesados en estudiar los cambios que la disponibilidad de P puede evocar en la ASR. Se ha encontrado que cuando A. thaliana crece en condiciones de P limitantes (1 µM) ocurren cambios más drásticos en la ASR. El número y densidad de las RLS se incrementa de manera muy marcada (figura 6 A y C) y la longitud de la RP se reduce drásticamente (figura 6). Asimismo hemos encontrado que estos cambios en la ASR, están directamente relacionados con la sensibilidad a auxinas (López-Bucio et al., 2002). Al mismo tiempo trabajamos en la búsqueda de mutantes que estuvieran afectadas en la respuesta del sistema radical a cambios a la baja disponibilidad de P, para esto se hizo un escrutinio en una población de semilla mutagenizada con etilmetanosulfonato, haciendo crecer a éstas en medio con carencia de P (1μM) y seleccionando aquellas que presentaran una RP que fuera al menos tres veces más larga que el resto de la población en estas condiciones (figura 18 A, flecha). De un total de 25000 semillas escrutadas, se seleccionó un grupo numeroso de 60 líneas que no mostraron respuesta (LópezBucio, 2001). Dado lo anterior nos interesa describir detpalladamente los cambios que se presentan en el sistema radical y particularmente en los procesos de división y/o elongación celular. También nos interesa analizar si los cambios descritos afectan la eficiencia de captación de fosfato por la raíz y el papel de las auxinas en este 31 proceso y con el análisis detallado de las mutantes podremos analizar los componentes genéticos que están participando en esta respuesta. Figura 6. Efecto de la disponibilidad de fosfato en la arquitectura de la raíz. (A) Plantas creciendo en condiciones óptimas (izquierda) y limitantes (derecha) de P. (B) Longitud de la raíz primaria. (C) Número de raíces laterales. Graficas tomadas de López-Bucio et al, 2002. 32 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo General Caracterizar genéticamente la respuesta morfo-fisiológica del sistema radical y en particular del meristemo de la raíz primaria de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. a la deficiencia de fósforo. 3.2. Objetivos Particulares Caracterizar los cambios morfológicos y fisiológicos que presenta el sistema radical durante el estrés por fósforo. Estudiar los cambios genéticos, morfológicos y fisiológicos, que ocurren en el meristemo de la raíz primaria, en respuesta a la baja disponibilidad de fósforo. Caracterizar un grupo de mutantes de A. thaliana que manifiestan una respuesta radical alterada a la deficiencia de fósforo, mediante análisis genéticos, morfológicos y fisiológicos. 33 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Material vegetal Para los experimentos reportados en esta tesis se utilizó Arabidopsis thaliana de los ecotipos Wassilewskija (Ws), Nossen (No-0) y Columbia (Col-0), las líneas transgénicas marcadoras de: fase G2 a M del ciclo celular CycB1;1::uidA (ColónCarmona et al., 1999), respuesta a auxinas DR5::uidA (Ulmasov et al., 1997), toma de P pAtPT1::uidA y pATPt2::uidA (Karthikeyan et al., 2002) y la línea transgénica DT-AtsM (Tsugeki y Fedoroff, 1999) que expresan la toxina de la difteria específicamente en células de la cofia y la línea “enhancer trap” CS9201 de la colección de James Haseloff et al. Que se expresa ínucamnete en tejido diferenciado (Department of Plant Science, Universidad de Cambridge, UK; http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/catalogFrame.html). 4.2. Condiciones de crecimiento 4.2.1 Crecimiento in vitro Las semillas se germinaron y crecieron según el protocolo descrito por López-Bucio et al. (2002), que consiste en: a) Esterilizar superficialmente las semillas haciendo lavados con etanol al 95% y blanqueador comercial al 20% por 5 y 7 minutos respectivamente y 5 enjuagues consecutivos con agua estéril. b) En condiciones de esterilidad, las semillas se colocan en cajas de Petri que contienen el medio de cultivo modificado MS (Murashige y Skoog) 0.1X a pH 5.7 adicionado con 0.5% (w/v) sacarosa y 1% (w/v) Phytagar (Gibco-BRL) y como fuente de P, NaH2PO4 en concentraciones limitantes (1 µm) u óptimas (1 mM). El MS modificado contiene: 2.0 mM de NH4NO3, 1.9 mM KNO3, 0.3 mM CaCl2.2H20, 0.15 mM MgSO4.7H20, 5 μM KI, 25 μM H3BO3, 0.1 mM MnSO4.H2O, 0.3 mM ZnSO4.7H20, 34 1 μM Na2MoO4.2H20, 0.1 μM CuSO4.5H20, 0.1 μM CoCl2.6H2O, 0.1 mM FeSO4.7H20, 0.1 mM Na2EDTA.2H20, inositol (10 mg/L), y glicina (0.2 mg/L). En los experimentos donde se evaluó que los cambios de arquitectura radical fueran específicos a la baja disponibilidad de P, los medios se modificaron de la siguiente forma: Para obtener los medios carentes de: a) potasio (K) se substituyó KI por NaI y se omitió KNO3, b) nitrógeno (N) se omitieron el NH4NO3 y KNO3 y como fuente de potasio se adicionó KHCO3, c) azufre (S) se substituyo el MgSO4, MnSO4, ZnSO4 y CuSO4 por sus respectivos cloruros y d) Fierro (Fe) el FeSO4 y el Na-EDTA se reemplazaron por Na2SO4 en la solución nutritiva respectivamente. c) Las cajas de Petri se mantienen durante 48 horas en obscuridad y a 4°C, con el fin de promover y sincronizar la germinación. d) Finalmente, para permitir el crecimiento del sistema radical en la superficie de la placa de agar, las cajas se colocan inclinadas con un ángulo aproximado de 65º en una cámara de crecimiento con ambiente controlado (Percival Scientific, Perry, IA, U.S.A.), con un fotoperiodo 16 h luz/8 h obscuridad e intensidad luminosa de 300 mmol/m2/s-1 a temperatura de 21-24°C en función de la duración de cada experimento. 4.2.2 Crecimiento en suelo Las plántulas germinadas in vitro y teniendo formados el primer par de hojas verdaderas, se transplantaron a moldes que contenían el sustrato especial para crecimiento de A. thaliana que contiene vermiculita, perlita y suelo orgánico (Sunshine, mezcla #3) 1:1:3 respectivamente. El sustrato se esterilizó previamente, humedeciéndolo con agua destilada y colocándolo en una autoclave por 30 minutos a 1.5 atmósferas de presión. Los moldes se cubrieron para mantener la humedad y se pasaron a cámaras de crecimiento vegetal (CONVIRON Scientific) con fotoperiodo 12 horas luz:12 obscuridad a 24°C. Las plantas se regaron con solución nutritiva (MS 0.1X) los dos primeros riegos y agua destilada el resto de los riegos. 35 4.3 Estudio de los componentes de la arquitectura radical y pelos radicales La cuantificación se efectuó directamente en las plantas creciendo en las cajas de Petri, para cada uno de los tiempos estipulados en cada experimento. La longitud de la RP se midió usando una escala de plástico. Para contar las RLs se hicieron observaciones en el estereomicroscopio (AFX-II-A Nikon, Tokio), tomándose en cuenta sólo aquellas que fueran observadas con el objetivo 3X. Para establecer el número y longitud de pelos radicales, se tomaron fotografías de la zona de diferenciación más cercana al ápice (1-0.5 cm), para lo cual se empleó un estereomicroscopio (5ZH10 Olympus) acoplado a una cámara de video (KP-D51 Hitachi). Las imágenes fueron procesadas usando Scion Image software libre (Scion Corporation, U.S.A.; www.scioncorp.com). 4.4 Análisis anatómico e histológico del sistema radical 4.4.1 Cortes histológicos Con el fin de fijar los tejidos, las muestras se incubaron a 4°C durante toda la noche en una solución al 1.5% de glutaraldehído y 0.3% de paraformaldehído (v/v) y 25 mM del amortiguador PIPES (Piperazina-N,N’-bis [ácido 2 etanesulfonico]). Las muestras fijadas se deshidrataron a temperatura ambiente haciendo cambios graduales en soluciones de etanol partiendo de una concentración de 10% hasta llegar al 100% (v/v). En cada cambio se incrementó la concentración en un 10 % y permanecieron las muestras 15 minutos en cada solución. Las muestras deshidratadas se embebieron en Historesina (Leica Instruments GmbH, Heidelberg) colocándolas en una mezcla de etanol:historesina en proporciones 3:1, 1:1, 1:3 por dos horas en cada una de ellas y por 24 horas en historesina pura. De las muestras embebidas en plástico se hicieron cortes de 3μ en un microtomo Leica RM 2155 (Leica Microsystems Nussloch GmbH). Los cortes se montaron en portaobjetos cubiertos con gelatina (Baum y Rost, 1996) y se tiñeron usando la reacción modificada de 36 PAS, para lo cual los portaobjetos se colocan en ácido peryódico (1 g/dl) por 20 minutos a 40°C, seguido por el reactivo de Schiff preparado por el método de DeTomasi (1936)con base en Pararosanilina HCl (Sigma®) por 60 minutos a temperatura ambiente (O'Brien and McCully, 1981) y como tinción de contraste se usó una solución acuosa de 0.05% de azul de toluidina O por 30 segundos (Electron Microscopy Sciences). 4.4.2 Clareo de tejidos Para hacer las observaciones microscópicas del sistema radical las muestras fueron clarificadas utilizando el método modificado de Malamy y Benfey (1997) en el cual las plantas se incuban en una solución de HCl 0.2N y metanol al 20% durante 50 minutos a 62° C, la cual es remplazada por NaOH al 7% en etanol al 40% se incuba a temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente se hacen cambios graduales de etanol al 40, 20 y 10% cada uno de 15 minutos. En el último cambio se le agrega un volumen de glicerol al 50% y se deja por lo menos una hora antes de ser transferido a glicerol al 50%. Las muestras se mantienen al menos 24 horas en esta solución para finalmente montarse en portaobjetos usando glicerol al 50%. Todas las laminillas se analizaron con óptica de Nomarski, se tomaron fotografias usando una cámara digital (Leica DC180) acoplada a un microscopio (Leica DMR) y el programa de captura de imágenes Leica IM50 4.6. 4.4.3 Ensayos histoquímicos La localización histoquímica del gen reportero que codifica para la enzima βglucoronidasa (GUS) se hizo incubando las plantas a 37 °C durante 12 horas en la solución que contiene el sustrato para la enzima GUS, X-Gluc (1mg/ml de 5-bromo-4cloro-3-indolil-β-D-glucurónido), 10 mM de acido etileno diamino tetracético, 1% w/w de X-Triton, 5 mM de ferricianuro de potasio, 5 mM de ferrocianuro de potasio en 37 amortiguador de NaPO4 100 mM, pH 7) como lo reporta Stomp (1992). Seguido a esto se procedió a clarificar las muestras. Para visualizar los gránulos de almidón característicos de las células de la cofia, las plantas se colocaron en solución acuosa de Lugol (yodo 5% y yoduro de potasio 10% w/v; Sigma®) durante tres minutos, seguido a esto, se enjuagaron tres veces en agua destilada. Las muestras se montaron en solución que contenía hidrato de cloral al 74% w/w y glicerol al 7.4% y se tomaron las fotografías (Umeda et al. 2000). 4.4.4 Medición y cuantificación celular El conteo celular se hizo en muestras clarificadas, directamente al microscopio (Leica DMR). Se consideraron células del meristemo a todas aquellas presentes en la zona meristemática que mantenían su tamaño constante y como células de la zona de elongación desde aquellas que eran del doble de tamaño que las meristemáticas hasta las que se habían alargado pero que no se habían diferenciado aún. Se tomaron fotografías de células de la epidermis de la zona de diferenciación y a partir de las imágenes y utilizando el programa Scion Image se midió la longitud de las células. 4.5 Evaluación cualitativa de la exudación de fosfatasas Se prepararon 200 ml de una solución de agarosa de bajo punto de fusión al 0.8% y cuando se enfrió a 50°C se le adicionó 30 μl del reactivo BCIP (5-bromo-4-cloro-3indolil-fosfato; GIBCO BRL). Los sistemas radicales de las plantas en las placas de agar fueron cubiertos con una capa delgada de dicha agarosa y una vez gelificada las cajas de Petri se incubaron a 37°C durante toda la noche. Las raíces coloreadas de azul se consideraron positivas para la exudación de fosfatasa. 38 4.6 Selección y caracterización de las mutantes afectadas en los cambios en la arquitectura radical evocados por la baja disponibilidad de P. 4.6.1 Selección de las mutantes Previamente a este trabajo, en nuestro grupo se realizó un escrutinio para identificar mutantes que estuvieran afectadas específicamente en la respuesta del sistema radical a la carencia de P. Para esto se sembraron 25,000 semillas (Col-0) mutagenizadas con etilmetanosulfonato (EMS) bajo condiciones de P limitante, (para más detalles sobre el escrutinio ver López-Bucio, 2001). Estas mutantes, al crecer en medio con 1 µM de P, forman una RP que mantiene un crecimiento constante y presenta escasas RLs, es decir, crecen como si estuvieran en medio con fosfato óptimo (1 mM). Con la finalidad de seleccionar el subgrupo de mutantes con las que se trabajó, en plantas adultas pertenecientes al grupo de mutantes de raíz larga reportados por López-Bucio (2001) se evaluaron los parámetros de: porcentaje de germinación, diámetro de la roseta, altura de la planta, tiempo de floración, número de silicuas, producción de semillas y que el fenotipo se mantenga constante después de tres generaciones. 4.6.2 Análisis genético y cruzas con líneas transgénicas marcadoras Todas las cruzas se hicieron con ayuda de un estereomicroscopio (AFX-II-A Nikon, Tokio), usando pinzas de punta fina. Las plantas que se utilizaron como madres se emascularon disectando a los botones florales todos los verticilos florales exceptuando el gineceo. Después de tres días de la emasculación el polen de la planta padre fue transferido al estigma intacto. Tanto en la generación F1 y F2 se colectaron las semillas y se germinaron y crecieron en medio con baja disponibilidad de P para verificar la segregación. Los datos obtenidos se procesaron utilizando la prueba estadística de ji-cuadrada (χ2). Las mutantes lpi (low phosphorus insensitive) se cruzaron tres veces con el ecotipo silvestre (Col-0) con la finalidad de eliminar 39 mutaciones no asociadas al fenotipo. Con las mutantes homocigotas se hizo lo siguiente: Para determinar la dominancia o recesividad de la mutación, se cruzaron a cada una de las mutantes lpi con su ecotipo silvestre (Col-0). Para determinar cuantos genes se encuentran representados en el grupo de mutantes, se cruzarón cada una de ellas con las restantes del grupo y se formaron grupos de complementación. Para evaluar parámetros como división celular, respuesta a auxinas y expresión de transportadores de alta afinidad en las mutantes lpi, se cruzaron las líneas transgénicas CycB1;1::uidA, DR5:uidA, AtPT1:uidA y AtPT2:uidA con cada una de las mutantes lpi, estas últimas usadas como madres. Las plantas F3 homocigotas para la mutación y que portan el gene reportero se usaron para los experimentos. 4.6.3 Cuantificación del contenido total de P en los tejidos vegetales La determinación del contenido total de P se hizo siguiendo el protocolo modificado de Hesse (1971) para lo cual todo el material de cristal se descontaminó sumergiéndolo durante toda la noche en ácido nítrico al 2% y enjuagándolo al menos tres veces con agua desionizada. En vasos de precipitado se colocó 90 mg de tejido seco y 10 ml de una solución de ácido nítrico:perclórico 5:1 y se dejó durante toda la noche en una campana de extracción, con el fin de degradar las muestras. Después se colocaron en una plancha caliente hasta que se evaporaron. Posteriormente el residuo se dejó enfriar, se disolvió en 10 ml de agua desionizada (la solución debe ser transparente y sin residuos sólidos) y se transfirió toda la solución a un matraz aforado de 25 ml, al que se le agregó 5 ml de la solución reveladora de vanadiomolibdato y se aforó con agua desionizada, se agitaron manualmente y se dejaron incubar por 30 minutos a temperatura ambiente y en obscuridad. Con ayuda de un espectrofotómetro (DU® 650, Beckman), a las muestras se les midió la absorbencia a 420 nm. A la par se elaboró una curva patrón usando concentraciones de 0, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 μg.μl-1 de NaH2PO4. Con base en el coeficiente de 40 regresión de la curva patrón, se calculó la concentración de P de las muestras experimentales. 4.6.4 Medición del contenido total de antocianinas en los tejidos vegetales Las antocianinas se extrajeron moliendo en mortero 500 mg de tejido fresco con 5 ml de una solución de metanol:ácido clorhídrico 95:5, dejándolo por 12 horas a 4°C en obscuridad para finalmente centrifugar y obtener el extracto sin partículas sólidas. El contenido total de antocianinas se obtuvo utilizando el método de pH diferencial (Giusti y Wrolstad, 2001), que consta de agregar 200 μl de muestra a 800 μl de cada una de las siguientes soluciones amortiguadoras: cloruro de potasio (0.025 M, pH 1.0) y acetato de sodio (0.4 M, pH 4.5), se deja reaccionar por 15 minutos y se mide la absorbencia a 520 y 700 nm (DU® 650, Beckman). Con los datos obtenidos se calcula el valor de A, A = [(A520–A700)pH1.0 – (A520–A700)pH4.5] para cada muestra y con este dato se calcula la concentración dada en mgl-1=[(A)(Mw)(DF)(1000)]/(є), donde Mw=449.2, DF=5 y є=26900. 4.6.5 Extracción de RNA y ensayos de hibridación tipo Northern El RNA total se extrajo de raíces y follaje de plantas creciendo en condiciones limitantes y óptimas de P agregando 1 ml de reactivo TRIZOLTM (Invitrogene) por cada 150 mg de tejido previamente congelado y pulverizado, dejándose incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras se centrifugaron a 12000 g por 15 minutos a 4°C, recuperándose el sobrenadante y dejándose incubar por otros 5 minutos. Seguido a esto se adicionaron 200 μl de una solución de cloroformo:alcohol isoamílico 24:1 por cada ml de sobrenadante recuperado y se agitaron. Los tubos se centrifugaron a 12000 g por 15 minutos a 4°C y el sobrenadante se recuperó, se le agregaron 0.5 volúmenes de isopropanol grado HPLC y se dejo incubar por 20 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó a 12000 g por 10 minutos a 4°C, se decantó el sobrenadante, la pastilla se lavó con 1 41 ml de etanol (grado HPLC) al 75% dos veces y se dejó secar. Finalmente se resuspendió la pastilla en 30 μl agua tratada con DEPC (Dietil pirocarbonato) y se dejo durante 4 horas a 4°C. Se verificó la integridad del RNA por medio de electroforesis en un gel de agarosa (0.8%) y se cuantificó en un espectrofotómetro (λ=260 nm). Para los experimentos de hibridación tipo northern, 10 μg de RNA total se resuspendieron en 13 μl de agua tratada con DEPC y se le agregaron 1.25 μl de ácido morfolino propanosulfónico (MOPS; Sigma®) 10X pH7, 6.25 μl de formamida (usb®), 2μl de formaldehído (37%; Sigma®), 4 μl de amortiguador de carga y 0.2 μl de bromuro de etidio (10 mg/ml), la mezcla se mantuvo en baño maría a 65 °C por 5 minutos y finalmente se dejó en hielo por 5 minutos. Las muestras se separaron por medio de electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa (GIBCO BRL) al 1% (w/v) a 90 volts por 90 minutos. Los geles contenían formaldehído 2.2 M y MOPS 1X. La transferencia se hizo durante 12 horas a una membrana Hybond-N1 (Amersham Biosciences), usando el amortiguador de transferencia de citrato de sodio salino (SSC) 6X. El RNA se fijó a la membrana por entrecruzamiento inducido por luz ultravioleta en un StratalinkerTM (1200 μJ/cm2) y se horneó a 80°C por 2 horas. Las sondas para los genes AtACP5 (del Pozo et al., 1999), At4 (Burleigh y Harrison, 1999), AtPT1 y AtPT2 (Muchhal et al., 1996), AtIPS1 (Martín et al., 2000) y AtPAP1 (Li et al., 2002) se marcaron radiactivamente usando el sistema “DECA prime II DNA labeling kit” (Ambion). Se prehibridó la membrana a 42°C durante 4 horas; seguido a esto se agregó la sonda marcada para hibridar y se dejo incubar a 42°C en agitación constante, por al menos 12 horas. Se hicieron dos lavados con SSC (2X) y SDS (0.1%) por 5 minutos a temperatura ambiente, seguido a esto se hicieron dos lavados a temperatura ambiente por 5 minutos con SSC (0.2X) y SDS (0.1%) y dos a 42°C durante el mismo tiempo y las mismas soluciones. Las membranas se expusieron en películas fotográficas (Biomax MSTM, Kodak) desde 12 horas hasta 5 días dependiendo de la señal. Las películas fueron reveladas y digitalizadas para su análisis usando el programa Scion Image. 42 4.7 Mapeo posicional de los genes mutados Para poder mapear el gen mutado, se generó la población de mapeo cruzando a las mutantes con un ecotipo polimórfico (WS); se revisó el fenotipo del sistema radical de la F1 en condiciones limitantes de P y se dejaron autofecundar. Las plantas F2 homocigotas para la mutación se usaron para hacer el mapeo utilizando marcadores moleculares tipo Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (CAPS) y Simple Sequence Length Polymorphisms (SSLPs; Konieczny y Ausubel, 1993; Bell y Ecker, 1994). Se colectó tejido y se extrajo DNA por separado de cada planta siguiendo los procedimientos reportados por Lukowitz et al. (2000). Para determinar a qué cromosoma estaba ligada la mutación se efectuó un análisis de segregantes mezcladas “Bulked Segregant Analysis” propuesto por Lukowitz et al., (2000); para lo cual se tomó una alícuota de DNA extraído de 50 plantas, se mezclo y se evaluaron Tabla 1 Marcadores usados para el análisis de segregantes mezcladas “bulked segregant analysis” Crom. (cM) Marcador BAC Iniciador directo (5´→3´) Iniciador reverso (5´→3´) Tamaño del producto de PCR (bp) Col Ler Ws [MgCl2] (mM) Se muestran los datos de los marcadores en la tabla de izquierda a derecha: El cromosoma en el que se ubican, la distancia en centimorgans (cM), BAC, secuencia de los iniciadores directos y reversos, tamaño de los productos esperados para cada ecotipo y la concentración recomendada de MgCl2 para las reacciones de PCR. Tomado del material complementario de (Lukowitz et al., 2000) 43 22 marcadores (SSLPs; tabla 1) que se encuentran representados a lo largo de los 5 cromosomas. Los métodos utilizados se encuentran disponibles públicamente en las bases de datos de The Arabidopsis Information Resource (TAIR; http://arabidopsis.org) y en los datos suplementarios de Lukowitz et al., (2000). Ya que se identificó el brazo del cromosoma en el que está ubicada la mutación, se procedió a establecer el intervalo de mapeo, evaluando las muestras individualmente para marcadores tipo SSLPS y CAPs (Bell y Ecker, 1994; Konieczny y Ausubel, 1993) que estén a 10 cM del marcador ligado. Se determinó el porcentaje de recombinación de la población segregante con base en los resultados se redujo ese intervalo. 4.8 Análisis estadísticos En todos los experimentos los datos fueron analizados estadísticamente utilizando el programa SPSS 10. Se efectuó análisis univariado y/o multivariado con la prueba de Tukey o Duncan (P<0.05). 44 5. RESULTADOS 5.1 Cambios genéticos, morfológicos y fisiológicos, que ocurren en el sistema radical y el meristemo de la raíz primaria, en respuesta a la baja disponibilidad de P. 5.1.1 La disponibilidad del P altera la arquitectura del sistema radical y la estructura del meristemo de la raíz primaria Cuando se germinaron semillas de A. thaliana (Col-0) en placas de agar que contenían MS 0.1X suplementado con diferentes concentraciones de P, las plantas que crecieron en medio óptimo (1 mM) de P (MOP) manifestaron un crecimiento Figura 7. Efecto de la disponibilidad de fósforo en la arquitectura del sistema radical. (A) plantas de 16 días creciendo en condiciones óptimas (izquierda) y limitantes (derecha). (B) ápices de la raíz de plantas de 8 días creciendo en condiciones óptimas (izquierda) y limitantes (derecha). continuo de la RP y pocas RLs, que crecían cerca de la base del tallo (figura 7 A). En contraste, las plantas que crecieron en medio limitante (1 µM) de P (MLP), presentaron cambios dramáticos en su arquitectura radical, incluyendo una 45 disminución en la longitud de la RP, una alta densidad de RLs y un aumento en la longitud y densidad de los pelos radicales (figura 7 A y B). Desde los 8 días después de la germinación (D.D.G.) estos cambios fueron apreciables en las plantas que crecieron en MLP comparándolas con las que crecieron en MOP, como se puede apreciar en la tabla 2. Tabla 2. Características del sistema radical de A. thaliana creciendo en condiciones limitantes (1 µM) y óptimas (1 mM) de P. P limitante P óptimo Densidad de pelos radicales (número/mm) 42.1 (1.7) a 24.3 (0.8) b Longitud de pelos radicales (µM) 415.4 (22.5)a 127.4 (15.5) b Longitud de la raíz primaria (cm) 1.1 (0.2) a 2.5 (0.4) b Número de raíces laterales maduras 2.6 (0.4) a 1.1 (0.3) b Las mediciones se efectuaron 8 días después de la germinación (D.D.G.). Los datos muestran las medias y la desviación estándar. Para cada parámetro medido, se usan letras diferentes para indicar las medias que difieren significativamente (P< 0.05). Para el día 16 después de haber germinado, las plantas que crecieron en MOP presentaron un meristemo formado por células proliferativas pequeñas, además de presentar los gránulos de almidón típicos de las células de la columela y ausencia de éstos en sus iniciales (figura 8 A). En contraste, las plantas que crecieron en MLP no presentaron gránulos de almidón en la columela (figura 8 B). Además el cambio de expresión del gen reportero que codifica para la proteína verde fluorescente en la línea “enhancer trap” especifica de tejido diferenciado CS9201, la pérdida de la estructura típica del meristemo y la formación de pelos radicales cercanos al ápice de la RP durante este estrés podría sugerir que las células del meristemo han cambiado su identidad y se mantiene metabólicamente activas (figura 8 A, B, C y D). Para establecer a nivel más fino cuáles son los cambios en la región apical de la RP, efectuamos cortes histológicos de dicha región en plantas de 12 días de crecimiento en presencia y ausencia de P. En las plantas que crecieron en MOP, la anatomía de la región meristematica presento una estructura típica, con un QC y células iniciales 46 bien definidas y gránulos de almidón conspicuos en la columela (figura 8 E y G) Figura 8. Efectos de la disponibilidad de P en el meristemo de la raíz primaria. Gránulos de almidón observados en la raíz primaria de Arabidopsis creciendo en condiciones óptimas (A) y limitantes (B) de P. Patrón de expresión del la proteía verde fluorescente (GFP) en la línea transgénica CS9201 creciendo en medio con alto (C) y bajo (D) P. Cortes longitudinales del ápice de la raíz de Col-0 creciendo en condiciones óptimas (E) y limitantes (F). Acercamiento de la región del QC y la columela (G) y (H) correspondientes a E y F respectivamente. Nótese que no hay gránulos de almidón en las células de la cófia (B y H) ni formación de pelos radicales y protoxilema cercanos a la punta. Plantas de 16 días de crecimiento (A–D). Plantas de 12 días de crecimiento (E–H). Barras de escala en A-D = 100 μm, en (E y F), (G) y (H) son iguales a 20, 40 y 10 μm, 47 similar a lo reportado por Baum et al. (2002). En contraste, en las plantas que crecieron en MLP se perdió la organización típica del MRP, no presento un QC ni células iniciales claramente definidas y además no hubo presencia de los gránulos de almidón en las células de la columela (figura 8 F y H). El ápice de la raíz es más grueso debido a un crecimiento isodiamétrico de las células que forman el meristemo (figura 8 F). Asimismo se apreció que están ocurriendo procesos de diferenciación en el meristemo porque se observó que la diferenciación del protoxilema ocurre en la región más cercana al ápice, que anteriormente estaba ocupada por las células del meristemo (140 μm desde el área del QC) y porque en distancias de 10 células a partir de sus iniciales, los tricoblastos se están diferenciando para formar pelos radicales (figura 8 E y F). De igual manera, al observar al microscopio el ápice de la RP de una muestra 20 de raíces clarificadas se encontró que la formación de las RLs ocurre más cercana al ápice en plantas que crecen en MLP. En plantas que crecen en MOP los PRLs se encontraron más cercanos al ápice a una distancia de la punta de 2 a 3 mm, mientras que en MLP se encontraron a una distancia de 300 a 450 μm. Lo anterior nos indica que la baja disponibilidad de P induce cambios anatómicos en la región apical de la RP y se continúan procesos de diferenciación. 5.1.2 Los cambios en la arquitectura de la raíz son evocados específicamente por la disponibilidad de P Dado que se ha reportado que la disponibilidad de algunos nutrimentos como el fierro y el nitrógeno evocan cambios en el sistema radical (Malamy y Ryan, 2001; Forde, 2002), existe la posibilidad de que las respuestas anteriormente descritas (apartado 5.1.1) no sean específicas a la disponibilidad de P. Para descartar esta posibilidad hicimos germinar y crecer a A. thaliana en medios de cultivo carentes de potasio (K), nitrógeno (N), azufre (S) y fierro (Fe), cuantificamos los componentes de la arquitectura del sistema radical, con el fin de compararlos con las plantas crecidas en condiciones de carencia de P y control (P óptimo). Encontramos que el eliminar del medio el N, Fe o S no tuvo ningún efecto en la longitud de la RP (figura 9 A y C). 48 En el medio carente de K, la longitud de la RP es menor, sin embargo no presenta desorganización celular, ni formación de pelos radicales cercanos a su meristemo (figura 9 A y C panel inferior). El número de las RLs se incrementa únicamente en las B N ú m ero de raíces laterales A L o n g itu d d e la raíz p rim aria (cm ) plantas que crecen en MLP y S, pero en la carencia de S la formación de RLs es C 6 a 5 4 a a S Fe a b 3 2 c 1 0 Cont P K N a 8 7 6 5 4 b c c 3 2 c c 1 0 Cont P K N S Fe Control P K N Fe S Figura 9. Cambios en la arquitectura del sistema radical de A.thalianas en respuesta a la carencia de algunos nutrimentos. Efecto de la carencia del nutrimento indicado en el crecimiento de la raíz primaria (A) y el número de raíces laterales (B). (C) Fotografías de plantas creciendo en carencia de en nutrimento indicado (panel superior), acercamiento del meristemo de la raíz primaria (Paneles inferiores) de las líneas transgénicas CycB1;1:uidA. Los valores en (A) y (B) representan la media, n=30 ± SE. Plantas de 14 D.D.G. creciendo en medios carentes del nutrimento indicado. Las letras indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). 25% menor que en P (figura 9 B). Lo cual nos sugiere que la disminución de la longitud de la RP y la diferenciación celular en la región meristemática es evocada específicamente por la carencia de P y que el incremento en el número de RLs es especifico para la carencia de S y de P, pero con mayor intensidad que en el medio carente de P. 49 5.1.3 La disponibilidad de P afecta el crecimiento de la raíz primaria y el número de raíces laterales Para comparar los efectos temporales de la disponibilidad de P en el crecimiento de la RP, la formación de RLS y en función de estos datos, calcular la densidad de RLs (DRLs; Longitud de la raíz primaria (cm) A 8 6 C Número de raíces laterales RLs por cada centímetro de la longitud total de la raíz P limitante primara), hicimos crecimiento, semillas 2 de cinéticas germinando A. thaliana y de creciendo Col-0, en condiciones limitantes y óptimas de P y 2 4 6 8 10 12 14 cada dos días se cuantificaron los parámetros antes mencionados. Se encontró que durante los primeros 4 16 D.D.G., las plantas creciendo en ambas 12 condiciones 8 tienen una tasa de crecimiento similar. Sin embargo a partir 4 de este día se observó una reducción del 0 2 4 6 8 10 12 14 crecimiento de la RP en las plantas que crecieron en MLP, en comparación con Densidad de las raíces laterales B de P óptimo 4 0 número 14 las plantas que crecieron en MOP que 12 presentaron un crecimiento constante. 10 8 Alrededor de los 10 D.D.G. cesó el 6 4 crecimiento de la RP de las plantas en 2 MLP y su longitud se mantuvo entre 1.3 y 0 2 4 6 8 10 12 14 D.D.G. Figura 10. Efecto de la disponibilidad de P en el crecimiento del sistema radical y en la formación de raíces laterales. Cinéticas de (A) longitud de de la raíz primaria, (B) número de raíces laterales y (C) densidad de las raíces laterales. Los valores graficados son las medias ± SE, n = 30. 1.5 cm hasta los 14 días que duró el experimento (figura 10 A). La primera raíz lateral emergió entre los 4 y 6 D.D.G., tanto en condiciones limitantes como óptimas de P. Sin 50 embargo, el incremento en el número de las RLs fue de 3 a 4 veces mayor en plantas que crecieron en MLP, comparándolas con las que crecieron en MOP (figura 10). Como consecuencia, la densidad de RLs de las plantas no estresadas mostró un ligero incremento hasta llegar a ser constante al día 10 D.D.G. En contraste, las plantas estresadas presentaron un incremento exponencial alrededor del día 8 y para el día 14 tenían de 4 a 5 veces mayor densidad de las RLs que las plantas no estresadas. Por lo que pudimos apreciar que la disponibilidad de P afecta de manera gradual al programa de desarrollo postembrionario del sistema radical de A. thaliana. 5.1.4 Los procesos de elongación y división celular se modifican en respuesta a la disponibilidad de P Dado que el crecimiento de la raíz ocurre en su región distal como resultado de la actividad proliferativa de las células del meristemo apical y la expansión rápida y controlada de las células en la zona de elongación, se hizo un análisis detallado de los cambios temporales que ocurren en el meristemo así como en las zonas de diferenciación y de elongación de raíces primarias de A. thaliana creciendo en P óptimo y limitante; lo anterior con la finalidad de determinar si el fenotipo de raíz corta observado en las plantas que crecen en MLP se debe a una reducción en la longitud celular o una reducción en la división celular o por la combinación de ambas. Se midió la longitud de los tricoblastos, los cuales acaban de entrar a la zona de diferenciación. Se encontró que en las plantas que crecieron en MOP, la longitud promedio de las células (147 ± 4 μm) permaneció constante durante los 14 días que duró el experimento. En contraste, en las plantas que crecieron en MLP, se observó una reducción en la longitud de estas células desde los primeros días después de su germinación, hasta llegar a su menor tamaño (30 ± 1 μm) el día 10, siendo 70% más cortas comparándolas con aquellas que crecieron en MOP (figura 11 A). El proceso de alargamiento ocurre durante el paso de las células por la zona de elongación; dicha zona disminuye su tamaño cuando hay estrés por P (figura 7 B). Esta reducción puede ser únicamente como consecuencia de una disminución de la 51 longitud de las células que la conforman sin afectar el número de éstas, o bien por una diferenciación de las células que permanecen en esta zona. Por lo tato contamos el número de células en una sola fila (que darán origen a la epidermis diferenciada), presentes en la zona de elongación. Los límites de dicha zona los tomamos a lo largo de la RP a partir de la primer célula que fuera del doble del tamaño que las células meristemáticas, hasta la primera célula que mostrara claramente la iniciación de un pelo radical. En las plantas que crecieron en MOP, desde el día 2 hasta que terminó el experimento, la zona de elongación presentó de 8 a 10 células en promedio. Por el contrario, en plantas que crecieron en MLP, además de observarse que la longitud de las células se afectó, se encontró una disminución dramática en el número de células que forman ésta zona perdiéndose la zona de elongación completamente al día 12 después de la germinación (figura 11 B). Lo anterior nos sugiere que, durante el estrés por P, la longitud de la RP se ve afectada al menos en parte por la disminución en la Figura 11. Cambios temporales de los parámetros celulares de la raíz de Arabidopsis thaliana durante el estrés por P. (A) longitud celular, (B) número de células epidérmicas alongándose y (C) número de células meristemáticas. Col-0 A y B, CycB1;1:uidA C. Se muestran los valores de las media ± SE, con una muestra de 30 raíces. elongación celular, causada por la diferenciación gradual y prematura de las células que salen de la región meristemática, teniendo como consecuencia final el agotamiento de la zona de elongación. Es conveniente remarcar que los procesos de 52 iniciación de las RLs ocurren mucho más cercanos a la punta de la RP, (300 a 500 μm) cuando las plantas crecen en estrés por P que cuando crecen en óptimas condiciones (2 a 3 mm). El siguiente paso efectuado fue investigar si el bajo P podría estar afectando los procesos de división celular en el MRP. Para esto se contó el número de células en el MRP de las plantas que crecieron en condiciones óptimas y limitantes de P, durante 14 días. Se observó que el número de células en la zona meristemática de las plantas creciendo en MOP permaneció constante durante el experimento (20 a 31 células), mientras que en las plantas que crecieron en MLP, el número celular Figura 12. Cambios temporales en la expresión del gen reportero GUS en las líneas marcadoras de mitosis CycB1;1:uidA (A-E y K-Ñ) y de respuesta a auxinas DR5:uidA (F-J y O-S) en respuesta a la disponibilidad de P. Patrón de expresión de plantas creciendo en P óptimo (A-J) y limitantes (K-S). Fotos representativas de una muestra de l5 raíces para cada tratamiento. 53 disminuyó desde etapas tempranas (4 días) y se siguió reduciendo hasta que no se identificaron células que al menos en morfología aparentaran ser meristemáticas (figura 11 C). Las células presentes mostraron características de células diferenciadas y sin aparente capacidad de división. Para tener evidencia molecular de que la actividad mitotica de estas células había cesado, se analizó la expresión temporal en plantas transgénicas del marcador específico del ciclo celular en la tansición G2 a M CycB1;1:uidA creciendo en alto y bajo P. En las plantas creciendo en MOP, la localización e intensidad de la expresión de CycB1;1:uidA se presentó fuertemente relacionada con la región meristemática, mostrando un patrón de expresión en las células en división cubriendo aproximadamente 200 μm, sin detectarse actividad en el centro quiescente o en la cofia de la RP (figura 12 A a E). En MLP, la expresión de CycB1;1:uidA durante los primeros días después de la germinación fue similar a las plantas que crecieron en MOP (figura 12 K a M), sin embargo, conforme pasó el tiempo este patrón de expresión se alteró hasta que a partir de los 12 días después de la germinación y hasta que el experimento finalizó, la expresión fue completamente ausente en la región meristemática de la RP, evidenciando la ausencia de divisiones celulares (figura 12 N y Ñ). Los resultados anteriores indican que bajo condiciones limitantes de P, la actividad mitótica en el MRP disminuye hasta perderse totalmente y agotarse. Lo cual contribuye al fenotipo de raíz corta evocado por la baja disponibilidad de P. 5.1.5 La deficiencia de fósforo altera la expresión del marcador de respuesta a auxinas en la raíz primaria Se ha reportado que en el ápice de la raíz es necesaria la formación de un gradiente de respuesta a auxinas para que se mantenga de manera correcta la estructura, la organización y la actividad mitótica del meristemo (Sabatini et al., 1999). Para determinar si la pérdida de división celular y los cambios en la anatomía del meristemo se correlacionan con cambios en el gradiente de respuesta a auxinas, se analizó la expresión temporal del marcador DR5:uidA en plantas que se encontraban 54 en bajo y alto P. Las plantas transgénicas que expresan el marcador DR5:uidA han sido utilizadas para visualizar regiones responsivas a auxinas (Ulmasov et al., 1997). Estas plantas nos permiten la visualización del gradiente de auxinas en la región distal del MRP (Sabatini et al., 1999). Se encontró que en los ápices de plantas creciendo en MOP, la respuesta máxima a auxinas, revelada por la expresión de DR5:uidA, se presentó en las células de la columela y las células del centro quiescente. También se detectó actividad de GUS en el cilindro central, particularmente en el procambium. La actividad de GUS en este tejido es variable y se puede presentar en la parte central o en capas celulares periféricas (figura 12 F). No se observaron cambios en el patrón de expresión de este marcador en plantas creciendo en condiciones óptimas desde el día 4 hasta el día 16 postgerminación (figura 12 F a J) similar a lo previamente reportado para plantas de A. thaliana (Sabatini et al., 1999). La expresión de DR5:GUS en plantas creciendo en MLP es similar en los primeros días después de la germinación (figura 12 O comparada con F). Para el día 8 la expresión disminuye en el cilindro central y en las células de la columela hay una disminución notable (figura 12 Q). A partir del día 12 D.D.G. se presentó una actividad residual en células que aparentemente fueron de las iniciales del procambium (figura 12 R y S). Los resultados indican que bajo condiciones limitantes de P, la disminución de la actividad mitótica en el MRP se correlaciona con la disminución en la respuesta a auxinas y el subsecuente agotamiento del meristemo. 5.1.6 El agotamiento del meristemo de la raíz primaria se correlaciona con el incremento en la expresión de genes que participan en el sistema de rescate al estrés por P Tomando en cuenta por un lado que la baja disponibilidad de P evoca cambios en la identidad de las células presentes en el ápice de la RP, por lo que estas células pierden su capacidad de dividirse, y por otro lado que el estrés por P induce un sistema de rescate que incluye la activación transcripcional de transportadores de P de alta afinidad (PT) y la exudación de ácidos orgánicos y fosfatasas ácidas (FA) que 55 permiten a la planta incrementar la toma de P desde la rizosfera (Raghothama, 1999), podríamos esperar que las células que han dejado de ser meristemáticas se diferencien para participar en la toma de P. Para investigar la relación entre el agotamiento del meristemo y el sistema de rescate inducido en bajo P, se hizo un monitoreo a varios tiempos de la inducción de dos procesos regulados por la disponibilidad de P, la exudación de FAs y la expresión dirigida por los promotores de los genes que codifican para los transportadores de alta afinidad de P AtPT1 y 2, en Figura 13. Efecto de la disponibilidad de P en: La exudación de fosfatasas ácidas en plantas de Arabidopsis creciendo en alto P (A) y bajo P (B-E). La expresión del gen reportero GUS fusionado a los promotores de los genes AtPT2 y AtPT1 sin estrés por P (F y K) y en el éstres (G a J y L a O) respectivamente. La flecha indica una raíz lateral que no presenta expresión de GUS. Fotos representativas de una muestra de l5 raíces para cada tratamiento, barra de escala 100 μm. 56 plantas creciendo en condiciones óptimas y limitantes de P. Bajo nuestras condiciones experimentales y durante el tiempo que duró el experimento (16 días), no se observó la exudación de FAs en las plantas que crecieron en MOP (figura 13 A). En plantas que crecieron en MLP a partir del día 10 se observó claramente una coloración azul, que nos indicó la exudación de FAs, en los ápices radicales (figura 13 B a E). La región que presentaba mayor exudación de FAs (deducida por la intensidad del color azul) fueron los meristemos agotados y los pelos radicales maduros (figura 13 C a E). Las plantas transgénicas pAtPT2:uidA creciendo en condiciones óptimas de P no mostraron actividad de GUS en el sistema radical, incluyendo las regiones meristemáticas, durante los 16 días que duró el experimento (figura13 F). De igual forma, no se presentó expresión de GUS en las plantas que crecieron en MLP menores de 8 días (figura 13 G). En contraste, desde los 10 D.D.G. las plantas que crecieron en MLP mostraron una fuerte expresión de GUS en todo el sistema radical y con más intensidad en los meristemos agotados (figura 13 H a J), similar a lo previamente reportado (Karthikeyan et al. 2002). Las líneas transgénicas pAtPT1:uidA que crecieron en MOP presentan una expresión de GUS baja en todo el sistema radical exceptuando las zonas meristemáticas y de elongación donde no se detectó expresión (figura 13 K). En las líneas transgénicas que crecieron en MLP, la expresión de GUS se incrementó considerablemente y los ápices de la raíz expresaron GUS conforme el proceso de diferenciación avanzó hacia el ápice de la raíz hasta alcanzar el meristemo (figura 13 L a O). Es de notar que solamente el tejido diferenciado expresa GUS, ya que en las RLs recién emergidas en plantas de 16 D.D.G., no se pudo detectar su expresión (figura 13 O flecha). En conjunto, estos datos nos permiten proponer que el programa de desarrollo que evoca la deficiencia de P se correlaciona al menos temporalmente con la exudación de fosfatasas ácidas y el aumento en la expresión de genes que codifican para transportadores de P de alta afinidad. 57 5.1.7 La pérdida de la actividad mitótica en el meristemo no es la causa del incremento en la expresión de genes que codifican para transportadores de P de alta afinidad y la exudación de fosfatasas durante el estrés por P. Como lo hemos visto anteriormente, en la respuesta a la baja disponibilidad de P existe una correlación entre la expresión de los PTs y exudación de FAs con la perdida de actividad meristemática. Para determinar si el hecho de que el meristemo pierda su actividad promueve la expresión de los transportadores de alta afinidad y la secreción de fosfatasas ácidas, se hizo un experimento evaluando la inducción de estos PTs en una línea trasngénica cuya RP es muy corta y cuyo MRP presenta una Figura 14. Efecto de la perdida de la actividad meristemática de la línea DT-AtsM en la expresión transportadores de P de alta afinidad y exudación de fosafatasas ácidas. Plantas creciendo en condiciones óptimas (A a C, G a I y M a Ñ) y limitantes (D a F, J a l y O a Q). La tinción en azul indica donde se esta expresando pAtPT2:uidA (A, G, M, D, J y O), la exudación de fosfatasas ácidas (B, H, N, E, K y P) y las células que están en mitosis (C, I, Ñ, F, L, y Q). Fotos representativas de una muestra de 20 raíces por tratamiento. 58 fuerte desorganización aún cuando crece en MOP. La línea transgénica DT-AtsM se caracteriza por que su meristemo deja de ser funcional debido a que expresa una toxina en las células de la cofia (Tsugeki y Fedoroff, 1999). Para el experimento cruzamos la línea DT-AtsM con las líneas CycB1;1:uidA y pAtPT2:uidA con la finalidad de evidenciar la división celular en el meristemo y la inducción de AtPT2. Para ello, se creció a la progenie F1 de las cruzas anteriores en MOP y MLP y se evaluó la actividad de gen reportero GUS y la exudación de FAs al medio. Encontramos que la actividad mitótica de las células del MRP de las plantas F1 disminuye de manera drástica a los 10 D.D.G. y que desaparece por completo a los 15 D.D.G., tanto en bajo como en alto P (figura 14 C, I, Ñ, F, L y Q). En las plantas que crecieron en MLP, a partir de los 10 D.D.G., el nivel de exudación de FAs y la inducción de pAtPT2:uidA fueron en incremento hasta el día 15 que duró el experimento (figura 14 J, K, O y P) mientras que no fueron detectables en las plantas que crecieron en MOP (figura 14 B, G, H, M y N). Esto muestra que la pérdida de la actividad meristemática no es la causa de la inducción de pAtPT2:uidA y la exudación de FAs y que esta relación es únicamente espacio temporal. Es importante entonces resaltar que la baja disponibilidad de P regula directamente la expresión PTs y la exudación de FAs de manera independiente a la perdida de la proliferación celular en el meristemo. 5.1.8 El agotamiento del meristemo de la raíz primaria no es la causa del aumento del número de raíces laterales durante el estrés por P Para descartar que el incremento en el número de RLs en las plantas que crecieron en MLP, se debiera a la perdida del la actividad mitótica del meristemo y no de manera directa a la baja disponibilidad de P, hicimos crecer a las plantas transgénicas DT-AtsM y como control al ecotipo Nossen en medio con bajo y alto P y se contó el número de RLs a los 5, 10 y 15 D.D.G. Se uso la línea DT-AtsM porque en el MRP pierde la actividad mitótica, emulando el agotamiento del meristemo que observamos cuando las plantas crecen en MLP. Se encontró que tanto en la planta silvestre WT como en la línea transgénica DT-AtsM se indujo un aumento en el 59 Figura 15. Efecto de la perdida de la actividad meristematica en el número de raíces laterales. Cuantificación de las raíces laterales de (A) A thaliana ecotipo Nossen y (B) línea transgénica DT-AtsM creciendo en condiciones óptimas y limitantes de P deuna muestra de 20 plantas número de RLs cuando las plantas crecieron en MLP (figura 15 A y B). Sin embargo la transgénica DT-AtsM tanto en bajo como en alto P, presenta un aumento muy ligero en el número de RLs si lo comparamos con las plantas WT (figura 15 A y B). Tomando en cuenta los resultados anteriores, el aumento del número de RLs en A. thaliana no es consecuencia de la pérdida del la actividad proliferativa del MRP, sino es consecuencia directa de la carencia de P. 5.1.9 La disponibilidad de P regula la emergencia de raíces laterales En la formación de las RLs se pueden distinguir dos procesos bien marcados que son la formación de los PRLs y la emergencia de éstos. El primordio se forma a partir de células del periciclo, las cuales efectúan una serie de divisiones celulares estereotipadas hasta formar esta estructura, seguido a esto, por elongación de las células y divisiones celulares en su meristemo, emergen y forman las RLs (Malamy y Benfey, 1997). Cuando A. thaliana creció en MLP, se observó un aumento gradual en el número de las RLs (figura 10 B). Este aumento en el número de las RLs puede 60 deberse a la inducción en la formación de novo de RLs, o bien por la inducción en la elongación de los PRL ya formados. Para poder determinar lo anterior, se hicieron crecer plantas en condiciones óptimas y limitantes de P. A los días 6, 10 y 14 se clarificaron y contaron todas las etapas de la formación de las RLs. Las estados de desarrollo de los PRLs se clasificaron de acuerdo con Zhang et al., (1999) y son: (A) hasta 3 capas celulares, (B) de más de tres capas celulares hasta formar el domo, (C) formado el domo y alargándose sin haber emergido, (D) RLs emergidas menores de 0.5 mm de longitud y (E) RLs de más de 0.5 mm de longitud (figura 16 B). Las plantas que crecieron en MOP presentaron un incremento gradual en el número de órganos laterales de la raíz (PRLs y RLs) conforme pasó el tiempo, y el número de Figura 16. Efecto de la disponibilidad de fósforo en el desarrollo de las raíces laterales. (A) cuantificación de los primordios y raíces laterales presentes en la raíz primaria de A. thaliana. Las plantas crecieron en condiciones óptimas (izquierda) y limitantes (derecha). Las cuantificaciones se hicieron a los 6, 10 y 14 días después de la germinación (D.D.G.). (B) Etapas de desarrollo que se cuantificaron. Se grafica la media ±SE, de una muestra de 20 plantas 61 primordios (figura 16; etapas A, B y C) siempre fue mayor (de 92 a 70%) que el número de las RLs (etapa D y E figura 16 A) durante el desarrollo del experimento. De manera contraria, en las plantas que crecieron en MLP, el total de órganos laterales de la raíz no presentaron aumentaron a partir del día 6 D.D.G. y el porcentaje de PRLs disminuyó hasta representar el 10% del total de los órganos laterales, mientras que el porcentaje de RLs aumento drásticamente (figura 16 A). Otro de los aspectos a resaltar es que al inicio del experimento (día 6), se podía observar que existió un mayor número de primordios en las plantas que crecieron en MLP comparando con el número de aquellas con las que crecieron en MOP. Por lo anterior se tiene que el P está regulando en etapas la formación de los PRLs (de manera temprana y la emergencia de las de los PRLs para formar RLs. 5.1.10 El proceso de desarrollo determinado y el incremento en la expresión de genes que codifican para transportadores de P de alta afinidad también ocurre en las raíces laterales Tabla 3. Agotamiento de los meristemos del sistema radical de limitantes (1 µM) y óptimas (1 mM) de P. A. thaliana creciendo en condiciones % de meristemos agotados D.D.G. P limitante P óptimo 8 22 ±12 0 13 25 ± 4 0 14 38 ± 11 0 15 47 ± 9 0 16 52 ± 7 0 Las observaciones se efectuaron a partir de los 8 y hasta los 16 días después de la germinación (D.D.G.). Los datos muestran las medias ± SD, n=15 Para establecer si el desarrollo determinado también ocurre en las RLs, efectuamos un análisis de crecimiento, morfología y expresión de las líneas marcadoras CycB1;1:uidA, DR5:uidA, pAtPT2:uidA y pAtPT1:uidA en las RLs de plantas de 12 y 62 16 días de crecimiento. A partir del día 8 después de la germinación se inspeccionó el desarrollo de las RLs de plantas creciendo en MOP y no se presentó ningún meristemo agotado en todo el sistema radical (Tabla 3). Además la expresión de CycB1;1:uidA y DR5:uidA presentó un patrón normal en todos los meristemos de las plantas que crecieron en MOP, mostrando la apariencia de mosaico típica de CycB1;1:uidA y el gradiente máximo de respuesta a auxinas en QC y columela para DR5:uidA (figura 17 E y F). De manera similar a lo observado en alto P, el sistema radical de las plantas que crecieron en bajo P presentó RLs en distintos estados de crecimiento, desde las recién emergidas (0-5 mm; figura 17 B y G) a maduras (510mm; figura 17 C y H), las cuales mantuvieron su crecimiento y mostraron alta actividad mitótica y el gradiente de de respuesta a auxinas. Además se encontró que las RLs de una longitud entre 15 y 20 mm ya no presentaban crecimiento dado que presentaron procesos de diferenciación, como la formación de pelos radicales en los ápices y meristemos agotados (figura 17 D, E, I y J). La expresión de GUS en las líneas CycB1;1:uidA y DR5:uidA se redujo de manera muy marcada en las RLs que no seguían creciendo (figura 17 D e I) y fue completamente ausente en las RLs que presentaron un meristemo agotado, morfológicamente reconocible (figura 17 E y J). El número de RLs agotadas se incrementó hasta un 52% a los 16 D.D.G:, que fue lo que duró el experimento (Tabla 3). Es importante remarcar que de igual forma que ocurre en la RP, en las RLs de primer orden se inician el proceso de diferenciación y las raíces terciarias comienzan a emerger, resultando en un sistema radical más ramificado. En plantas de 16 días creciendo en alto P no se detectó la expresión de pAtPT2:uidA en ninguna de sus RLs (figura 17 K), mientras que únicamente en las RLs agotadas de las plantas que crecieron en bajo P se detectó un fuerte incremento en la expresión de pAtPT2:uidA (figura 17 L). Similar a lo ocurrido en la RP, la expresión de pAtPT1:uidA es ligera y se presenta únicamente en los tejidos diferenciados de las RLs de plantas que crecen en condiciones óptimas (figura 17 M). Sin embargo, cuando crecen en MLP presentan una fuerte inducción en los tejidos diferenciados y en los meristemos de las RLs que se han diferenciado y agotado (figura 17 P), lo cual claramente contrasta con las regiones meristemáticas de las RLs que aún no se 63 habían agotado y no presentan inducción de este gen (figura 17 N y O). Por lo tanto encontramos que los cambios evocados por la disponibilidad de P ocurren en todos los meristemos apicales radicales que se han agotado. Figura 17. Efecto de la disponibilidad de fósforo en el patrón de expresión de CycB1;1:uidA, DR5:uidA, pAtPT2:uidA y pAtPT1:uidA, en las raíces laterales de A. thaliana creciendo en meio limitante de P. Plantas de CycB1;1:uidA (A), DR5:uidA (F), pAtPT2:uid (K) y pAtPT1:uidA (M) creciendo en fósforo alto . Diferentes estados de desarrollo de las raíces laterales de plantas de 16 días de crecimiento, CycB1;1:uidA (B-E) y DR5:uidA (G-J) creciendo en condiciones limitantes de fósforo. Patrón de expresión de pAtPT2:uidA (L) y pAtPT1:uidA (P) en las raíces laterales agotadas y en raíces laterales de pAtPT1:uidA recién emergidas (N y O). Barra de escala = 100 µm. 64 5.2 Caracterización de un grupo de mutantes de A. thaliana que manifiestan una respuesta radical alterada Como ya hemos observado, la disponibilidad de P está afectando el desarrollo del sistema radical, tanto en la formación de RLs y pelos radicales como en el crecimiento del sistema radical. Con el fin de encontrar los componentes moleculares que están participando en estos cambios, seguimos la estrategia de genética directa y se buscaron mutantes que se encuentren afectadas en este proceso, por lo que en nuestro grupo de trabajo se efectuó un escrutinio en una población de semillas de A. thaliana Col-0 mutagenizada con etilmetanosulfonato (EMS), seleccionando aquellas mutantes que se encontraran afectadas en los cambios del sistema radical evocados por la baja disponibilidad de P. De dicho escrutinio se seleccionaron cinco grupos de mutantes, afectados en alguno de los componentes de la arquitectura radical (LópezBucio, 2001). 5.2.1 Selección de un grupo de mutantes que no detienen el crecimiento de su raíz primaria en bajo P Uno de los grupos de mutantes insensibles a la baja disponibilidad de P reportados por López-Bucio (2001) constituyó un grupo de 60 mutantes EH (por Esmeralda Hernández Abreu quien inició el escrutinio). La característica principal de este grupo de mutantes fue que, a diferencia de las plantas tipo silvestre (WT), cuando crecen en condiciones limitantes de P alargan su RP (figura 18 A y B). De este grupo se seleccionó un subgrupo de 11 mutantes, tomando como parámetros de selección que provinieran de distintos grupos parentales de semilla mutagenizada y que el fenotipo del sistema radical fuera consistente por al menos tres generaciones filiales. Estas 11 mutantes, ahora renombradas lpi por las siglas en inglés de low phosphorus insensitive, se retrocruzaron al menos tres veces para su posterior caracterización. 65 5.2.2 El fenotipo de las mutantes lpi solamente varía en condiciones limitantes de P Para cotejar las alteraciones en el desarrollo inducidas por la baja disponibilidad de P en las mutantes lpi, se crecieron plantas silvestres (WT) del ecotipo Col-0 y las mutantes lpi lado a lado en placas con alto (1mM) y bajo (1μM) P. Tanto las plantas WT como las mutantes que crecieron en MOP presentaron un sistema radical típico pivotante, producto de un desarrollo indeterminado donde la RP es el eje principal del crecimiento y las RLs son muy cortas (figura 18 B). Sin embargo en MLP, las plantas WT presentan una RP con un crecimiento limitado y con formación de varias RLs, aparentando ser un sistema radical corto, muy claramente ramificado contrasta y con que la arquitectura del sistema radical observado en alto P (figura 18 B). Mientras que las mutantes lpi1 fueron insensibles a la inhibición del crecimiento de la RP inducida por la carencia de P, en MLP presentaron una arquitectura del Figura 18 Escrutinio y caracterización fenotípica. (A) Pantas en MOP, la flecha indica una de las mutantes seleccionadas. (B) Plantas de 14 D.D.G., WT (Col-0) y lpi1 creciendo lado a lado en medio con alto (izquierda) y bajo (derecha) P. (C) Col0, lpr1 y lpi2 creciendo en invernadero. 66 sistema radical similar a la arquitectura característica en alto P (18 B figura). En condiciones de invernadero, la parte aérea de las mutantes lpi presentó un desarrollo vegetativo, de silicuas y producción de semillas similar a las plantas WT (figura 18 C). Bajo estas condiciones la única diferencia observada entre la WT y las mutantes fue la floración más temprana (3 a 5 días) en las mutantes. Estas observaciones indican que los defectos genéticos presentes en las mutantes lpi afectan de manera específica al programa de desarrollo postembrionario en condiciones limitantes de P y de modo muy marcado a nivel del sistema radical. 5.2.3 Análisis genético Para determinar las bases genéticas del fenotipo de las mutantes lpi, las líneas homocigotas de cada una de las mutantes se cruzaron con las plantas WT y se Tabla 4. Tasa de segregación de la progenie resultante de las cruzas de cada una de las líneas mutantes lpi con las plantas silvestres (WT). Cruza lpi1 X WT lpi2 X WT lpi3 X WT lpi4 X WT lpi5 X WT lpi6 X WT lpi7 X WT lpi8 X WT lpi9 X WT lpi10 X WT lpi11 X WT Fenotipo de la progenie _________F1_____ Fenotipo de la progenie ________F2_______ Relación obtenida Relación esperada Raíz corta (WT) Raíz larga (mutante) Raíz corta (WT) Raíz larga (mutante) WT:mutante WT:mutante 18 0 22 14 18 19 26 19 17 15 0 0 22 0 0 0 0 0 0 0 0 18 44 13 50 86 58 76 75 39 62 61 24 17 60 20 20 14 23 30 12 28 29 62 2.89:1.11 0.71:3.29 2.86:1.14 3.24:0.76 3.22:0.78 3.07:0.93 2.85:1.15 3.06:0.94 2.75:1.25 2.71:1.29 1.12:2.88 3:1 1:3 3:1 3:1 3:1 3:1 3:1 3:1 3:1 3:1 1:3 χ2* 0.27 2.01 0.48 2.13 1.18 0.16 0.73 0.06 1.80 2.50 0.39 Plantas creciendo en medio limitante de P. * Con un grado de libertad y un valor critico del 95%, la hipótesis es aceptada si la χ2 es menor o igual a 3.84 67 analizaron las generaciones F1 y F2. En la generación F1 de las mutantes lpi 2 y 11, el 100% de las plantas presentaron fenotipo mutante y en la F2 se presentó una relación 1:3 (sivestre:mutante) indicando que son mutaciones dominantes. Con el resto de las mutantes en la generación F1, todas las plantas presentaron fenotipo silvestre y en la generación siguiente la segregación fue 3:1 indicando que son mutaciones recesivas (tabla 4). De lo anterior obtenemos que en nuestro grupo de mutantes se presentan nueve mutantes recesivas y dos dominantes. Para determinar el número de genes que se encontraban representados en el grupo de mutantes lpi se efectuaron las pruebas de complementación, para lo cual tomamos una de las mutantes y la cruzamos con el resto de las mutantes del grupo. Lo anterior se hizo para cada una de las mutantes del grupo. Al analizar la F1 de cada una de las cruzas, no se presentaba el fenotipo silvestre, pero, en algunas cruzas la RP de la progenie F1 era más corta que la de las mutantes padres, es decir aparentaba ser un fenotipo intermedio. Se analizó la F2. de estas cruzas y se encontró que estaban segregando los fenotipos silvestre y mutante (tabla 5). Los Tabla 5. Segregación de la progenie de las cruzas entre las mutantes lpi. Fenotipos generación F2 Cruza Raíz corta Raíz larga lpi1 X lpi2 lpi1 X lpi3 lpi1 X lpi4 lpi1 X lpi6 lpi2 X lpi3 Lpi2 X lpi4 Lpi2 X lpi6 lpi2 X lpi11 Lpi3 X lpi4 Lpi3 X lpi6 Lpi4 X lpi6 11 36 9 0 15 27 12 13 10 15 11 74 154 53 93 87 96 90 121 96 69 135 Otro Total Relación obtenida 2.1:13.9 3:13 2.3:13.7 50 (ng) 85 190 62 93 102 173 102 146 106 84 146 12 (ag) 2.3:13.7 2.5:8.9:4.6 1.9:14.1 1:14:1 1.5: 14.5 2.9:13.1 1.1:14.9 Plantas creciendo en medio limitante de P Las cruzas de lpi1 con lpi5 a 11 no presentaron segregación. No germinó (ng), agravitropica (ag). 68 resultados revelaron que en la progenie de las cruzas entre lpi1 y lpi4 a 11 no se detectó segregación alguna, sugiriéndonos que son alélicas, pero en las cruzas entre la mutantes lpi1,2,3 y 4, todas segregaron (tabla 5), confirmando la existencia de cuatro genes independientes (LPI1 a 4) en nuestro grupo de mutantes lpi. 5.2.4 Las alteraciones en al desarrollo del sistema radical son especificas a la disponibilidad de P Recientemente se ha reportado que algunos tipos de estrés abiótico como la salinidad y la disponibilidad de nutrimentos afectan el desarrollo de la RP de A. thaliana (López-Bucio et al., 2003; West et al., 2004). El estrés salino afecta el crecimiento del sistema radical inhibiendo la producción de nuevas células por los meristemos (West et al., 2004). Para determinar si las mutantes lpi están afectadas en la respuesta a la salinidad, cruzamos las mutantes lpi con la línea CycB1;1:uidA. La progenie y el control (línea CycB1;1:uidA ) se hicieron crecer en MS 0.1X con P óptimo por cinco días y después se transplantaron a medios suplementados con 1% de NaCl. Se dejaron crecer por otros seis días más, se midió el incremento de la longitud de la RP y se hicieron la detección histoquímica de GUS. Las mutantes transplantadas a medio que no estaba suplementado con NaCl, de manera similar al control, presentaron un incremento en la longitud de su RP entre 2.5 y 3 cm, además mantuvieron actividad mitótica en el MRP, esto último evidenciado por la expresión del gen reportero CycB1;1:uidA (figura 19). Sin embargo, cuando fueron transplantadas a medio con alto contenido de sal (1%) no presentaron divisiones celulares en sus meristemos y solamente incrementaron de 0.1 a 0.2 cm la longitud de su RP, presentando un comportamiento similar a las plantas control (figura 18). Lo anterior nos indica que el desarrollo de la RP de las mutantes lpi presenta los mismos cambios inducidos por la salinidad que las plantas WT, por lo que estas mutaciones no afectan dicha respuesta. 69 Figura 19. Respuesta de las mutantes lpi ante el estrés salino. Gráfica donde se muestra la media ± SE de una muestra de 20 plantas mostrando el incremento de la longitud de la raíz primaria de las mutantes lpi portando el marcador de división celular CycB1;1:uidA y como control la línea CycB1;1:uidA, en presencia o ausencia de NaCl en el medio. Fotografias mostrando la actividad de GUS. Las letras indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). Para apreciar la especificidad de las mutaciones lpi a la deficiencia de P, se evaluó el efecto de la carencia de otros nutrimentos tales como el potasio (K), nitrógeno (N), azufre (S) y fierro (Fe), en los componentes de la arquitectura radical de las plantas WT y las mutantes lpi. Se encontró que la longitud de la RP en las plantas WT presentó una disminución drástica (70%) cuando crecieron en medio carente de fósforo (-P) y una menor disminución (40%) en medio sin potasio (-K) comparándolas con las que crecieron en condiciones control (medio con P óptimo; C), mientras que no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en las plantas que crecieron en medio sin nitrógeno (-N), azufre (-S) o fierro (-Fe; figura 20 A). La 70 longitud de las raíces primarias de las mutantes lpi fue similar a L o n g itu d d e la raíz p rimaria (cm) A 6 aaa a a 4 cb bb aa a a a a a a aa a a b WT lpi1 lpi2 lpi3 lpi4 c 2 la de las plantas WT en todos los tratamientos de carencia de algún nutrimento, excepto en –P, en el cual presentan la longitud de su RP similar a la observada en C (figura 20 A). Las mutantes d lpi 0 2 a mostraron 4 una diferencia muy pequeña pero B Nú mero d e raíces laterales a a a aa a a a 10 estadísticamente significativa en a a la a 8 b b b bb 6 4 c c c ccc c c c ccc c c c longitud de sus raíces primarias en -K al comprarse con la longitud de las raíces de c c c c c plantas tipo silvestres (figura 20 c 2 A). 0 Control P K N Fe S Figura 20. Especificidad de fenotipo de las mutantes lpi. Las plantas de WT, lpi1,2,3 y 4 se crecieron por 12 días en medios carentes de los nutrientes indicados y como control medi con P óptimo. Se cuantificó los parámetros de arquitectura del sistema radical. Medias (±SE) de una muestra de 20 plantas cuantificando la longitude de la raíz primaria (A) y número de raíces laterales (B). las letras indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). Las plantas WT incrementaron el número de las RLs en medios – P y –S (3 y 2 veces) respectivamente, mientras que no se presentó cambio en el número de éstas en los medios C, -K, -N y –Fe (figura 20 B). Las mutantes lpi1, 3 y 4 mostraron una respuesta similar a la presentada por las plantas WT cuando crecieron en medio –P y –S, mientras que la mutante lpi2 no mostró un incremento en el número de RLs en –P, pero respondió de igual manera a la carencia de S (figura 20 B). Lo anterior nos demuestra que las mutantes lpi responden de manera específica a la carencia de P en el medio y que además con la mutante lpi2 es posible estudiar de manera independiente la disminución de la longitud de la RP con respecto al aumento en el número de RLs. 71 5.2.5 Las mutantes lpi no son hiperacumuladoras de P Para determinar si el fenotipo de las mutantes se debe a una toma alta de P o por la hiperacumulación de éste en los tejidos, se midió el contenido total de P en el follaje y en la raíz de las mutantes lpi y las plantas WT. Para esto las plantas se hicieron crecer en condiciones óptimas y limitantes de P. A los 18 días de crecimiento se colectaron, pesaron y secaron a 70°C las muestras. Para cuantificar el contenido total de P se utilizaron 90 mg de tejido seco. El contenido de P total tanto en las WT como en las mutantes lpi fue más alto en las plantas que crecieron en MOP comparándolo con aquellas que crecieron en MLP. En MOP el follaje de las mutantes lpi1, 2 y 3, presentó un 14% menos del contenido total de P y lpi4 igual contenido con respecto a las controles, mientras que en los sistemas radicales de todas las mutantes presentaron una ligera reducción (9% en promedio) en el contenido total de P (tabla 6). En los MLPs, las mutantes presentaron una disminución de la cantidad de P, en promedio de 6 y 25 % en follaje y raíz respectivamente, comparándolas con la cantidad en las plantas control (tabla 6). Estos resultados demuestran que el fenotipo de la RP de las mutantes lpi no se debe a un incremento general o local del contenido total de P. Tabla 6. Efecto de la disponibilidad de P en las plantas WT y en las mutantes lpi en el contenido total de P (% del tejido seco ) Líneas P óptimo Follaje P limitante Raíz Follaje Raíz WT 1.45 1.62 1.05 0.66 Lpi1 1.26 1.46 1.03 0.50 Lpi2 1.23 1.5 0.90 0.54 Lpi3 1.27 1.44 0.98 0.50 Lpi4 1.49 1.51 1.01 0.48 Las mediciones del contenido de P total se efectuaron dos veces con resultados similares. 72 5.2.6 En las mutantes lpi los procesos de A elongación y división celular no se ven Longitud celular (mm) 0.2 0.15 P óptimo a P limitante b b b b b b 0.1 0.05 C élulas en la z ona de elongación C La disminución en la longitud de la RP de d las plantas WT cuando crecen bajo estrés por P está relacionada con la reducción de 30 la elongación y la división celular en la 25 región apical de la raíz. Para analizar estos 20 dos procesos, las mutantes lpi se crecieron 15 en medio con y sin P por 14 días y se 10 a a a a a a a a a hicieron mediciones en el ápice de la raíz. Como 5 b 0 30 C élulas en el meristemo limitantes de P c c 0 B afectados cuando crecen en condiciones a se observó anteriormente, las células epidérmicas de la raíz de las a a a plantas WT que crecieron en MLP fueron a a a a a 80% más cortas que las que crecieron en 25 MOP (figura 21 A). Cuando se midieron 20 estas células en las mutantes lpi, no se 15 encontraron diferencias estadísticamente 10 significativas entre las mutantes que crecieron en bajo y alto P (figura 21 A). Sin 5 b embargo, las células epidérmicas fueron 0 WT lpi1 lpi2 lpi3 lpi4 Figura 21. Efecto de la disponibilidad de P en algunos parámetros celulares de la raíz primaria. Longitud de las células epidérmicas (A). Número de células presentes en la zona de elongación (B). Número de células meristemáticas (C). Se grafican medias ± SE de una muestra de 15 plantas. entre 15 y 30 % más cortas que las células de las WT creciendo en MLP. El número de células en la zona de elongación y en la meristemática se reduce debido a la diferenciación gradual de las células en la zona de elongación y de las células presentes en el meristemo agotado. Para determinar si este proceso de diferenciación también ocurre en las mutantes lpi, 73 se llevó a cabo la cuantificación de las células presentes en la zona de elongación y meristemática de las plantas WT y las mutantes lpi creciendo en alto y bajo P. En figura 21 (B y C), se puede apreciar que en la zona meristemática y en la de elongación de las plantas WT, el número de células se reduce casi en su totalidad cuando las plantas crecen en bajo P, similar a lo anteriormente mencionado. De manera contraria, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el número de células presentes en la región de elongación y la meristemática de las mutantes lpi cuando crecieron en MLP y MOP (figura 21 B y C). Cuando las plantas WT crecieron en MLP, la reducción del número de células en la zona meristemática y de elongación correlacionó con la diferenciación de las células del ápice (figura 22 C y D). En la zona que correspondía al meristemo hubo formación de pelos radicales (figura 22 C flecha). En MOP no se generaron pelos en esta región cercana al ápice (figura 22 A y B ) sino hasta los 2 mm desde la punta, independientemente del contenido de P en el medio, en las mutantes lpi no se observó formación de pelos en el ápice radical (figura 22 G, K, Ñ y R). Para evaluar si se presentaban cambios en la división celular y en el gradiente de auxinas en el ápice de la raíz de las mutantes lpi cuando se sometian a estrés por P, se cruzaron cada una de las mutantes lpi con las líneas transgénicas CycB1;1:uidA y DR5:uidA. Una vez que las mutantes portaban los marcadores, se hicieron crecer en condiciones óptimas y limitantes de P por 12 días, se hizo el ensayo histoquímico de GUS y se analizaron los patrones de expresión. En las plantas WT que crecieron en condiciones óptimas de P, se observó el patrón de expresión de mosaico típico de CycB1;1:uidA y en las células de la columela y QC de DR5:uidA (figura 22 A y B) y en las WT plantas que crecieron en condiciones limitantes de P, no se pudo detectar expresión de GUS en la punta de las raíces (figura 22 C y D), sugiriendo que entraron a un programa de desarrollo determinado. En el ápice la raíz de las mutantes lpi, la expresión de CycB1;1:uidA y DR5:uidA fue similar tanto en condiciones limitantes como en óptimas de P (figura 22 E-S). Además el ápice de las mutantes que crecieron en MLP, era anatómicamente similar, incluyendo la presencia de un QC claramente definido, como lo presentan las plantas WT creciendo en MOP (figura 22 G, H, K, L, Ñ, O, R y S). Estos resultados demuestran 74 que las mutantes lpi, a diferencia de las WT, mantienen un programa de desarrollo indeterminado cuando crecen bajo condiciones de baja disponibilidad de P. Figura 22. Efecto de la disponibilidad de P en la expresión de los marcadores CycB1;1:uidA y DR5:uidA en las mutantes lpi1 (E a H), lpi2 (I a L), lpi3 (Ma O) y lpi4 (P a S). Plantas de 12 días de crecimiento en condiciones óptimas y limitantes de P. Fotos representativas deuna muestra de 15 plantas. Formación de pelos radicales en la zona meristemática (flecha). 75 5.2.7 Las mutantes lpi están parcialmente afectadas en sus respuestas al estrés por P Dentro de las respuestas más conspicuas que se han reportado a la carencia de P en A. thaliana se encuentran el incremento en número y densidad de pelos radicales y acumulación de antócianinas (Bates y Lynch, 1996; Raghothama, 1999). Para establecer si las mutantes están lpi afectadas también en dichas respuestas crecimos a las mutantes lpi y a la WT en condiciones óptimas y limitantes de P y se evaluaron dichas comparamos la respuestas. longitud de Cuando los pelos radicales de plantas WT con las mutantes lpi, encontramos que las mutantes lpi1 y 2 mostraron pelos radicales más largos que la WT, tanto en bajo como en alto P, mientras que en las mutantes lpi3 y 4 fueron similares al control (figura 23 A). Además se observó que los pelos radicales de las mutantes lpi y Figura 23. El efecto de la disponibilidad de P en algunas respuestas del sistema de rescate a la baja disponibilidad de P. Se presenta la media ± SE de la longitud de de los pelos radicales (A), densidad de pelos radicales (B) y contenido de antocianinas(C). La densidad de pelos radicales es le número de pelos radicales por centímetro de raíz. Una muestra de 20 plantas crecieron por 12 días (A y B) y por 18 días, tres repeticiones biológicas (C). Las letras representan diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). la WT son más largos en las plantas que crecieron en MLP. El aumento en la longitud de los pelos radicales se vió reducido solamente en las mutantes lpi1 y 2. La longitud de los pelos radicales en la WT en MLP, fue en promedio de 2.4 veces más largos que cuando crecieron en MOP, mientras que en las mutantes lpi1 y 2 fueron 76 1.80 y 1.5 veces más largos respectivamente (figura 23 A). En las plantas WT la densidad de los pelos radicales (número de pelos radicales por centímetro de RP) se incremento un 80% en condiciones limitantes de P, mientras que en las mutantes lpi éste aumento no es tan marcado, siendo solamente de un 20 a un 15% (figura 23 B). Con respecto al contenido total de antocianinas, únicamente la mutante lpi2 presentó diferencias estadísticamente significativas (20% menos) cuando creció en MLP comparándola con las plantas WT (figura 23 C). Estos resultados nos indican que las mutantes son parcialmente insensibles a la baja disponibilidad de P, dado que las respuestas como la acumulación de antocianinas y el aumento en la longitud de los pelos radicales permanecen en menor o mayor grado en las mutantes. 5.2.8 Las mutantes lpi presentan una menor respuesta en la expresión de genes inducibles por la carencia de P Las alteraciones que presentan las mutantes lpi en los cambios del sistema radical a la baja disponibilidad de P sugieren que los genes LPI podrían formar parte de una ruta de señalización que sense el estatus de nutrimentos y específicamente de P, la cual modula la actividad mitótica y el mantenimiento del meristemo. Sin embargo, esto no excluye que estas mutaciones afecten otro tipo de respuestas tales como la inducción de la expresión de genes específicos para éste estrés. Para estudiar si las lesiones genéticas en la mutantes lpi1 y 2 tienen algún efecto en la inducción de éstos genes, se analizó la expresión de los genes que codifican para transportadores de alta afinidad de P en condiciones contrastantes de P. Con este objetivo, se introdujeron las construcciones que tenían el promotor de los genes que codifican para los transportadores de P de alta afinidad AtPT1 y AtPT2, fusionados al gen reportero GUS (pAtPT1:uidA y pAtPT2:uidA) en las mutantes lpi1 y 2, haciendo las cruzas entre ellas. Como se había reportado previamente, las plantas pAtPT1:uidA creciendo en MOP tienen una expresión baja pero detectable en todo el sistema radical, exceptuando la región no diferenciada del ápice de la raíz, donde la actividad de GUS fue indetectable (figura 24 A y B) mientras que para pAtPT2:uidA no se detectó expresión en ninguna parte del sistema radical (figura 24 C y D). En MLP, la 77 expresión del gen reportero GUS en las plantas control se incrementa drásticamente en los dos marcadores (pAtPT1:uidA y pAtPT2:uidA), y de manera aún más marcada en el ápice de las raíces que presentaban meristemos agotados y pelos radicales (figura 24 E a H). En MOP, la expresión de pAtPT1:uidA y pAtPT2:uidA en el fondo genético de las mutantes lpi1 y 2, no presentó diferencias con relación a lo observado en el control (figura 24 I a L y Q a T). En MLP la expresión de pAtPT1:uidA en lpi1 y 2 fue inducida en la mayor parte del sistema radical pero a diferencia del control, no se observó tinción de GUS en el ápice de la raíz (figura 24 M, N, U y V). Para el caso de pAtPT2:uidA, se observaron niveles muy bajos de expresión en ambas mutantes y a diferencia del control, no se detectó expresión en el ápice de la raíz cuando crecieron en MLP (figura 24 O, P, W y X). Para estudiar más detenidamente el papel que los genes LPI en la expresión de genes inducibles por la carencia de P, evaluamos el efecto de la carencia de P sobre Figura 24. Expresión de AtPT1:uidA y AtPT2:uidA en la transgénica y en las mutantes lpi1 y 2. Plantas de 12 días de crecimiento en medio con condiciones óptimas y limitantes de P. Se muestra fotografías representativas de un grupo de 20 plantas analizadas. 78 el nivel de RNAm de los siguientes genes cuya expresión es inducida por la carencia de P: At4, PURPLE ACID PHOSPHATASE 1 (AtPAP1), ACID PHOSPHATASE 5 (AtACP5), PHOSPHATE TRANSPORTER 1 (AtPT1), PHOSPHATE TRANSPORTER 2 (AtPT2) e INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (AtIPS1; Muchhal et al., 1996; Burleigh and Harrison, 1999; del Pozo et al., 1999; Martín et al., 2000; Li et al., 2002). Los análisis de hibridación tipo Northern de At4, AtPAP1, AtACP5, AtPT1, AtIPS1, y AtPT2 se hicieron usando el RNA total extraído de las plantas WT, lpi1, lpi2 y phr1. Esta última una mutante afectada en la inducción de la expresión de genes que responden a la carencia de P, que crecieron en condiciones óptimas y limitantes de P. En todos los casos se determinó la señal relativa con respecto al RNAm de tubulina, un gen que no es inducible por bajo P. El nivel de expresión basal de los transcritos de todos los genes, se incrementó en las plantas WT crecidas en MLP, particularmente el RNA extraído de las raíces (figura 25 A y B). Este incremento en el nivel basal del transcrito también se observó en las mutantes lpi 1 y lpi2, sin embargo a niveles más bajos que los observados en WT. La inducción de los transcritos por la baja disponibilidad de P de AtPAP1, AtPT1, AtPT2 y AtACP5 en la raíz de las mutantes phr, lpi1 y lpi2, se redujo entre un 20 a un 80% con respecto al WT (figura 25 A y B). El cambio más drástico en los niveles de transcritos de los genes inducibles por P, se presentó en las raíces de la mutante lpi2 donde no se presento una inducción significativa de la expresión de AtIPS1 y se observó una inducción de At4 (doble) si se compara con WT (figura 25 A y B). En el follaje, no se observó incremento en el nivel de transcritos de AtPT1 en las mutantes phr1, lpi1 y lpi2, y la tasa de inducción de los transcritos de AtPAP1 y AtPT2, redujeron entre 40 y 80%. En contraste los transcritos de AtACP5 fueron de 6 a 3 veces más altos en las mutantes phr1 y lpi1 en relación al WT. En la mutante lpi2 no se encontró inducción en los niveles de transcrito de At4 y AtIPS (figura 24 A y B). Estos resultados demuestran que las mutaciones lpi no solamente alteran las respuestas del sistema radical a la carencia de P, sino que también alteran la respuesta de algunos genes relacionados con la aclimatación de A. thaliana a la falta de P. 79 Figure 25. Efecto de la disponibilidad de fósforo en la expresión de genes inducibles por su carencia en las mutantes lpi 1 y 2.(A) Ensayo de hibridación tipo northern de AtPT1, AtPAP1, At4, AtPT2, AtACP5 y AtIPS1, usando RNA del follaje y la raíz de plantas de 14 D.D.G. de A. thaliana creciendo en condiciones óptimas (1 mM ) y limitantes (μM) de P. (B) Valores de normalización de la intensidad de la señal obtenida de follaje (izquierda) y raíces (derecha). La intensidad de la señal se cuantificó usando el programa Scion y se normalizó con respecto a su valor correspondiente en tubulina 80 5.2.9 Los meristemos de las raíces laterales de las mutantes lpi pierden su actividad mitótica Al hacer los análisis las mutantes lpi que crecieron en MLP encontramos que los meristemos de las primeras dos o tres RLs que emergieron presentaban una morfología que indicaba que se habían agotado, mientras que en las plantas que crecieron en MOP no se observaron estos cambios morfológicos en ningún ápice de sus raíces. Para comprobar si los meristemos de las RLs de las mutantes se agotaban, se hizo crecer a las mutantes lpi1 y 2 que portaban los marcadores CycB1;1:uidA, pAtPT1:uidA o pAtPT2:uidA en condiciones óptimas y limitantes de P. Después de 16 días de haber germinado se analizaron los meristemos de las Figura 26. Efecto de la disponibilidad de fósforo en el agotamiento de las raíces laterales y en la expresión de genes de específicos a la carencia de P. Expresión de los marcadores CycB1;1:uidA (A, G, M, D, J y P), AtPT1:uidA (B, H, N, E, K y Q) y AtPT2:uidA (C, I, O, F, L y R) en condiciones de P óptimo (A a C, G a I y M a O) y limitante (D-F, J-L y P-R). Fotografías representativas de las dos primeras raíces laterales, n=20 81 primeras RLs. Al hacer el ensayo histoquímico de GUS encontramos que la expresión de CycB1;1:uidA ésta completamente ausente en los meristemos de las RLs de las plantas que crecieron en MLP, indicándonos que los meristemos estaban en proceso de agotamiento (figura 26 J y P). La expresión de pAtPT1:uidA en los meristemos agotados estaba presente en ambas mutantes (figura 26 K y Q) mientras que pAtPT2:uidA estaba ausente en la mutante lpi1 y muy reducida en la mutante lpi2; demostrándonos que el programa de desarrollo indeterminado estaba afectado únicamente en el MRP de las mutantes lpi y que estos meristemos agotados presentaban una inducción diferencial de los transportadores de P de alta afinidad. 5.2.9 Ubicación de los genes mutados en los cromosomas Con el fin de conocer la ubicación del gen mutado en el genoma, se generaron poblaciones de mapeo. Dichas poblaciones se generaron cruzando cada una de las mutantes lpi homocigotas las cuales están en el fondo genético Columbia con plantas silvestres WS, se colectó la progenie F1 y se dejó autofecundar para obtener la población F2. Para el caso de lpi1, 3 y 4 la población F2 se creció en MLP y se seleccionaron de manera individual las plantas que dieron fenotipo mutante (homocigotas para la mutación), se extrajo DNA y se efectuó el análisis de segregantes mezcladas “Bulked Segregant Analysis”. Se encontró que el gen mutado LPI1 esta ligado al marcador ciw 11 por lo que la mutación se encuentra ubicada en el brazo superior del cromosoma III. (figura 27 A). Para determinar el intervalo de mapeo, se evaluaron los marcadores ciw11 y nga162 en 60 plantas de manera individual para determinar el porcentaje de recombinación y se obtuvo 17.5% y 35.7% respectivamente, indicando que la mutación esta más cercana al marcador ciw11 (figura 28 A). Para delimitar la región de mapeo, se seleccionaron dos marcadores que flanquearan a ciw11 a aproximadamente 10% de recombinación, ARLIM15.2 hacia el norte y GL1 al sur. ARLIM15.2 presentó un 23.6% de recombinación sugiriendo que la mutación se encuentra ubicada al sur de ciw11, sin embargo, cuando se evaluó GL1 no fue posible determinar el porcentaje de recombinación, puesto que solamente se podía detectar el alelo correspondiente al 82 fondo genético WS (figura 28 B). Lo mismo ocurrió para los marcadores ATPOX y Figura 27. Análisis de segregantes mezcladas “Bulked Segregant Analysis”. (A) mutante lpi1 y (B) mutante lpi3. Se muestran los geles de electroforesis de los productos de PCR para cada uno de los marcadores. En cada fotografía el control (heterocigota) se presenta en el lado izquierdo y la mezcla de las segregantes (F2 homocigotas recesivas) en el lado derecho. La banda especifica para Col-0 esta marcada con el asterisco. En (A) a diferencia del resto de los marcadores, en ciw 11, la banda correspondiente a Ws se pierde mientras que la de Col-0 se incrementa (circulo) indicando que la mutación esta ligada a ciw11. En (B) la mutación esta ligada a ciw7. F1P2-TGF, por lo que no fue posible determinar el intervalo de mapeo. La mutación lpi1 se encuentra en el ecotipo Col-0, sin embargo, las mutantes de la población de mapeo presenta una región muy grande (desde GL1 hasta F1P2-TGF) del cromosoma 3 que corresponde al ecotipo WS. Evaluamos los marcadres GL1 y F1P2-TGP en las mutantes lpi3 y 4 y encontramos que estaba presente también la región Ws en ambas mutantes (figura 28 C). Para el caso de la mutación lpi3, por medio del análisis de segregantes mezcladas se encontró que la mutación esta ligada al marcador ciw 7 por lo que se ubica el brazo inferior del cromosoma 4 y presenta un 38.9% de recombinación (figura 27 B). 83 Figura 28. Definiendo el intervalo de mapeo. (A) Cromosoma III región donde se ubica la mutación lpi1, los valores es el porcentaje de recombinación (B) Evaluación del marcador GL1 en la población de mapeo, notar que solamente se presenta el alelo WS. (C) Evaluación de los marcadores GL1 y F1P2-TGF en las mutantes lpi1, lpi3 y lpi4 84 6. Discusión El crecimiento, desarrollo y reproducción de las plantas esta a expensas de los nutrimentos presentes en su entorno dado que son organismos sésiles. La distribución de los nutrimentos poco móviles, como es el caso del P, es espacial y temporalmente heterogénea. En el suelo la disponibilidad del P disminuye conforme se aleja la raíz de la superficie y además se presentan zonas muy localizadas (parches) ricas en este nutrimento (Lynch, 1995). Por lo anterior, la arquitectura del sistema radical es extremadamente importante para la productividad vegetal, dado que determina la capacidad de la planta para explorar y explotar el medio heterogéneo donde crece (Fitter et al., 2002; Lynch, 1995). Varias especies vegetales pueden acrecentar la toma del P aumentando la capacidad exploratoria del sistema radical, llegando a los parches ricos en P del suelo, por medio del aumento en la ramificación del sistema radical y la formación de pelos radicales (Lynch, 1995; Lynch y Brown, 2001). Si bien algunos nutrimentos como es el caso del P evocan cambios en el desarrollo del sistema radical, los mecanismos por los cuales las plantas perciben la disponibilidad de estos nutrimentos y traduce(n) esta(s) señal(es) en programas de desarrollo particulares, no han sido aún completamente descritos. Para disectar los mecanismos fisiológicos y genéticos que las angiospermas presentan ante la carencia de P, varios grupos de investigación están usando a A. thaliana como un sistema modelo. Recientemente se ha descrito que la baja disponibilidad de P induce cambios drásticos en la arquitectura del sistema radical en A. thaliana los cuales incluyen una disminución del crecimiento de la RP, aumento en el crecimiento y densidad de pelos radicales y un crecimiento prolífico de las RLs (Bates y Lynch, 1996; Williamson et al., 2001; López-Bucio et al., 2002). El hecho de que A. thaliana forme un sistema radical más corto y ramificado puede ser como consecuencia de la alteración de su programa de desarrollo postembrionario debido a la disponibilidad de P. La información generada en este trabajo describe de manera detallada los cambios anatómicos, morfológicos y fisiológicos que conllevan al cambio en la arquitectura del sistema radical a través de la actividad de sus 85 meristemos, y además aporta evidencias sólidas de que dichos cambios están regulados genéticamente. 6.1 La deficiencia de P induce un programa de crecimiento determinado en el sistema radical de A. thaliana Uno de los fenómenos más conspicuos que se observan en respuesta a la baja disponibilidad de P en el desarrollo de la raíz es la inhibición gradual del crecimiento de la RP y el aumento en el número de RLs (figura 7, 10 y tabla 2). Dichos cambios en la arquitectura solamente se presentan durante la carencia de P y no de otro nutrimento (figura 9). Nuestros resultados muestran que la reducción en la longitud de la RP se da por un proceso progresivo y complejo que incluye: una reducción en la elongación celular y una disminución y pérdida total de las zonas de elongación y meristemática. A diferencia de las plantas que crecen en condiciones óptimas de P, en la RP de las plantas que sometidas a estrés por P, se observan cambios muy marcados en la longitud celular, el número de células en proceso de alargamiento y el número de células meristemáticas. Desde los primeros días de haber germinado (2 a 4) se observa una disminución en los tres parámetros antes mencionados y dicha disminución continúa de manera exponencial hasta que al día 12 D.D.G., la longitud celular llega a su menor tamaño, representando el 20% del tamaño de las células de la RP de plantas que crecen en MOP. Además, no se detectan células en proceso de elongación, perdiéndose la zona de elongación en el ápice de la raíz. Finalmente a los 14 D.D.G., no se detecta una sola célula meristemática (figura 11) y las células presentes en esta zona anteriormente meristemática, pierden su actividad mitótica (evidenciada por la expresión de CycB1;1:uidA) y no presentan la organización tisular típica ni un QC anatómicamente distinguible (figura 8 F-H y 12). Es importante resaltar que esta región que anteriormente la ocupaba el meristemo ahora está ocupada por células diferenciadas y metabólicamente activas (evidenciado por la expresión de la proteína verde fluorescente GFP que se expresa en tejido diferenciado línea CS920; figura 8 D). 86 La reducción en la longitud de las células y la perdida de la zona elongación y del meristemo es debido en parte a un proceso de diferenciación que inicia en las células más dístales del ápice radical, en la zona de elongación. Dichas células se empiezan a diferenciar antes de que alcancen su longitud final y como consecuencia no se alargan más. Conforme pasan los días, la diferenciación ocurre más cercana a la punta de la raíz y las células son cada vez más cortas, hasta que la zona de elongación desaparece y la longitud celular llega a ser el 20% de la longitud de las células radicales de plantas que crecen en condiciones optimas de P (figura 7 B y 11). Este proceso de diferenciación es gradual y continúa hasta la región meristemática. Asimismo hemos encontrado que solamente los meristemos que pierden su capacidad de división celular están totalmente diferenciados (figura 12), presentando la formación de pelos radicales absorbentes y protoxilema en la región antes meristemática, además de no distinguirse anatómicamente el QC y las células iniciales (figura 8). La reducción en la elongación celular y la perdida total de las zonas de elongación y meristemática también se presenta en las RLs maduras (5-10 mm; tabla 3; figura 17 A-E). Tomando en cuenta que durante el desarrollo postembrionario que presenta el sistema radical de A. thaliana cuando hay suficiente P en el medio, debe existir una regulación perfecta entre la división y la diferenciación celular, de tal forma que pueda mantener un crecimiento indeterminado. Postulamos que durante el estrés por P este equilibrio es roto y el programa de crecimiento indeterminado cambia a un programa de desarrollo determinado. Este cambio de programa de crecimiento por la carencia de P, no se debe a la carencia del P per se como nutrimento, dado que cuando las mutantes lpi crecen en MLP no presentan diferenciación temprana, ni disminución en la elongación celular ni tampoco pérdida de la actividad mitótica en el meristemo; de hecho, mantienen un crecimiento indeterminado independientemente del contenido de P en el medio en que esté creciendo (figura 18, 21 y 22). Más bien se debe a que el P es una señal ambiental que afecta el programa de desarrollo postembrionario. Por lo tanto, proponemos que la baja disponibilidad de P evoca un cambio en el programa de desarrollo postembrionario indeterminado a uno determinado en el cual la división celular es inhibida, la diferenciación celular es 87 promovida y el meristemo se agota. Este tipo de crecimiento determinado en el sistema radical había sido previamente reportado en cactáceas, pero como parte de su programa de desarrollo el cual no era inducible por factores ambientales (Dubrovsky, 1997); también en las raíces proteoides Lupinus albus se ha observado este programa de desarrollo determinado como una respuesta adaptativa a la carencia de P (Johnson et al., 1996). 6.2 El mantenimiento de los meristemos es importante en el crecimiento determinado del sistema radical de A. thaliana durante el estrés por P Durante el crecimiento indeterminado se producen células de novo en el meristemo radical por la división mitótica de las células iniciales que rodean al QC. Estas células pasan por varios ciclos de división celular durante su permanencia en la zona meristemática, una vez fuera de esta zona, en ausencia de división celular, éstas se elongan hasta tomar su tamaño característico, para finalmente diferenciarse al tipo celular correspondiente (Dolan y Davies, 2004). Dicho proceso requiere de una regulación coordinada para que cada uno de los pasos se efectúe de manera correcta y le permitan a la raíz mantener un crecimiento continuo. Sin embargo, se sabe poco de las señales y sus vías de transducción que están regulando lo anterior. Se ha propuesto que para que exista un patrón de formación correcto en el meristemo de A. thaliana debe haber un equilibrio entre dos señales antagónicas, una proveniente del QC para mantener a las células iniciales en un estado desdiferenciado y la otra que proviene de las células maduras para guiar el destino de las nuevas células producto de la división de las células iniciales (van den Berg et al., 1997). Un mecanismo similar podría existir para el mantener el crecimiento indeterminado del ápice de la raíz, que contaría con dos señales antagónicas, una proveniente de la región más madura de la raíz que estaría evocando la diferenciación celular y otra proveniente de la región meristemática que estaría inhibiendo la diferenciación y promovería la división celular. Durante el crecimiento determinado evocado por la carencia de P se observó el desequilibrio entre la división, la elongación y la diferenciación celular, presentándose una diferenciación 88 celular progresiva con dirección a la punta de la raíz así como una pérdida en la división celular y el consecuente agotamiento del meristemo, es decir, que este desequilibrio está permitiendo que se de el crecimiento determinado. Cuando crece en MOP la progenie de la cruza entre las líneas transgénicas CycB1;1:uidA, (marcador de mitosis) y DT-AtsM (expresa la toxina de la difteria específicamente en las células de la cofia) la actividad mitótica en el MRP se pierde como consecuencia de la expresión de la toxina (figura 14 C, I y N). Conforme las divisiones celulares van decreciendo, hay un proceso de diferenciación con dirección a la punta (figura 14 B, H y N). Este proceso de diferenciación generado por la pérdida de la actividad meristemática, emula a lo observado en los ápices de las raíces de plantas que crecen en MLP puesto que hay formación de pelos radicales absorbentes y del protoxilema en el ápice de la raíz, no se pueden distinguir anatómicamente el QC ni las células iniciales y las células son más cortas (figura 14); incluso el MRL de esta línea transgénica se pierde su actividad proliferativa independientemente del contenido de P en el medio. Por lo cual postulamos que la disminución y la pérdida de la actividad meristemática es suficiente para que se dé el proceso de diferenciación en el ápice de la raíz. 6.3 La disponibilidad de P regula el mantenimiento de los meristemos La baja disponibilidad de P induce que los meristemos pierdan su actividad mitótica (figura 12 y 17), dado que al analizar los cambios en el sistema radical de las mutantes lpi a la baja disponibilidad de algunos nutrimentos (P, N, S, Fe y K), encontramos que solamente la respuesta evocada por el P se encuentra afectada (figura 20). Proponemos que debe existir un sistema altamente específico que sensa la disponibilidad del P para que la información sea transmitida por una red de señalización que se encuentra bajo regulación genética. Además, al cuantificar el contenido de P en las mutantes lpi, encontramos que no son hiperacumuladoras de P (tabla 6) sugiriéndonos que el mantenimiento del meristemo no se encuentra regulado por el estatus total de P en la planta sino por el censado local de la concentración de P en la rizósfera. Los experimentos hechos en colaboración con la 89 Ingeniera en Alimentos Alejandra Chacon-López sugieren que la pérdida de la actividad meristemática evocada por baja disponibilidad de P podrían deberse a un efecto directo o indirecto de la carencia del P en la actividad y/o el mantenimiento del QC, dado que cuando las plantas crecen en estrés por la carencia de P, el evento detectado de manera más temprana es un cambio en el QC seguido de la reducción del número de células en el meristemo y la diferenciación celular (anexo2, articulo 5, figura 5). Por lo anterior postulamos que el meristemo sirve como un sensor de señales ambientales y puede regular el desarrollo postembrionario de la raíz modulando su crecimiento vía la regulación de la actividad proliferativa. El mecanismo por el cual la carencia de P regula la actividad meristemática esta aún sin ser entendido, sin embargo, el hecho de que las mutantes lpi no entren a un programa de desarrollo determinado cuando crecen en MLP sugiere que LPI1, 2, 3 y 4 son reguladores del mantenimiento del meristemo bajo estas condiciones de estrés. Recientemente se han reportado algunos genes que son indispensables para el mantenimiento del meristemo como son los factores de transcripción putativos de la clase AP2 PLETHORA 1 y 2 (PLT1 y PLT2; Aida et al., 2004), los factores de transcripción de la familia GRAS SHORT-ROOT (SHR) y SCARECROW(SCR) y AtCLE19, un miembro de la familia relacionada a CLV3/ESR (Casamitjana- Martínez et al., 2003). Nuestros resultados dejan abierta la posibilidad de que los genes antes mencionados pudieran ser regulados ya sea transcripcional o postranscripcionalmente por LPI1, 2, 3 y 4 en función de la disponibilidad de P en el medio. De manera particular especulamos que la disponibilidad de P puede regular la expresión o actividad de PLT1 y PLT2 porque la arquitectura del sistema radical de la doble mutante plt1/plt2 es muy parecida a la de las plantas WT que crecen en condiciones limitantes de P. La regulación del ciclo celular es de suma importancia para que las células se mantengan en división constante, lleguen a ser quiescentes, se alarguen o se diferencien. Los reguladores del ciclo celular presumiblemente controlan la duración del ciclo celular y el número de divisiones que llevan a cabo las células del meristemo, antes de que se alarguen y diferencien (West et al., 2004). Dados los cambios en el programa de desarrollo evocados por la carencia de P, podríamos 90 suponer que la carencia de este nutrimento estaría afectando el ciclo celular ya que se puede apreciar una pérdida en la división celular (figura 12) y una reducción en el número de divisiones celulares evidenciadas por la disminución del número de células en el meristemo (figura 11 C), con la consecuente diferenciación del mismo (figura 8). Aunado a esto, cuando se aplican agentes químicos que bloquean la replicación como la hidroxiurea y la afidicolina a la raíz de A. thaliana, se presenta un fenotipo igual al evocado por la carencia de P que comprende la reducción de la longitud de la RP que va acompañada de la pérdida de la actividad mitótica y diferenciación del meristemo (Culligan et al., 2004). Asimismo se ha visto que genes reguladores del ciclo celular como la cinasa activadora de cinasas dependientes de ciclinas (cak1At), la ribonucleótido reductasa 1 (RNR1) y la proteína relacionada a retinoblastoma (RBR) son necesarios para el mantenimiento del meristemo porque una mala regulación de éstos tiene como consecuencia la pérdida de la división celular y la diferenciación del meristemo (Umeda et al., 2000; Culligan et al., 2004; Wildwater et al., 2005). El estudio de la expresión de los genes mencionados tanto en las plantas silvestres como en las mutantes lpi dará las bases para definir cómo es que la baja disponibilidad de P está regulando el ciclo celular vía los genes LPI. 6.4 La disponibilidad de P influye en el establecimiento del gradiente respuesta a auxinas en el meristemo Se ha demostrado que en la punta de la raíz de A thaliana se localiza una máxima respuesta a auxinas el cual es indispensable para mantener la organización y funcionamiento del meristemo (Sabatini et al., 1999; Kerk y Feldman, 2001). En nuestros experimentos se observa este gradiente de respuesta a auxinas en las plantas (DR5:uidA) que crecen en MOP, se ubica en la columela y sus células iniciales, en el QC y en el cilindro central de la raíz. En las plantas que crecen en MLP desde los 4 D.D.G., se reduce la expresión del gen reportero GUS en el cilindro vascular, y esto prosigue en los siguientes días mostrándose sólo expresión en algunas células del procambium hasta no detectarse a los 16 D.D.G. La expresión de GUS también se disminuye en las células de la cofia lateral a partir de los 8 D.D.G., 91 hasta reducirse a un pequeño grupo de células donde presumiblemente se encontraba el QC. Los genes PIN de manera colectiva controlan la distribución de auxinas que regulan la división y expansión celular en la RP, además la acción conjunta de estos genes tiene un papel muy importante en el mantenimiento del meristemo, ya que participan en la formación del gradiente de respuesta a auxinas en el ápice radical y restringen el dominio de expresión de los genes PLT (Blilou et al., 2005). Por esto no podemos excluir que durante el desarrollo determinado evocado por la carencia de P la actividad de los genes PIN se ve afectada. Sin embargo, en la línea transgénica DR5:uidA la reducción progresiva de la expresión de GUS en la cofia coincide temporal y espacialmente con los cambios en la división celular en el MRP (figura 12), así como con el inicio de la diferenciación, por lo que no es posible establecer si el desarrollo determinado en condiciones limitantes de P, es consecuencia de la afección en el gradiente de respuesta a auxinas o sea lo que lo cause. En las RLs más viejas (0.5 a 1 cm) donde el proceso de agotamiento es anatómicamente distinguible, también se observa esta correlación (figura 17). 6.5 El aumento en el número de raíces laterales durante el estrés por P, es independiente del agotamiento del meristemo Otro de los cambios evocados por la baja disponibilidad de P es el aumento en el número y densidad de las RLs (figura 10). Varias evidencias experimentales sugieren que la pérdida de la actividad meristemática ya sea por la ablación celular o por decapitación del MRP evoca un incremento en el número de RLs (Torrey, 1950; Tsugeki y Fedoroff, 1999). De hecho, se ha descrito en cactáceas que el crecimiento determinado favorece la formación de RLs (Dubrovsky, 1997). Sin embargo en experimentos con la línea transgénica DT-AtsM la cual pierde la actividad proliferativa de su meristemo independientemente de la concentración de P en el medio, encontramos que cuando crece en MLP el número de RLs aumenta al doble comparandola con las que crecen en MOP (figura 15), sugiriéndonos que el agotamiento del meristemo no es un prerrequisito para que el número de Rls aumente tan drásticamente como ocurre cuando las plantas crecen en MLP. 92 Además, al hacer el análisis fenotípico de las mutantes lpi, encontramos que a pesar de que las mutantes lpi1, 3 y 4 mantienen la actividad del MRP durante la carencia de P, responden a este estímulo estresante incrementando el número de RLs (figura 20). La mutante lpi2 mantiene un crecimiento continuo de la RP y no presenta un incremento en el número de RLs. Los resultados anteriores nos dan la evidencia genética de que el incremento en el número de RLs durante la carencia de P no es debida al agotamiento del meristemo sino que este aumento en el número de RLs es consecuencia directa de la carencia de P y pudiera estar obrando a nivel de la inducción en la formación de primordios o en la emergencia acelerada de estos para formar RLs. Al hacer un análisis microscópico de los primordios y las RLs de plantas que crecen en condiciones limitantes y óptimas de P encontramos que en las plantas que crecen en condiciones limitantes de P, la mayoría de los primordios que se presentan al día 6 postgerminación emergen y forman RLs maduras al llegar a los 14 D.D.G., contrariamente a lo que ocurre en MOP donde la mayoría de los primordios se mantienen sin emerger (figura 16), lo que nos sugiere que la baja disponibilidad de P induce que los primordios que se están formando emerjan para formar RLs maduras. En nuestro grupo de trabajo se ha encontrado que la proteína BIG es clave para inducir la formación de primordios independiente de la concentración de P en el medio en el que crece, pero que es requerida para incrementar la emergencia de los primordios para formar RLs. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que la baja disponibilidad de P, también induzca la formación de más primordios en etapas tempranas del desarrollo de la raíz ya que al día 6 (primer de cuantificación de primordios) se puede observar que existe un mayor número de primordios (30%) en las plantas que crecen en MLP comparándolas con las que crecen en MOP (figura 16). 93 6.6 El agotamiento del meristemo esta relacionado con el incremento temporal y espacial de la expresión de genes que permiten a la planta tomar el P eficientemente El análisis temporal de los efectos de la baja disponibilidad de P demuestran que hay una relación espacio temporal entre los cambios morfogenéticos en el ápice de la raíz y el incremento de la expresión de los transportadores de alta afinidad (PT) AtPT 1 y 2 y la exudación de fosfatasas ácidas (FA) en el sistema radical. Cuando las líneas transgénicas pAtPT1:uidA y pAtPT2:uidA crecen en MLP, desde los primeros días de crecimiento se observa el proceso de diferenciación en las células más distales al ápice radical. Conforme pasa el tiempo, la diferenciación avanza con dirección a la punta de la raíz. En ambas líneas transgénicas hay una fuerte inducción en la expresión del gen reportero GUS únicamente en los tejidos que se han diferenciado (figura 13). Para el día 12 después de la germinación, se pierde totalmente la división celular en el meristemo apical, sus células se diferencian totalmente y se aprecia una fuerte expresión de pAtPT1:uidA y pAtPT2:uidA así como la exudación de FA (figura 13). No se detecta la expresión del gen reportero GUS en las laterales recién emergidas y que no se han agotado aún (figura 13 flecha). Por su parte, en las mutantes lpi1 y 2 que portan la construcción pAtPT1:uidA o pAtPT2:uidA los meristemos apicales no se agotan cuando crecen en MLP y se observa la tinción de GUS de manera exclusiva en los tejidos diferenciados, mientras que en la región meristemática aún sin diferenciar no se detecta (figura 24). De lo anterior deducimos que para que se pudieran expresar los PTs es necesario que las células estén diferenciadas. Sin embargo, la expresión de los PT y la exudación de FA no es consecuencia de este programa de diferenciación en el ápice de la raíz, puesto que en la progenie de la cruza de DT-AtsM con la línea transgénica AtPT2:uidA, únicamente hay inducción del PT y exudación de FA cuando estas plantas crecen en condiciones limitantes de P, a pesar de que las células del ápice de la raíz se diferencian gradualmente hasta que el meritemo se agota (como ocurre con la WT en bajo P) tanto en bajo como en alto P (figura 14). Aunado a esto, las mutantes lpi 1 y 2 no presentan diferenciación celular ni en la zona meristemática 94 ni en la zona de elongación cuando crecen en MLP, pero sí presentan la inducción en la expresión de pAtPT1:uidA y pAtPT2:uidA (figura 24) 6.7 Los genes LPI afectan solamente un subgrupo de respuestas evocadas por la baja disponibilidad de P El sistema de rescate a la baja disponibilidad de P incluye respuestas a nivel morfológico, fisiológico, bioquímico y molecular como lo son la acumulación de antocianinas, exudación de fosfatasas y ácidos orgánicos a la rizósfera y aumento en la expresión de varios genes (Raghothama, 1999). La caracterización fenotípica de las mutantes lpi demostró que las proteínas que codifican para los genes LPI están involucradas en el sistema de regulación de las respuestas a la carencia de P. Algunas de las respuestas, como la acumulación de antocianinas y la estimulación del alargamiento de los pelos radicales (figura 23), se mantienen sin cambios significativos en las mutantes lpi, sugiriéndonos que las respuestas inducibles por la baja disponibilidad de P, se encuentran reguladas por distintas rutas, y que la regulación de algunas respuestas son independientes de los genes LPI (figura 27). Con respecto a la regulación de genes por la disponibilidad de P encontramos que en las mutantes lpi1 y 2 los niveles de transcritos de AtPAP1, AtACP5, AtPT1, AtIPS1 y AtPT2 fueron menores cuando las plantas crecieron en MLP comparándose con el control (figura 25), siendo entonces LPI1 y LPI2 reguladores negativos. PHR1 codifica para un factor de transcripción del tipo MYB el cual es requerido para la inducción de genes regulados por la carencia de P y respuestas como la acumulación de antocianinas pero no en los cambios del sistema radical evocados por la carencia de P (Rubio et al., 2001). Abel et al., (2002) propone que las respuestas a la carencia de P están reguladas al menos en dos rutas independientes. Una de éstas engloba los cambios morfológicos del sistema radical y la otra regula la expresión de los genes de respuesta a la carencia de P y es precisamente en esta última donde PHR1 tiene un papel preponderante en su regulación (figura 5). El hecho de que las mutantes lpi además de estar afectadas en las respuestas de arquitectura del sistema radical, también estén afectadas en la 95 activación de algunos genes que están relacionados con la adaptación de la planta a la carencia de P, demuestra que existen puntos de interacción (crosstalk) entre dos de las vías de regulación. Los cambios en la expresión de AtACP5, AtPT1 y AtIPS1 en las mutantes lpi1 y lpi2 fueron similares en la mutante phr1, ésta ultima está afectada en la regulación de la expresión de genes que responden a la carencia de P (Rubio et al., 2001), sugiriendo la posibilidad que las proteínas LPI estan regulando río arriba la expresión o función de PHR1 (figura 29 A). Sin embargo, como las mutantes lpi no están afectadas en la acumulación de antocianinas y la mutante phr1 Figura 29. Modelo de la regulación de las respuestas del sistema de rescate a la baja disponibilidad de P. (1) La baja disponibilidad de P induce el aumento en la formación de pelos radicales en una vía independiente a PHR1 y LPI1-4. (2) EL estrés por P altera la arquitectura del sistema radical vía la formación de raíces laterales y el mantenimiento de los meristemos, siendo estos regulados por los genes LPI; las modificaciones del sistema radical incrementan la exploración del suelo y la toma de P. (3) La carencia de P induce un grupo de genes responsivos a la baja disponibilidad P y sus productos promueven el reciclamiento 96 no esta afectada en los cambios de la arquitectura del sistema radical cuando se encuentran en estrés por P, sería también posible que los genes LPI estén actuando en una ruta diferente que PHR1 (figura 29 B). 6.8 Importancia biológica Los cambios en el programa de desarrollo postembrionario evocados por la carencia de P, que incluyen un cambio en el programa de desarrollo determinado en el sistema radical e inducción en la formación y la emergencia de las RLs, podrían estar encaminados a: 1) incrementar al máximo la superficie de absorción de la raíz por medio de la formación de un sistema radical altamente ramificado el cual pueda explorar de manera más efectiva las capas superiores del suelo que son las capas que generalmente son más ricas en este nutrimento y 2) proveer las condiciones fisiológicas en el sistema radical de A. thaliana para incrementar la capacidad de solubilizar y tomar el P por la activación de genes que estén participando en estos procesos. De forma consistente con esta hipótesis encontramos que el programa de desarrollo determinado correlaciona con el incremento en el número de RLs (figura 10), un incremento de 2 a 3 veces en la capacidad de toma de P (anexo1, figura 1), activación transcripcional de pAtPT1:uidA y pAtPt2:uidA y la exudación de fosfatasas ácidas, estos últimos de manera conspicua en los meristemos agotados (figura 13 y 17). Por lo anterior podemos afirmar que los cambios en el programa de desarrollo postembrionario en respuesta al estrés por P son un componente muy importante en el sistema de respuestas de A. thaliana a la carencia de P. En nuestro conocimiento éste es el primer reporte que demuestra experimentalmente que el crecimiento determinado tiene una importancia biológica significativa enfocada a incrementar la capacidad de toma del P por el sistema radical de A. thaliana. La noción de que el crecimiento determinado evocado por la baja disponibilidad de P está genéticamente controlado y que forma parte de un programa de desarrollo postembrionario, se sustenta en el hecho de que las mutantes lpi1-4, cuando crecen en MLP pueden mantener un crecimiento continuo de la raíz de manera similar a cuando crecen en MOP y que no se induce el agotamiento del meristemo por bajo P. La clonación y 97 caracterización de los genes que participen en esta respuesta incrementará nuestro conocimiento en las interacciones moleculares, bioquímicas y de la arquitectura del sistema radical las cuales ocurren durante la adaptación de las plantas a suelos pobres en P. La clonación de los genes afectados en la mutantes lpi será de gran utilidad para el entendimiento de las vías de señalización que están regulando las respuestas a la baja disponibilidad de P. 98 7 CONCLUSIONES El estudio de los cambios en la arquitectura del sistema radical de A. thaliana, en respuesta a la baja disponibilidad de P que se hizo en esta tesis nos permite concluir que: 1.- La baja disponibilidad de P evoca la inhibición gradual del crecimiento de la RP y el aumento en el número y densidad de RLs. 2.- La reducción en la longitud de la raíz se da por un cambio en el programa de desarrollo postembrionario indeterminado a uno determinado en el cual la división celular es inhibida, la diferenciación celular es promovida y el meristemo se agota. 3.- El P además de ser un nutrimento, actúa como una señal ambiental que afecta el programa de desarrollo post embrionario del sistema radical. 4.- Los efectos más claros que ocurren durante el desarrollo determinado son: una reducción en la elongación celular y una disminución y pérdida total de las zonas de elongación y meristemática. 5.- La reducción en la longitud de las células, la pérdida de la zona elongación y el meristemo es debido en parte a un proceso de diferenciación gradual que inicia en las células más dístales del ápice radical, en la zona de elongación y continúa hasta la región meristemática. 6.- La baja disponibilidad de P induce que los meristemos pierdan su actividad. La disminución y pérdida de la actividad meristemática es suficiente para que se dé el proceso de diferenciación gradual en el ápice de la raíz. 7.-El meristemo sirve como un sensor de señales ambientales locales y puede regular el desarrollo postembrionario de la raíz modulando su crecimiento vía la regulación de la actividad proliferativa. 8.- El aislamiento de las mutantes low phosphorous insensitive (lpi) demostró que los cambios en la arquitectura radical evocados por la deficiencia de P pueden ser diseccionados genéticamente. 9.- Las mutantes low phosphorous insensitive (lpi) son especificas y parcialmente insensibles a la carencia de P. 99 10.-El hecho de que las mutantes lpi no entren a un programa de desarrollo determinado cuando crecen en MLP indica que LPI1, 2, 3 y 4 regulan el mantenimiento del meristemo y que son indispensables para que se mantenga el desarrollo indeterminado cuando las plantas crecen en condiciones óptimas de P. Dicha proteínas podrían estar actuando vía genes relacionados directamente con el control del ciclo celular, el transporte y sensibilidad a auxinas. 11.-El incremento en el número de raíces laterales durante la carencia de P no es debido la falta del funcionamiento normal del meristemo sino consecuencia directa de la carencia de P. 12.-El P es un regulador negativo de la formación y emergencia de los primordios de las RLs. 13.- Hay una relación espacio-temporal entre el programa de desarrollo determinado y un aumento en la expresión de genes que participan en la toma de fósforo puesto que durante el estrés por P, la expresión de los PTs, la exudación de FA y el incremento en la toma de P se da de manera conspicua en los meristemos agotados. Sin embargo dichas respuestas no son consecuencia del programa de diferenciación en el ápice de la raíz. 14.- Los cambios en el programa de desarrollo postembrionario evocados por la carencia de P podrían estar encaminados a: 1) incrementar al máximo la superficie de absorción de la raíz por medio de la formación de un sistema radical altamente ramificado el cual pueda explorar de manera más efectiva las capas superiores del suelo, que son las capas que generalmente son más ricas en este nutrimento y 2) proveer las condiciones fisiológicas en el sistema radical de A. thaliana para incrementar la capacidad de solubilizar y tomar el P por la activación de genes que estén participando en estos procesos. 15.- La caracterización fenotípica y de expresión de genes de las mutantes lpi nos demostró que las respuestas evocadas por la baja disponibilidad de P, se encuentran reguladas por distintas rutas y que las proteínas que codifican para los genes LPI son reguladores negativos de un subgrupo de estas respuestas. 16.- Las mutantes lpi están afectadas en las respuestas evocadas por la carencia de P tanto a nivel de arquitectura de la raíz como de la expresión de genes específicos a 100 la carencia de este nutrimento por lo que existen puntos de interacción (crosstalk) entre las vías que regulan los cambios en la arquitectura del sistema radical y la activación de algunos genes que están relacionados con la adaptación de la planta a la carencia de P. 101 8 PERSPECTIVAS Para entender detalladamente de qué manera la disponibilidad de P afecta al mantenimiento del meristemo, es necesario estudiar varios aspectos que están relacionados con la viabilidad del meristemo como son: A) examinar como se esta afectando el QC y que papel podría estar desempeñando durante el estrés por P, B) evaluar si genes tales como PLETHORA 1 y 2, SHORT-ROOT, SCARECROW o AtCLE19 que se han reportado como necesarios para mantener funcional el meristemo, tanto en WT en las mutantes lpi, C) analizar de qué forma la carencia de P impacta sobre los reguladores clave del ciclo celular, ya que su regulación es primordial para el mantenimiento de los meristemos y D) estudiar la relación entre el transporte polar de auxinas, así como la sensibilidad de la raíz a esta hormona ya que se ha visto fuertemente relacionada con el mantenimiento del meristemo. Por otro lado es muy importante la clonación posicional de los genes afectados en las mutantes lpi, ya que nos dará una muy buena herramienta para el entendimiento de las potenciales interrelaciones entre el sensado e integración de la(s) señal(es) y las respuestas que se han fijado en la planta durante su proceso evolutivo y que le han ayudado a sobrevivir durante periodos de carencia de P. 102 BIBLIOGRAFÍA 1.-Abel S, Ticconi A, Delatorre A (2002) Phosphate sensing in higher plants. Physiol Plant 115,1-8 2.-Aida M, Beis D, Heidstra R, Willemsen V, Blilou I, Galinha C, Nussaume L, Noh YS, Amasino R, Scheres B (2004) The PLETHORA genes mediate patterning of the Arabidopsis root stem cell niche. Cell 119,109-20 3.-Baldwin JC, Karthikeyan AS, Raghothama KG (2001) LEPS2, a phosphorus starvation- induced novel acid phosphatase from tomato. Plant Physiol 125,728–737 4.-Bariola PA, Howard CJ, Taylor CB, Verbug MT, Jaglan VD, Green PJ (1994) The Arabidopsis ribonuclease gene RSN1 is tightly controlled in response to phosphate limitation. Plant J 6, 673-685 5.-Bates T, Lynch J (1996) Stimulation of root hair elongation in Arabidopsis thaliana by low phosphorus availability. Plant Cell Environ 19,529-538 6.-Baum SF, Rost TL (1996) Root apical organization in Arabidopsis thaliana L. Root cap and protoderm. Protoplasma 192,178-188 7.-Baum SF, Dubrovsky JG, Rost TL (2002) Apical organization and maturation of the cortex and vascular cylinder in Arabidopsis thaliana (Brassicaceae) roots. Am J Bot 89,908-920 8.-Bell CJ, Ecker JR (1994) Assignment of 30 micro satellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics 19,137-144 9.-Blilou I, Frugier F, Folmer S, Serralbo O, Willemsen V, Wolkenfelt H, Eloy N, Ferreira P, Weisbeek P, Scheres B (2002)The Arabidopsis HOBBIT gene encodes a CDC27 homolog thatlinks the plant cell cycle to progression of cell differentiation. Genes & Dev. 2002 16: 2566-2575 10.-Blilou I, Xu J, Wildwater M, Willemsen V, Paponov I, Friml J, Heidstra R, Mitsuhiro A, Palme K, Scheres B (2005). The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature 433,39-44 11.-Burleigh SH, Harrison MJ (1999) The down-regulation of Mt4-like genes by phosphate fertilization occurs systemically and involves phosphate translocation to the shoots. Plant Physiol 119,241–248 103 12.-Casamitjana-Martínez E, Hofhuis H F, Xu J, Chun-Ming L, Heidstra R, Sheres B (2003) Root-specific CLE19 overexpression and the sol1/2 suppressors implicate a CLV-like pathway in the control of Arabidopsis root meristem maintenance. Curret Biol 13, 1435-1441 13.-Celenza JL, Grisafi PL, Fink GR (1995) A pathway for lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Genes Dev 9,2131-2142 14.-Chen DL, Delatorre CA, Bakker A, Abel S (2000) Conditional identification of phosphate starvation response mutants in Arabidopsis thaliana. Planta 211,13–22 15.-Colon-Carmona A, You R, Haimovitch-Gal T, Doerner P (1999) Spatio-temporal analysis of mitotic activity with a labile cyclin-GUS fusion protein. Plant J 20,503-508 16.-Cronquist A. (1971) Introducción a la botánica. CECSA. Segunda edición. México 454-463 pp 17.-Culligan K, Tissier A, Britt A (2004) ATR regulates a G2-phase cell-cycle checkpoint in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 16,1091–1104 18.-De Tomasi JA (1936) Improving the technic of the Feulgen stain. Stain Technol 11: 137-144 19.-Del Pozo JC, Allona I, Rubio V, Leyva A, de la Pena A, Aragoncillo C, Paz-Ares J (1999) A type 5 acid phosphatase gene from Arabidopsis thaliana is induced by phosphate starvation and by some other types of phosphate mobilizing/oxidative stress conditions. Plant J 19,579–589 20.-Dolan L, Janmaat K, Willemsen V, Linstead P, Poethig S, Roberts K, Scheres B (1993) Cellular organization of the Arabidopsis thaliana root. Development 119,71-84 21.-Dolan, L (1994). Roots. En Arabidopsis an atlas of morphology and development. Bowman, J.Editor. SpringerVerlag. E.U.A. 93-95 pp. 22.-Dolan L, Davies J (2004) Cell expansion in roots. Curr Opin Plant Biol 7,33–39 23.-Dong B, Rengel Z, Delhaize E (1998) Uptake and translocation of phosphate by pho2 mutant and wild type seedlings of Arabidopsis thaliana. Planta 205,251-256 24.-Dubrovsky JG (1997) Determinate primary-root growth in seedlings of Sonoran Desert Cactaceae; its organization, cellular basis, and ecological significance. Planta 203,85-92 25.-Duff SMG, Sarath G, Plaxton WC (1994) The role of acid phosphatases in plant phosphorus metabolism. Physiol Plant 90,791–800 104 26.-Essigmann B, Güler S, Narang RA, Linke D, Benning C (1998) Phosphate availability affects the thylakoid lipid composition and the expression of SQD1, a gene required for sulfolipidbiosynthesis in Arabidopsis thaliana. Proc Nat Acad Sci USA 95, 1950-1955 27.-Fahn A (1974) Anatomía vegetal. H.Blume ediciones. España. 28.-Feldman JL (1984) Regulation of root development. Ann Rev Plant Physiol 35,223-42 29.-Fitter A, Williamson L, Linkohr B, Leyser O (2002) Root system architecture determines fitness in an Arabidopsis mutant in competition for immobile phosphate ions but not for nitrate ions. Proc R Soc Lond B 269,2017-2022 30.-Forde BG (2002) Local and long-range signaling pathways regulating plant response to nitrate. Ann Rev Plant Biol 53,203-224 31.-Franco-Zorrilla JM, Martín AC, Solano R, Rubio V, Leyva A, Paz-Ares J (2002) Mutations at CRE1 impair cytokinin-induced repression of phosphate starvation responses in Arabidopsis. Plant J 32, 353–360 32.-Franco-Zorrilla JM, González E, Bustos R, Lindares F, Leyva A, Paz-Ares J (2004) The transcriptional control of plant responses to phosphate limitation. J Exp Bot 396,285-293 33.-Friml J (2003) Auxin transport - shaping the plant. Curr Opin Plant Biol 6,7-12 34.-Giusti MM, Wrolstad RE (2001) Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. In: Current Protocols in Food Analytical Chemistry, R.E. Wrolstad (Ed.), John Wiley & Sons, New York (2001) pp. 1–13. 35.-Goldstein AH, Beartlein DA, McDaniel RG (1988) Phosphate starvation inducible metabolism in Lycopersicon esculentum. I. Excretion of acid phosphatase by tomato plants and suspension cultured cells. Plant Physiol 87,711–715 36.-Hamburger D, Rezzonico E, MacDonald-Comber Petétot J, Somerville C, Poirier Y (2002) Identification and characterization of the Arabidopsis PHO1 gene involved in phosphate loading to the xylem. Plant Cell 14, 889-902 37.-Haran S, Logendra S, Seskar M, Bratanova M, Raskin L (2000) Characterization of Arabidopsis acid phosphatase promoter and regulation of acid phosphatase expression. Plant Physiol 124,615–626 105 38.-Härtel H, Dörmann P, Benning C (2000) DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis. Proc Nat Acad Sci USA 19,10649–10654 39.-Hesse PR (1971) Soil phosphorus: its measurements and its uptake by plants. Aust J Soil Res 35,227–239 40.-Hinsinger P (2001) Bioavailability of soil inorganic P in the rizosphere as affected by root-induced chemical changes: A review. Plant Soil 237,173-195 41.-Hirt H, Shinozaki K (2004) Plant responses to abiotic Stress. Springer. UK 300 pp 42.-Holford CR, (1997) Soil phosphorous: its measurements and its uptake by plants. Aust Jour Soil Res 240,1448-1453 43.-Ito Y, Nakanomyo K, Motose H, Iwamoto K, Sawa S, Dohmae N, Fukuda H (2006) Dodeca-CLE Peptides as Suppressors of Plant Stem Cell Differentiation. Science 313,842-845 44.-Jiang K, Meng YM, Feldman LJ (2003) Quiescent center formation in maize roots is associated with an auxinregulated oxidizing environment. Development 130, 1429-1438 45.-Johnson JF, Vance CP, Allan DL, (1996) Phosphorus deficiency in Lupinus albus. Altered lateral root development and enhanced expression of phosphoenolpyruvate carboxilase. Plant Physiol 112,31-41 46.-Jones DL (1998) Organic acids in the rhizosphere: a critical review. Plant Soil 205,25– 44 47.-Karthikeyan AS, Varadarajan DK, Mukatira UT, D’Urzo MP, Damsz B, Raghothama KG (2002) Regulated expression of Arabidopsis phosphate transporters. Plant Physiol 130:221-233 48.-Kerk NM, Feldman L (1995) A biochemical model for the initiation and maintenance of the quiescent center: implications for organization of root meristems. Development 121,2825-2833 49.-Theierl K, Stenzel I, Glund K (1998) Extracellular administration of phosphate-sequestering metabolites induces ribonucleases in cultured tomato cells. Planta 204,404–407 50.-Konieczny A, Ausubel FM (1993) A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotypespecific PCR-based markers. Plant J 4,403-410 51.-Lee RB, Ratcliffe RG (1993) Subcellular distribution of inorganic phosphate, and levels of nucleoside triphosphate, in mature maize roots at low external phosphate concentrations: measurements with 31P NMR. J Exp Bot 44,587–598 106 52.-Lee RB, Ratcliffe RG, Southon TE (1990) 31 P NMR measurements of the cytoplasmic and vacuolar Pi content of mature maize roots: relationships with phosphorus status and phosphate fluxes. J Exp Bot 41,1063–1078 53.-Leyser O, Day S (2003) Mechanism in plant development. Blackwel ed. Oxford UK. 241pp. 54.-Li D, Zhu H, Lui K, Liu X, Leggewies G, Udvardi M, Wang D (2002) Purple acid Phosphatases of Arabidopsis thaliana. Comparative analysis and differential regulation by phosphate deprivation. J Biol Chem 227, 27772-27782 55.-Liu C, Muchhal US, Raghothama KG (1997) Differential expression of TPS11, a phosphate starvation-induced gene in tomato. Plant Mol Biol 33,867–874 56.-Löffler A, Abel S, Jost W, Beintema JJ, Glund K (1992) Phosphate-regulated induction of intracellular ribonucleases in cultured tomato (Lycopersicon esculentum) cells. Plant Physiol 98,1472–1478 57.-López-Bucio J (2001) Estudio de los mecanismos que controlan la eficiencia de captación de fósforo en plantas y su potencial manipulación biotecnológica. Tesis de Doctorado. Centro de Investigación y Estudios Avanzados de Instituto Politécnico Nacional. 90 pp. 58.-López-Bucio J, Hernández-Abreu E, Sánchez-Calderón L, Nieto-Jacobo MF, Simpson J, Herrera-Estrella L (2002). Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiol 129:244-256 59.-López-Bucio J, Cruz-Ramírez A, Herrera-Estrella L (2003) The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Oppin Plant Biol 6,280–287 60.-López-Bucio J, Hernández-Abreu E, Sánchez-Calderón L, Pérez-Torres A, Rampey RA, Bartel B, HerreraEstrella L (2005) An auxin transport independent pathway is involved in phosphate stress-induced root architectural alterations in Arabidopsis: identification of BIG as a mediator of auxin in pericycle cell activation. Plant Physiol 137,681–691 61.-Lukowitz W, Gillmor CS, Scheible W (2000) Positional cloning in Arabidopsis. Why it feels good to have a genome initiative working for you. Plant Physiol 123,795-805 62.-Lynch J (1995) Root architecture and plant productivity. Plant Physiology 109: 7-13 63.-Lynch JP, Brown KM (2001) Topsoil foraging an architectural adaptation of plans to low phosphorous. Plant Soil 237,225-237 107 64.-Ma Z, Baskin TI, Brown KM, Lynch JP (2003) Regulation of root elongation under phosphorous stress involves changes in ethylene reponsiveness. Plant Physiol 1331,1381-1390 65.-Malamy JE, Benfey PN (1997) Organization and cell differentiation in lateral roots of Arabidopsis thaliana. Development 124,33-44 66.-Malamy JE, Ryan KS (2001) Environmental regulation of lateral root initiation in Arabidopsis. Plant Physiol 127,899-909 67.-Martin AC, del Pozo JC, Iglesias J, Rubio V, Solana R, de la Pena A, Leyva A, Paz-Ares J (2000) Influence of cytokinins on the expression of phosphate starvation responsive genes in Arabidopsis. Plant J 24,559–567 68.-Meyerowitz EM (1987) Arabidopsis thaliana. Annual Review of Genetic 21,93-111 69.-Meyerowitz EM (1997) Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell 88:229-308. 70.-Miura K, Rus A, Sharkhuu A, Yokoi S, Karthikeyan A, Raghothama KG, Baek D, Koo YD, Jin JB, Bressan RA, Yun DJ, Hasegawa PM (2005) The Arabidopsis SUMO E3 ligase SIZ1 controls phosphate deficiency responses. Proc Nat Acad Sci USA 102,7760-7765 71.-Muchhal US, Pardo JM, Raghothama KG (1996) Phosphate transporters from the higher plant Arabidopsis thaliana. Proc Nat Acad Sci USA 93, 10519-10523 72.-Mudge SR, Rae AL, Diatloff E, Smith FW (2002) Expression analysis suggests novel roles for members of the Pht1 family of phosphate transporters in Arabidopsis. Plant J 31,341-353. 73.-Nacry P, Canivenc G, Muller B, Azmi A, Onckelen H, Rossignol M, Doumas P (2005) A role for auxin redistribution in the responses of the root system architecture to phosphate starvation in Arabidopsis. Plant Physiol 138, 2061-2074 74.-Nürnberger T, Abel S, Jost W, Glund K (1990) Induction of an extracellular ribonuclease in cultured tomato cells upon phosphate starvation. Plant Physiol 92, 970–976 75.-Oberson A, Friesen DK, Rao IM, Bühler S, Frossard E (2001) Phosphorus transformations in an Oxisol under contrasting land-use systems: The role of soil microbial biomass. Plant Soil 237,197-210 76.-O’Brien TP, McCully ME (1981) The study of plant structure principles and selected methods. Editorial Termacarphi. Australia. 108 77.-Ogawa N, DeRisi J, Brown P (2000) New components of a system for phosphate accumulation and polyphosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae revealed by genomic expression analysis. Mol Biol Cell 11, 4309-4321 78.-Okada K, Shimura Y (1994) Modulation of root growth by physical stimuli. En Arabidopsis. Meyerowitz EM, Somerville CR, Editores. Cold Spring Harbor Laboratory Press. E.U.A. 665-684 pp. 79.-Raghothama KG (1999) Phosphate acquisition. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50:665-693 80.-Rausch C, Bucher M (2002) Molecular mechanism of phosphate transport in plants. Planta 216:23-37 81.-Rubio V, Linhares F, Solano R, Martín AC, Iglesias J, Leyva A, y Paz-Ares J (2001) A conserved MYB transcription factor involved in phosphate starvation signaling both in vascular plants and in unicellular algae. Gene Dev 15,2122–2133 82.-Sabatini S, Beis D, Wolkenfelt H, Murfett J, Guilfolyle T, Malamy J, Benfey P, Leyser O, Bechtold N, Weisbeek P, Scheres B (1999) An auxin-dependent distal organizer of pattern and polarity in the Arabidopsis root. Cell 99:463-472 83.-Salama A, Wareing PF (1979) Effects of mineral nutrition on endogenous cytokinins in plants of sunflower (Helianthus annuus L.). J Exp Bot 30,971–981 84.-Schachtman DP, Reid RJ, Ayling SM (1998) Phosphorus uptake by plants: From soil to cell. Plant Physiol 116:447-453 85.-Schiefelbein JW, Benfey PN (1991) The development of plant roots: New approaches to underground problems. Plant Cell 3,1147-1154 86.-Schiefelbein, JW, Benfey PN, (1994) Root development in Arabidopsis. En Arabidopsis. Meyerowitz, EM. y Somerville, CR. Editores. Cold Spring Harbor Laboratory Press. E.U.A. 335-353 pp. 87.-Schiefelbein JW (2000) Constructing a Plant Cell. The Genetic Control of Root Hair Development. Plant Physiol 124,1525–1531 88.-Schmidt W, Tittel J, Schikora L (2000) Role of hormones in the induction of iron deficiency responses in Arabidopsis roots. Plant Physiol 122,1109-1118. 89.-Stomp A (1992) Histochemical localization of β-Glucoronidasa en GUS protocols: Using the gus gene as a reporter of gene expression. Gallagher, S. R. editor. Academic press. E.U.A. 103 113 pp. 109 90.-Theodorou ME, Plaxton CW (1993) Metabolic adaptations of plant respiration to nutritional phosphate deprivation. Plant Physiol 101,339-344 91.-Ticconi CA, Delatorre CA, Lahner B, Salt DE, Abel S (2004) Arabidopsis pdr2 reveals a phosphate-sensitive checkpoint in root development. Plant Journal 37,801-814 92.-Tsugeki R, Fedoroff NV (1999) Genetic ablation of root cap cells in Arabidopsis. Proc Nat Acad Sci USA 96,12941–12946 93.-Torrey JG (1950) Induction of lateral roots by indoleacetic acid and decapitation. Am J Bot 37,257–264 94.-Torriani A (1990) From cell membrane to nucleotides: the phosphate regulon in Escherichia coli. Bioessays 12, 371-376. 95.-Trull MC, Deikman J (1998) An Arabidopsis mutant missing one acid phosphatase isoform. Planta 206,544550 96.-Taylor CB, Bariola PA, delCardayré SB, Raines RT, Green PJ (1993) RNS:A senescence-associated RNasa of Arabidopsis that diverged from the S-RNases before speciation. Proc Nat Acad Sci. USA 90, 5118-5122 97.-Ueda M, Matsui K, Ishiguro S, Sano R, Wada T, Paponov I, Palme K, Okada K (2004) The HALTED ROOT gene encoding the 26S proteasome subunit RPT2a is essential for the maintenance of Arabidopsis meristems. Development 131, 2101-2111 98.-Ulmasov T, Murfett J, Hagen G, Guilfoyle, TJ (1997) Aux/IAA Proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9,1963-1971 99.-Umeda M, Umeda-Hara C, Uchimiya H (2000) A cyclin-dependent kinase-activating kinase regulates differentiation of root initial cells in Arabidopsis. Proc Nat Acad Sci USA 97,13396-13400 100.-van den Berg C, Willemsen V, Hage W, Weisbeek P, Scheres B (1995) Cell fate in the Arabidopsis root meristem determined by directional signaling. Nature 378,62-65 101.-van den Berg C, Willemsen V, Hendriks G, Weisbeek P, Scheres B (1997) Short-range control of cell differentiation in the Arabidopsis root meristem. Nature 390,287-289 102.-Watt M, Evans J (1999) Proteoid roots. Physiology end development. Plant Physiol 121,317-324 103.-West G, Inze D, Beemster TS (2004) Cell cycle modulation in the response of the primary root of Arabidopsis to salt stress. Plant physiol 135,1050-1058 110 104.-Wildwater M, Campilho A, Perez-Perez JM, Heidstra R, Blilou I, Korthout H, Chatterjee J, Mariconti L, Gruissem W, Scheres B (2005) The RETINOBLASTOMA-RELATED gene regulates stem cell maintenance in Arabidopsis roots. Cell 123,1337-49 105.-Williamson L, Ribrioux S, Fitter A, Leyser O (2001) Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiol 126:1-8 106.-Yu B, Xu C, Benning C (2002) Arabidopsis disrupted in SQD2 encoding sulpholipid synthase is impaired in phosphate-limited growth. Proc Nat Acad Sci USA 99,5732–5737 107.-Zakhleniuk OV, Raines CA, Lloyd JC (2001) pho3: a phosphorus-deficient mutant of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Planta 212,529-534 108.-Zhang H, Jennings A, Barlow PW, Forde BG (1999) Dual patways for regulation of root branching by nitrate. Proc Nat Acad Sci USA 96,6529-6534 109.-Zhang H, Forde BG (1998) An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Science 247:4407-409 110.-Zhang H, Jennings A. Barlow PW, Forde BG (1999). Dual patways for regulation of root branching by nitrate. Proc Nat Acad Sci USA 96:6529-6534 111 ANEXO 1 Experimentos de toma de P. Los experimentos de toma de P fueron efectuados en colaboración con la Dra. Fernanda Nieto Jacobo, en el laboratorio de Regulación Genética e Ingeniería Metabólica del departamento de Ingeniería Genética del CINVESTAV unidad Irapuato. Método En condiciones estériles, se cultivaron plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo Col-0 en MS 0.1X sólido (ver métodos) en condiciones de bajo (1 μM) y alto (1mM) de P durante 7 y 11 días. Después del tiempo de cultivo las plantas fueron transferidas a medio líquido que contenía 1 µM de NaH2PO4 y 0.6-1 µCi de 32 P como ácido ortofosforico de libre acarreador (Amersham). Después de 30 minutos de incubación, las plantas fueron lavadas con cuidado en agua desionizada. Un grupo de 5 plantas de cada tratamiento fueron colocadas en un plástico y expuestas a una película fotográfica (Biomax MSTM, Kodak) para obtener la autoradiografía. Otro grupo de 5 plantas de cada tratamiento se transfirieron a un vial plástico que contenía 15 µl de agua desionizada para cuantificar la actividad de 32 P en un contador de centellos (Packard, TRICARB 2100 TR). Resultado Para evaluar si las raíces primarias que presentaron el desarrollo determinado en respuesta a la baja disponibilidad de P eran capaces de tomar P del medio, germinamos semillas de Arabidopsis y las dejamos crecer por 7 o 11 días en condiciones óptimas y limitantes de P, después las transferimos a medio líquido MS 0.1X que contenía 1 µM P y 1 µC de 32 P y se monitoreó la toma de 32 P por 112 autoradiografía y conteo de centelleo. Los autoradiogramas de las plantas tratadas con 32 P mostraron que al día 7, la toma de P se dio en todo el sistema radical de las plantas que crecieron en bajo P. En las plantas que crecieron en condiciones óptimas de P la señal se detectó de manera preferencial en la parte distal de la RP (figura 1 A y B). Al día 11 las plantas que crecieron en medio con P alto presentaron una señal débil en todo el sistema radical con una mayor señal en la región apical (figura 1 C y E). Mientras que la plantas que crecieron en medio con P limitante presentaron una señal muy intensa en la parte más distal de la RP y RLs (figura 1 D y E), evidenciando una mayor toma de P en esas regiones. Con el contador de centelleos se encontró que la tasa de toma de 32 P en las plantas que crecieron en condiciones óptimas de P fue constante, alcanzando 578 desintegraciones por minuto (dpm) por planta al día 7 y 596 al día 11 después e la germinación (figura 1 G). La toma de 32P de las plantas que crecieron en condiciones limitantes de P incrementa con el tiempo, iniciando en 975 dpm por planta la día 7 y 1506 por al día 11, lo cual fue de 2 a 3 veces mayor que lo observado en plantas creciendo en medio con P alto (figura 1 G). 113 Figura 1. Efecto del crecimiento determinado en la toma de 32 P. Autoradiografía de: (A) plantas de 7 días después de la germinación (d.a.g. por sus siglas en ingles) creciendo en alto P. (B) plantas de 7 d.a.g. creciendo en bajo P. (C) de plantas de 11 d.a.g. creciendo en P óptimo. (D) de plantas de 11 d.a.g. creciendo en bajo P, presentando una señal de 32P muy intensa en las puntas de la raíz, marcado con flechas. (E) Acercamiento de una planta del panel C y (f) del panel D. (G) Toma de P en función del tiempo. Plantas creciendo en condiciones limitantes y óptimas de P durante los tiempos indicados. Los valores presentados representan la media ± SD de radioactividad tomada por planta (n=5), en tres experimentos independientes. Las letras diferentes indican las medias que difieren significativamente (p<0.05). 114 ANEXO 2 Publicaciones efectuadas durante el desarrollo de la tesis 1.-Cruz-Ramírez A, López-Bucio J, Ramírez-Pimentel G, Zurita-Silva A, Sánchez-Calderón L, González-Ortega E, Herrera-Estrella L (2004) The xipotl mutant of Arabidopsis reveals a critical role for phospholipid metabolism in root system development and epidermal cell integrity. Plant Cell 16,2020-2034. 2.-Sánchez-Calderón L, López-Bucio J, Chacón-López A, Cruz-Ramírez A, Nieto-Jacobo F, Dubrovsky JG, Herrera-Estrella L (2005) Phosphate starvation induces a determinate developmental program in the roots of Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiology 46,174184. 3.-López-Bucio J, Hernández-Abreu E, Sánchez-Calderón L, Pérez-Torres A, Rampey RR, Bartel B, Herrera-Estrella L (2005) An auxin transport independent pathway is involved in phosphate stress-induced root architectural alterations in Arabidopsis. Identification of BIG as a mediator of auxin in pericycle cell activation. Plant Physiol 137,681-691. 4.-López-Bucio J, Cruz-Ramírez A, Pérez-Torres A, Ramírez-Pimentel JG, SánchezCalderón L, Herrera-Estrella L. (2005). Root Architecture. En: Plant Architecture and its manipulation. Turnbull, C. Ed. Blackwell Annual Review Series. pp 181-206. 5.-Sánchez-Calderón L, López-Bucio J, Chacón-López A, Gutiérrez-Ortega A, HernándezAbreu E, Herrera-Estrella L (2006) Characterization of low phosphorus insensitive (lpi) mutants reveals a crosstalk between low P-induced determinate root development and the activation of genes involved in the adaptation of Arabidopsis to P deficiency Plant Physiol 140, 879-889. 115