Download Factor de dilucion

Dr. José A. Cardé-Serrano
Lab Biol 4207
Universidad de Puerto Rico en Aguadilla
Cultivo y enumeración de
bacteriófagos
Objetivos
 Definir virus
 Explicar la morfología de un bacteriófago
 Conocer el ciclo de vida de un virus
 Realizar técnicas que permitan cultivar y
enumerar bacteriófagos
Definición virus
 El término virus deriva del latín "veneno”
 Acido nucleico rodeado de una capa de proteínas
Introducción
 Este experimento demuestra la habilidad de los virus de
replicarse dentro de células susceptibles.
 Cultivo de virus
 Tipos de cultivo celular
 Una sola capa (monolayer)
 Cultivo primario – células vienen directamente del
organismo
 Cultivo secundario – células provienen de linaje de
células
 En suspensión
 Células no están en un medio sólido sino en un
medio liquido
Introducción
 Método de detección
 Efectos citopatológicos
 Ensayo de placas
 Fluorescencia
 Centros infecciosos
 Ensayo de transformación
 No placas
 Inhibición por contacto
Ciclo reproductivo
de los virus
Entrada
 La entrada en la célula consta de dos etapas:
 Adsorción - fijación del virus en la superficie celular
 Penetración - paso a través de la membrana.
 Hay una alta especificidad en la fijación de un virus a la
membrana de su célula hospedadora.
 Receptores y co-receptores
 Proceso evolutivo, se sugiere que cada virus ha ido
adquiriendo sitios de unión específicos para anclarse en la
membrana de un determinado tipo celular.
Entrada…
 La penetración a través de la membrana sigue diversas
modalidades:
 el virus completo,
 solamente su ácido nucleico
 Por regla general, se necesita la participación de muchas
partículas virales para que alguno de ellos logre penetrar
en la célula
 MOI – “Multiplicity of infection” – cuantas partículas
virales son necesarias para infectar una célula
Figura III.1. Esquema de los principales eventos en la adsorción del
bacteriófago T4 a la pared celular de la bacteria E. coli.
(a)el fago libre muestra las fibras y clavijas de la cola.
(b) Adhesión de las fibras de la cola.
(c) El fago se acerca a la pared celular y las clavijas entran en contacto
con la pared celular, inyecta su DNA
FIGURA III.2. Esquema del mecanismo de penetración del material
genético del fago T4 o T2 a través de la pared celular de la bacteria.
(a)Las clavijas del fago entran en contacto con la pared celular y la funda
se encuentra extendida.
(b) La funda de la cola se contrae y el material genético del fago penetra
la pared celular; la lisozima presente en el fago digiere la porción de
pared/membrana celular localizada directamente bajo la partícula viral.
http://www.hybridmedicalanimation.com/anim_bacterio
phage.html
Modalidades de penetración en la célula
 Los virus complejos producen una
rotura en la membrana bacteriana
en uno de los puntos de anclaje
 Gracias a la presencia de algunas
moléculas de enzimas hidrolíticas
entre las proteínas de la capsula.
 A través de la rotura, el tubo central
inyecta el ADN vírico, quedando la
capsula vacía en el exterior de la
bacteria.
 La presencia de cápsula en la
superficie bacteriana es un buen
indicio de que la bacteria ha sufrido
una infección vírica.
Ebola, AP22
Modalidades de penetración en la célula
 Otros virus sin envoltura lipídica se introducen en la
célula con cápsula y todo, lo cual puede realizarse de dos
maneras:
 Por penetración directa: después de la fijación, el virus
abre una brecha en la membrana y se introduce en el
citoplasma.
 Por endocitosis: la membrana forma una invaginación
en torno al virus, llegando a formar una vesícula que
penetra en la célula. Formada la vesícula, el virus abre
una brecha en la membrana de la misma con ayuda de
algunas enzimas hidrolíticas que él mismo transporta,
penetrando así en el citoplasma.
Modalidades de penetración en la célula
 Los virus con envoltura lipídica burlan la barrera de la
membrana celular porque su cubierta lipídica se funde con
la membrana, ya que tienen la misma naturaleza. Esta
fusión de membranas puede realizarse en dos lugares
distintos:
Fusión en la superficie celular: de manera que el virión
penetra directamente en el citoplasma.
Fusión con un lisosoma: se forma una vesícula por
endocitosis, a la que se une un lisosoma para digerir la
partícula introducida; entonces, la cubierta lipídica del virus
se funde con la membrana del lisosoma y el virión escapa
hacia el citoplasma.
“Uncoding” Integración
 La fase de integración corresponde a un tiempo, después
de la penetración, en que el virus parece desaparecer,
pues no se advierte ningún indicio de su presencia ni de su
actividad.
 Lo que ocurre en esta fase es un desensamblaje de las
piezas del virus (si es que ha penetrado completo), y su
ácido nucleico queda asimilado en las estructuras
celulares aptas para los procesos de replicación y
transcripción.
 Esta fase, variable de unos tipos de virus a otros, termina
con la síntesis de los mARN necesario para que se
sinteticen las proteínas que actuarán en la multiplicación
del virus.
Modalidades de fase de integración
 Ciclo ordinario o lítico: el ácido nucleico vírico procede
inmediatamente a la transcripción de su mensaje genético
en los mARN necesarios para su multiplicación, y
prosigue rápidamente el ciclo vital. Este tipo de ciclo es el
más común en la naturaleza.
 Ciclo lisogénico: fue descubierto por Lwoff en
bacteriófagos. El ADN vírico se cierra por sus extremos
generando un ADN circular. Este ADN se inserta en el
ADN bacteriano en un lugar específico en el que la
secuencia de nucleótidos bacterianos es semejante
alguna región del ADN vírico.
Lisogénico vs
Lítico
https://www.youtube.c
om/watch?v=hFwA0a
BX5bE
Multiplicación
 La multiplicación del virus consiste tanto en la replicación
de su ácido nucleico, como en la síntesis de las proteínas
de la cápsula.
 Los ácidos nucleicos y las proteínas recién sintetizadas se
ensamblan rápidamente, produciéndose nuevas partículas
víricas.
Infeccion con M13
Liberación
 La liberación del virus consiste en la salida de las
nuevas partículas víricas (viriones), que podrán infectar
nuevas células iniciando un nuevo ciclo.
Laboratorio: Parte Práctica
Medida de unidades infecciosas
 Se logra inoculando diluciones en serie de un virus en
un cultivo de células hospederas.
 La respuesta puede ser cuantitativa,
 Ensayos en placas, transformación,
 Cualitativa
 Todo o nada
Ensayo en placas
 PFU (Unidades de
formación de placas)
 Placa – Región clara en
el césped de bacterias
 Infección lítica
 Lisis de la bacteria
 PFU = # de placas x
factor de dilución
 20- 100, 30 – 300
Materiales:
 Cinco tubos de agar suave de triptona
 Cinco platos de agar duro de triptona:
 Nueve tubos de caldo de triptona:
 Pipetas 1-ml
 Cultivo bacteriófago (M-13)
 Cultivo E. coli
Procedimiento
1. Rotule todos los tubos de dilución de la siguiente manera:
- Cinco tubos de agar suave de triptona: 10-5, 10-6, 10-7,
10-8, 10-9
- Cinco platos de agar duro de triptona: 10-5, 10-6, 10-7,
10-8, 10-9
- Nueve tubos de caldo de triptona: 10-1-10-9
2. Coloque los cinco tubos del agar suave en un baño de
María ha 100°C para derretir el agar. Enfriar hasta 55°C y
mantenerlo a esta temperatura hasta que lo vaya usar.
3. Con pipetas de 1-ml, realice una dilución en serie (10-110-9) de la solución original del bacteriófago usando los
nueve tubos de 9-ml del caldo de triptona.
Procedimiento
4. Al tubo de agar suave marcado 10-5, añada dos gotas
del cultivo de E.coli y 0.1-ml del caldo de triptona con una
concentración de 10-4 del bacteriófago. Mezcle, rotando el
tubo de ensayo entre las palmas de su mano.
5. Vierta el contenido del tubo sobre la placa marcada 10-5
antes de que el agar se endurezca. Mueva la placa de
manera gentil y uniformemente hasta que el agar suave
cubre por completo la placa. Deje que se endurezca.
6. Repita el paso 4 para las soluciones de 10-5-10-9 del
caldo de triptona.
7. Incube el plato con los cultivos por 24 horas a 37°C
Replication of M13 in E. coli
* Viral (+) strand DNA enters cytoplasm
* Complementary (-) strand is synthesized by bacterial
enzymes
* DNA Gyrase, II topoisomerase, acts on double-stranded
DNA and catalyzes formation of negative supercoils in doublestranded DNA
* Final product is parental replicative form (RF) DNA
* A phage protein, pII, nicks the (+) strand in the RF
* 3'-hydroxyl acts as a primer in the creation of new viral
strand
* pII circularizes displaced viral (+) strand DNA
* Pool of progeny double-stranded RF molecules produced
* Negative strand of RF is template of transcription
* mRNAs are translated into the phage proteins
Replication of M13 in E. coli
Phage proteins in the cytoplasm are pII, pX, and pV, and they are part of
the replication process of DNA. The other phage proteins are synthesized
and inserted into the cytoplasmic or outer membranes.
* pV dimers bind newly synthesized single-stranded DNA and prevent
conversion to RF DNA
* RF DNA synthesis continues and amount of pV reaches critical
concentration
* DNA replication switches to synthesis of single-stranded (+) viral DNA
* pV-DNA structures from about 800 nm long and 8 nm in diamter
* pV-DNA complex is substrate in phage assembly reaction
Assembly of phage is associated with the membrane of bacteria and
requires five capsid proteins, three assembly proteins, ATP, a proton
motive force, and at least one bacterial protein, thioredoxin.
¿Preguntas?
Diluciones:
-Cuando se hacen diluciones siempre se comienza con
una concentración de algo (el primero)…
- Se añade mas del segundo, y el efecto es reducir la
concentración del primero.
-Asi que si haces cálculos y ves que la concentración
aumenta!!... algo hicistes mal!
-Revisa el trabajo para asegurarte que la concentración
disminuyó.
C1V1=C2V2
Diluciones….
C1V1=C2V2
Lo importante aquí es definir las variables bien.
Ej: Si tienes un amortiguador de fosfato de sodio 0.2M, y tomas 10
ml de el y lo añades a 90 ml de agua.
Cuál es la concentración final de la nueva solución o de la dilución?
Para esta fórmula necesitas 3 de las siguientes 4 variables:
C1= concentración inicial, 0.2M
V1= volumen inicial, 10ml
C2 = ? concentración final a la queda que no sabemos, x, lo que nos
preguntan!
V2= volumen final, 100 ml.
Este es un posible punto de error: 90 ml no es el volumen final!!!
Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial
Factores de dilución (fd): es la segunda forma de hacer
diluciones.
-Un factor de dilución es una expresión matemática que te
permite calcular cuanto mas diluído esta una solución
resultante preparada a partir de una solución “stock”.
-Se calcula como: el volumen final dividido entre el
volumen inicial. Cual es el factor de dilución en el
ejercicio anterior?
100ml/10ml = 10 o lo que es igual, una dilución de 1 en
10; diluido 10 veces!, 10 veces mas diluido, 10 veces mas
concentrado... factor de dilución es 10
Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial
Una vez tienes el factor de dilución que hacer?
•lo cambias a decimal o fraccion y lo multiplicas por la
C1
•divides la C1 entre el fd.
C2=C1/fd;
•C2=0.2M/10=0.02M o C2=C1 x fd = 0.2M x 1/10
la [ ] será 1/10 de la original!
Diluciones Múltiples:
Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la
concentración final se calcula :
Fd1= 100ml/10ml = 10
Fd2 = 50ml/2ml = 25
Fd3 = 90ml/30ml= 3
FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces…
Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva
concentracion:
Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM
Factor Para 10-5 = 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 0.1:1
PFU = 4 x(10X10X10x10x10) =
= 4 x (100,000) = 400,000
Diluciones Múltiples:
Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n
veces), la concentración final se calcula :
Fd1= 100ml/10ml = 10
Fd2 = 50ml/2ml = 25
Fd3 = 90ml/30ml= 3
FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces…
Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva
concentracion:
Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027
M = 0.27mM = 270 μM
Factor Para 10-5 = 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 0.1:1
PFU = 4 x(10X10X10x10x10) =
= 4 x (100,000) = 400,000