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Tema 18. Condiciones de la actividad enzimática:
Dependencia de la Temperatura y el pH.
1. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de
reacción.
1.1.Teoría de Arrhenius y la Teoría de las velocidades
absolutas de reacción de Eyring: Equivalencia.
1.2. Dependencia de la temperatura en reacciones
enzimáticas
2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática
3. Deducción de los pKa de los aminoácidos del
centro activo
4. Efecto del pH sobre la ionización del
substrato
1. Efecto de la Temperatura sobre la Velocidad de Reacción
La velocidad de las reacciones químicas es fuertemente dependiente de la
temperatura
Según la mecanica estadística la “Energía cinética media” (Ec) de un conjunto de
moléculas es función de la temperatura actual, T.
* Si la reacción tiene lugar a una temperatura T1 ==> hay un grupo de moléculas con
“energía suficiente” para reaccionar después de una colisión eficaz.
* A una temperatura más elevada, T2, (T2 >T1), el número de moléculas con “energía
suficiente” es mayor.
La mínima energía que deben tener las moléculas para poder colisionar de
manera efectiva, se denomina “Energía de activación” (Ea).
-Según la Mecánica clásica:
Ec  f(v) = ½ mv2 ≥ Ea
-Por otro lado:
Ec  f(T)
Como se observa en la figura, a medida que aumenta
la temperatura, aumenta el número de moléculas con
energía suficiente (Ec > Ea), es decir, con velocidad
suficiente, para colisionar eficientemente
v -> Ea
* A partir de una serie de datos experimentales, Arrhenius
observó que el ln de la cte de velocidad, lnk, era función
lineal del inverso de la temperatura absoluta, 1/T, y
propuso la siguiente relación matemática:
k = A  e- (Ea/RT)
O en forma exponencial:
Si representamos: lnk frente a 1/T,
 Ea 1 
ln k  ln A  

 R T
y
= b
-
mx
* En la ec. de Arrhenius :
k = A  e- (Ea/RT)
A es una constante que tiene las mismas unidades que la constante de
velocidad y representa la frecuencia de las colisiones eficaces entre las
moléculas de los reactantes.
R es la constante universal de los gases (8,315 J K mol
T es la temperatura absoluta
Ea es la llamada energía de activación de Arrhenius
-1
-1)
Energía debe suministrarse a las moléculas reaccionantes para obtener
un choque eficaz.
NOTA: Es conveniente tener en cuenta no es una deducción basada en una teoría
preestablecida, sino que fue expresada a partir de observaciones experimentales, sin
un modelo teórico previo.
En el supuesto de que A y Ea sean independientes de la temperatura, podemos
calcular la razón de las dos constantes k1/k2 a dos temperaturas diferentes, T1 y T2, que
difieren en 10ºC.
Ea
Ea
k 1  A e

RT1
k 2  A e
Ea Ea

RT2 RT1
Aplicando logaritmos:

RT2
Ea T1 T2 
RT1T2
k1
e
e
k2
k 1 EaT1  T2 
ln

k2
RT1T2
A la razón de las dos constantes k1/k2 a dos temperaturas diferentes, suele
denominársele Q10.
Ea valor experimental 50-100 kJ/mol
Q10 2 a 4 al variar 10 C
Duplica o cuadriplica la velocidad de reacción cada 10 grados
1.1.Teoría de Arrhenius y la Teoría de las velocidades absolutas de reacción
de Eyring: Equivalencia.
- Continuemos considerando una reacción del tipo:
Aproximación experimental de
Arrhenius
k  Ae
Ea 1

R T
S  P
Teoría de las velocidades absolutas de
reacción de Eyring (TEMA 5)
k BT
k
e
h
 H #
RT
e
S #
R
- Tomando ln de ambas ecuaciones tendremos:
 Ea 1 
ln k  ln A  

 R T
H
S
ln k  ln k B  ln T  ln h 

RT
R
#
#
Derivando respecto de la temperatura, (Ea, H# y S# independientes de la temperatura)
Aproximación experimental de
Arrhenius
Teoría de las velocidades absolutas de
reacción de Eyring (TEMA 5)
d ln k  1 H
d ln k Ea 1



2
2
dT
T
RT
dT
R T
#
Ea 1
1 H
 
2
2
De donde,
R T
T RT
#
Ea  RT  H
#
- Esta ecuación es muy útil, desde el punto de vista práctico, pues nos permite obtener
el valor de la entalpía de activación, H#
Nota: el valor de Ea lo podemos calcular experimentalmente, a partir de
la pendiente de la representación de lnk  1/T
- Sustituyendo el valor H# en la ecuación de Eyring:
k BT
k
e
h
 Ea
RT
ee
S #
R
k
k BT
e
h
k  Ae

 H #
RT
e
S #
R
Ea 1
R T
- Comparando esta ecuación con la de Arrhenius, se obtiene el siguiente valor para la
constante A∞:
Valor experimental
k BT
A 
ee
h
S #
R
La ecuación anterior nos permite calcular el valor de S#.


A
S  R ln
 1
 k BT

#
Los valores de entalpía de activación, H#, y de entropía de activación, S#, son de una
gran utilidad.
Información sobre la naturaleza del estado de transición y del mecanismo de reacción.
Cálculo de la energía libre de Gibbs G# a una T determinada
- El valor de H#, generalmente es positivo, lo que significa que para formar el estado
de transición deben tensionarse o distorsionarse algunos enlaces, consumiendo calor
(energía).
- Generalmente, un valor de entropía de activación, S#, alto y negativo sugiere que en
el estado de transición las moléculas que han reaccionado adoptan conformaciones
mucho más ordenadas que las que tenían en el estado elemental.
1.2. Dependencia de la temperatura reacciones enzimáticas
Vmax función lineal de la [E] y de la kcat
función lineal de la temperatura ??
Kcat es función de la temperatura (Ecuación de Eyring)
Naturaleza proteica de las enzimas
[N]
Procesos de desnaturalización
[D]
Incremento de temperatura reacción enzimática
1. Aumento de la velocidad (reacción química) Ley de Arrhenius
2. Desnaturalización proteica
[N]

D
KD 
N 
[D]
Equilibrio de desnaturalización:
Constante de equilibrio
G   RT ln K D
o
D
KD  e
 GDo
RT
e
o
H D
o
S D
RT
R
e
Entalpia y Entropia estandar de
desnaturalización de la enzima
Ensayamos el efecto de la temperatura en condiciones de velocidad máxima
KD 
D
N 
Vmax= kcat [N]
[Eo] = [N] + [D]
N  
Eo
1 KD
Función de la temperatura
Kcat y KD
Vmax= kcat [N]
k  Ae

1 KD
Ea 1
R T
V max  Ae
kcat  Ae


Ea
RT
N   Eo
Ea
RT

Eo
 RTH D SRD 
1  e e 


o
o
Temperaturas <<
Eo
 RTH D SRD 
1  e e 


o
o
KD es muy pequeña
Varian según Arrehnius
1
Vmax y la Kcat
 RTH D SRD 
1  e e 


o
o
Temperaturas >Temperatura de transición
50% N y 50% D
Tiende a 0
KD es grande
Temperatura>>>>
Enzima de un cangrejo de alaska
Quimiotripsina porcina
Enzima Bacteria de Yellowstone
Desnaturalización
Comportamiento
según Arrhenius
Vmax
Temperatura
Temperatura
Energía de activación y parametros termodinámicos de la reacción enzimática:
Se obtienen en el rango de temperaturas donde no hay fenómenos de
desnaturalización
Graficas de Arrhenius discontinuas: Cambios conformacionales
asociados a la temperatura
m2  
Ea 2
R
Ln Vmax
m1  
1/Tc
Ea1
R
1/T
Enzimas asociadas a membranas. Tc temperatura cambio de
conformación de los fosfolipidos asociados a la proteína en la
membrana
2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática
Ácidas
Enzimas:
Neutras
Alcalinas
Vmax
1
3
5
7
9
1
3
pH
5
pH
pKa
-COOH
3,0-3,2
- -COOH
3,0-5,0
-imidazolio
5,5-7,0
7
9
1
3
5
7
9
pH
pKa de aminoácidos
que pueden estar
implicados en el centro
activo
-NH3
7,5-8,0
Interior de la proteína
SH
8,0-8,5
Fenol
9,8-10,5
pKa cambios de hasta 2
unidades
Guanidinio
11,6-12,6
Modelo comportamiento de una enzima con dos residuos ionizables
que interviene en el centro activo.
K1
K2
EH1H 2  EH1  E 
+S
+S
+S

1

EH1H 2 S  EH S  E S
Ks1
Ks2

1
kcat
EH  P
Substrato no ionizable en el rango de pH
K1 y k2 constantes de disociación de los grupos protonizables
Ks1 y Ks2 constantes de disociación de las diferentes especies químicas forman
complejos la E y S
Km constante de Micaelis de formación del único complejo que da el producto EH1-
Los diferentes complejos se expresan en función de [H+] y las contantes de disociación
Eo  EH 1H 2  EH1  E   EH 1H 2 S  EH1 S  E  S
Valores de los distintos complejos
EH 1H 2  EH

1
H 
K1

1

2
 

1


1

1
E S H 
Ks 2 
EH S 

 

S EH1 
Km 
EH S 

1
 


1
Valor de la constante de Michaelis
Sustituyendo y sacando factores comunes
 

 H
K2 
Ks 2 
  H
Eo  EH 
1

EH
S

1

1



H 
H 
 Ks1
 K1

1

EH 1H 2 S 
Ks 2
E S  EH S
H
Ks1

EH 1H 2
2


1


K2
H

1

1
E H 
K 
EH 
EH S H 
Ks1 
K1
E   EH  
EH H S   EH S  H 
Ks1

EH H 

 
 
De esta expresión tenemos que obtener el valor de

vo  kcat EH1 S

EH S 
  EH S  Km
S 
Km 
EH

1
S EH
 
 
 H
 H
K 
Ks2 
Eo  EH1 
 1  2   EH1 S 
1  
H 
H 
 Ks1
 K1
 
 

1

1
EH S   Eo

1

1

EH S 

1
A partir de la ecuación de balance de
masas de la enzimas y el valor de Km
1
Km  H 
K2   H 
Ks 2 
1    
1  

S   K1
H   Ks1
H 
 
 
 
 
1
vo  kcatEo
Km  H 
K2   H 
Ks 2 

1



1

S   K1
H    Ks1
H  
 
 
 
 
Multiplicando y diviendo por la expresión
 
 H
Ks 2 
1  

H 
 Ks1
vo 
 
V max


H
Ks 2 
1  Ks1  H  
1 

 Km

1 

 
 
S
H  
K2 
K1
H  
 S 

H
Ks 2 
  
Ks1 H 

 
 
 
Expresión general que representa el comportamiento de la velocidad de
una enzima con dos restos aminoácidos protonizables y su forma activa es
EH S 

1
pH puede modificar tanto la Vmax
como la Km
K1  Ks1
Presencia de Substrato no modifica los pKa
de los grupos ionizables de la enzima
K 2  Ks 2
V max
S

H
K 2  Km  S 
1



 
K
1
H


V max
VmpH 

H
K2 
1



K1
H  

vo 
 
 
 
 
No se modifica la Km
sólo la Vmax
A [S] saturantes
1
1

f 
H
K2 
1  K1  H  


1
EH1


Eo
f
 


 
f - Función de Michaelis
Fracción de la enzima en la forma EH1
Da los productos de la reacción
Valor entre 0 y 1
-
[H+]<<<K1 y [H+]>>>K2
1
1
f
[H+]
Vmax no se modifica
muy altas ó muy bajas
Vmax tiende a 0
0,5
pK1
pK2
Otras Formas activas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
1
1
1
f
EH1H2
1
f
E=
0,5
0,5
pK1
f  1
pK2
K1
KK
 1 22

H
H
   
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
H   H 
f  1
 2

K1K 2
K2
3. Deducción de los pKa de los aminoácidos del centro activo
1
1
1

f 
H
K2 
1  K1  H  


A pH bajo
1
1
 0,5 

f

H 
1  K1 


pH  pK1
 
 
1
f
0,5
pK1
 
pH  pK 2
pK2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A pH alto
pH
Para el modelo enzima diprótica y en su forma EH1-
Sólo pueden hacerse cuando la diferencia entre los dos pK sea al menos
3,5 unidades de pH de diferencia
Linearización de la ecuación de la velocidad máxima en función de la variación de pH
V max

H
K2 
1



 
K
1
H


VmpH
K1
 
V max
H
VmpH 
 
 
0
VmpH
log
V max
{
} -log2
 
A pH bajos
Se desprecia 1 como sumando y K2/[H+]
VmpH
log
 pH  pK1
V max
pK1
pK2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
A pH altos
Se desprecia 1 como sumando y [H+]/K1
log
VmpH
 pH  pK 2
V max
Confirmados por otras técnicas:
Modificación química específica de aa, mutagenesis dirigida, etc
Cálculo del pKa para una Enzima monoprotica
K1

EH  E  H
+S
Km
EHS

EH  P
V max
S kcat
v pH 

H   Km  S 
1  K1 


1
1  K1Km
K1 
Km
1
  




v pH
H V max S V max  V max S V max
 
 
-1/K1
1/vpH
1/[H+]
4. Efecto del pH sobre la ionización del substrato
KH

SH  S  H
+S

Sólo se ioniza el substrato
So= S- + SH
Km
kcat
EHS
S   SH
Generalmente fenómenos
poco frecuentes
EP
KH
H
 

K 
So  SH 1  H 
H 

So
K
1  H
H
v  V max
So
Km 
K
1  H
H
 
 
So
V max

KH 
Km1     So
H 

 
Sólo varia la Km
 
log
KmpH
 pH  pK H
Km
Obtener el

KH 
KmpH  Km1   
H 

pKH
¿Y si se ionizan tanto la enzima como el subtrato? Tarea
 
RESUMEN
TEMPERATURA
El calor aumenta la velocidad de las reacciones. Arrhenius descubrió experimentalmente la ley de
dependencia de la constante de velocidad de una reacción con la temperatura. Para la mayoria de
las reacciones químicas la constante de velocidad aumenta de 3,0 a 4,0 veces al aumentar 10° C
la temperatura.
Mediante la ecuación experimental de Arrhenius puede determinarse la Ea o energía de activación
de Arrhenius, energía que ha de comunicarse a las moléculas para que tengan un choque eficaz.
Las reacciones catalizadas por enzimas siguen la ley de Arrhenius. La naturaleza proteica limita el
calentamiento progresivo para aumentar la velocidad, pues se puede llegar a la desnaturalización
de la proteína
Experimentalmente, se obtiene Ea y a partir de ella se puede obtener el valor de los parámetros
termodinácos de la reacción enzimática como la entalpia, entropía y energía libre de activación.
pH
Las enzimas ensayadas in vitro a diferentes pH se comportan como: enzimas ácidas, neutras y
básicas.
Las curvas de actividad enzimática frente a variaciones de pH puede darnos información sobre los
pKa de los residuos de aminoácidos implicados en la catálisis.
La función de Michaelis de las enzimas con residuos ionizables se ajustan muy bien a los
comportamientos experimentales
Cuando el substrato no influye en la ionización de la enzima, solamente la Vmax se verá afectada.
En el caso de que sea solamente el substrato el que se ionice en el rango de pH estudiado,
solamente se verá modificada la constante de Michaelis.