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Uxrvrnsma» »r JaÉN Facultad de Ciencias Exper imentales Trabajo Fin de Grado Producc¡ón de bacteriocinas de bacterias lácticas aisladas de encurtidos Alumno: Ma Adoración Rascón Sánchez Junio, 2016 Uxrvrnsma» »r JaÉN Facultad de Ciencias Exper imentales Trabajo Fin de Grado Producc¡ón de bacteriocinas de bacterias lácticas aisladas de encurtidos Alumno: Ma Adoración Rascón Sánchez Junio, 2016 ÍNDICE RESUMEN………………………………………………………………………..………….2 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………..…..…3 1.1. Encurtidos………………………………………………………………..…..…3 1.1.1. Fermentación………………………………………………………………3 1.1.2. Encurtidos analizados……………………………………………...…....6 1.2. Bacterias lácticas…………………………………………………………..….8 1.2.1. Clasificación de bacterias lácticas………………………………….…9 1.2.2. Sustancias producidas por bacterias lácticas…………………….…9 1.3. Bacteriocinas……………………………………………………………….…11 1.3.1. Clasificación de bacteriocinas…………………………………………12 1.3.2. Aplicación de bacteriocinas en alimentos………………………...…13 1.4. Probióticos………………………………………………………………...…...14 2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………….16 3. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………..…….….17 3.1. Material biológico……………………………………………………………..…17 3.2. Material de laboratorio……………………………………………………….…17 3.3. Medios de cultivo……………………………………………………………...…18 3.4. Procesado de los alimentos………………………………………………...…20 3.5. Crecimiento bacteriano………………………………………………………....21 3.6. Tinción de Gram………………………………………………….…………...….21 3.7. Producción de bacteriocinas…………………………………………….….…22 4. RESULTADOS ………………………………………………………….………….….24 4.1. Crecimiento bacteriano…………………………………………….……………24 4.2. Identificación de microorganismos por Tinción de Gram……………..….25 4.3. Detección de bacterias productoras de bacteriocinas……….………..…29 5. DISCUSIÓN………………………………………………………………….…………41 6. CONCLUSIONES………………………………………………………….…………42 7. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………….…….……43 1 RESUMEN Las bacterias ácido lácticas (BAL) están ampliamente distribuidos en la naturaleza, estas se han aislado tanto del tracto digestivo de humanos y animales como de algunos alimentos, siendo la leche su medio más típico. Estas bacterias han sido utilizadas históricamente para preservar los alimentos ya que gracias a la fermentación de azúcares se obtienen algunas sustancias como ácido láctico o bacteriocinas que ayudan a competir contra microorganismos patógenos por lo tanto son muy utilizadas en la industria alimentaria y farmacéutica. En este ensayo hemos intentado aislar bacterias ácido lácticas de encurtidos y observar la producción o no de bacteriocinas ya que estos péptidos tienen actividad antimicrobiana frente a microorganismos patógenos protegiendo nuestra salud y pueden actuar como probióticos. ABSTRACT Lactics acid bacterias (LAB) are so extended in nature, there have been found in the human and animals digestive tract, and also in some food, being milk the most typical. These bacterias have been used historically to perserve food becasuse in the fermentation of sugars is obtained some substances as lactic acid or bacteriocins that help to figth against pathogenic microorganisms, so they are use so much in food industry and pharmaceutical industry. In these experiment we have tired to isolate lactics acid bacterias on pickled to see the production or not of bacteriocins, as these peptides have antimicrobian activity againt phatogenic microorganisms protecting our health and they can perform as probiotics. 2 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Encurtidos Los encurtidos son alimentos vegetales hortícolas sumergidos en una determinada concentración de sal y/o vinagre para disminuir su pH, alargando así la vida útil del alimento y por lo tanto su conservación. Esto se debe a un proceso de acidificación que hace que la aparición de microorganismos indeseados sea prácticamente nula y por lo tanto el riesgo de intoxicación alimenticia mínima, además de adquirir nuevas características organolépticas. Según el método utilizado para elaborar el encurtido se producirá fermentación o no. Si se sumerge únicamente en vinagre no se producirá fermentación, pero por el contrario, si se introduce en salmuera habrá fermentación espontánea gracias a las bacterias fermentativas que se encuentran en el mismo, convirtiendo los azúcares del vegetal en ácido láctico. 1.1.1. Fermentación Este proceso es el responsable de las características distintivas de los productos fermentados, como pueden ser su textura, sabor y aroma, prolongación de su vida útil y de los beneficios que presentan para la salud. (Holzapfel, 2002). Dicho proceso se da en multitud de alimentos además de darse en encurtidos como son por ejemplo productos lácteos, pan, cerveza, vino, etc. La fermentación es uno de los pasos más importantes a la hora de elaborar un producto fermentado, entre ellos los encurtidos. Para ello se introducen los vegetales en salmuera y se deja que la flora microbiana perteneciente al alimento lo fermente de manera natural. De este modo evitaremos las fermentaciones de microorganismos indeseados y con ello la putrefacción del alimento. Introduciendo el vegetal en sal lograremos que se lleve a cabo únicamente la fermentación ácido-láctica de bacterias lácticas, el medio adecuado para que se produzca debe tener una concentración óptima de salmuera y un pH ácido o cercano a pH neutro, este descenso es debido a la producción de ácido láctico. 3 Dentro de la fermentación podemos elegir entre dos métodos para llevarla a cabo según la concentración de sal que a su vez depende de la temperatura a la que vaya a estar el alimento. - Baja salinidad (8% de sal): Se da una fermentación rápida, se produce una cantidad pequeña de gas y hay que tener controlado el proceso para que no se desarrollen bacterias perjudiciales y el fruto no tenga la firmeza deseada. - Alta salinidad (10% de sal): La fermentación es algo más lenta, la producción de gases es mayor y más vigorosa. La firmeza del fruto suele ser mejor y además el riesgo de aparecer organismos indeseados es muy bajo. En el proceso de fermentación se producen algunos cambios como: - Cambios físicos: En las primeras 48-72h el agua, azúcares, proteínas, minerales, etc. que contiene el fruto se difunde por osmosis a la salmuera añadida, perdiendo peso. Estos servirán como alimento a las bacterias ácido lácticas. Pasado el tiempo, la sal vuelve a penetrar en el fruto creando poros por los que entra el agua, dando al fruto su aspecto normal, turgente. Un encurtido con fermentación previa está más firme y crujiente. - Cambios químicos: El cambio más significativo es la transformación de azúcares procedentes de los frutos a ácido láctico gracias a las BAL aunque también aparecen, en pequeñas cantidades, ácido acético, alcoholes y ésteres. En ocasiones hay cantidades importantes de anhídrido carbónico e hidrógeno. El valor de pH va ligado a la producción de ácido láctico. Al principio el pH se encuentra entre 6,5-7 y tras la fermentación y por lo tanto producción de ácido láctico, desciende a valores entre 3,4 y 3,8 pero nunca superando el pH 4. La acidez final del producto dependerá del método de salinidad empleado, oscilando entre 0,6 y 0,8. 4 - Cambios microbiológicos: Los microorganismos más importantes que intervienen en la fermentación son las bacterias ácido lácticas, bacterias productoras de gases y levaduras que se encuentran de forma natural tanto en el fruto como en la tierra que se cultiva. Para la producción de ácido láctico, el microorganismo más abundante y habitual es Lactobacillus plantarum aunque se pueden encontrar otros como Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides y Pediococcus cerevisiae. En la producción de gas aparecen bacterias del género Aerobacter, que además generan anhídrido carbónico e hidrógeno. A mayor concentración de salmuera, mayor concentración de aerobacterias y por lo tanto mayor producción de gases pero cuando la concentración desciende hay una rápida formación de ácido láctico que impide la proliferación de dichas bacterias. Las levaduras oxidativas son responsables de malos olores y disminución de calidad en los encurtidos, por lo que hay q combatir su aparición y para ello se utiliza aceite mineral, rayos U.V. o luz solar. En los procesos de fermentación se debe controlar: -Concentración de sal: Este evaluación se deberá hacer diariamente durante los diez primeros días y para ello se utilizará un densímetro o pesasales contrastados. -Control de pH: Para medir este parámetro se utiliza un pH-metro o una tira de pH y se evalúa en la misma muestra en la que se determina la concentración de salmuera. Este control se hará durante los primeros 15 días, a partir de aquí se hará de forma más espaciada hasta llegar al final de la fermentación en la cual quizás haya que corregir la acidez del producto. -Control de observación de frutos y depósitos de fermentación: Para ello se va observando periódicamente tanto los frutos como los 5 depósitos en los que estos se encuentran anotándose las observaciones, indicándonos la finalización de los cambios físicos del fruto. 1.1.2. Encurtidos analizados Para llevar a cabo este ensayo hemos estudiado dos grupos de encurtidos divididos en encurtidos ecológicos y no ecológicos. Un producto ecológico es aquel que se obtiene sin utilizar ningún tipo de producto químico, por lo tanto no se modifica su capacidad nutritiva con dichos productos ya sean abonos, pesticidas, herbicidas, etc. tanto para mejorar la fertilidad del suelo como para eliminar algún tipo de hierba o insecto indeseado del producto. Para el cultivo de productos ecológicos vegetales se pueden utilizar compost como forma de abono o rotación de cultivos para renovar los nutrientes del suelo entre otras prácticas, manteniendo así la fertilidad del suelo en el que estos son cultivados, pues esta práctica se basa en la producción de vegetales respetando el medio que le rodea, es decir, el ecosistema. Por el contrario para la producción de productos no ecológicos sí se usan productos químicos ya sea para su elaboración como para su conservación, pues a la hora de cultivar vegetales se utilizan abonos, pesticidas, herbicidas, etc. tanto para mantener o mejorar la fertilidad del suelo como para eliminar algún insecto, microorganismo o planta indeseada en el cultivo. A la hora de la conservación y preservación del alimento pueden añadirse conservantes, aditivos, aromas, etc. artificiales. Los alimentos utilizados en el ensayo han sido: Aceitunas La aceituna es el fruto de la oliva que pertenece a la familia Oleaceae. Este fruto proporciona algunos beneficios como favorecer la digestión, previene enfermedades cardiovasculares, facilita el vaciamiento de la vesícula biliar y además son antioxidantes. Su pulpa contiene alrededor del 80% de ácido oleico, un ácido graso que ejerce un beneficio para los vasos sanguíneos, de ahí su ayuda a prevenir enfermedades cardiovasculares, pues ayuda a eliminar el colesterol malo de la sangre. 6 Las aceitunas pueden consumirse en forma de aceite o en fresco tras un proceso de fermentación. Al inicio de la fermentación de estos alimentos predominan géneros Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc, que compiten con la microbiota Gram positiva, que a medida que continúa el proceso van desapareciendo y predominando otras, por lo que al final encontramos generalmente Lactobacillus. (Fernández et al., 1993; Harris, 1998). Pepinillos El pepinillo es un pepino inmaduro comercializado como encurtido tras una fermentación ácido-láctica. El pepino pertenece a la familia de las cucurbitáceas y se consume en forma de encurtido por su resistencia a temperaturas elevadas y concentración salina elevada. El microorganismo que lleva a cabo este proceso es Lactobacillus plantarum. El pepinillo, al estar fermentado no aporta los mismos nutrientes que el pepino fresco, pues el aporte nutricional que aporta es algo más bajo, aunque podemos destacar su contenido en sodio, vitamina B6 y ácido ascórbico que tiene poder antioxidante. También puede servir para la prevención de tumores gracias a su poder antioxidante. Guindillas La guindilla pertenece a una variedad autóctona de pepino. Es un alimento rico en vitaminas, destacando vitamina C que le da actividad antioxidante lo que hace que sea beneficioso para nuestra vista, oído, piel, aparato respiratorio y circulatorio. La vitamina A que favorece el metabolismo y la utilización de aminoácidos por las proteínas; vitamina E, con importantes funciones antioxidantes y la vitamina K, que presenta acción antihemorrágica, coagulante y acelera la cicatrización de los tejidos (Franco, 1995). Su sabor picante se debe al alcaloide capsaicina quien actúa también como antioxidante. Berenjenas Es una planta herbácea anual, contiene un alto porcentaje de agua y bajo en azúcares, proteínas y grasas por lo que no tiene mucho aporte calórico. Su mineral más abundante es el potasio aunque también contiene calcio, magnesio y fósforo. Podemos encontrar algunas vitaminas como provitamina A 7 o vitamina C. Pero tiene una sustancia llamada solanina que es tóxica y puede provocar migrañas y alteraciones gastrointestinales por lo que no la podemos consumir cruda. 1.2. Bacterias lácticas Se conoce como bacterias lácticas a aquellos microorganismos que tras la fermentación de carbohidratos, obtienen como producto final ácido láctico. Este grupo de bacterias tal vez sea el más abundante, ya que están ampliamente distribuidas, pudiendo encontrarlas tanto en la naturaleza como en el tracto digestivo y urinario de humanos y animales formando parte de su microflora. Además, este grupo tiene un importante papel en la industria alimentaria interviniendo en la producción de alimentos fermentados como leche, productos lácteos, cárnicos, vegetales, vinos y cervezas. Las bacterias lácticas (BAL), aportan nuevas características organolépticas a los alimentos mejorando su sabor, olor, textura y valor nutricional. Además, ayudan a aumentar la vida útil del alimento gracias a la acidificación del medio (tras la producción de ácido láctico) y a su capacidad de crecer y desarrollarse en ambientes con un pH ácido y concentración salina relativamente alta, lo que hace que se inhiba el crecimiento y desarrollo de microorganismos patógenos y por tanto de sus sustancias tóxicas. Debido a la concentración salina del medio, se lleva a cabo una buena deshidratación del alimento, haciendo que este se deteriore por factores físicos o químicos y no por agentes bacterianos. La amplia distribución de BAL es debido a su capacidad de crecer y desarrollarse en ambientes de elevadas temperaturas, de altas concentraciones de cloruro sódico, en sustratos de origen animal de un pH neutro, así como en elevada acidez en sustratos de origen vegetal (Carr, 1973). Esta amplia heterogeneidad de ambientes se debe a su amplia diversidad morfológica y fisiológica. En general, las BAL son cocos o bacilos Grampositivos, no esporulados, anaeróbicos aerotolerantes, inmóviles, microaerofílicos o aerotolerantes; oxidasa, catalasa y bencidina negativas, carecen de porfirinas y citocromos, no reductores de los nitratos y producen ácido láctico como el único o principal producto de la fermentación de 8 carbohidratos (Carr et al., 2002; Vázquez et al., 2009). Aunque algunos ensayos han demostrado que hay algunas excepciones y no todas las bacterias lácticas tienen dichas características. Al ser microorganismos anaerobios pueden impedir el crecimiento de aerobios Gram negativos. 1.2.1. Clasificación de bacterias lácticas Las bacterias ácido lácticas pertenecen al filo Firmicutes que contiene alrededor de Leuconostoc, 20 géneros: Pediococcus, Lactococcus, Aerococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenooccus, Vagococcus y Weisellason los principales miembros de las BAL, siendo Lactobacillus el más grande de estos géneros. (Bouzar et al., 1997; Devlieghere et al., 2004; Gálvez et al., 2007; Jagnow y Wolfang, 1991). Estas bacterias se pueden clasificar según su producto final en la fermentación: homofermentativas (Producen como producto final en la fermentación sólo ácido láctico) o heterofermentativas (Como producto final de la fermentación produce otras sustancias a demás de ácido láctico) o según a la temperatura óptima a la que crecen: mesófilas (tienen una temperatura de incubación entre 20-25ºC durante 18-20h) o termófilas (tienen una temperatura de incubación entre 40-45ºC durante 2-4h). 1.2.2. Sustancias producidas por bacterias lácticas Ácido láctico: Este ácido es el que producen en mayor cantidad las bacterias lácticas. El ácido provoca un ambiente desfavorable para agentes patógenos o para la putrefacción del alimento ya que el pH del medio influye mucho en el crecimiento y desarrollo de los microorganismos responsables del deterioro del alimento. El efecto que causa el ácido en el alimento depende de la especie de microorganismo, tipo de ácido, concentración y tiempo. Así, por ejemplo, las bacterias lácticas son ácido tolerantes, es decir, pueden crecer algunas a valores de pH tan bajos como 3.2 y otras a valores tan altos como 9.6 (la mayoría crecen a pH entre 4 y 4.5) (Carr et al., 2002). 9 Ácido propiónico: Este al igual que otros ácidos hace que haya un ambiente desfavorable para bacterias gram positivas, gram negativas, mohos y levaduras lo que hace preservar por más tiempo el alimento en el que se encuentre. Ácido cítrico y algunos ácidos volátiles: Estos también son producidos por BAL y de igual modo que el resto de los ácidos, son antagonistas del desarrollo y proliferación de diferentes microorganismos. Los ácidos que producen estas bacterias (láctico, acético y propiónico) ejercen su acción antimicrobiana interfiriendo con el potencial de membrana, inhiben su transporte activo, reducen el pH intracelular, dando lugar a la liberación de iones hidrógeno y del anión correspondiente, haciendo que ambos iones inhiban una gran variedad de funciones metabólicas y el crecimiento celular. (Doores, 1993; Vazquez et al., 2009). Diacetilo: El diacetilo (2,3 - butanodiona) que procede del piruvato es otro de los productos finales del metabolismo de las bacteriaslácticas (Kandler, 1983).Este compuesto orgánico da aroma a algunos productos como mantequilla o cerveza además de impedir el crecimiento de algunos microorganismos, aunque su utilización en la industria alimentaria es algo dificultosa porque las BAL no producen una cantidad adecuada del mismo. Peróxido de hidrógeno: Este compuesto se acumula en cultivos con bacterias ácido lácticas catalasa negativo, es decir, carecen de dicho enzima. Este, puede reaccionar con otros compuestos formando sustancias inhibidoras. Bacteriocinas: De las sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias lácticas, las bacteriocinas son las más interesantes tecnológicamente, ya que debido a su naturaleza proteica (Tagg et al., 1976), las inactivan los enzimas proteolíticos del tracto gastrointestinal y no son tóxicas ni inmunógenas en animales de experimentación (Bhunia et al., 1990), siendo un candidato perfecto para la conservación de alimentos. 10 1.3. Bacteriocinas Las bacteriocinas son péptidos con actividad antimicrobiana, segregadas por un gran número de bacterias para inhibir el crecimiento de otros microorganismos competidores (Monroy et al., 2009). Aunque estas sustancias pueden producirlas diversidad de especies bacterianas, tanto gram negativas como positivas, quizás las mejor conocidas sean las producidas por las BAL por su prometedor uso como bioconservantes de alimentos (Stiles y Hasting, 1991; Ray y Daeschel, 1992; Hernández et al., 1993; Jack et al., 1995; Cleveland et al., 2001). Estas sustancias se detectaron por primera vez en Escherichia coli (Hardy, 1975) y más tarde en algunas bacterias Gram-positivas (Tagg et al., 1976). Las bacteriocinas producidas por bacterias lácticas son un grupo muy heterogéneo, pues por normal general, estas están formadas únicamente por proteínas aunque se han podido observar que algunas, además de su parte proteica, tienen componentes glucocídicos o lipídicos. Por este motivo, no todas reaccionan igual ante un determinado pH, temperatura o degradación enzimática. Por norma general, estas son estables a pH ácidos o próximos a pH neutros y termorresistentes, lo que les permite mantener su actividad antimicrobiana a temperaturas similares a las de pasterización y esterilización de la leche (Piard et al., 1992). No obstante, si la temperatura es demasiado elevada para la cepa, puede suprimir la producción de bacteriocinas. La biosíntesis de bacteriocinas ocurre o en la fase logarítmica del desarrollo bacteriano o al final de la misma y, en la mayoría de los casos guarda relación con la biomasa producida (Piard y Desmazeaud, 1992), para que estas se produzcan debe haber algunos nutrientes, como extracto de levadura, aminoácidos, manganeso y manitol para aumentar, disminuir o suprimir la producción de diversas bacteriocinas (Rogers, 1972; Clarke et al., 1975; Hale y Hinsdill, 1973 y Tagg et al., 1975). Estos péptidos, las bacteriocinas, son inactivados por un enzima proteolítico, ya sea pancreático o gástrico, por lo que no resulta tóxico para el consumo humano y animal y es muy utilizado en la industria alimentaria para la biopreservación, pues actúa frente microorganismos no deseados o patógenos de los alimentos controlando la 11 fermentación de la microflora y acción microbiana, de tal modo que alarga la vida útil del alimento. 1.3.1. Clasificación de bacteriocinas Según la clasificación propuesta por Kemperman, y Monroy et al., 2009 basada en características genéticas y bioquímicas del péptido, las bacteriocinas se clasifican en: Clase I – Lantibioticos: Se trata de pequeños péptidos (<5 kDa) activos a nivel de membrana, termolábiles, contienen aminoácidos poco comunes como la dihidroalanina, ßmetil-lantionina y lantionina, debido a modificaciones postraduccionales (Kemperman et al., 2003). Las más conocidas son nisina (que se comercializa como aditivo alimentario y es muy utilizado sobre todo en productos fermentados ya que actúa de una manera adecuada a pH ácidos), lacticina 841 y lacticina S. Los lantibioticos, a su vez, son divididos en dos subgrupos según su estructura y modo de acción Clase I A y Clase I B. Clase II – No lambióticos: Péptidos lineales no modificados postraduccionalmente, su tamaño es menor a 10 kDa y son termoestables. Actúa a nivel de membrana plasmática. Su representante más característico es la pediocina PA-1. Este grupo se subdivide en Clase II A, Clase II B y Clase III C. Clase III – Grandes y termolábiles: Su tamaño es superior a 30 kDa y son termolábiles, por lo que se desnaturaliza a cierta temperatura. A este grupo pertenecen bacteriocinas como helveticina J. V, acidofilicina A y lactacinas A y B. Clase IV – Bacteriocinas complejas: Son bacteriocinas formadas por una parte proteíca y una o más fracciones lipídicas o glucocídicas. Algunas de estas son lactocina S (glicoproteíca) o mesenterocina 52 (lipoproteíca). 12 Clase V –Circular y no modificada: Estas bacteriocinas tienen aspecto circular y no son modificadas postraduccionalmente. En este grupo se incluyen: AS-48 y gasericina A. 1.3.2. Aplicación de bacteriocinas en los alimentos. Las bacteriocinas producidas por BAL son de gran interés en la industria alimentaria, ya que son productos GRAS y pueden ser usadas como bioconservantes (Deegan et al., 2006). Se produce de forma natural en algunos productos lácteos y se utiliza en la producción de alimentos y como un aditivo en productos lácteos para prevenir la descomposición ocasionada por bacterias Gram positivas, especialmente de los géneros Clostridium, Staphylococcus, Bacillus y Listeria (Maldonado y Llancas, 2007). Tienen un alto grado de inhibición contra microorganismos alterantes y al ser de naturaleza proteica son digeridas por enzimas digestivas, lo cual hace que su consumo no sea tóxico ni dañino para la salud humana y animal. Estos productos se comercializan en diferentes formulaciones para su uso en alimentos específicos como carnes, mariscos, queso, pan y bebidas (Danisco, 2013). Actualmente, la nisina y pediocina PA-1 tienen licencia para su uso como bioconservantes (Simha et al., 2012). La nisina es producida por L. Lactis, es inactiva frente a muchos microorganismos alterantes y patógenos, además de no ser sintetizada a temperaturas de refrigeración. Es de naturaleza ácida lo que le permite ser estable a pH bajos. Es una de las bacteriocinas más estudiadas hasta el momento, se ha encontrado en alimentos como productos lácteos (queso Gouda y el Emmenthal) donde inhibe el crecimiento de esporas de C. botulinum pero también es muy utilizada en carnes (por su poca solubilidad en el pH de la carne y su producción en la misma). La nisina, se utiliza para disminuir la intensidad del tratamiento térmico de los alimentos enlatados mejorando la apariencia y sabor del producto final sin comprometer la seguridad del alimento (Díez, 2011). La pediocina, es producida por Pediococcus acidolactic y se emplea para conservar productos como carnes y vegetales, además dada su alta actividad contra especies de Listeria, esta bacteriocina tiene un alto potencial para ser 13 utilizado como conservador en alimentos lácteos (Fernández, 2005; Wirawan et al., 2007). La pediocina PA-1 también ha sido expresada en Streptococcus thermophilus, un organismo importante en fermentaciones lácteas (Coderre y Somkuti, 1999) y en la levadura Saccharomyces cerevisiae para mejorar la conservación del vino, pan y otros productos en los que se usan las levaduras (Schoeman et al., 1999). Se ha demostrado que hay una mejora en la calidad microbiana, en piezas de carne, contra carnobacterias, Brochothrixthermosphacta y BAL tras la combinación de envases antimicrobianos y temperaturas próximas al punto de congelación. Comúnmente se usan tres métodos de aplicaciónde la bacteriocina (Chen y Hoover, 2003): 1. Inoculación de bacterias lácticas directamente en el producto para la obtención de bacteriocinas en el mismo. 2. Incluir en el alimento bacteriocinas purificadas o semipurificadas para conservar el alimento. 3. Usar un producto fermentado con bacteriocinas como un ingrediente en un alimento procesado. 1.4. Probiótico. El concepto de probiótico ha ido evolucionando con el paso de los años, la definición más reciente de probiótico surge a finales de los años 80, la cual los definía como suplementos dietarios microbianos, viables, seleccionados que cuando son introducidos en suficientes cantidades, afectan beneficiosamente al organismo humano a través de sus efectos en el tracto intestinal (Khalil et al., 2007; Grajek et al., 2005). Según la FAO, los probióticos son microorganismos vivos los cuales cuando son administrados en cantidades adecuadas confieren un beneficio saludable en el huésped (Grajek et al., 2005). La flora intestinal juega un papel muy importante en la salud de humanos y animales, los probióticos se utilizan para mejorar la salud intestinal y para estimular el sistema inmunológico (Fuller 1989; Torres 2002). La mayoría de estos 14 microorganismos son bacterias ácido lácticas utilizadas para la fermentación de productos en la industria alimentaria, pero para que la ingesta de bacterias ácido lácticas sea beneficiosa debe ingerirse una cierta cantidad de las mismas, la concentración sugerida de bacterias ácido lácticas está en el rango de 106 – 107 UFC/g de producto (Ruiz et al., 2008; Hummel et al., 2007). Los géneros que predominan son Lactobacillus y Bifidobacterium. Estos microorganismos, son utilizados en la industria alimentaria para elaborar los llamados alimentos probióticos. Hay una amplia variedad de dichos productos los cuales vienen en diversos formatos como leches fermentadas o en forma de tabletas, capsulas, polvos o pequeños sobres que contienen la bacteria liofilizada. Los probióticos pueden ser encontrados en forma de suplemento y como componentes de alimentos y bebidas (Barzosa et al., 2004; Ogueke et al., 2010). Efectos beneficiosos de los probióticos. Como se ha dicho anteriormente, el uso de probióticos tiene un efecto beneficioso para la salud humana y animal tras el consumo de productos lácteos fermentados o la ingesta de células vivas de bacterias ácido lácticas presentes en alimentos probióticos, estos pueden servir para combatir el control de infecciones en el intestino por patónegos, reducir la incidencia de tumores de colon o diarreas o estimular el sistema inmune entre otros beneficios. Hay varios estudios que evidencian estos beneficios como por ejemplo un estudio realizado en 2009 por Piper y leyva en el cual especies de Lactobacillus mostraban una inhibición efectiva frente a cepas gastrointestinales de Escherichia coli y en 2010 un estudio llevado a cabo por Narayan y otros investigadores reafirmaron las ventajas de probióticos en el tratamiento de diarreas. También se ha demostrado que los probióticos en combinación con tratamientos médicos estándar podrían ser usados en el tratamiento de úlcera péptica causada por Helicobacter pylori y posiblemente en su profilaxis (Hamilton Miller, 2003). 15 2. OBJETIVOS Los objetivos fijados para este estudio son: - Realizar un análisis microbiológico de diferentes tipos de encurtidos para observar la presencia o no de bacterias lácticas. - Examinar la morfología de dichas bacterias lácticas mediante la Tinción de Gram. - Observar actividad antimicrobiana de las cepas obtenidas frente a Enterococcus faecalis S-47 y Listeria innocua 4030 mediante el ensayo de crecimiento en cruz. - Estudiar la producción de bacteriocinas de las cepas obtenidas frente a Enterococcus faecalis S-47 y Listeria innocua 4030 observando el halo de inhibición mediante las técnicas de ensayo en gota y en pocillos. 16 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Alimentos empleados. Para realizar este estudio se cogieron 17 muestras de diferentes encurtidos repartidas en dos grupos, un grupo “encurtidos ecológicos” y otro grupo “encurtidos no ecológicos”. Dentro de los encurtidos ecológicos utilizamos: guindillas verdes picantes, pepinillos, aceituna gordal, aceituna con aliño intenso, banderillas picantes, cocktail de aceitunas, aceituna (tomillo, ajo, pimiento)y aceituna negra seca. El grupo de los encurtidos no ecológicos se dividiría a su vez en dos subgrupos, uno de encurtidos enlatados y otro de encurtidos caseros. - Encurtidos enlatados: banderillas, aceituna verde con especias, aceitunas negras, aceituna gordal, guindillas y pepinillos. - Encurtidos caseros: Berenjenas, pepinillos y aceitunas machacadas. 3.2. Material de laboratorio. Matraces (de diferentes volúmenes) Microscopio Tubos eppendorf Guantes Tubos de ensayo Placas Petri Micropipetas (diferentes volúmenes) Centrífuga Puntas de micropipetas Asa de siembra Pipetas Pocillos Balanza Pinzas estériles Stomacher Cristal violeta Autoclave Safranina Estufa Lugol Mechero Bunsen Alcohol Gradillas Aceite de inmersión Bolsas pequeñas estériles Solución salina Portas y cubre objetos 17 3.3. Medios de cultivo. 3.3.1. MRS AGAR Este es un medio selectivo para la producción de bacterias ácido lácticas, como por ejemplo Lactobacilos. La peptona y glucosa del medio, son necesarias para el crecimiento bacteriano, y el citrato inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas. Composición MRS agar: Compuesto g/L di-Amononio Hidrógeno Citrato 2,0 Extracto de carne 8,0 Extracto de levadura 4,0 D(+)-Glucosa 20,0 Magnesio Sulfato 0,2 Manganeso (II) Sulfato 0,05 Peptona Bacteriológica 10,0 di-Potasio Hidrógeno Fosfato 2,0 Sodio Acetato 5,0 Tween 80 1,0 Agar 10,0 pH 6,2±0,2 Preparación: Para preparar 800mL de medio, de acuerdo con las indicaciones del fabricante, cogimos 49,6 g de MRS agar y 800 mL de agua destilada estéril. Para ello utilizamos una balanza y un matraz donde realizar la mezcla, una vez hecha, introducimos el matraz en el autoclave a una temperatura de 115 ºC durante 20 minutos, a continuación lo dejamos atemperando a 50 ºC en un baño térmico. Una vez atemperado, se vierte el contenido en placas Petri al lado del mechero bunsen para que la placa no se contamine. Dejamos enfriar y solidificar las placas y las guardamos en la cámara fría hasta el momento de su utilización. 18 3.3.2. MRS BROTH Medio selectivo para desarrollo y proliferación de bacterias lácticas, este se trata de un medio de cultivo líquido. Composición: Compuesto g/L Proteosa peptona 10,0 Extracto de carne 8,0 Extracto de levadura 4,0 D(+)-Glucosa 20,0 Acetato de sodio 5,0 Citrato de triamonio 2,0 Sulfato de magnesio 0,2 Sulfato de manganeso 0,05 Fosfato dipotásico 2,0 Polisorbato 80 1,0 pH 6,2±0,2 a 25ºC Preparación de MRS BROTH o líquido: De este medio preparamos 200mL, para ello pesamos 10,40 gramos de acuerdo con las instrucciones del bote y añadimos 200 mL de agua destilada esterilizada. Disolvemos bien la mezcla llevándolo a ebullición y repartimos en tubos, los cuales son autoclavados. 3.3.3. MRS TAMPONADO, para la producción de bacteriocinas Composición: Compuesto g/L Para 600mL (g) Fosfato dibásico 10,0 6 Fosfato monobásico 4,3 2,58 MRS agar 62,0 37,2 19 Preparación de MRS tamponado: Preparamos un matraz de 600 mL de este medio, para ello pesamos las cantidades en una balanza, las disolvimos en 600 mL de agua destilada y autoclavamos la mezcla. Distribuimos el medio de cultivo en placas de Petri. 3.3.4. BHA BLANDO, utilizado como sobrecapa Este medio fue empleado como sobrecapa una vez inoculado la bacteria indicadora para la proliferación de bacteriocinas. Composición: Componente g/L Para 200 mL (g) Fosfato dibásico 10,0 2,0 Fosfato monobásico 4,3 0,8 Agar 17,0 1,6 BHI 35,0 3,0 pH 7,2 Preparación BHA blando: Preparamos 200 mL en un matraz y para ello pesamos los diferentes componentes en la balanza, lo fundiremos en el microondas y a continuación lo repartimos en tubos con 6ml cada uno. Autoclavamos y una vez sacado del autoclave, lo mantenemos en cámara fría hasta su uso. Para realizar el ensayo lo fundimos y mantenemos en el baño, para verterlo más tarde a una placa Petri (a modo de sobrecapa). 3.4 Procesado de alimentos Se pesaron 5 gramos de cada alimento analizado y fue introducido en una bolsa hermética estéril junto con 45 mL de solución salina al 0,9%. La bolsa fue introducida en el Stomacher para homogeneizar la mezcla. A continuación, se realizan diluciones añadiendo 100 µL de la solución madre en un eppendorf con 0,9 mL de solución salina estéril, siempre al lado del mechero bunsen para 20 evitar contaminaciones. De cada alimento analizado tendremos la solución madre y su dilución. Tanto la solución madre como su dilución serán sembradas en placas Petri con medio MRS, añadiendo 100 µL. La placa 0 contendrá 100 µL de solución madre y la placa 1 tendrá 100 µL de la muestra diluida. Una vez sembradas todas las placas se meterán en la estufa a 30 ºC durante 48h. 3.5. Crecimiento de bacterias. El crecimiento bacteriano se observa tras 48 y 72h de incubación de las placas Petri en la estufa a 30ºC, transcurridas estas horas observamos las diferentes colonias crecidas en el medio, las cuales, con ayuda de una pipeta y al lado del mechero para evitar contaminación, picaremos e inocularemos en MRS líquido. Se eligieron las colonias blancas y pequeñas que nos indica el comerciante que son bacterias lácticas, aunque más tarde lo comprobaremos. Se descartan colonias grandes que pueden ser levaduras. 3.6. Tinción de Gram La tinción de Gram es una técnica que permite observar y diferenciar, con ayuda de colorantes y microscopio, entre bacterias Gram negativas y Gram positivas. Esto se debe a la capa de peptidoglicano que tienen las bacterias en su pared, en el caso que las bacterias Gram positivas es gruesa lo que hace que el cristal violeta quede atrapado dentro y quede teñida de color azul/morado, mientras que en el caso de bacterias Gram negativas esa capa de peptidoglicano es más delgada, dejando escapar el cristal violeta tras la adicción de alcohol. Tras la aplicación de alcohol se añade safranina para que las bacterias Gram negativas queden teñidas de rojo y sea más fácil su visualización al microscopio. Esta técnica también permite diferenciar la morfología de los microorganismos ya sea, cocos, cocobacilos o bacilos. 21 Para llevar a cabo dicha tinción: - Colocamos una gota de agua destilada en el portaobjetos y con ayuda de un asa de siembra, cogimos colonias crecidas en los tubos de MRS inclinado y las mezclamos con la gota de agua. - Fijamos la gota con ayuda del mechero. - Una vez fijada la muestra la cubrimos con cristal violeta durante 2 minutos. - Retiramos el cristal violeta y añadimos lugol durante 2 minutos. - Decoloramos con alcohol al 96% durante 30 segundos. Retirar el alcohol con abundante agua. - Añadimos safranina durante 3 minutos, lavamos con agua y dejamos secar la muestra. - Observamos la muestra al microscopio a 100x y usando aceite de inmersión para observar la morfología de la colonia. 3.7. Producción de bacteriocinas. Para la producción de bacteriocinas se utilizó bien las semillas en MRS de cada cepa guardadas o un cultivo overnight en MRS de cada una de las cepas mantenidas en semilla. Y se ensayó la producción de bacteriocinas mediante tres ensayos: en cruz, en gota y en pocillos. En todos ellos se utilizaron como cepas indicadoras Listeria innocua 4030 y Enterococcus faecalis S47, ambas sacadas de la colección de cepas del grupo de microbiología de la Universidad de Jaén. 3.7.1. Ensayo en cruz. Para realizar este ensayo preparamos 20 placas Petri con MRS tamponado, divididos en dos grupos de 10 placas. En las placas realizamos 5 cruces con cada una de las bacterias de cada alimento. Se incubó durante 24h a 30ºC, una vez crecidas las cruces, se vierte sobre la placa de MRS tamponado 6 mL 22 de sobrecapa de BHA blando a la cual le inoculamos 60 µL de la bacteria indicadora. Un grupo lo inoculamos con Listeria innocua y otro grupo con Enterococcus faecalis S-47. A las 24h de incubación a 37ºC se observó la aparición de halo alrededor de las cruces. 3.7.2. Ensayo en gota. Para la producción de bacteriocinas se utilizaron las diferentes cepas a analizar en un cultivo overnight en medio MRS líquido, De este sobrenadante se cogen 5 µL, los cuales depositaremos sobre una placa Petri con medio MRS tamponado, colocando 5 gotas de cepas diferentes por placa bien separadas, estas gotas tendrán un diámetro entre 5-6 mm. Se incubó a 30ºC durante 24h y una vez crecidas las gotas, se añadió una sobrecapa de BHA tamponado en la cual irá inoculada 60 µL de la cepa indicadora L. innocua, (3 x 108 UFC aprox.). Tras 24h de incubación en estufa a 37 ºC observamos el halo de inhibición de cada cepa a estudiar. Este procedimiento lo repetimos para la cepa indicadora Enterococcus faecalis. 3.7.3. Ensayo en pocillos. Para la producción de bacteriocinas en medio líquido, mediante el ensayo en pocillos, se obtuvieron las diferentes cepas a analizar en un cultivo overnight en medio MRS líquido. De cada cultivo se cogen 800 µL los cuales se centrifugan a 13000 rpm durante 10 minutos, para separar los restos celulares y de medio de cultivo que quedarán en el fondo, del sobrenadante que será donde se encuentren las bacteriocinas. A continuación, fundimos las sobrecapas y las mantenemos en el baño para atemperarlas, mientras tanto, vamos colocando sobre las placas con medio MRS tamponado Torres de acero inoxidable esterilizadas (8 mm de diámetro x 1 cm de altura y capacidad aproximada de 85 µL), bien separadas entre ellas y rotulándolas para saber qué cepa hay en cada torre. Acto seguido, inoculamos 60 µL de la bacteria indicadora (Listeria innocua o Enterococcus faecalis) en la sobrecapa de BHA blando, de la cual se añade 6 mL por placa y se mueve con suavidad para que se extienda de forma uniforme por toda la placa. Una vez solidificada la sobrecapa, se retiran con 23 ayuda de unas pinzas las torres que dejan un hueco o pocillo en el cual añadiremos 85 µL del sobrenadante de cada cepa a ensayar su actividad antimicrobiana. Una vez sembradas todas las cepas se incuban a 37ºC durante 24h para observar posteriormente la presencia de halo de inhibición. El ensayo se hace por duplicado, y frente a Listeria innocua o Enteroccus faecalis. 4. RESULTADOS Una vez realizados los ensayos de este trabajo se procede a la observación de los resultados para analizar y obtener una valoración. 4.1. Crecimiento bacteriano. De cada alimento sembramos en medio MRS agar una placa madre o placa 0 que contiene el alimento homogeneizado junto con solución salina y una diluida o placa 1 que tiene suspensión madre diluida con solución salina. En ambas placas se siembran 100 µL y las dejamos incubar en estufa a 30ºC durante 48 – 72 horas para que crezcan los microorganismos. Como se puede observar en la tabla 1, pasadas 48 horas tan solo hay crecimiento en las placas de aceitunas con aliño ecológicas, banderillas ecológicas, aceitunas con ajo y tomillo ecológicas, aceitunas negras ecológicas y banderillas, aunque pasadas 72 horas ha habido crecimiento prácticamente en todas las muestras excepto en guindillas ecológicas, aceituna gordal ecológica, cocktail de aceitunas ecológicas, aceitunas negras y aceituna gordal. Esto puede deberse a que el crecimiento de bacterias ácido lácticas es lento, además de obtener colonias muy pequeñas, también podemos intuir que hay un crecimiento anterior en productos ecológicos y caseros ya que estos están menos procesados que en el caso de los productos no ecológicos enlatados, pues en estos hay que llevar un control exhaustivo para que no aparezcan microorganismos indeseados en los recipientes en los que se envasarán. 24 Tabla1: Presencia o no de colonias en las placas de MRS agar al sembrar los alimentos Alimento 48 horas 72 horas Guindilla ecológica (A) - - Pepinillo ecológica (B) - + Aceituna Gordal ecológica - - + + Banderillas ecológicas(E) + + Cocktail aceitunas ecológicas - - + + Aceituna negra ecológica (H) + + Banderillas (I) + + Aceituna especias (J) - + Aceitunas negras (k) - - Pepinillos (L) - + Aceituna gordal (M) - - Guindillas (N) + + Berenjena Casera (Be) + + Pepinillo Casero (Pe) + + Aceituna Machacada Casera + + (C) Aceitunas aliño ecológicas (D) (F) Aceituna ajo y tomillo ecológica (G) (A.M.) Una vez visto el crecimiento en las placas, seleccionamos de cada alimento las colonias que tengan aspecto blanquecino y de pequeño tamaño ya que esa morfología es propia de BAL. Picamos las colonias y las sembramos en MRS líquido para su posterior crecimiento y observación al microscopio mediante tinción de Gram. 4.2. Identificación microorganismos por tinción de Gram. Una vez obtenidas las colecciones de colonias en MRS líquido realizamos la tinción de Gram para observar su morfología además de saber seguro si todas 25 las colonias aisladas corresponden a cepas bacterias y si son Gram positivas o Gram negativas. Como se puede observar en las siguientes tablas (Tablas 2 a 13), la gran mayoría de las colonias aisladas corresponden a BAL, Gram positivas y con forma de bacilo, que corresponde a la forma típica de este grupo bacteriano, aunque también se observar BAL con morfología de cocobacilo y coco pero en menor medida. En algunos casos aparecen levaduras que las descartamos para el ensayo. En la figura 1 podemos ver la imagen de bacterias y levaduras Gram positivas al microscopio tras la tinción de Gram. Figura 1: Bacterias y levaduras Gram positivas. Tabla 2: Resultado en pepinillos ecológicos de tinción de Gram Alimento Cepa Morfología Tipo Pepinillo ecológico B1 Cocobacilo Gram + Tabla 3: Resultado de tinción de Gram en aceitunas con aliño ecológicas Alimento Cepa Morfología Tipo Aceituna aliño ecológica D1 Bacilo Gram + Tabla 4: Resultado de tinción de Gram en banderillas ecológicas Alimento Cepa Morfología Tipo E1 - - Banderillas E2 - - Ecológicas E3 Bacilo Gram + E4 Bacilo Gram + 26 Tabla 5: Resultado de tinción de Gram en aceitunas con tomillo y ajo ecológicas. Alimento Cepa Morfología Tipo G1 Bacilo Gram + G2 Bacilo Gram + Aceituna tomillo y G3 Bacilo Gram + ajo ecológica G4 Bacilo Gram + G5 Bacilo Gram + G6 Bacilo Gram + G7 Bacilo Gram + Tabla 6: Resultado de tinción de Gram en aceitunas negras ecológicas. Alimento Cepa Morfología Tipo Aceituna negra H1 Bacilo Gram + ecológica H2 Bacilo Gram + Cepa Morfología Tipo I1 Cocobacilo Gram + I2 Cocobacilo Gram + I3 Cocobacilo Gram + I4 Cocobacilo Gram + I5 Coco Gram + I6 Cocobacilo Gram + I* Coco Gram + I. Coco Gram + Tabla 7: Resultado de tinción de Gram en banderillas Alimento Banderilas Tabla 8: Resultado de tinción de Gram en aceitunas con especias Alimento Cepa Morfología Tipo J1 Bacilo Gram + Aceituna con J2 Bacilo Gram + especias J3 Bacilo Gram + Tabla 9: Resultado de tinción de Gram en pepinillos Alimento Cepa Morfología Tipo Pepinillo L1 Bacilo Gram + 27 Tabla 10: Resultado de tinción de Gram en guindillas Alimento Guindilla Cepa Morfología Tipo N1 Bacilo Gram + N2 Bacilo Gram + N3 Bacilo Gram + N4 Cocobacilo Gram + N5 Cocobacilo Gram + N* Bacilo Gram + N. Bacilo Gram + Tabla 11:Resultado de tinción de Gram en berenjenas caseras Alimento Berenjenas caseras Cepa Morgología Tipo Be1 Bacilo Gram + Be2 Bacilo Gram + Be3 Bacilo Gram + Be4 Bacilo Gram + Be5 Bacilo Gram + Tabla 12: Resultado de tinción de Gram en pepinillos caseros Alimento Pepinillos caseros Cepa Morfología Tipo Pe1 Cocobacilo Gram + Pe1 Cocobacilo Gram + Pe3 Coco Gram + Pe4 Cocobacilo Gram + Pe5 Coco Gram + Tabla 13: Resultados de tinción de Gram en aceitunas machacadas caseras. Alimento Cepa Morfología Tipo A.M.1 Cocobacilo Gram + Aceitunas A.M.2 Cocobacilo Gram + machacadas A.M.3 Bacilo Gram + caseras A.M.4 Levadura Gram + A.M.5 Coco Gram + 28 Si agrupamos las cepas obtenidas en cada alimento en un gráfico podremos visualizar de forma más clara en qué alimentos ha habido un mayor crecimiento de cepas bacterianas. Figura 2: Porcentaje de cepas obtenidas en los diferentes encurtidos. En la Figura 2 se observa que destaca sobre el resto las banderillas no ecológicas, aunque también se aislaron un gran número de colonias de las guindillas, las aceitunas con tomillo y ajo, todas ellas ecológicas. Por el contrario, en los alimentos que hemos obtenido un menor número de colonias han sido en pepinillos ecológicos y no ecológicos y en aceituna gordal ecológica. 4.3. Detección de bacterias productoras de bacteriocinas Una vez obtenidas las diferentes cepas de bacterias Gram + de toda la colección, se pasó a estudiar la actividad antimicrobiana de estas bacterias mediante un halo de inhibición alrededor de la cepa indicadora, que en nuestro caso se trata de Listeria innocua 4030 y Enterococcus faecalis S-47. Para ver el grado de inhibición que tienen nuestras cepas frente a las cepas indicadoras se realizaron tres ensayos, los cuales se exponen a continuación. 29 4.3.1. Ensayo en cruz. Para este ensayo utilizamos placas Petri con medio MRS agar, en las cuales sembramos en forma de cruz las diferentes cepas de los encurtidos y una vez secas añadimos una sobrecapa de BHA blando en el que inoculamos las bacterias indicadoras, para así poder observar el halo de inhibición que creaba la colección de cepas obtenidas de los encurtidos frente a Listeria innocua y Enterococcus faecalis S-47. En este caso teníamos en cuenta si había o no halo de inhibición el cual mediamos con +, cuantas más cruces hay, mayor amplitud del halo. A continuación, en la figura 3 podemos observar el resultado de algunas cepas: Figura 3: Resultado del halo de inhibición frente a E. faecaliss-47 y L. innocua 4030. Tabla 14: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en pepinillos ecológicos, mediante la técnica en cruz Pepinillos ecológicos Listeria innocua Enterococcus faecalis B1 + + La cepa obtenida en pepinillos ecológicos (tabla 14), a pesar de ser una sola, tiene actividad antimicrobiana frente a Listeria innocua y Enterococcus faecalis. Tabla 15: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en aceituna con aliño ecológica, mediante la técnica en cruz. Aceituna aliño ecológica Listeria innocua Enterococcus faecalis D1 + + La cepa obtenida de las aceitunas con aliño ecológicas (tabla…), también mostró inhibición frente a Listeria innocua y Enterococcus faecalis. 30 Tabla 16: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en banderillas ecológicas, mediante la técnica en cruz. Banderillas ecológicas Listeria innocua Enterococcus faecalis E3 - - E4 +++ ++ De las dos cepas aisladas de las banderillas ecológicas (tabla 16) tan solo una tiene actividad antimicrobiana frente a las indicadoras, aunque su actividad es considerablemente buena, siendo mayor frente a Listeria que frente al Enterococo. Tabla 17: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en aceitunas con tomillo y ajo ecológicas, mediante la técnica en cruz. Aceituna tomillo y ajo Listeria innocua Enterococcus faecalis G1 ++ - G2 ++ ++ G3 ++ - G4 - + G5 ++ + G6 + + G7 +++ ++ ecológica Todas las cepas obtenidas de este encurtido (tabla 17) tiene actividad antibacteriana frente a Listeria innocua y/o Enterococcus faecalis, pudiendo destacar una actividad muy buena de la cepa G7 frente a Listeria. Las cepas G1 y G3 no muestran inhibición frente a Enterococcus ni G4 frente a Listeria. Tabla 18: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en aceitunas negras ecológicas, mediante la técnica en cruz. Aceituna negra ecológica Listeria innocua Enterococcus faecalis H1 - - H2 - - Ni H1 ni H2, las dos cepas aisladas de las aceitunas negras mostraron inhibición frente a Listeria ni Enterococcus. 31 Tabla 19: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en banderillas, mediante la técnica en cruz. Banderillas Listeria innocua Enterococcus faecalis I1 - - I2 - - I3 - - I4 - - I5 - - I6 - - I* - - I. - - A pesar de tener bastantes cepas aisladas de las banderillas, ninguna presenta actividad antimicrobiana frente a las bacterias indicadoras. Tabla 20: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en aceitunas con especias, mediante la técnica en cruz. Aceitunas con especias Listeria innocua Enterococcus faecalis J1 - - J2 - - J3 - - En cuanto a las cepas de las aceitunas con especias (tabla 20), ninguna de las cepas tiene actividad antimicrobiana frente a las bacterias indicadoras. Tabla 21: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en aceitunas con especias, mediante la técnica en cruz. Pepinillos Listeria innocua Enterococcus faecalis L1 - - La única cepa obtenida en pepinillos no presenta inhibición frente a las cepas indicadoras. (Tabla 21) 32 Tabla 22: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en guindillas, mediante la técnica en cruz. Guindillas Listeria innocua Enterococcus faecalis N1 - - N2 - - N3 ++ - N4 - - N5 - - N* - - N. - - En este caso (tabla 22), tan solo N3 presenta inhibición frente a Listeria innocua, además su actividad frente a la cepa indicadora es bastante buena. Tabla 23: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en berenjenas caseras, mediante la técnica en cruz. Berenjenas caseras Listeria innocua Enterococcus faecalis Be1 + ++ Be2 +++ ++ Be3 ++ ++ Be4 ++ ++ Be5 ++ ++ En el caso de las Berenjenas caseras (tabla 23)se puede ver como todas las cepas obtenidas en berenjenas caseras tienen una buena actividad antibacteriana frente a Listeria innocua y Enterococcus faecalis, destacando la cepa de Be2 que tiene una muy buena actividad frente a Listeria innocua. Tabla 24: Resultados de actividad antimicrobiana de BAL en pepinillos caseros, mediante la técnica en cruz. Pepinillos caseros Listeria innocua Enterococcus faecalis Pe1 + - Pe2 - - Pe3 - - Pe4 - - Pe5 - - 33 Tan solo una cepa de pepinillos caseros, Pe1, tiene actividad frente a Listeria innocua pero no frente a Enterococcus faecalis. (Tabla 24). Tabla 25: Resultado de actividad antimicrobiana de BAL en aceitunas machacadas caseras, mediante la técnica en cruz. Aceitunas machacadas caseras Listeria innocua Enterococcus faecalis A.M.1 - - A.M.2 + - A.M.3 + - A.M.4 - - A.M.5 - - En las aceitunas machacadas se observa (tabla 25) como las cepas A.M.2 y A.M.3 tienen actividad antimicrobiana frente a listeria innocua pero no hay ninguna cepa activa frente a Enterococcus faecalis. 4.3.2. Ensayo en gota. Para realizar el ensayo en gota nos quedamos con las muestras que habían dado lugar a la presencia de actividad antimicrobiana con el ensayo en cruz. En este ensayo se estudia la presencia o no de bacteriocinas y su actividad antimicrobiana frente a las cepas de Listeria innocua y Enteroccus faecalis. Las muestras en medio líquido se sembraron mediante una gota de 5 µL en una placa con MRST, a las 24h pudimos comprobar el crecimiento de todas las gotas. A continuación se añade BHA blando con las cepas indicadoras inoculadas y se incuba a 37ºC durante 24h para comprobar el grado de inhibición de las cepas obtenidas de los encurtidos mediante la medida del diámetro del halo. 34 Figura 4: Halo de inhibición en el ensayo en gota. En la figura 4 podemos observar el resultado del halo de inhibición que crean las cepas aisladas en encurtidos frente a las bacterias indicadoras. Tabla 26: Resultado del halo de inhibición en pepinillos ecológicos en el ensayo en gota. Pepinillo Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del ecológico innocua halo (mm) faecalis halo (mm) B1 + 19 + 15 Como se observa en la tabla 26, la cepa presenta halos de inhibición frente a Listeria innocua de 19 mm y Enterococcus faecalis de 15 mm. Tabla 27: Resultado del halo de inhibición en aceitunas con aliño ecológicas en el ensayo en gota. Aceituna aliño Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del ecológica innocua halo (mm) faecalis halo (mm) D1 + 15 + 18 Se observa inhibición frente a ambas cepas indicadoras, siendo mayor el halo en Enterococcus (18 mm) que en Listeria (15 mm). (Tabla 27) Tabla 28: Resultado del halo de inhibición en banderillas ecológicas en el ensayo en gota. Banderillas Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del ecológicas innocua halo (mm) faecalis halo (mm) E4 + 10 - - La cepa E4 presenta un halo de inhibición de 10 mm frente a Listeria innocua pero no se observa halo frente a Enterococcus. (Tabla 28). 35 Tabla 29: Resultado del halo de inhibición en aceitunas con tomillo y ajo ecológicas en el ensayo en gota. Aceituna Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del tomillo y ajo innocua halo (mm) faecalis halo (mm) G1 + 18 + 11 G2 + 19 + 17 G3 + 17 + 12 G4 + 17 + 13 G5 + 16 + 12 G6 + 15 + 15 G7 + 17 + 15 ecológicas En las 7 cepas obtenidas (tabla 29)podemos observar que aparece halo tanto para Listeria como para Enterococcus, también se aprecia que los halos frente a Listeria son mayores que los halos frente a Enterococcus (una media de 17 mm en Listeria frente a 13,6 mm en Enterococcus). Tabla 30: Resultados del halo de inhibición en guindillas en el ensayo en gota. Guindillas N3 Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del innocua halo (mm) faecalis halo (mm) + 14 + 11 La cepa N3 de las guindillas tiene actividad antimicrobiana frente a Listeria innocua y Enterococcus faecalis con halos de inhibición de 14 mm y 11 mm correspondientemente. (Tabla 30). Tabla 31: Resultado del halo de inhibición en berenjenas caseras en el ensayo en gota. Berenjenas Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del caseras innocua halo (mm) faecalis halo (mm) Be1 + 16 + 12 Be2 + 20 + 12 Be3 + 14 + 12 Be4 + 21 + 12 Be5 + 23 + 18 En la tabla 31 se puede observar como todas las cepas obtenidas en berenjenas caseras tienen actividad antimicrobiana frente a Listeria y 36 Enterococcus y con un grado de inhibición mayor en Listeria que en Enterococcus. En Listeria, el halo tiene una media de 18,8 mm y en Enterococcus 13,2 mm y una moda claramente apreciable de 12 mm. Tabla 32: Resultado del halo de inhibición en pepinillos caseros en el ensayo en gota. Pepinillos Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del caseros innocua halo (mm) faecalis halo (mm) Pe1 + 16 + 13 La cepa Pe1 de los pepinillos caseros (tabla 32) presenta halo tanto en Listeria como en Enteroccus siendo 3 mm mayor en Listeria. Tabla 33: Resultado del halo de inhibición en aceitunas machacadas caseras en el ensayo en gota. Aceitunas Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del machacadas innocua halo (mm) faecalis halo (mm) A.M.2 + 18 + 12 A.M.3 + 18 + 14 caseras En el caso de las aceitunas machacadas (tabla 33) ambas cepas presentan actividad antimicrobiana frente a Listeria y frente a Enterococcus, en el caso de Listeria, ambas cepas tienen un halo de 18 mm y en el caso de Enterococcus la cepa A.M.3 presenta un halo algo mayor que en el caso de A.M.2. 4.3.3. Ensayo en pocillos. Una vez obtenido el sobrenadante mediante centrifugación de las diferentes cepas aisladas en los encurtidos que habían dado positivo en el ensayo en cruz, procedimos a ensayarlos mediante la técnica de los pocillos. Para ello sobre una placa de petri con MRS agar colocamos unas torres de acero (5 por placa), añadimos una sobrecapa con las bacterias indicadoras inoculadas, una vez solidificada la sobrecapa retiramos con cuidado las torres dejando un 37 hueco o pocillo en el cual añadimos las cepas.Dejamos incubar las muestras en estufa y medimos los halos resultantes. En la siguiente figura (figura 5) y posteriores tablas (tablas 34-38) se pueden observar el resultado de la actividad antimicrobiana de las cepas aisladas frente a Listeria innocua y Enterococus faecalis. Figura 5: Halo de inhibición en el ensayo con pocillos. Tabla 34: Resultado halo de inhibición en pepinillos ecológicos en la técnica con pocillos. Pepinillos Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del ecológicos innocua halo (mm) faecalis halo (mm) B1 - - + 10 En la cepa obtenida en pepinillos ecológicos, tan solo se apreció un halo frente a Enterococcus faecalis de 10 mm. Tabla 35: Resultado halo de inhibición en banderillas ecológicas en la técnica con pocillos. Banderillas Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del ecológicas innocua halo (mm) faecalis halo (mm) E4 - - + 10 En la cepa de banderillas, únicamente aparece halo de inhibición de 10 mm, frente a Enterococcus faecalis. 38 Tabla 36: Resultado halo de inhibición en aceitunas con tomillo y ajo ecológicas en la técnica con pocillos. Aceitunas Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del tomillo y ajo innocua halo (mm) faecalis halo (mm) G1 - - + 12 G2 - - + 12 G3 - - + 10 G4 - - + 10 G5 - - + 11 ecológicas En las 5 cepas obtenidas de las aceitunas con tomillo y ajo, se observa halo de inhibición frente a Enterococcus, con una media de 11 mm. Tabla 37: Resultado halo de inhibición en pepinillos caseros en la técnica con pocillos. Pepinillos Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del caseros innocua halo (mm) faecalis halo (mm) Pe1 - - + 10 En la cepa de pepinillos (tabla 37) solo aparece un halo de 10 mm frente a Enterococcus faecalis. Tabla 38: Resultado halo de inhibición en aceitunas machacadas caseras en la técnica con pocillos. Aceituna Listeria Longitud del Enterococcus Longitud del machacada casera innocua halo (mm) faecalis halo (mm) A.M.3 - - + 10 Por último en una de las cepas de aceitunas machacadas (tabla 38) la cepa A.M.3 tiene actividad antimicrobiana frente Enterococcus faecalis, presentando un halo de inhibición de 10 mm. Para visualizar más claramente el resultado final de los ensayos, nos ayudamos de las figuras que encontramos a continuación (figuras 6 y 7) dónde observamos como en la técnica en gota ha habido un mayor número de cepas con actividad antimicrobiana frente a las bacterias indicadoras, siendo 18 cepas en el caso de Enterococcus faecalis y 19 cepas en el caso de Listeria innocua, 39 mientras que en la técnica con pocillos tan solo obtenemos 9 cepas frente a Enterococcus faecalis pero ninguna frente a Listeria innocua. Figura 6: Comparación de número de cepas obtenidas en los ensayos de pocillos y gota. Además de aparecer más número de cepas en el ensayo en gota que en el ensayo en pocillos, los diámetros de los halos de inhibición también son mayores. Se aprecia un halo mayor frente a Listeria que frente a Enterococcus a pesar de que tan solo haya inhibición en el ensayo en gota. Los halos de menor tamaño se obtuvieron en el ensayo en pocillos frente a Enterococcus. Figura 7: Comparativa de halos de inhibición en los ensayos de pocillos y gota. Diámetro de halos de inhibición 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ENSAYO EN GOTA E. faecalis ENSAYO EN POCILLOS E. faecalis 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ENSAYO EN GOTA L. innocua ENSAYO EN POCILLOS L. innocua 40 5. DISCUSIÓN En el proceso de fermentación de los encurtidos entran en juego las bacterias ácido lácticas, junto con la solución salina (salmuera) y la actuación de la flora microbiana asociada de forma natural a la materia prima, realizan la fermentación natural. (Martínez, 1988). En nuestro trabajo hemos podido observar la presencia de bacterias lácticas en muchos de los encurtidos ensayados, destacando sobre todo aceitunas con aliño ecológicas, banderillas ecológicas, aceitunas con ajo y tomillo ecológicas, aceitunas negras ecológicas y banderillas. Podemos encontrar producción de bacteriocinas en numerosas bacterias Gram- Positivas y Gram- negativas, aunque las más utilizadas en la industria alimentaria son las producidas por las BAL (Parra, 2010). El tipo de alimento (líquido, sólido, emulsión), su composición (contenido graso, proteasas y otros factores), la presencia de conservantes químicos, y la temperatura de almacenamiento, entre otros, pueden tener una enorme influencia en la actividad y efectividad de las bacteriocinas. En nuestro caso hemos encontrado también diferencias en la producción de bacteriocinas dependiendo del tipo de alimento, ha sido mayoritaria en el caso de los alimentos ecológicos. La estructura del alimento ejerce un efecto dinámico en el crecimiento de las bacterias y la difusión de las sustancias inhibitorias. (Bizani et al, 2005). La producción de bacteriocinas y su actividad depende de la temperatura de incubación, considerando, además, la sensibilidad al calor de los microorganismos de deterioro o patógenos que se desea controlar. La producción máxima de bacteriocinas puede obtenerse con un medio de cultivo con factores limitantes de crecimiento como azúcares, vitaminas y fuentes de nitrógeno, regulando el pH y eligiendo las mejores condiciones del medio (Ogunbanwo et al, 2003) para aumentar la eficiencia del proceso. Este puede ser el motivo de las diferencias de halos encontrados en las tres técnicas ensayadas, siendo mayor el número de productoras en la técnica en cruz, que puede deberse a la producción de ácidos. Por todo esto las cepas positivas deberían ensayarse en otros medios de cultivo, optimizando tanto los medios como las condiciones. 41 Los conservantes naturales son aditivos para alimentos, que se utilizan básicamente para alargar la vida útil del producto, previniendo posibles daños o alteraciones de su sabor, textura o apariencia debidos a la acción de agentes químicos (oxidación), físicos (temperatura y luz) o biológicos (microorganismos). Estos compuestos purificados pueden ser utilizados como biopreservantes en alimentos para la reducción o eliminación de ciertos microorganismos de deterioro y algunos patógenos como Listeria monocytogenes. (Joerger, 2003; Ogunbanwo et al, 2003). Los resultados de nuestro trabajo reflejan la presencia de sustancias antimicrobianas en algunos encurtidos, su optimización y purificación podría ser de interés alimentario en el futuro. 7. CONCLUSIONES A partir de los resultados obtenidos podemos concluir: 1. Ha habido crecimiento de cepas bacterianas en los encurtidos: pepinillos ecológicos, aceitunas con tomillo y ajo ecológicas, aceitunas aliñadas ecológicas, aceitunas negras ecológicas, berenjenas caseras, pepinillos caseros, aceitunas machacadas caseras, guindillas, pepinillos, banderillas y aceitunas con especias. 2. No ha habido crecimiento de cepas bacterianas en: aceituna gordal ecológica, guindillas ecológicas, cocktail de aceitunas ecológicas, aceitunas negras y aceituna gordal. 3. Los encurtidos con mayor número de cepas bacterianas han sido las banderillas seguidas de guindillas y aceitunas con tomillo y ajo ecológicas y los encurtidos caseros (pepinillos, aceitunas y berenjenas). 4. En el crecimiento microbiológico hemos encontrado bacterias gran positivas de diferentes morfologías y levaduras Gram positivas. 5. De los tres ensayos llevados a cabo para la producción de bacteriocinas ha habido mayor crecimiento en el ensayo en cruz, seguido del ensayo en gota y por último el ensayo en pocillos. 42 6. En la técnica en cruz, se observa actividad antimicrobiana tanto en Listeria innocua como en Enterococcus faecalis aunque destaca un poco sobre Listeria. 7. En la técnica en gota se aprecian halos de inhibición tanto en Listeria innocua como en Enterococcus faecalis pero con un halo algo mayor en Listeria. 8. En el ensayo en pocillos tan solo hay actividad antimicrobiana frente a Enterococcus faecalis S-47 con un diámetro medio de 10 mm. 9. Los encurtidos: aceitunas con tomillo y ajo ecológicas, pepinillos ecológicos, banderillas ecológicas, pepinillos caseros y aceitunas machacadas ecológicas han tenido actividad antimicrobiana en los tres ensayos llevados a cabo. 10. Los halos que destacan por su diámetro se encuentran en Berenjenas caseras, aceitunas machacadas caseras y aceitunas con tomillo y ajo ecológicas. 8. BIBLIOGRAFÍA Barboza, J. E., Vázquez, H., Salcedo, R. y Bautista, M. (2004). Probióticos y conservadores naturales en alimentos. Acta Universitaria. 14, 32-38. Bhunia, A. K., Johnson, M. C., Ray. B., Belden, E. L. (1990). Antigenic property of pediocinAcH produced by Pediococcus aciditacticí H. 3. AppIied Bacteriology. 69, 211-215. Bizani, D., Motta, A., Morrissy, Terra, R., Souto, A., Brandelli, A. (2005). Antibacterial activity of cerein 8A, a bacteriocin-like peptide produced by Bacillus cereus.International Microbiology. 8, 125-131. Bouzar, F., Cerning, J., Desmazeaud, M. (1997). Exopolysaccharide production and texture-promoting abilities of mixed-strain starter cultures in yogurt production, Journal Dairy Science. 80, 2310-2317. Carr, J. G. (1973). Lacties of the word unite. 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