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ANÁLISIS GENÉTICO Y EL
ESTUDIO DEL DESARROLLO
• 1) Mutantes ¿por qué son útiles?
• 2) Genes de efecto cigótico y materno
• 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis
•
•
•
•
a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila
b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón
c) Peculiaridades de Arabidopsis
d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de
modificadores
• 4) Series alélicas, su importancia y obtención
• 5) Estudio de los genes encontrados
•
•
•
•
•
a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas
b) Cómo obtener mosaicos
c) Cómo marcar los sectores mutantes
d) Modificaciones del sistema de mosaicos
e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta
ANÁLISIS GENÉTICO Y EL
ESTUDIO DEL DESARROLLO
• 1) Mutantes ¿por qué son útiles?
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2) Genes de efecto cigótico y materno
3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis
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a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila
b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón
c) Peculiaridades de Arabidopsis
d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de
modificadores
4) Series alélicas, su importancia y obtención
5) Estudio de los genes encontrados
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a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas
b) Cómo obtener mosaicos
c) Cómo marcar los sectores mutantes
d) Modificaciones del sistema de mosaicos
e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta
¿CÓMO ENTENDER UN FENÓMENO
BOLÓGICO?
Atracción por la luz
Dos posibles aproximaciones:
-1) Extraer proteínas, RNA, metabolitos … de individuos
antes y después de entrar en contacto con la luz y
buscar diferencias.
Problemas: complejidad de los resultados, falta de
sensibilidad …
-2) Buscar individuos o generar mutantes que no se
sientan atraídos. Identificar los genes afectados.
Problemas: no se encuentren esos individuos, mutantes
triviales …
COMPLEJIDAD DEL DESARROLLO
¿Cómo se sabe que los
productos de estos genes
intervienen?
¿Cómo se sabe qué genes
están en la misma ruta?
¿Cómo se sabe el orden de
actuación de los que están en
la misma ruta?
EL VALOR DE LOS MUTANTES
El gen afectado debe estar implicado en la formación de esa estructura
wt
A
B
C
Mutante
D
Fenotipo
normal
A
B
C*
D
Fenotipo
anormal
Identificar componentes de una ruta (de señalización, metabólica …
El análisis de los mutantes da pistas sobre dónde y cómo actúan los genes
y el orden en que intervienen en un proceso
El tipo de alteraciones que se observan en los mutantes y los que no lo
hacen pueden dar pistas sobre cómo se genera una estructura
EL VALOR DE LOS MUTANTES
Regulación de la síntesis de aas en S. cerevisae
Medio completo
Medio sin His
wt
Síntesis aas ↓
Síntesis aas ↑
Mut tra3
Síntesis aas ↑
Síntesis aas ↑
Mut aas1,
aas2, aas3
Síntesis aas ↓
Síntesis aas ↓
TRA3
Síntesis aas
AAS1
AAS2
AAS3
Síntesis aas
EL VALOR DE LOS MUTANTES
La combinación de mutantes en un mismo individuo da pistas sobre
cómo interaccionan los productos de los genes afectados
Posibles fenotipos de un doble mutante (a/a; b/b):
-1) Muestra tanto el fenotipo A como el B
Los genes a y b actúan de forma independiente (color de flores y semillas en guisantes
de Mendel)
-2) Fenotipo wt, o casi wt
Uno de los mutantes actúa como SUPRESOR del otro. Puede indicar relación
funcional entre los dos genes.
-3) Fenotipo más fuerte que uno de los de partida (A o B)
Uno de los mutantes actúa como INTENSIFICADOR del otro.
Puede indicar relación funcional entre los dos genes (parálogos, rutas paralelas …)
-4) Muestra el fenotipo A o el B
Uno de los mutantes actúa como EPISTÁTICO sobre el otro.
Los dos genes actúan en la misma ruta y pueden hacerse hipótesis sobre su orden en ella.
EL VALOR DE LOS MUTANTES
Regulación de la síntesis de aas en S. cerevisae
wt
Síntesis aas ↓
Mut tra3
Síntesis aas ↑
Síntesis aas
TRA3
tra3; aa3
tra3; aa1
tra3; aa2
Mut aas1, aas2, aas3
Síntesis aas ↓
AAS1
AAS2
AAS3
Síntesis aas
Síntesis aas ↓
aa3 epistático sobre tra3
Síntesis aas ↑
tra3 epistático sobre aa1
y sobre aa2
¿Orden en que actúan estos genes?
LA IMPORTANCIA DEL FENOTIPADO
Luz azul
FOTOTROPISMO
Fitocromo A (phyA) influye en el proceso
¿phyA actúa preferentemente en el núcleo o en el citoplasma?
NÚCLEO
CITOPLASMA
phyA
Luz azul
FHL
FHY1
phyA
Sin phyA está afectado el fototropismo
Sin phyA en el núcleo apenas lo está
CONCLUSIÓN:
phyA actúa principalmente
en el citoplasma
PERO …
LA IMPORTANCIA DEL FENOTIPADO
Fenotipado más fino:
seguir la velocidad del proceso
phyA-NLS-GFP
WT
fhy1fhl
phyA actuaría sin importar si está en el núcleo, o en el citoplasma
phyAfhy1fhl
phyA
NÚCLEO
CITOPLASMA
phyA
FHL
FHY1
phyA
phyA-NLS
Ahora notamos que phyA sí hace algo importante
en el núcleo para el fototropismo: MÁS LENTO en fhy1fhl
phyA-NLS
En plantas SIN phyA endógeno:
todo el phyA está en el núcleo
ESQUEMA DE UNA FLOR TÍPICA
LA IMPORTANCIA DE LOS
MUTANTES
• Hay mutantes en los que está alterado el
patrón floral, NO la morfología de sus partes.
• En esos mutantes no hay cualquier tipo de
alteración. Ver qué tipos se dan y cuáles no
permite comprender cómo tiene lugar el
proceso.
Mutante “A”
Estructura floral: carpelos, estambres, estambres, carpelos
Mutante “B”
Estructura floral: sépalos, sépalos, carpelos, carpelos
Mutante “C”
pétalos en
vez de
estambres
Estructura floral: sépalos, pétalos, pétalos, nueva flor
Mutante “C”
Una nueva
flor en vez
de carpelos
Estructura floral: sépalos, pétalos, pétalos, nueva flor
4
3 2 1
carpelo
estambre
C
C
sépalo
A
pétalo
pétalo
1 2 3
estambre
sépalo
B
B
A
ANÁLISIS GENÉTICO Y EL
ESTUDIO DEL DESARROLLO
•
1) Mutantes ¿por qué son útiles?
• 2) Genes de efecto cigótico y materno
•
3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis
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a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila
b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón
c) Peculiaridades de Arabidopsis
d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de
modificadores
4) Series alélicas, su importancia y obtención
5) Estudio de los genes encontrados
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a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas
b) Cómo obtener mosaicos
c) Cómo marcar los sectores mutantes
d) Modificaciones del sistema de mosaicos
e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta
GENES DE EFECTO MATERNO
(+/-)
(-/-)
(+/-)
Fenotipo normal
Fenotipo determinado por
el genotipo de la madre,
NO por el del individuo
(+/-)
Fenotipo anormal
¿CUÁNTO DE LA MADRE?
El caso de Bicoid
+/-
+/-
-/-
x
♀
+/-
x
♂
-/Vive
+/-
♀
x
♂
-/-
+/Mueren
-/-
♀
♂
-/-
+/Viven
Todo el producto del gen necesario para el desarrollo viene de la madre:
EFECTO MATERNO CLÁSICO
¿DÓNDE EN LA MADRE?
+/-
+/+
+/-
+/+
-/-
x
Mosaico
♀
Mosaico
♂
-/-
x
♀
♂
+/-
+/-
Muere
Viven
El producto del gen necesario para el desarrollo viene de las
gónadas maternas
¿CUÁNTO DE LA MADRE?
El caso de Engrailed (letal en homocigosis)
+/-
♂
-/-
+/-
+/x
x
Mosaico
♀
+/-
+/-
♀
x
Mosaico
♂
+/-
♀
+/-
♂
-/-
Mismos
defectos
-/-
-/-
+/-
Muere
Muere
Vive
Sólo importa el genotipo del cigoto: EFECTO CIGÓTICO CLÁSICO
¿CUÁNTO DE LA MADRE?
Extra sex combs (esc)
+/-
♀
Se necesita un aporte materno
¿pero produce algo el embrión?
-/-
+/-
Muere
♂
x
-/-
+/-
♀
♂
Diferente por lo que ha
producido el embrión
♀
-/-
-/-/-
Vive
-/-
♂
+/-
+/-
♀
♂
T2 y T3 como T1
NO TODO el producto del gen necesario
para el desarrollo viene de la madre
ANÁLISIS GENÉTICO Y EL
ESTUDIO DEL DESARROLLO
•
•
1) Mutantes ¿por qué son útiles?
2) Genes de efecto cigótico y materno
• 3) Encontrar los genes: programas de
mutagénesis
•
•
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•
•
•
a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila
b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón
c) Peculiaridades de Arabidopsis
d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de
modificadores
4) Series alélicas, su importancia y obtención
5) Estudio de los genes encontrados
•
•
•
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•
a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas
b) Cómo obtener mosaicos
c) Cómo marcar los sectores mutantes
d) Modificaciones del sistema de mosaicos
e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta
DISEÑO GENERAL
,
x
x
,
… ,
,
…
Mutagénesis y obtención de mutantes INDIVIDUALES
Amplificación por separado de cada mutante individual
Típicamente no pueden distinguirse los distintos individuos
Cruces entre hermanos de cada familia
,
,
,
,
¿Fenotipo de interés de los mutantes en homocigosis?
Mantener la mutación desde los heterocigotos, ¿cómo distinguirlos?
En especies AUTOFECUNDABLES se obtienen los homocigotos
sin necesidad de amplificación previa de cada mutante individual
3a) EL “SCREENING” DE
HEIDELBERG (DROSOPHILA)
DROSOPHILA COMO SISTEMA
• Ventajas generales:
– Fácil y barato de mantener
– Tiempo de generación corto (10 dias)
– Produce mucha progenie
DROSOPHILA COMO SISTEMA
• Ventajas genéticas:
– Sin recombinación meiótica en machos
– Sólo cuatro cromosomas
– Cromosomas politénicos visibles al óptico
– Muchos caracteres externos variables
(ojos, nervios en las alas, quetas…)
– Un gran repertorio de técnicas y trucos
– Genoma completamente secuenciado
EL SCREENING DE HEIDELBERG
• Primer intento de hacer una búsqueda global de
mutantes del desarrollo.
• ¿No sería inmanejable el número de genes que
intervienen en el proceso?
• ¿Servirían de algo esos mutantes, serían
informativos?
EL SCREENING DE HEIDELBERG
• Cosas importantes a tener en cuenta:
– ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener
todo.
– Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar
– Planificar un esquema de cruzamientos para obtener
individuos con las mutaciones y poder conservarlas.
– Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés.
• Se buscaron genes cigóticos que mataran al
embrión: no llegarían a salir larvas del huevo.
CICLO VITAL DE DROSOPHILA
EL SCREENING DE HEIDELBERG
• Cosas importantes a tener en cuenta:
– ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener
todo.
– Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar
– Planificar un esquema de cruzamientos para obtener
individuos con las mutaciones y poder conservarlas.
– Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés.
• Se buscaron genes cigóticos que mataran al
embrión: no llegarían a salir larvas del huevo.
• Esas mutaciones deberían causar alteraciones
morfológicas visibles en la cutícula
LA CUTÍCULA EMBRIONARIA
LA CUTÍCULA EMBRIONARIA
¿Cómo hacer mutagénesis?
Se hace mutagénesis de un buen número de machos de modo que un cierto
porcentaje de sus espermatozoides tengan mutaciones
¿Cómo hacer mutagénesis?
Los machos mutagenizados se cruzan “en masa” con hembras normales
x
F1
Todos los descendientes son heterozigotos. Por lo general, cada uno
para una mutación distinta.
¿Cómo hacer mutagénesis?
Para los mutantes recesivos es preciso obtener individuos homozigotos.
Pero, ¿cómo conseguirlos?
x
1/4
La autofecundación “en masa” de la F1 NO generará casi nunca
homozigotos para cada mutación sino dobles mutantes en heterozigosis
porque típicamente de cada mutación sólo hay 1 individuo en la F1
¿Cómo hacer mutagénesis?
Cruzando POR SEPARADO cada macho F1 con hembras wt se obtiene en
cada cruce (botella) 1/2 de heterozigotos para cada mutación.
x
F2
1/2
1/2
Hemos conseguido amplificar cada mutación: ya hay varios individuos
con la MISMA mutación que luego podrán cruzarse entre ellos
(No haría falta si fueran hermafroditas capaces de autofecundarse)
¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas
aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga
1/2
x
1/4 de los cruces
Todos wt
1/2
¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas
aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga
1/2
1/2
x
1/2 de los cruces
1/2
1/2
¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas
aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga
1/2
1/2
x
1/4 de los cruces
1/4
Fenotipo visible
1/2
1/4
¿Cómo hacer mutagénesis?
Resumen de los resultados de la autofecundación en botellas
donde había un mutante
1/2
1/2
x
1/16
6/16
9/16
Entre los hermanos de los mutantes habrá portadores de la mutación,
pero también muchos wt
¿Cómo hacer mutagénesis?
El experimento se simplificaría si hubiera algún modo de eliminar
automáticamente los individuos “a” y “b”
F1
F2
x
1/2
x
1/2
a
F3
b
1/16
6/16
9/16
¿Cómo hacer mutagénesis?
Una posibilidad es usar letales recesivos (r) y letales dominantes
inducibles (D)
r
F1
x
r
D
r
r
D
F2
r
r
D
¿Cómo hacer mutagénesis?
Pero si hay recombinación en la hembra el sistema puede destruirse
r
D
Meiosis
r
D
x
r
…
r
…
¿Cómo hacer mutagénesis?
• Los recombinantes que se producen entre
cromosomas que difieren en una inversión dan
descendientes inviables. En Drosophila hay
sistemas de cromosomas con inversiones,
CROMOSOMAS BALANCEADORES, que pueden
emplearse para evitar este problema.
• El “screening” se hace por separado para cada
cromosoma
El “screening” de Heidelberg
EMS
w
w
x
B
r
D
w
F1
B
w
r
D
Se mutagenizan con EMS varios miles de machos que después se
cruzan con hembras vírgenes “en masa”
El “screening” de Heidelberg
w
B
r
r
B
x
w
D
D
29º 4 dias
18º o 25º
w
w
D
B
B
B
D
r
D
r
r
F2
B
r
D
El “screening” de Heidelberg
w
B
x
r
w
w
1/4
w
B
w
B
r
1/2
F3
r
B
B
r
r
1/4
Mueren como larvas
CRITERIOS DE SELECCIÓN:
-1)no hay moscas de ojos blancos;
-2)de 1/4 de los huevos no salen larvas;
-3)observación embriones
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
• 1500 machos mutagenizados se cruzaron
con unas 2500 hembras vírgenes
EMS
w
w
x
B
r
D
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
• 1500 machos mutagenizados se cruzaron
con unas 2500 hembras vírgenes
• 10.000 cruces individuales de F1, 5764
dieron suficiente descendencia
w
B
r
B
r
x
w
D
D
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
w
w
1/4
w
B
r
1/2
B
B
r
r
1/4
Mueren como larvas
• 4217 de las F2 no dieron descendientes de
ojos blancos (73% → 1.3 mut/crom) Poisson, no media
• 2843 daban 25% huevos de los que no salían
larvas
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
• Examen a la lupa de los embriones de las
2843 líneas
• 1620 líneas son letales embrionarios
auténticos
• 321 muestran defectos claros cutícula
• Análisis de complementación: 61 genes,
48 con más de 1 alelo, 13 con 1 alelo
ASPECTO DE ALGUNOS MUTANTES
MUCHOS MUTANTES CON
PROBLEMAS EN LOS SEGMENTOS
LOS MUTANTES SUGIEREN APARICIÓN
PROGRESIVA DE PATRONES
Zonas a lo largo del eje A/P
14 parasegmentos
Borde anterior y posterior de
cada parasegmento
Identidad de cada región
SATURACIÓN DEL “SCREENING”
¿Qué fracción de los genes que se podría encontrar con este
protocolo de trabajo se ha encontrado realmente?
¿Merece la pena seguir buscando con este protocolo?
Criterio 1: seguir la marcha del proceso
Constantemente aparecen
mutantes, pero …
El caso del cromosoma
2 de Drosophila:
Cada vez se encuentran
menos GENES nuevos
SATURACIÓN DEL “SCREENING”
Criterio 2: número de alelos por gen. Cuantos más haya, más
cerca de la saturación.
El caso del cromosoma
2 de Drosophila:
Aproximadamente
4,55 alelos/locus
(hay mejores
aproximaciones)
¿Podemos predecir cuántos genes quedan por encontrar?
Asunción clásica: la distribución de frecuencias de alelos sigue una Poisson
La fracción de genes sin mutar (0 alelos) será: P(0)= e-m
Caso del cromosoma 2: m=4,55, P(0)= 0,01. El 1% del total de genes que se podrían
encontrar no se ha mutado aún, quedarían menos de 1 (0,6)
SATURACIÓN DEL “SCREENING”
Problema: muchas veces la distribución no parece una Poisson.
Previsible si no todos los genes tienen la misma probabilidad de
recuperarse como mutantes.
14
Fuerte exceso de
loci con una
mutación
12
Observados
Poisson
El caso del cromosoma
2 de Drosophila:
Número de loci
10
Poisson para
m = 4,55 alelos/locus
8
6
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Número de alelos
Posteriormente se han encontrado 8 genes más en este cromosoma con el tipo de problema
buscado en el “screening” original. Esos 8 loci representan el 11,6% del total de 69 loci,
P(0)=0,116, mucho más que lo previsible según Poisson (P(0)=0,01)
SATURACIÓN DEL “SCREENING”
Criterio 3: análisis de deleciones. ¿Las hay que causen un fenotipo
de interés pero en las que no mapee uno de los loci identificados?
El caso del cromosoma 2 de Drosophila:
Crom. 2
Deleciones
(cubren 30% del cromosoma)
Deleciones dando
fenotipos cuticulares
Loci de mutantes
previamente identificados
En todas mapea alguno de los loci identificados
(compatible con saturación)
3b) PROBLEMAS EN OTROS
ORGANISMOS: PEZ CEBRA Y
RATÓN
EL PEZ CEBRA COMO SISTEMA
MODELO DE VERTEBRADOS
•
•
•
•
•
Pequeño tamaño (3-4 cm)
Tiempo de generación corto (3-4 meses)
Alta fecundidad (100-200 huevos/hembra)
Fácil de mutagenizar
Embrión transparente y de desarrollo
externo
• Se puede fecundar “in vitro”. Esperma
congelable
“SCREENINGS” EN EL PEZ
CEBRA
Amplificación de cada mutante
en una familia F2
1/4 de los cruzamientos entre los
F2 darán individuos homozigotos
para m: con fenotipo visible
Varias peceras, cada una
con cruces entre parejas
de hermanos F2
“SCREENINGS” DEL PEZ CEBRA
“SCREENING” DE TÜBINGEN
•
•
•
49 MACHOS MUTAGENIZADOS
3075 FAMILIAS F2 INICIADAS
2746 FAMILIAS F2 ANALIZADAS
–
•
•
•
•
•
•
150 GENES CON MÁS DE 1 ALELO
222 GENES CON 1 ALELO
Nº alelos/gen: de 1 a 34. Nº medio:
2.4
Development 123:1-36 (1996)
266 MACHOS MUTAGENIZADOS
2799 FAMILIAS F2 INICIADAS
1808 FAMILIAS F2 ANALIZADAS
–
(14.357 cruces para dar F3)
4624 MUTANTES OBTENIDOS
1163 MUTANTES CONFIRMADOS
372 GENES IDENTIFICADOS
–
–
–
“SCREENING” DE BOSTON
•
•
•
(más de 30.000 cruces para dar F3)
2383 MUTANTES OBTENIDOS
695 MUTANTES CONFIRMADOS
220 GENES IDENTIFICADOS
–
–
–
56 GENES CON MÁS DE 1 ALELO
164 GENES CON 1 ALELO
Nº alelos/gen: de 1 a 11. Nº medio:
1.5
Development 123:37-46 (1996)
“SCREENING” DE HAPLOIDES
Ventaja:
Enseguida se detectan
mutaciones interesantes
Problemas:
-1)Los embriones haploides
acaban muriendo
-2)Los embriones haploides tienen
algunos problemas de desarrollo
MÉTODOS ALTERNATIVOS
Presión poco después
de la fertilización:
NO se completa la meiosis II y
embriones diploides
Problema: no son
completamente homocigotos
Choque térmico tras fertilización:
NO se completa 1ª mitosis tras
meiosis y embriones diploides y
completamente homocigotos
Problema: pobre viabilidad (10-20%)
“Screeining” de
haploides ya visto
EL RATÓN COMO MODELO
•
•
•
•
Es un mamífero (cercano al hombre)
Genoma secuenciado
Transformable y sistemas “knock out”
Corto tiempo de generación (2 meses)
• Desarrollo embrionario intrauterino
• Requerimientos de espacio en jaulas
• Pocos programas de mutagénesis a gran
escala: unos 300 mutantes dominantes
(visibles en G1) desde más de 40.000
ratones, pocos de desarrollo
DISEÑO DE UN CROMOSOMA
BALANCEADOR EN RATÓN
Sin Wnt3 el ratón muere
Ag da color amarillento al pelo
Puro y Neo dan resistencia
a antibióticos
Se obtiene un gen Hprt funcional,
Hprt permite crecer en medio HAT
ca. 1/3 del cromosoma con la inversión
UN BALANCEADOR PARA EL
CROMOSOMA 11
Color amarillento de partes del
cuerpo de los ratones portadores
de la inversión
ESQUEMA DEL “SCREENING”
Ratones macho
Marcador dominante
REX: pelo rizado
Mutación
Camadas de más de 24 ratones sin animales negros indican un mutante recesivo letal
3c) PECULIARIDADES DE
ARABIDOPSIS
MUTAGÉNESIS EN ARABIDOPSIS
Meristemo apical del embrión
Sector
m/+
Nº células del meristemo que
contribuirán a las semillas
de la planta = 2 en Arabidopsis
Sector
+/+
Como cada individuo se autofecunda no hace falta una generación previa
de amplificación del número de individuos m/+