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Apoptosis En Enfermedades
Neurodegenerativas
Introducción a La Terapia Génica
Curso 2004-2005
Apoptosis En Enfermedades
Neurodegenerativas
•
•
•
•
Apoptosis neuronal.
Mecanismos de supervivencia.
Enfermedades neurodegenerativas.
Aplicación: estudio de la apoptosis
neuronal asociada a la enfermedad de
scrapie.
Apoptosis En Enfermedades
Neurodegenerativas
•
•
•
•
Apoptosis neuronal.
Mecanismos de supervivencia.
Enfermedades neurodegenerativas.
Aplicación: estudio de la apoptosis
neuronal asociada a la enfermedad de
scrapie.
La Neurona
• Normalmente sobreviven toda la vida del
individuo permitiendo el mantenimiento de
los circuitos neuronales.
• En el desarrollo muchas neuronas (50%)
sufren apoptosis (Sinaptogénesis).
• Señales de supervivencia neuronal:
– Factores Neurotróficos.
– Glutamato (neurotransmisor excitatorio).
Inducción De Apoptosis in vitro
• Falta de factores neurotróficos:
– Desarrollo.
– Enfermedades Neurodegenerativas.
• Toxicidad del péptido b-amiloide:
– Enfermedad de Alzheimer.
• Excitotoxicidad.
• Falta de K.
• Estrés oxidativo:
– Infarto.
– Envejecimiento.
Falta De Factores Neurotróficos
• Señales de
supervivencia.
• Causa de la pérdida
masiva de neuronas en
el desarrollo.
• Modelo in vitro:
– NGF: Ns simpáticas y
células PC12.
– BDNF o CNTF: Ns
sensitivas.
– Cultivos sin suero.
Toxicidad Del Péptido b-amiloide
AAP
b-amiloide
c-jun
caspasas
Apoptosis:
Ns corticales
Ns hipocampo
Necrosis:
Ns corticales
Neuroblastomas
PC12
• Principal compuesto de
las placas seniles.
• Péptido de 39 a 42 aa
proveniente de la
glicolisis de AAP (695770 aa).
• Apoptosis o necrosis
según el tipo celular o
el protocolo
experimental.
Excitotixicidad
• Los aminoácidos excitadores
son neurotransmisores
(Glutamato).
• Implicados en la
diferenciación neuronal y en
la memorización.
• Receptores:
– Ionotrópicos
glutamatérgicos (NMDA).
– Metabotrópicos.
• Estímulo excesivo: muerte
neuronal.
Apoptosis
Necrosis
Otros Modelos
• Falta de K:
– La supervivencia y
diferenciación
neuronales in vitro
requiere altas [K].
– Privación de K en el
medio  apoptosis
• Estrés oxidativo:
– Agentes oxidantes en
el medio (H2O2,
peroxinitrito).
– Inhibición de la
síntesis de
antioxidantes
intracelulares 
aumento de radicales
libres.
Mecanismos Moleculares De
La Apoptosis
Mecanismos Moleculares (2)
Pro-apoptóticas
Caspasas
Digestión de sustratos específicos.
Bax, Bad
Formación de poros en la Mb. Mit. (salida Cyt-c).
Receptores Glutamato
Entrada de Ca; activación de quinasas y proteasas.
Fas
Iniciación de la cascasda de Casp-8.
Par-4
Disfunción mitocondrial; supresión de señales de supervivencia (NFkB).
P53
Transcripción de genes apoptóticos (Bax).
Anti-apoptóticas
Bcl-2, Bcl-xL
Estabiliza la función mitocondrial; supresión stress oxid.
IAPs
Inhibición de caspasas.
Factores
tróficos/citoquinas
Expresión de enzimas antioxidantes, prots reguladoras de Ca, IAPs,
Bcl-2; fosforilación de AKT y otros.
Telomerasa
Previene el acortamiento de los telómeros; modular respuestas de
daño ADN.
Enzimas antioxidantes
Suprimen estrés oxidativo.
Protein Kinasa Cz
Estimula la expresión de (NF-kB)
Prots. Unión al Ca
Homeostasis del Ca.
Mattson, M.P. (2000) Nature reviews 1: 120-9
Receptores De Membrana
Fas
Apoptosis por falta de factores neurotróficos
p75
http://perso.wanadoo.fr/adna/Apoptose.html
Los Proto-oncogenes:
c-fos y c-jun
• Modelos in vitro:
– Falta de K o suero,
exposición al bamiloide, strés
escitotóxico.
Factores neurotróficos
c-Jun
c-Jun
• Modelos in vivo:
– Axotomía o estrés
excitotóxico.
JNK
JNK
Genes Del Ciclo Celular
• Ciclinas:
– D1: su función en la apoptosis es variable
dependiendo del tipo neuronal y del estímulo.
– D1 y B1: + individualización de cromosomas en la
apoptosis inducida por ácido okadaico en
neuroblastomas.
• P53:
– Participación demostrada in vivo e in vitro.
– No participa en el desarrollo cerebral normal.
– Convierte a las neuronas más sensibles al estímulo
apoptótico.
La Familia De Bcl-2
• Sobre-expresión de Bcl-2 in vivo e in
vitro inhibe la apoptosis.
• Bcl2 : exceso de neuronas en
cerebro y médula.
• Bcl2 (-/-): desarrollo normal y
degeneración importante post-natal.
• Bcl-x (-/-): muerte neuronal
apoptótica masiva en el desarrollo.
• Bax (-/): exceso de neuronas
simpáticas y motoneuronas.
Resistentes a la privación de NGF in
vitro y a la axotomía.
Regulación De La Familia Bcl-2
• Transcripcional:
– EGL-1, Bim, Hrk.
• Post-traducción:
– Bax, Bad, Bid.
Putcha et al. (2002)
• Las proteínas pro-apoptóticas BAX y
BAK no presentan redundancia o
expresión compensatoria en niveles
fisiólogicos.
• Bim comparte función con Hrk pero no
con Bid o Bad.
• Fas-FasL no contribuyen a la apoptosis
por TFD.
Putcha et al. (2002)
• El modelo de apoptosis basado en la
privación de factores neurotróficos en cultivos
neuronales de SCG y CG depende únicamente
de la expresión y traslocación de BAX para la
salida de Cyt-c y activación de caspasas.
• BIM y HRK están inducidos y requieren de
BAX para mediar la muerte celular.
• La subfamilia BH3 puede mediar la
traslocación de BAX.
Putcha et al. (2002)
Citoplasma
Modelo 1 BH3
Mitocondria
BAX
BAX
Cyt c
BCL-2
BCL-w
BCL-XL
Modelo 2
BAX
Modelo 3 BH3
BCL-w
BCL-XL
BAX
BH3
Modelo 4
BAX
BH3
BAX
BH3
BAX
Cyt c
Cyt c
BCL-2
BCL-W
BCL-XL
BAX
Cyt c
Putcha et al. (2002)
Citoplasma
Modelo 1 BH3
Mitocondria
BAX
BAX
BID
BAD
BCL-2
BCL-w
BCL-XL
BIM
Modelo 2
BAX
Modelo 3 BH3
BCL-w
BCL-XL
BAX
BH3
Modelo 4
Cyt c
BAX
BH3
BAX
BH3
BAX
Cyt c
Cyt c
BCL-2
BCL-W
BCL-XL
BAX
Cyt c
Putcha et al. (2002)
Mitocondria
Citoplasma
+NGF
BAX
BAX
(periférico)
BAX
(integral)
Cyt c
BCL-2
BCL-XL
-NGF
multimerización
BAX
BAX
(periférico)
BIM
Dp5
BAX
(integral)
BCL-2
BCL-XL
Cyt c
Caspasas
• Casp-8 respuesta a la
inducción por Fas y el
receptor de la
neurotrofina p75.
• Casp-3: importante en
el desarrollo.
• Casp-1: apoptosis de
neuronas postmitóticas.
• Casp-2: apoptosis por
falta de factores
neurotróficos.
• Responsabilidad diferente
según el tipo neuronal, el
grado de madurez y el
estímulo apoptótico.
• Activación de caspasas
efectoras:
– Activación DNasas.
– Poly-ADP-ribosa polimerasa.
– Kinasa ATM.
– Canales de iones (AMPA).
– Proteínas del citoesqueleto.
Otros Factores
• Par-4:
– Prostate apoptosis response-4 protein.
– Sobre-expresada en células apoptóticas de tumores
de próstata.
– Esencial en la apoptosis neuronal (desarrollo y
patológica):
• Sobreexpresada en respuesta a estímulos apoptóticos.
• Interacción con la proteinkinasa Cz y Bcl-2 (dominio
Leucine Zipper).
Otros Factores
• Telomerasa:
– Previene el acortamiento de
los cromosomas en la
mitosis.
– Actividad incrementada en
la inmortalización y
transformación celular y en
el desarrollo.
– Acción anti-apoptótica en
los estadíos tempranos de
la muerte neuronal.
www.bio.miami.edu/dana/250/telomerase.jpg
Radicales Libres
• La apoptosis neuronal producida por diversos
estímulos (privación de factores
neurotróficos, excitotoxididad, falta de K,
exposición a b-amiloide, isquemia) se
acompaña de la producción de radicales libres
de O.
• La acción de antioxidantes (SOD) no inhiben
la apoptosis por falta de NGF.
• NGF previene la muerte celular cuando los
radicales libres ya se han producido.
• Los radicales libres disminuyen la resistencia
de las neuronas a la apoptosis.
Apoptosis En Enfermedades
Neurodegenerativas
•
•
•
•
Apoptosis neuronal.
Mecanismos de supervivencia.
Enfermedades neurodegenerativas.
Aplicación: estudio de la apoptosis
neuronal asociada a la enfermedad de
scrapie.
Inducción De Apoptosis
• Falta de factores neurotróficos:
– Desarrollo.
– Enfermedades Neurodegenerativas.
• Glutamato (neurotransmisor excitatorio):
– Neurodegeneración aguda (infarto).
– Enfermedad de Alzheimer.
• Estrés oxidativo:
– Infarto.
– Envejecimiento.
• Toxinas ambientales.
Mecanismos De Supervivencia
• La complejidad funcional y estructural
del SN se basa en la no división celular.
• La supervivencia neuronal permite
mantener funciones continuas a larga
distancia y la memoria duradera.
Cascadas De Señalización
Anti-apoptótica
Factor De Trascripción NF-kB
Actividad protectora in vitro e in vivo:
NF-kB
APOPTOSIS
Mn SOD
Bcl-2
IAP
Falta de factores neurotróficos
Excitotoxicidad
Estrés oxidativo
Promueve apoptosis:
NF-kB
OExcitotoxinas
Glutamato
Acido kainico
N-metil-D-aspartato
APOPTOSIS
NEURONAL
Señalización Intracelular
Factores Neurotróficos
Bcl-2, Bcl-Xl
Ez antioxidantes
Heat-shock proteins
Caspasas
Autocrina o Paracrina
Stress
Chaperona
PKB/AKT
Ca/calmodulin
dependent
Protein kinase
Ca2+
Depolimerización
actina
NMDA Canales
De Ca2+
Ca2+
CREB
cGMP
NF-kB
Apoptosis En Enfermedades
Neurodegenerativas
•
•
•
•
Apoptosis neuronal.
Mecanismos de supervivencia.
Enfermedades neurodegenerativas.
Aplicación: estudio de la apoptosis
neuronal asociada a la enfermedad de
scrapie.
Otros Factores Que Modulan
La Apoptosis En E.N.D.
E.N.D.
Genéticos
Ambientales
Alzheimer
APP, mutaciones de
la presenilina, ApoE
Traumatismo, baja
educación, aporte
calórico
Parkinson
A-synuclein,
mutaciones parkin
Trauma, toxinas,
aporte calórico
Huntington
Expansiones de PolyCAG en Huntingtin
ALS
Mutaciones Cu/ZnSOD
Toxinas, respuesta
autoinmune
Infarto
Mutaciones cadasil
Fumar, dieta, grasa.
Mattson, M.P. (2000) Nature reviews 1: 120-9
Productos génicos asociados con la neurodegeneración
Gene
Disease
Effect of Mutant
on Apoptosis
Caspase
Substrate?
Effect of
Caspase Cleavage
Androgen receptor
Kennedy's
Increased
Yes
Increased apoptosis
Huntingtin
Huntington's
Increased
Yes
Increased apoptosis
Spinocerebellar
atrophy-2 (ataxin-2)
Spinocerebellar
atrophy-2
Increased
Yes
?
Dentatorubropallidolu
ysian
atrophy (atrophin-1)
Dentatorubropallidoluysian atrophy
Increased
Yes
Increased apoptosis
Spinocerebellar
atrophy-3 (ataxin-3)
Machado-Joseph
disease
Increased
Yes
?
Presenilin-1
Alzheimer's
Increased
Yes
?
Presenilin-2
Alzheimer's
Increased
Yes
?
Beta-amyloid
precursor protein
Alzheimer's
Increased
Yes
Increased apoptosis
ApoE
Alzheimer's
?
?
?
Superoxide
dismutase-1
Familial amyotrophic
lateral sclerosis
Increased
No for caspase-3
?
Alpha-synuclein
Parkinson’s
Increased
No for caspase-3
?
http://www.hosppract.com/issues/2001/09/bred.htm
Enfermedades Neurodegenerativas
• Corteza cerebral:
– Enfermedad de Alzheimer (demencia senil).
– Enfermedad de pick (demencia).
– Enfermedad de Creutzfeld-Jakob.
• Ganglios Basales:
– Enfermedad de Parkinson.
– Corea de Huntington.
• Degeneración espino-cerebral:
– Ataxia de Fiedreich.
– Atrofia olivo-pronto-cerebelar.
• Enfermedades de la motoneurona:
– Esclerosis Lateral Amiotrófica.
– Atrofia olivo-pronto-cerebelar.
Alzheimer
• Pérdida progresiva del reconocimiento y
problemas emocionales.
• Degeneración sináptica y muerte de neuonas
en las estructuras límbicas (hipocampo,
amígdala y septo) y corteza asociada.
• Agregados hiperfosforilados de proteína Tau.
• Excesiva proteolisis mediada por Ca y estrés
oxidativo.
• Acumulación de placas de b-amiloide.
Muerte Neuronal
• TUNEL:
– Observada en ausencia de degeneración
neurofibrilar.
– Se observa también en casos poco severos
(poca NDF).
– Células TUNEL+, DNF-, Tau patológicas+.
– Células gliales TUNEL+.
– Células TUNEL+, b-amiloide+ y próximas a
placas seniles.
• Expresión de genes de apoptosis.
Mecanismos Moleculares
• Sobre-expresión de Bax:
– En las placas seniles.
– No en neuronas Tau-PHF+.
• Bcl-2:
– Resultados inmunohistoquímicos controvertidos.
– No cambios en ARNm.
• C-fos, c-jun, p53 y Fas:
– En neuronas TUNEL+.
– No en neuronas Tau-PHF+.
• Actividad de caspasas:
– Fragmentación de la actina.
• Otros: Par-4, represión de NCKAP1.
b-amiloide
• Inducción de apoptosis.
• Aumenta la vulnerabilidad neuronal al estrés oxidativo
y la reducción energética.
– Peroxidación de lípidos de membrana.
– Deterioro de ATPasas de membrana y transportadores de
glutamato y clucosa:
–
–
–
–
Despolarización de membrana.
Depleción de ATP.
Excesivo influjo de Ca.
Disfunción mitocondrial.
• Protección: antioxidantes y estabilizadores de la
homeostasis del Ca, neurotróficos y citoquinas.
b-amiloide
b-amiloide
Apoptosis
APP
Casp-3
Ab
C31
Factores Genéticos
• Mutaciones en APP, presenilinas1 y 2.
• Desarrollo temprano y hereditario de la
enfermedad.
• Mutaciones en presenilinas:
– Incremento de la digestión g-secretasa.
– Pre-1*: neuronas más susceptible a apoptosis.
• Acción Pres-1 anterior a la activación de
caspasas. Aumenta la salida de Ca del RE.
Parkinson
• Disfunción motoral.
• Degeneración de las neuronas
dopaminérgicas in la substancia nigra.
• Neuronas: estrés oxidativo incrememtnado y
disfunción mitocondrial.
• Déficit del complejo mitocondrial I.
• Factores genéticos y ambientales sensibilizan
a las neuronas al estrés oxidativo y déficit
energético.
Mecanismos Moleculares
• Incremento de par-4 y p53 en neuronas
dopaminérgicas.
• Inhibidores de la caspasa-1, drogas que
suprimen la síntesis de macromoléculas
y facotres neurotróficos protegen a las
neuronas in vitro.
• Mutaciones en a-synuclein en un
pequeño número de casos.
Huntington
• Movimientos incontrolados.
• Enfermedad hereditaria: expansiones de CAG
en el gen de hungtintin Incrementos de
repeticiones de poliglutamina.
• Transtornos de la función mitocondrial y
muerte excitotóxica.
• El efecto de hungtintin* no se limita a las
neuronas.
Mecanismos Moleculares
• Redistribución de Casp-8 en una fracción
insoluble del tejido del striatum.
• Huntingtin*  Caspasa-8.
• Caspasas  huntingtin  agregación y
neurotoxicidad.
• Espresión de huntingtin inhibe la apoptosis
antes de la lesión mitocondrial.
Esclerosis Lateral Amiotrófica
• Parálisis progresiva.
• Degeneración de las motoneuronas en
la médula espinal.
• Formas esporádica y genética
(mutaciones en la cu/Zn SOD).
• SOD* no disminuye su actividad
antioxidante pero incrementa su
actividad pro-apoptótica.
Mecanismos Moleculares
• SOD* interacciona con H2O2 o O-  daño
oxidativo en las membranas y alteraciones en
las funciones mitocondriales  vulnerables a
la apotposis excitotóxica.
• Incremento de Bax, no de Bcl-2.
• Sobreexpresión de Bcl-2 e inhibidores de
caspasas retrasan la degeneración y muerte.
Infarto Cerebral
• Infarto:
– Corazón necrótico.
– Penumbra isquémica.
• Daño del ADN y
activación de PARP.
• Expresión genes
proapoptóticos y salida
de cyt-c.
• Hidrólisis de MPL:
– ASMasaEsfingomielina
ceramida.
Apoptosis En Enfermedades
Neurodegenerativas
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Apoptosis neuronal.
Mecanismos de supervivencia.
Enfermedades neurodegenerativas.
Aplicación: estudio de la apoptosis
neuronal asociada a la enfermedad
de scrapie.