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Lección 1
Introducción y principios
generales
ALGUNAS CUESTIONES BÁSICAS
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¿Qué moléculas son los principales “componentes activos” en las células?
Las proteínas (enzimas, componentes de sistemas de señalización …)
¿Qué determina la actividad de una proteína?
Su estructura 3D, que viene condicionada por su estructura primaria
Dónde está en un organismo, cuándo aparece y cuánto lo hace
¿Puede replicarse una proteína?
No, la estructura 1aria de una proteína no puede pasar de una molécula de
proteína a otra. Eso sí es posible en los ácidos nucleicos
¿Dónde está contenida la información sobre la estructura 1aria de una proteína?
En los ácidos nucleicos: en la región codificante de los genes
¿Dónde está contenida la información sobre el dónde, cuándo y cuánto?
En los ácidos nucleicos: en la región promotora de los genes y en la
estructura de la cromatina
¿Dónde están situados los genes en los eucariotas?
En los cromosomas, cada cromosoma es una molécula de DNA lineal que
contiene un número variable de genes y suele haber varios cromosomas
por célula
ALGUNAS CUESTIONES BÁSICAS
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¿Qué es el locus de un gen?
La posición dónde se encuentra en un cromosoma
¿Son iguales todas los genes de un determinado tipo presentes en los
individuos de una especie?
No, suele haber variantes: son los alelos
¿Un carácter, un gen?
Para la gran mayoría de los caracteres NO: varias proteínas intervienen
en un proceso, su expresión está controlada por otras proteínas y RNAs
y su actividad por sistemas de señalización sensibles a cambios
ambientales. Por tanto, lo habitual es: un carácter, varios genes +
influencias ambientales
¿Controlado genéticamente = inflexiblemente determinado?
No siempre, porque la actividad de las proteínas se ve modificada por
efectos ambientales
¿Un gen, un carácter?
Una proteína suele tener siempre el mismo tipo de actividad pero si
cambia el contexto en el que actúa puede hacerlo el efecto final en el
organismo. Consecuencia: en muchas ocasiones el mismo gen afecta a
diferentes caracteres. Otra posibilidad: un gen da varios productos
(“splicing” alternativo)
TIPOS DE GENES EUCARIOTAS
-1) Su producto final es una proteína
-2) Su producto final es un RNA
-rRNA o tRNA
Transcritos por RNApol específicas
Productos estables
Tendencia a estar agrupados en el genoma
-miRNA
Transcritos por la RNApol II
Productos pequeños e inestables
Dispersos por el genoma
-lncRNA
ALELOS DE UN GEN
Mutación
Individuos
a1
a1/a1
a34
a16
a4
a1/a12
a6
a18
a2
a5
a4/a8
.
.
.
a12
a3
“Pool” de alelos del gen “a”
en la especie
Deriva
Selección
negativa
¿GEN → CARÁCTER?
Ca2+
1
2
3
4
Carácter X:
Ca2+
a
b
c
d
Genes 1, 2, 3, 4, 5
Señal ambiental
e
CARÁCTER X
f
g
Un gen afecta a varios caracteres
Un carácter afectado por varios genes
Efectos ambientales
5
Gen 2
7
k
TF1-P
2
b
TF1
Receptor
Señal
3
c
d
CARÁCTER Y
m
r
6
Carácter Y:
Genes 2, 3, 6, 7
Señal ambiental
“SPLICING” ALTERNATIVO
a-tropomiosina
Es probable que lo sufra la mayoría de los genes en eucariotas
GENES DELATORES
Delator
Delator transcripcional
¿dónde se transcribe el gen?
Gen de interés
Delator
Delator traduccional
¿dónde se acumula el producto?
¿Efecto de la cromatina en esa zona del genoma?: inserción dirigida del delator
lacZ
(β-galactosidasa)
GUS
(β-glucuronidasa)
GFP
Luciferasa
¿CÓMO ENTENDER UN FENÓMENO
BIOLÓGICO?
Atracción por la luz
Dos posibles aproximaciones:
-1) Extraer proteínas, RNA, metabolitos … de individuos
antes y después de entrar en contacto con la luz y
buscar diferencias.
Problemas: complejidad de los resultados, falta de
sensibilidad …
-2) Buscar individuos o generar MUTANTES que no
se sientan atraídos. Identificar los genes afectados.
Problemas: no se encuentren esos individuos, mutantes
triviales …
REQUISITO PREVIO
Sólo puede estarse seguro de que un gen afecte a un carácter si
disponemos de más de un alelo de ese gen: VARIABILIDAD
AA AA AA AA AA AA AA AA AA
Bb Bb Bb BB BB Bb bb bb bb
Cc CC cc Cc CC cc Cc CC cc
?
?
Aa AA aa Aa AA aa Aa AA aa
Bb Bb Bb BB BB Bb bb bb bb
CC CC CC CC CC CC CC CC CC
Tres genes controlan el carácter en esta especie pero sólo podemos
detectar en cada población el efecto de dos (los variables)
¿CÓMO OBTENGO LOS
MUTANTES?
¿GENES TAMAÑO OREJAS?
-Parto de las variantes que hay ya en la naturaleza (variabilidad
natural)
-Hago mutagénesis y busco mutantes de interés (“screening”)
Mutagénesis
GRAN VARIABILIDAD NATURAL
Un genoma humano típico difiere del de referencia en 4.1-5 millones de sitios.
La mayoría (> 99%) son SNPs o cortos “indels”
2100 a 2500 son variaciones estructurales (que afectan en total a unos 20 millones de
pares de bases):
-unas 1000 delecciones grandes
-unas 160 variantes de nº de copias
-unas 915 inserciones de Alu
-unas 128 inserciones de L1
-unas 51 inserciones SVA (retrotransposones SVA)
-unas 4 NUMTs (inserciones de DNA mitocondrial en el genómico)
-unas 10 inversiones
Variantes en un individuo típico que pueden afectar a la función génica:
-149-182 sitios que causan truncación proteína
-10000 a 12000 sitios que causan cambios de secuencia en proteína
-459000-565000 sitios en zonas UTR y promotores
Datos de “A global reference for human genetic variation” The 1000 genomes Project consortium
Nature 526:68-74 (2015) basados en 2504 individuos de 26 poblaciones
“SCREENING” CLÁSICO
Mutagénesis
…
AL AZAR
¿No mutado?
Cada gen puede estar o no mutado en algún individuo.
Cuantos más individuos más probabilidad de tener
mutaciones en todos los genes
Individuos SIN
fenotipo de interés
SE
DESCARTAN
¿Gen no relacionado?
Análisis del fenotipo en
búsqueda de individuos
donde sea de interés
Identificación del gen mutado en los individuos con el
fenotipo de interés. Algunos genes importantes para
el proceso en estudio se encontrarán muchas veces,
otros ninguna
“Screening” SATURADO: todos los genes que se podían
encontrar con el método usado se han encontrado
“GENOME-WIDE SCREENING”
Identificar todos
Mutarlos
los genes
uno a uno
…
Su interés radica en que
tiene un gen mutado.
Otros fenotipados pueden
detectar algo
Colecciones de
interés PÚBLICO
SE
CONSERVAN
Cada gen estará mutado en algún
individuo
Individuos SIN
fenotipo de interés
Fenotipar cada
individuo
Asignación de una función a cada
gen SI ES QUE al mutarse origina
un fenotipo detectable
GENES → FUNCIONES:
DOS ESTRATEGIAS Y DOS
APROXIMACIONES
GENÉTICA DIRECTA/ REVERSA
Genética directa: del
mutante al gen, de la
función al gen
*
Gen afectado
Mutante (función
del gen)
PASOS A SEGUIR: Mapear la región del genoma afectada en el mutante;
identificar el gen; clonarlo; comparar secuencias de los alelos wt y mutante
Genética reversa: del
gen al mutante, del
gen a la función
Gen
Mutante (función
del gen)
PASOS A SEGUIR: Cambiar la secuencia del gen en el organismo (obtener
un mutante); identificar alteraciones producidas; predecir la función del gen
APROXIMACIÓN INDIVIDUAL vs
SISTEMÁTICA
Genética directa
Mi mutante favorito
INDIVIDUAL
Genética reversa
GEN
FUNCIÓN
Mi gen favorito
Individuos wt
Mutagénesis
AL AZAR
SISTEMÁTICA
Genoma
Mutagénesis
DE CADA UNO
de los genes
“Genome-wide
screening”
Colección de
mutantes
(individuos o
genes)
Genética directa
Genética reversa
GENES
FUNCIONES
¿QUÉ GEN ESTÁ MUTADO?
¿DÓNDE ESTÁ EL GEN AFECTADO
EN EL MUTANTE?
APROXIMACIÓN CLÁSICA:
•
¿En qué cromosoma está? ¿En qué posición en ese cromosoma?
Para contestar lo anterior debemos saber cómo se hereda en relación
con otros genes de posición ya conocida (MARCADORES):
Debemos estimar con qué frecuencia se separa nuestro alelo
mutante de alelos de los marcadores a los que estaba asociado,
frecuencia de RECOMBINACIÓN
Loci situados en distintos cromosomas: 1/2 probabilidad de que se
separen
Loci situados en el mismo cromosoma: < 1/2 probabilidad de que se
separen (tanto menor cuanto más cerca estén)
NUEVAS APROXIMACIONES:
•
•
Secuenciar el genoma de individuos estrechamente emparentados con y sin la
mutación, comparar las secuencias e identificar los cambios relevantes
“Tilling arrays” con DNA de individuos con y sin la mutación
MAPEO CON “TILLING ARRAYS”
Región del genoma
Oligonucleótidos de la región
“Tilling array”
Hibridación sondas de DNA wt
y mutante con el “array”
Hibridación con DNA wt
Hibridación con DNA mutante
Localización del mutante
MAPEO POR RECOMBINACIÓN
Indv 1
Nuestro mutante: m
Marcador A/a
AAmm
Prog 2
aamm X
Descendientes recombinantes:
se han separado los alelos
asociados
Indv 2
X
aaMM
Prog 1
Am aM
A M
Am
a m
aM
Alelos A y m asociados en
un genomio
Alelos a y M asociados en
el otro
Descendientes parentales:
se mantiene los alelos asociados
como en el progenitor
Frec. Recom ~ 1/2: en distintos cromosomas
Frec. Recom < 1/2: en el mismo cromosoma
GENES CON LOCI EN
DISTINTOS CROMOSOMAS
MEIOSIS DE UN DIHÍBRIDO
b
B
a
A
Segregación INDEPENDIENTE de cada
pareja de cromosomas homólogos
Probabilidad: ½
Combinaciones parentales
1/2 * (1/4 + 1/4 + 1/4 +1/4) = 1/2
Probabilidad: ½
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
Combinaciones recombinantes
1/2 * (1/4 + 1/4 + 1/4 + 1/4) =1/2
(RF = 50%)
CRUZAMIENTO PRUEBA DE UN
DIHÍBRIDO
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
RF = 50%
Proporción 1:1:1:1
GENES CON LOCI EN EL
MISMO CROMOSOMA
(GENES LIGADOS)
EFECTO DEL SOBRECRUZAMIENTO
ENTRE LOS LOCI
Sólo con
sobrecruzamiento
Sólo se DETECTAN si ocurren ENTRE dos loci HETEROCIGOTOS
Sin sobrecruzamiento no hay gametos recombinantes
para los loci en el MISMO cromosoma
TIPOS DE DIHIBRIDOS DE
GENES LIGADOS
Ligados en fase de ACOPLAMIENTO (CIS)
Ligados en fase de REPULSIÓN (TRANS)
CRUZAMIENTO PRUEBA DE UN
DIHÍBRIDO CIS
Si hay SIEMPRE sobrecruzamiento
entre esos dos loci (frec. sobrec = 100%)
se obtiene 50% de gametos recombinantes
(1/4 + 1/4), es decir, RF= 50%
=
RF < 50%
Recombinantes desde
un trans
Parentales desde
un trans
Si RF=1% los loci están separados 1cM y CADA uno de los dos tipos
de gametos recombinantes aparece en proporción de 0.5%
DISTANCIA GENÉTICADISTANCIA FÍSICA
Pocos sobrecruzamientos en la heterocromatina.
Poca distancia en el mapa genético pero
mayor distancia física
Zona con muchos sobrecruzamientos.
Distancia genética desproporcionada
Por término medio en humanos 1 cM equivale a 105-107 pb.
En levaduras 1 cM equivale a unas 6000 pb
LA RF NUNCA SUPERA EL 50%
Aunque los loci en estudio estén
muy alejados y siempre haya
sobrecruzamientos no puede haber
más de un 50% de recombinantes
Meiocitos con más de un
sobrecruzamiento también
dan como máximo
50% de recombinantes
Entre dos loci no se puede distinguir
si ha habido sobrecruzamientos
simples o múltiples: se subestima
la distancia y se subestima tanto
más cuanto más alejados estén.
Solución: loci intermedios
¿ES LA MUTACIÓN EN EL
GEN MAPEADO REALMENTE
LA CAUSA DEL FENOTIPO?
RESCATE DE UN MUTANTE
C. elegans wt
unc-104
Se mueven lentamente
y sin coordinación
Se quedan paralizados y
enrollados
UNC-104::GFP
Rescate del mutante,
se mueven de nuevo
normalmente
¿QUÉ INFORMACIÓN DAN
LOS MUTANTES?
¿Cómo se sabe que los
productos de estos genes
intervienen?
¿Cómo se sabe qué genes
están en la misma ruta?
¿Cómo se sabe el orden de
actuación de los que están en
la misma ruta?
EL VALOR DE LOS MUTANTES
El gen afectado debe estar implicado en la formación de esa estructura
wt
A
B
C
Mutante
D
Fenotipo
normal
A
B
C*
D
Fenotipo
anormal
Identificar componentes de una ruta (de señalización, metabólica …
El análisis de los mutantes da pistas sobre dónde y cómo actúan los genes
y el orden en que intervienen en un proceso (EPISTASIAS)
El tipo de alteraciones que se observan en los mutantes y los que no lo
hacen pueden dar pistas sobre cómo se genera una estructura
POSIBLES FENOTIPOS
-Un único fenotipo. Esperable si el gen tiene una única
función.
-Más de un fenotipo (PLEIOTROPÍA). Posibilidades:
INTERESANTE: el gen tiene varias funciones en distintos
momentos o lugares.
MENOS INTERESANTE: hay una relación trivial entre los fenotipos
(un mutante causa parálisis y malnutrición porque al no moverse el
individuo no puede alimentarse)
-No todos los mutantes muestran el fenotipo
(PENETRANCIA INCOMPLETA): por cambios aleatorios de expresión
alrededor de un valor umbral; por interacciones con otros genes o el
ambiente …
-No todos los mutantes muestran el fenotipo en el mismo
grado (EXPRESIVIDAD VARIABLE)
-Sin fenotipo. El gen pasa inadvertido.
DUPLICACIONES GÉNICAS
Duplicación
Divergencia con el tiempo
Dos posibilidades
*
Actividades del producto
ligeramente diferentes
Expresión ligeramente
diferente de los genes
Si muta uno de los genes a veces el otro podrá suplirle: no aparece fenotipo o
es débil. Efecto de la REDUNDANCIA
TIPOS DE MUTANTES
Mutantes o alelos de pérdida de función (“loss-offunction”)
-Mutantes nulos (“null mutants”) o amorfos (“amorphic
mutants”)
Suelen ser recesivos. El arquetípico sería una deleción. Se consideran
como muy útiles para determinar la función de un gen. Útiles en estudios
de epistasia.
-Mutantes de pérdida parcial de función o hipomorfos
(“hypomorphic mutants”)
Suelen ser recesivos. Si no se reconocen como tales sus fenotipos
pueden dar problemas de interpretación y son nocivos para los estudios
de epistasia
+
*
+
+
+/+
m/+
*
*
m/m
Test para un
mutante nulo
+/+
m/+
*
m/m
m/Df
wt
wt
mutante
mutante
m/Df
+/+
M/+
Mutante haploinsuficiente
(DOMINANTE)
mismo fenotipo
+
*
+
+
+/+
m/+
*
*
*
m/m
≠ fenotipo
≠ fenotipo
Test para un
mutante hipomorfo
wt
mutante
+/+
m/+
m/m/m
m/m
m/Df
m/Df
TIPOS DE MUTANTES
Mutantes o alelos de ganancia de función (“gain-offunction”)
-Mutantes
sobreproductores
hipermorfos (“hypermorphic mutants”)
(“over-producers”)
o
Suelen ser dominantes. El producto del gen sigue apareciendo en los
mismos lugares y momentos. Posibilidades: más expresión del gen; el
producto es más estable; producto más activo ... Útiles para determinar la
función de un gen si hay redundancias. Útiles en estudios de epistasia
+
*
+
+
+/+
M/+
*
*
*
M/M
M/Df
mutante
Test para un mutante
sobreproductor
wt
+/+
M/+
M/M
M/Df
TIPOS DE MUTANTES
Mutantes o alelos de ganancia de función (“gain-offunction”)
-Mutantes
sobreproductores
hipermorfos (“hypermorphic mutants”)
(“over-producers”)
o
-Mutantes de expresión ectópica (“ectopic expression”) o
neomorfos (“neomorphic mutants”)
Suelen ser dominantes. El producto del gen aparece en sitios o
momentos donde no lo hace normalmente. Útiles para determinar la
función de un gen si hay redundancias. Nocivos en estudios de epistasia
MUTANTE ANTENNAPEDIA
EXPRESIÓN ECTÓPICA:
mutante dominante (ganancia de función)
Segmento anterior como uno posterior:
POSTERIORIZACIÓN
X
Cada región viene especificada por una combinación de genes homeóticos
TIPOS DE MUTANTES
Mutantes o alelos de ganancia de función (“gain-offunction”)
-Mutantes
sobreproductores
hipermorfos (“hypermorphic mutants”)
(“over-producers”)
o
-Mutantes de expresión ectópica (“ectopic expression”) o
neomorfos (“neomorphic mutants”)
-Mutantes dominante-negativos (“dominant negative”) o
antimorfos (“antimorphic mutants”)
El producto del alelo mutante al interaccionar con el normal lo hace
funcionar mal. Típico de productos génicos que funcionan en complejos.
Como un alelo nulo, pero de efecto dominante.
MUTANTE ANTIMORFO
Heterocigoto: produce ambos
tipos de receptor
Los heterodímeros no son funcionales:
puede haber efecto dominante
¿AYUDA TENER VARIOS
ALELOS MUTANTES DEL
MISMO GEN?
LA IMPORTANCIA DE LAS
SERIES ALÉLICAS
wt
No todos los alelos son igual
de útiles para estudios
posteriores: intensificación,
supresión, epistasias, etc
Distintos alelos
mutantes del mismo gen
Distintos alelos pueden afectar
a diferentes actividades del
mismo gen
Gana fuerza la hipótesis de
que el gen está implicado en
el desarrollo de esa estructura
LA IMPORTANCIA DE LAS
SERIES ALÉLICAS
Este alelo indica
que el mismo gen
interviene en el
desarrollo del ala
y la pata
Este alelo indica
que afecta más
fuertemente al
desarrollo del ala
que al de la pata
Ala
*
Pata
*
*
wt
Alelo nulo
Alelo hipomorfo
LA IMPORTANCIA DE LAS
SERIES ALÉLICAS
ETAPA I
ETAPA II
Gen A
Antena
Gen A
Cabeza
Alelo nulo de A: no hay cabeza
y no se puede llegar a etapa II
Detectamos dónde actúa PRIMERO el gen
Podemos no detectar dónde lo hace luego
LA IMPORTANCIA DE LAS
SERIES ALÉLICAS
ETAPA I
ETAPA II
Gen A
Antena
Gen A
Cabeza
Alelo hipomorfo de A:
problemas en cabeza y antena
Podemos detectar los distintos sitios donde
actúa el gen
¿TENEMOS MUTANTES DEL
MISMO O DE DIFERENTES
GENES?
ANÁLISIS DE COMPLEMENTACIÓN
Cruce a realizar:
¿Afectan las dos mutaciones al mismo gen?
(deben ser recesivas)
m1/m1
¿Fenotipo?
SÍ LO HACEN
m1
m2
m2/m2
m1 m2
NO LO HACEN
m1
X
wt2
*
*
*
X
x
X
No hay producto funcional
del gen
FENOTIPO MUTANTE
No hay complementación
wt1
m2
Hay producto funcional
de ambos genes
FENOTIPO wt
Hay complementación
*
X
BÚSQUEDA DE NUEVOS ALELOS (m)
CUANDO YA TENEMOS UNO RECESIVO (a)
Se basa en el análisis de complementación. Mutagenizamos individuos normales porque
queremos mutar el alelo silvestre (+). Al cruzarlos con individuos con el alelo ya
conocido (a) los pocos descendientes que sigan siendo mutantes lo serán porque
portan un nuevo alelo mutante (m)
+/+
No se mutó
el alelo +
+/a
x
a/a
Nuevo alelo
mutante: m
m/a
Fenotipo wt:
Fenotipo mutante:
HAY COMPLEMENTACIÓN
NO HAY COMPLEMENTACIÓN
¿CONTROLAN EL MISMO
PROCESO ESTOS VARIOS
GENES DE LOS QUE YA
TENEMOS MUTANTES?
INTERACCIÓN ENTRE GENES
La combinación de mutantes en un mismo individuo da PISTAS sobre
cómo interaccionan los productos de los genes afectados
Posibles fenotipos de un doble mutante (a/a; b/b):
-1) Muestra tanto el fenotipo A como el B
Los genes a y b actúan de forma independiente (color de flores y semillas en guisantes
de Mendel)
-2) Fenotipo wt, o casi wt
Uno de los mutantes actúa como SUPRESOR del otro. Puede indicar relación
funcional entre los dos genes
-3) Fenotipo más fuerte que uno de los de partida (A o B)
Uno de los mutantes actúa como INTENSIFICADOR del otro.
Puede indicar relación funcional entre los dos genes (parálogos, rutas paralelas …)
-4) Muestra el fenotipo A o el B
Uno de los mutantes actúa como EPISTÁTICO sobre el otro.
Los dos genes actúan en la misma ruta y pueden hacerse hipótesis sobre su orden en ella.
¿PODEMOS OBTENER
INTENSIFICADORES Y
SUPRESORES
INTENCIONADAMENTE?
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
mutagénesis
inicial
wt
mutagénesis
posterior
mutante
a/a
de interés
supresor
sup/sup; a/a
wt
mutante
wt
mutante
supresor
intensificador
intensificador
enh/enh; a/a
MUTANTES ESPECIALES
MUTANTES CONDICIONALES
mut
T permisiva
mut
T restrictiva
mut
wt
Fenotipo
wt
Fenotipo
mutante
wt
H
E1
E2
E3
E4
wt
¿Cuándo se necesita el producto del gen?
Utilidad:
Mantener individuos mutantes para un gen
esencial
Obtener mutantes condicionales
Mutagénesis a T
restrictiva
Individuos
mutantes
Cambiar a T
permisiva
¿Individuos
ahora wt?
MOSAICOS
-/-
Muere
¿?
¿?
¿?
¿Dónde o cuándo se necesita la actividad de un gen?
¿Qué problemas causa la falta de actividad de un gen en cada sitio o momento?
¿Se necesita su actividad en las células en que se expresa o en otras diferentes?:
mutantes autónomos o no autónomos
No autónomo
Autónomo
Fen. mut
Fen. wt
Fen wt
Fen. mut
ORGANISMOS MODELO
1) Hay millones de especies vivientes, muchas tendrán interesantes
características, pero no hay recursos para estudiar todas en profundidad.
2) Dependiendo del nivel a que se estudien, habrá cosas que tengan en
común muchas especies: “Lo que es válido para E. coli debe serlo para los
elefantes” (Monod, 1954)
3) Principales características que debe cumplir una buena especie modelo en
estudios genéticos y genómicos:
a) Fácil de mantener en el laboratorio e individuos no muy grandes.
b) Produce muchos descendientes en poco tiempo.
c) Fácil obtener e identificar mutantes y hacer cruzamientos entre
individuos de forma controlada.
d) Se pueden clonar genes siguiendo protocolos “típicos” así como
reintroducirlos en individuos (transgénesis).
e) Se ha determinado la secuencia de su genoma.
4) Especies modelo eucariotas más típicas para estudios genéticos y
genómicos:
ORGANISMOS MODELO
Saccharomyces cerevisae
Colonias en 2 días
Mal para señalización
Mus musculus
Ciclo vital en 60 días
Problemas de espacio
Caenorhabditis elegans
Ciclo vital 4 dias
Transformación dirigida difícil
Drosophila melanogaster
Ciclo vital en 7-10 días
Transformación dirigida difícil
Arabidopsis thaliana
Ciclo vital en 42 días
Transformación dirigida difícil
Zea mays
Ciclo vital en 120-150 días
Transformación complicada
Danio rerio
Ciclo vital en 90 días
Aún no ampliamente usado
Oryza sativa
Ciclo vital en 100-120 días
Transformación complicada