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Práctica de hematología Practica de hematológica Parte I – recuento de hematíes y hematocrito Objetivo: medir el número de hematíes por mm3 de sangre y el volumen corpuscular mediano del hematíe (VCM). Material necesario: Sangre con anticoagulante (heparina) Pipetas automáticas graduables 100 μl y 1000 μl Solución isotónica NaCl mOsm Cámaras de Neubauer Capilares microhematocrito Centrifuga microhematocrito Plastelina Microscopio Hematocrito Para conocer el valor de hematocrito hay que llenar una capilar con sangre con anticoagulante. Seguidamente pondremos plastelina en uno de los extremos y colocaremos la capilar en una centrifuga de microhematocrito, de manera que el extremo tapado por plastelina quede a la parte más externa de la centrifuga. Se centrifuga durante 5 minutos. Al cabo de este tiempo se observa que se han separado totalmente el plasma y la fracción globular de la sangre; se lee el valor de hematocrito utilizando la plantilla que hay al fondo de la centrifuga. Recuento de eritrocitos El número de eritrocitos en un mm3 es muy elevado, por tanto hay que diluir la sangre para poder contar los eritrocitos de forma adecuada. Para diluir la sangre hay que utilizar una solución isotónica (300 mOsm/l), para evitar la lisis osmótica de los eritrocitos. Es conveniente practicar una dilución de 1:100 o 1:400 para efectuar el recuento de forma correcta y cómoda. Una vez se ha diluido la sangre, se pone una muestra en una cámara de Neubauer (dispositivo de vidrio grabado con un entramado de tamaño conocido), que nos permite contar el número de las células presentes en un volumen exacto. Se coge una pequeña muestra de la disolución de sangre, y se deposita una gota que se aplica al lado del cubreobjetos de la cámara, dejando que el líquido pase por capilaridad. Se pone la cámara al microscopio y se enfoca con el objetivo de 10 aumentos y poca luz. Se cuentan los eritrocitos en los cuadros A, B, C D y E. 1 Práctica de hematología Para calcular el número de eritrocitos por mm3 de sangre, se debe tener en cuenta la dilución. Se calcula con la fórmula siguiente: eritrocitos M D mm3 V Teniendo en cuenta que: M = media de eritrocitos presentes en los cuadros A, B, C, D y E. V = volumen de cada uno de los cuadros (0.25·0.25·0.1)mm3 D = dilución (100, 200 o 400) Volumen corpuscular medio Una vez conocido el valor de hematocrito y el numero de eritrocitos por mm3 de sangre, se puede calcular el volumen corpuscular medio de los eritrocitos, que se expresa en fentolitros (fL=10-15L). De hecho, se puede calcular el volumen corpuscular medio utilizando la siguiente fórmula: VCM Hct 10 eritrocitos(en millones) Valores normales en diferentes especies: 2 Especie Eritrocitos/mm3 Hematocrito VCM Équidos 6.8-12.9·106 32-53 37-58.5 Bóvidos 5-10·106 24-46 40-60 Ovinos 9-15·106 27-45 28-40 Caprinos 8-18·106 24-48 19.5-37 Suidos 5-8·106 32-50 50-68 Canidos 5.5-8.5·106 37-55 60-77 Felinos 5-10·106 24-45 39-55 Práctica de hematología Parte II – recuento de leucocitos y formula leucocitaria Objetivo: contar los leucocitos y el porcentaje de cada tipo de célula de la serie blanca. Material necesario: Sangre con anticoagulante (heparina) Pipetas automáticas graduables 100 μl y 1000 μl Solución de Turk Cámaras de Neubauer Portaobjetos Colorante y fijador Aceite de inmersión Microscopio Recuento de leucocitos Para realizar un recuento de correcto del número de leucocitos, no es suficiente diluir la sangre, sino que también provocar la lisis de los hematíes para recontar con más comodidad. Hay que coger un volumen exacto de sangre con anticoagulante y diluir la sangre 10 o 20 veces con liquido de Turk (ácido acético glacial (3ml), solución de violeta genciana 1% (2.5ml) y agua destilada (300ml)). Esta solución tiene una osmolaridad muy baja, que provoca la lisis de los hematíes. Los leucocitos son más resistentes a la lisis osmótica, porque tienen núcleos. Quedan teñidos por el colorante de violeta de genciana. Una vez la sangre es diluida, se agita durante 5 minutos y se coge una muestra con la punta de una pipeta. Esta muestra se deposita sobre una cámara de Neubauer, así que el líquido penetre entre la cámara y el cubreobjetos por capilaridad. Se pone la cámara al microscopio y se recuentan los leucocitos en los cuadros W, X, Y y Z. Para calcular el número de leucocitos en un ml, hay que tener en cuenta el número medio de células presentes en los cuatro cuadros, el volumen del cuadro y la dilución hecha: leucocitos M D mm3 V M = media de eritrocitos presentes en los cuadros W, X, Y y Z. V = volumen de cada uno de los cuadros (1·1·0.1)mm3 D = dilución (10 o 20) 3 Práctica de hematología Formula leucocitaria Para encontrar la formula leucocitaria hay realizar una frotis de sangre. El frotis se hace depositando una gota de sangre sobre un portaobjetos limpio y desengrasado. La gota se extiende sobre el porta con la ayuda de otro porta. La sangre debe no llegar al límite y se ha de extender con una velocidad constante. Es importante poner solo una pequeña cantidad de sangre para obtener un frotis suficiente fino. La tinción del frotis se realiza una vez se ha secado la sangre. La tinción se hace con colorantes ácidos (como la eosina) y básicos (como el azul de metileno), a la practica, la tinción se hace de manera rápida con la ayuda do colorantes combinados comerciales. La observación del frotis sanguíneo se hace con el objetivo de inmersión. Para calcular la formula leucocitaria hay que contar 100 células (como mínimo) y dar los porcentaje de cada célula. Los valores del recuento y de la formula leucocitaria dan en conjunto una cifra del numero de cada tipo de célula de la serie blanca. Cada uno de los parámetros en particular proporciona solo información incompleta. Valores normales en diferentes especies: (Expresados en numero de células en mm3 de sangre) Especie PMNN PMNB PMNE Linfocitos Monócitos Total Équidos 2,260-8,580 0-290 0-1,000 1,500-7,700 0-1,000 5,400-14,300 Bóvidos 600-4,000 0-200 0-2,400 2,500-7,500 25-840 4,000-12,000 Ovinos 700-6,000 0-300 0-1,000 2,000-9,000 0-750 4,000-12,000 Caprinos 1,200-7,200 0-120 50-650 2,000-9,000 0-550 4,000-13,000 Suidos 4,500-9,000 80-120 300-1,000 8,200-13,200 750-1,300 15,000-22,000 Canidos 3,000-11,500 0-100 100-1,250 1,000-4,800 150-350 6,000-17,000 Felinos 2,500-12,500 0-100 0-1,500 1,500-7,000 0-850 5,500-19,500 4 Electrocardiograma – seminario ECG En el corazón se encuentran dos tipos de fibras: células marcapasos y fibras musculares. Las fibras marcapasos se despolarizan automáticamente y posteriormente lo hace la fibra muscular. Las diferentes células tienen diferentes gráficas representativas de despolarización: Tejido marcapasos Nodo sinusal o senoatrial. Es el tejido marcapasos principal. Va más rápido que los demás, por tanto es él que manda. Se despolariza cíclicamente. Nodo atrio-ventricular Fascículos de His Red de Purkinje Del corazón al ECG El ECG es un registro que representa la diferencia de potencial en función del tiempo. Hay diferentes ondas, que representan la despolarización y repolarización de diferentes partes del corazón. Onda P. Despolarización de las aurículas. Onda Q. Despolarización del septo interventricular. Onda R. Despolarización de los ventrículos. Onda S. Despolarización de la base del corazón. Onda T. Repolarización ventricular. 5 Electrocardiograma – seminario El ECG presenta diferentes derivaciones, que se dividen en monopolares y bipolares. Las derivaciones monopolares miden la diferencia de potencial entre un punto y un punto medio entre dos puntos (aVR, aVL y aVF), mientras que las derivaciones bipolares miden la diferencia de potencial entre dos puntos en el animal (I, II y III). También existen derivaciones precordiales; aunque estas no son utilizadas en clínica veterinaria, son muy importantes en medicina humana. Convenciones El dipolo siempre se define como la diferencia de potencial entre los dos electrodos. Si su sentido es de negativo hacia positivo, el registro marca una subida. Si su sentido es de positivo a negativo, el registro marca una bajada. 6 Electrocardiograma – seminario Derivaciones bipolares Onda P Derivación I – dipolo positivo. Derivación II – dipolo positivo. Derivación III – dipolo positivo. Onda Q Derivación I – dipolo negativa. Onda T – repolarización ventricular La repolarización ventricular depende del animal. Los ventrículos pueden repolarizarse en dos formas distintas: De pericardio a endocardio: Derivación II – dipolo positivo o negativo, depende del animal. o Derivación I – positiva. Derivación III – dipolo positivo. o Derivación III – positiva. o Derivación II – positiva. De endocardio a pericardio Onda R Derivación I – dipolo positivo. o Derivación I – negativa Derivación II – dipolo positivo. o Derivación II – negativa Derivación III – dipolo positivo. o Derivación III – negativa Onda S Derivación I – cero. Derivación II – dipolo negativo. Derivación III – dipolo negativo. Derivaciones monopolares Onda R aVR – negativa aVL – positiva o negativa aVF – positiva Protocolo del ECG Frecuencia cardíaca. Medida a tiempo de 10 a 15 segundos. o Frecuencia cardíaca disminuida – bradicardia. o Frecuencia cardíaca elevada – taquicardia. Ritmo o Ritmo sinusal normal – intervalo similar entre latidos. o Arritmia de origen sinusal (fisiológica) – coordinación entre sistema circulatorio y sistema respiratorio (respiración y frecuencia cardíaca). 7 Electrocardiograma – seminario Medidas del registro de ECG. Siempre so cogen de la derivación II. o Onda P. Altura: 0.4 mV Intervalo: 0.04 s o Intervalo PR: 0.06-0.13 s o Complejo QRS Intervalo: 0.06 s Altura: 3 mV o Onda T: altura inferior a 0.25 del complejo QRS. o Intervalo QT: 0.15-0.25 s Calculo del eje cardíaco (ángulo normal: 40-100º). o Sistema de Einthoven. Se resta la porción negativa de la porción positiva de la onda R-S en las derivaciones I y II. El valor corresponde a un vector. Los dos vectores se suman (suma vectorial) que dan el vector de la dirección de la despolarización. A partir de este vector se puede calcular el ángulo entre el vector y la linea I. o Sistema hexoaxial de Bailey. Se busca la derivación más isoeléctrica. La derivación perpendicular da el ángulo, que se lee en el extremo positivo o negativo en función de si el registro original es positivo o negativo. 8 Electrocardiograma – práctica Práctica de ECG Protocolo de diagnóstico 1. Frecuencia cardíaca. 14/10s --> 84/min. Normal. 2. Ritmo. Normal 3. Onda P. 0.04 mV. Normal. 4. Intervalo PR. 0.1s. Normal. 5. Complejo QRS. o Duración: 0.06 s. Normal. o Diferencia de potencial: 3.2 mV. Normal. 6. Complejo ST. o Duración: 0.08 s o Diferencia de potencial: 0.2 mV 7. Onda T. 0.04 mV. Normal. 8. Intervalo QT. 0.22 s. Normal. 9. Ángulo. o Sistema de Einthoven: 60º. o Sistema hexoaxial de Bailey: 60º. 9 Electrocardiograma – práctica Derivación I Derivación II Derivación III 10 Electrocardiograma – práctica Derivación aVR Derivación aVL Derivación aVF 11 Electrocardiograma – práctica Diferentes representaciones de diferencia de potencial 5mm/s 10mm/s 50mm/s 12 Electrocardiograma – práctica de ordenador ECG – práctica de ordenador Caso 1 Un perro cazador de 12 años llega a la consulta porque el propietario detecta que su agilidad está disminuida desde hace un par de meses. De todas maneras, el perro está acostumbrado a cazar tres o cuatro veces a la semana. El animal no presenta ninguna sintomatología extraña y una analítica correcta. El veterinario decide hacer un electrocardiograma y obtiene el siguiente registro con la derivación 1. Preguntas 1. ¿Qué parámetros del electrocardiograma podéis medir? Frecuencia cardiaca y ritmo. No se puede medir las ondas, que se miden con la derivación II. 2. ¿son valores normales? El perro tiene bradicardia – frecuencia de 60/min. 3. ¿Qué es el volumen sistólico y el volumen por minuto? Volumen sistólico es el volumen bombeado por latido, y el volumen por minuto es el volumen bombeado durante un minuto (igual a frecuencia por volumen sistólico). 4. Pensando que según una radiografía se observa que el tamaño del corazón está ligeramente aumentado, ¿Qué será la ventaja fisiológica de un registro de este tipo en relación al volumen por minuto? Caso 2 Una perra ha de ser intervenida quirúrgicamente por una castración. Antes de empezar la anestesia el veterinario realiza un electrocardiograma sin encontrar ninguna alteración significativa. Preguntas 1. ¿Qué observáis en el registro electrocardíaco? El ritmo y la frecuencia cardiaca. Ritmo sinusal normal, y frecuencia cardiaca de 240/min. – taquicardia. 2. ¿Qué es el efecto del sistema parasimpático (vías colinérgicas) y simpáticas (vías adrenérgicas) sobre la frecuencia cardiaca? Parasimpático – disminuye la frecuencia cardiaca. Simpático – aumenta la frecuencia cardiaca. 3. ¿Cómo se explica las modificaciones del electrocardiograma en función del protocolo anestésico propuesto? La atropina inhibe los receptores muscarínicos del parasimpático – inhibición vagal, que produce la taquicardia (manda el simpático). 13 Electrocardiograma – práctica de ordenador 4. ¿Qué sería el efecto de la administración de propranolol vía endovenosa? El propranolol es inhibe los receptores beta de los receptores adrenérgicos. En el corazón solo hay receptores beta, por tanto la administración de propranolol produce disminución de frecuencia cardiaca – bradicardia. Caso 3 A – 60º. Eje cardíaco normal. B – 120º. Desviación del eje cardíaco a la derecha. Posible hipertrofia del ventrículo derecho. C – 30. Desviación del eje cardíaco a la izquierda. Puede ser debido a una hipertrofia del ventrículo izquierdo. Si se debe a una estenosis aórtica, también presentará edema pulmonar – acumulación de agua en los pulmones, y taquicardia, debida a al intercambio gaseoso reducido. D – -120º. E – 90º o 60º. Depende de la derivación que se escoge – la I ( 90º) o la aVL ( 60º). Es probable que el eje esté entre ambos ángulos. Caso 4 En los registros siguientes se muestran tres grados de afectación de una misma enfermedad. En el primero, el animal no muestra ninguna alteración aparente, únicamente tiene un poco de disnea cuando pasea mucho tiempo. El segundo animal se cansa bastante cuando hace ejercicio. El tercero presenta disnea y está tumbado en el suelo. Preguntas 1. Calcular la frecuencia cardiaca por cada uno de los casos (onda P y complejos QRS). ¿Los resultados coinciden? Frecuencia cardiaca: Ondas P A – 90/min. A – 90/min. B – 40/min. B – 110/min. C – 20/min. C – 100/min. No coinciden los resultados (más ondas P que latidos). 2. ¿Se puede hablar de frecuencia cardíaca? No se puede hablar de frecuencia cardíaca, ya que no coinciden las ondas P con el complejo QRS. 3. Según tu conocimiento sobre actividad marcapasos y conducción del impulso ¿Dónde piensas que se produce la alteración? ¿Qué alteración puede tener el primer animal? 14 Electrocardiograma – práctica de ordenador La enfermedad se debe a bloqueo atrio-ventricular. Hay diferentes grados, que se deben al hecho que hay animales en los cuales sólo algunos de los impulsos no pasan. En los casos leves, llegan a pasar todos, pero llegan lentamente – se ve incrementado el intervalo PR (fuera de los valores de referencia 0.06-0.13s) 4. ¿Por qué en estos animales aparecen síntomas respiratorios? La disminución de la frecuencia cardíaca implica la aparición de síntomas respiratorios – el animal respira más rápidamente para compensar la frecuencia cardíaca reducida y el volumen bombeado reducido. Resumen El nodo atrio-ventricular sirve para conducir el impulso y retardarlo, para que prevenir una contracción simultanea del ventrículo y aurícula. Se produce porque las células del nodo son muy poco acopladas por GAP junctions, por tanto la despolarización se produce lentamente. En el perro, retarda el impulso eléctrico 0.06-0.13 en el perro. Si el retraso es fuera de este intervalo, hay una patología. Si es menor que 0.06, la aurícula y el ventrículo contraerán casi simultáneamente; si es mayor que 0.13, la conducción será demasiado lenta y se producirá un bloqueo atrio-ventricular de grado I. Conducción más lenta a nivel de ventrículo se produce por bloque ventricular – a nivel de fascículos de His y fibras de Purkinje. Se observa en forma de complejo QRS mas ancho – más que 0.05s. Extrasístole – latido que avanza y aparece fuera del ritmo normal. Puede ser producido fisiológicamente. Cuando no hay onda P antes del latido cardíaco, la despolarización empieza por el nodo atrio-ventricular, y de allí sigue bajando por los ventrículos. No hay despolarización de las aurículas, y no se produce contracción auricular. El ventrículo por tanto se contrae bombeando solo los 70% del volumen – solo bombea la sangre que pasa al ventrículo por gravedad. En un latido normal, la repolarización de la aurícula se representa en el complejo QRSE. Normalmente cuando no hay onda P, se ve un complejo QRS más grande, porque no se resta de él el potencial la repolarización de las aurículas. Cuando el impulso se origina en el septo ventricular (fascículos de His o fibras de Purkinje, por debajo del nodo atrio-ventricular) se observa una onda R negativa. Fibrilación ventricular – se pierde la frecuencia cardíaca. Se pierde la automatización del latido cardiaco. No hay frecuencia cardíaca ni volumen cardiaco. La despolarización se produce sin ninguna regulación – aparece en el ventrículo, aurícula, septo etc. Sin sincronización. Una onda P de mayor voltaje significa dipolo mas grande – el músculo genera más electricidad – la aurícula está hipertrofiada. Puede ser producido por estenosis de la válvula atrio-ventricular. Intervalos – conducción a través del corazón. 15 Electrocardiograma – práctica de ordenador Voltajes – masa muscular. Elevado voltaje significa hipertrofia. QRS pequeño significa atrofia del ventrículo. Para saber qué ventrículo está atrofiado, hay que calcular el eje cardíaco. Receptores adrenérgicos en el corazón En el experimento se estudian los efectos de los diferentes neurotransmisores adrenérgicos (adrenalina, noradrenalina y isoprenalina) y la naturaleza de los receptores cardíacos – se quiere determinar si son del tipo β o del tipo α. La aorta está unida a un transformador de presión que mide la fuerza que aplica el corazón al bombear la sangre. También se mide la frecuencia cardíaca. Los dos parámetros se miden constantemente y se representan en una gráfica. El corazón está sumergido en una solución con 95% oxigeno y 5% de dióxido de carbono. Al aplicar 2 μg de noradrenalina se observa un efecto cronotrópico positivo (aumenta la frecuencia) y un efecto inotrópico positivo (aumenta la fuerza). Para demostrar que este efecto es dependiente de la dosis, se aplica una dosis de 5 μg de noradrenalina, y entonces se observa efecto cronotrópico y inotrópico más fuertes, arritmia y extrasístoles. Al aplicar 2 μg de adrenalina se observa un efecto cronotrópico y inotrópico similar que el efecto de la noradrenalina. Al aplicar 0.5 μg de isoprenalina (se requiere una dosis menor) se observa el efecto cronotrópico y inotrópico, pero la duración de este efecto es más larga y disminuye más lentamente. Para determinar la naturaleza de los receptores adrenérgicos cardíacos, se aplicará un bloqueador de receptores y luego la dosis aplicada previamente de cada uno de los neurotransmisores. Se aplica 2 μg de fentolamina (bloquea receptores del tipo α), y al cabo de 1 minuto (para que el bloqueador tenga suficiente tiempo para unirse a los receptores) se aplica una dosis de 2 μg de noradrenalina. No se observa ningún cambio – el efecto cronotrópico y inotrópico es igual que antes. Por tanto, podemos decir que los receptores del corazón no son del tipo α sino del tipo β. Se vuelve a aplicar una dosis de 2 μg de fentolamina, y después de 1 minuto aplicar la dosis de adrenalina (2 μg), e igual que antes, no se observa ningún cambio en la respuesta inotrópica y cronotrópica. Al igual que en las dos ultimas aplicaciones, al aplicar una dosis de 0.5 μg isoprenalina después de la aplicación de fentolamina, no se observa ningún cambio. Para estudiar la actividad de los receptores cardíacos β, se aplica una dosis de 2 μg de propranolol (bloquea receptores β), y al cabo de un minuto, la dosis de noradrenalina. Se observa un cambio minúsculo en la respuesta 16 Electrocardiograma – práctica de ordenador inotrópica y cronotrópica. Éste se debe a que la dosis no es suficiente para provocar el bloqueo de los receptores β. Cuando se aplica una dosis de 10 μg de propranolol y la dosis de adrenalina, se observa que la respuesta inotrópica y cronotrópica está muy disminuida – los receptores están bloqueados, y no responden a los neurotransmisores. El mismo efecto se observa cuando se aplica propranolol antes de aplicar una dosis de adrenalina o de isoprenalina. La conclusión de este experimento: los receptores adrenérgicos del corazón son del tipo β. Al aplicar 5 μg de acetilcolina, se observa una respuesta cronotrópica e inotrópica negativa – baja la frecuencia cardíaca y disminuye la fuerza de bombeo del corazón. Los β-bloqueadores son utilizados en medicina para disminuir la frecuencia cardíaca y presión arterial, en personas que tienen elevada presión arterial o cuando se quiere inhibir los efectos de la adrenalina y noradrenalina (por ejemplo, después de un infarto cardíaco, cuando el aumento de frecuencia puede dañar el corazón). 17 Anemias Clasificación de las anemias Según la morfología: Tamaño (VCM): o Aumentado – anemia macrocítica o Disminuido – anemia microcítica Color o Disminuido – anemia hipocrómica o Igual – anemia normocrómica Según la respuesta de la medula ósea: Porcentaje de reticulocitos o Aumentado – anemia regenerativa o Igual o disminuido – anemia no regenerativa Según la patofisiología: Hemorragia – perdida de eritrocitos y hemoglobina (perdida de hierro). Hemólisis – hemólisis de hematíes debida a síntesis de anticuerpos que atacan los glóbulos rojos propios del individuo. Característica de enfermedades autoinmunes. Hipoplásica – anemias no regenerativas debidas a insuficiencia de la función hematopoyética de la médula ósea. Carenciales – falta de sustancias en la dieta. Secundarias a otras patologías. Anemia macrocítica Anemia microcítica 18 Recuento de eritrocitos Disminuido Disminuido Hematocrito Igual o disminuido Disminuido VCM Aumentado Disminuido Hemoglobina Igual Disminuida CCMH Igual Disminuido % reticulocitos Igual o disminuido Igual o aumentado Anemias Síntomas de anemia: Hipoxia Mucosas pálidas Taquicardia Hiperventilación Síntomas secundarios debidos de la causa de la anemia. Ejemplo: carencia de B12 produce síntomas nerviosos. Puede ayudar en la localización de la causa de la anemia. La hipoxia estimula el riñón (que es uno de los órganos mas sensibles a la hipoxia) a sintetizar y segregar eritropoyetina, que favorece la formación de nueves eritrocitos y su maduración y liberación a la sangre. Un aumento de la cantidad de eritrocitos en la sangre recompensa la hipoxia. Los eritrocitos derivan de una célula madres, que sufre una secuencia de divisiones celulares acompañadas de una serie de cambios morfológicos y fisiológicos: disminución del tamaño, perdida de RNA, incremento de la cantidad de hemoglobina y perdida de orgánulos. El núcleo es el ultimo en perderse. La célula, para madurarse, ha de llegar a cierta concentración crítica de hemoglobina. Una vez ha llegado a esta concentración, pierde el núcleo transformándose en eritrocito maduro, y se libera al corriente sanguíneo. Un aumento de la eritropoyetina puede ser debido a varias causas: Causas fisiológicas – aumento de los requisitos de oxigeno o Policitemia fisiológica. Presente en individuos que viven a gran altura, donde la presión del oxigeno es baja. o Procesos de elevado ritmo de crecimiento: gestación y crecimiento. Causas patológicas: o Anemias o Enfermedades pulmonares y enfermedades circulatorias (sobre todo insuficiencia cardíaca crónica). Inducen policitemia secundaria para recompensar la falta de oxigeno. 19 Anemias Anemia macrocítica Anemia microcítica Alteración de la formación de la célula Alteración de la formación de hemoglobina Alteración de la división Síntesis de grupo hemo Síntesis de DNA Hierro, B2 Vitamina B12, acido fólico La célula roja se forma correctamente pero no puede tiene problemas en la síntesis del grupo hemo de la hemoglobina (debido a carencia de hierro y a raramente de B6). Por el déficit de hierro la célula no llega la concentración crítica de hemoglobina, y se queda en la medula. Mientras tanto, sufre otra división celular, lo que produce una célula más pequeña. La división es lenta y no llega al número suficiente de veces para dar eritrocitos de tamaño normal. La membrana también es modificada, y es mas frágil --> vida media mas corta. La concentración de hemoglobina es normal, porque la célula tiene suficiente tiempo para acumular hemoglobina. Anemias carenciales Carencia de vitamina B12 La vitamina B12 se liga a un factor intrínseco sintetizado y segregado por la mucosa gástrica. El complejo se absorbe a nivel de la mucosa del ileon termina, y se transporta a la sangre unido a un transportador sérico. Causas de deficiencias de vitamina B12: Deficiencia en la dieta Mala absorción o No se produce el factor intrínseco en cantidad adecuada – lesión de la mucosa gástrica. o Factor intrínseco inhibido – enfermedades autoinmunes. o Lesiones al ileon terminal – se daña la mucosa que absorbe la vitamina. o Competición por la B12 – obstrucción intestinal que favorece la proliferación de la flora intestinal, que compite con el individuo por la vitamina. 20 Anemias Aumento de los requisitos: durante aumento de división celular – crecimiento rápido y gestación. Carencia de hierro El hierro se almacena en tres tejidos: Hígado (30%) en forma de ferritina y hemosiderrina (deposito insoluble que puede dañar el parénquima hepático hasta causas cirrosis hepática en casos extremos). Músculo (3%) en forma de mioglobina. Médula ósea (65%) en forma de hemoglobina. El hierro llega al estomago en forma de Fe3+, y se transforma en el ión Fe2+ por el pH acido. El ión Fe2+ se absorbe por la mucosa y puede ir a un de dos destinos, en función de la reserva de hierro disponible del organismo. Reservas llenas. El ión se liga a la apoferritina y se acumula en la célula epitelial de la mucosa intestinal. Cuando se produce la descamación se pierde y se excreta con las heces. Reservas no llenas – necesidad de hierro. El hierro queda en forma de ión Fe2+ y se liga a la apotransferrina. Viaja unido a ella vía sanguínea hasta llegar a la médula ósea, músculo o hígado. Causas de deficiencias de hierro: Deficiencia de la dieta (sobre todo en los alimentados de leche, que es pobre en hierro). Hemorragias crónicas (sobre todo a nivel intestinal). Perdida constante de hierro. Alteraciones del metabolismo de hierro. Requisitos elevados – gestación y crecimiento rápido. 21 Cronobiología Cronobiología Muchos parámetros se mantienen constantes por mecanismos de feedback manteniendo la homeostasis del medio interno (concentración de oxigeno regulada por el sistema respiratorio, concentración de urea y otros metabolitos por el sistema urinario etc.). Sin embargo, algunos de estos parámetros varían en función del tiempo, creando un ritmo biológico. En función del periodo, hay ritmos circadiarios (alrededor de las 24 horas – sueno y vigila), ritmos ultradiarios (inferiores a 24 horas – ritmo cardíaco o respiratorio) y ritmos infradiarios (superiores a 24 horas – estro estacional). Periodo – el tiempo que dura una oscilación. Mesor corresponde a la media ajustada de la onda. Amplitud – la diferencia entre el pico y el mesor. Acrofase – el punto en el cual se da el pico máximo. Batifase – el punto en el cual se da el pico mínimo. Hora Temperatura Frecuencia cardíaca 8.00 36.0 60 9.00 36.2 60 10.00 36.2 64 13.00 36 88 15.00 36.8 80 16.00 36.7 78 17.00 36.1 78 18.00 35.8 84 18.30 36.1 80 19.30 36.9 84 20.00 36.3 84 21.00 36.1 90 00.00 35.6 64 00.30 36.0 70 22 Cronobiología Mesor – 36.16 Amplitud – 0.49 Acrofase – 15.57 Caso Un veterinario trabaja en un laboratorio de recerca de una industria farmacéutica y le encargan un estudio sobre los posibles efectos de la molécula TF-333 sobre la temperatura corporal. Aquel compuesto tiene una serie de efectos beneficiosos en el tratamiento de enfermedades respiratorias en el perro, pero se sospecha que puede modificar la temperatura corporal. Por resolver este problema el veterinario realiza el protocolo siguiente: 1. se utilizan 6 perros de la raza “Beagle”. 2. se mide la temperatura rectal de los animales a primera hora de la mañana antes de comenzar el experimento (situación 1). 3. se administra vía oral el fármaco a una concentración de 1 mg/Kg. peso vivo (volumen total de 2 ml). 4. se mide la temperatura rectal de los animales por la tarde antes de irse (situación 2) Resultados: Perro 1 Perro 2 Perro 3 Perro 4 Perro 5 Perro 6 Situación 1 38.1 37.6 38.2 37.7 38.1 38.2 Situación 2 38.7 39 38.4 38.2 38.4 39 23 Cronobiología Conclusiones del experimento. El veterinario redacta el siguiente informe: “existen diferencias significativas entre los datos de la situación 1 y la situación 2 y por tanto este resultado demuestra efectivamente que el TF333 aumenta la temperatura corporal. Preguntas 1. Calcular la media y la desviación Standard de los datos de las dos situaciones antes y después de la administración de TF-333. Descriptive Statistics: antes; después Variable antes después N 6 6 Mean 37.983 38.617 Median 38.100 38.550 TrMean 37.983 38.617 Variable antes después Minimum 37.600 38.200 Maximum 38.200 39.000 Q1 37.675 38.350 Q3 38.200 39.000 StDev 0.264 0.337 SE Mean 0.108 0.138 2. Utiliza un test estadístico para valorar si los datos son realmente diferentes de forma significativa Paired T-Test and CI: antes; después Paired T for antes - después antes después Difference N 6 6 6 Mean 37.983 38.617 -0.633 StDev 0.264 0.337 0.432 SE Mean 0.108 0.138 0.176 95% CI for mean difference: (-1.087; -0.180) T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = -3.59 P-Value = 0.016 3. Representa una gráfica (orientativa) de los niveles plasmáticos de un fármaco en función del tiempo según la vía de administración propuesta. ¿cómo sería la gráfica en una vía endovenosa? 24 Cronobiología 4. Con vuestro conocimiento sobre los ritmos biológicos haz una crítica del protocolo propuesto y de las conclusiones. Los datos y la conclusión son probablemente equivocados porque la diferencia de temperatura sigue un ritmo circadiario, y la diferencia de temperatura entre las dos horas en que se mide la temperatura probablemente se deben a esta ritmicidad. 5. Propone un protocolo alternativo teniendo en cuenta la vía de administración (oral y endovenosa) y el ritmo biológico. Si el fármaco se administra vía oral, hay que tener en cuenta la ritmicidad de la temperatura, y por tanto aplicar el fármaco siempre a la misma hora del día, y medir la temperatura a la misma hora del día. Si la administración es vía endovenosa, se puede medir la temperatura antes de la administración del fármaco y después, mientras sea dentro de un intervalo de poco tiempo (digamos menos de 30 minutos) ya que los cambios no son tan evidentes, porque los cambios son cíclicos, pero de duración larga – un ciclo cada 24 horas. Si aumentamos el número de animales estudiados, aumenta la fiabilidad del experimento; por el otro lado, bajar el número de animales estudiados baja los gastos y es más ético. Protocolo: 1. Consultar el libro ‘farmacopea europea’ en el apartado de tests de pirógenos (agentes que aumenta la temperatura) inyectables. Se utilizan conejos para los tests de pirógenos, porque son los mas sensible a cambios de temperatura (se le sube la temperatura mas fácilmente) – el conejo es el reactivo biológico mas adecuado para este tipo de experimento. 2. Aplicar el fármaco vía endovenosa a tres conejos y se mide la temperatura antes y después de la aplicación. Se suma la diferencia de temperatura. Si la suma es inferior a 1.15, el fármaco no es pirógeno. Si la suma es superior a 2.65, el fármaco es pirógeno. Si la suma es entre 1.15 y 2.56, hay que repetir el experimento con 6 animales. El número de animales va aumentando poco a poco (si la suma está en el margen dudoso) manteniendo la fiabilidad del experimento y la ética utilizando el número mínimo de animales. Numero de animales No pirógeno Dudoso Pirógeno 3 animales < 1.15 1.15-2.65 > 2.65 6 animales < 2.80 2.80-4.30 > 4.30 9 animales < 4.55 4.55-5.95 > 5.95 25 Termorregulación – seminario I Termorregulación El gasto energético se define como la suma del trabajo energético, la energía almacenada (en forma de ácidos grasos, por ejemplo) y el calor disipado. La tasa metabólica se define como la cantidad de energía liberada por una unidad de tiempo. La eficiencia se define como el trabajo ejecutado por el gasto total de energía. En una contracción isotónica, la eficiencia es alrededor de los 50%. En una contracción isométrica, la eficiencia es 0%. Tasa metabólica y su determinación La determinación de la tasa metabólica es muy importante. Hay varios métodos para determinar la tasa metabólica. En la determinación de la tasa metabólica por calorimetría, se mide el calor disipado por el individuo en reposo y ayuno. El coste de mantenerse en reposo y ayuno se define como metabolismo o tasa metabólica básica. En animales, no se utiliza el término metabolismo o tasa metabólica basal ya que es imposible mantener el animal quieto. Se utiliza el término metabolismo estándar, que se define que el animal hace lo que le da la gana y su metabolismo es proporcional. Se estudia el metabolismo estándar utilizando cámaras metabólicas, que están completamente aisladas, y equipadas de sensores de oxigeno y calor. El nivel de metabolismo es proporcional a la cantidad de calor disipado y la cantidad de oxigeno consumido. Determinados compuestos orgánicos requieren para su metabolización más oxigeno que otros. Por tanto, es importante reconocer el coeficiente respiratorio del compuesto, que se define como el coeficiente entre el volumen de CO2 exhalado y el volumen de oxigeno inhalado. Por ejemplo, la glucosa tiene un coeficiente respiratorio de 1, mientras que el triglicérido tripalmitina tiene coeficiente respiratorio de 0.703. Este método de estudio puede servir para reconocer la fuente de energía utilizada por ciertos tejidos, midiendo las presiones de oxigeno y dióxido de carbono tanto en las arterias y las venas, deduciendo el coeficiente respiratorio. Por ejemplo, el cerebro tiene coeficiente respiratorio de 0.98, lo que significa que el cerebro consume casi exclusivamente glucosa. Eso implica un problema en los diabéticos, que carecen la insulina. La insulina es la hormona que favorece la entrada de glucosa a los tejidos, y en su ausencia, la glucosa sanguínea no puede penetrar en las neuronas del cerebro. Los alimentos tienen diferentes contenidos de energía (en calorías) los lípidos tienen más que el doble de calorías que los hidratos de carbono. La degradación de proteínas a urea (mayoría de los mamíferos terrestres) produce energía en cantidad parecida a los hidratos de carbono, pero su coefi- 26 Termorregulación – seminario I ciente respiratorio es inferior, ya que la desaminación de los aminoácidos es un proceso costoso en cuanto a energía. Determinación de la tasa metabólica Una cámara metabólica es un espacio aislado y termostatado. Un tubo pasa agua dentro de la cámara. Se conoce la temperatura del agua antes de entrar en la cámara. Se mide la temperatura del agua al salir de la cámara. Conociendo la cantidad de agua que ha pasado por la cámara, se puede calcular la cantidad de calor disipado por el animal dentro de la cámara. La cámara también se dispone de un mecanismo que estima el coeficiente respiratorio. Además, se estudian la orina y las heces, para estimar la degradación de los compuestos nitrogenados. Determinación del oxigeno utilizado Estima la velocidad en que el organismo utiliza el oxigeno. Un pendiente más grande significa tasa metabólica superior. El mecanismo convierte los cambios de volumen de gases en una grafica. El mecanismo consta de una cámara que contiene oxigeno, y un filtro que absorbe dióxido de carbono, válvulas unidireccionales y detector de presión. Al inspirar, disminuye el volumen de oxigeno dentro de la cámara. Al aspirar, el gas atraviesa el filtro y se elimina el dióxido de carbono. El volumen dentro de la cámara de oxigeno es inferior que en la primera aspiración, por tanto se forma un pendiente en la grafica. Comparación de tasa metabólica Para comparara tasas metabólicas, hay que eliminar la influencia del peso – expresar la tasa metabólica en Kcal/tiempo/kg. La tasa metabólica también se puede expresar en Kcal/tiempo/m2, que relaciona la tasa metabólica con la superficie de contacto del individuo con el exterior. Al estudiar la tasa metabólica de diferentes especies se observa lo siguiente. La musaraña ( )חדףtiene la tasa metabólica 105 mayor que la tasa metabólica de un elefante, es decir, un gramo de musaraña metaboliza 105 veces más que un gramo de elefante. El elefante tiene piel gruesa que aísla bien; la musaraña es tan pequeña que pierde calor todo el tiempo, ya que su piel es finísima y tiene poco pelaje. Para mantenerse viva, ha de comer constantemente – llega a comer unas veces su peso corporal al día. La musaraña es el mamífero más pequeño compatible con la vida. Si fuera más pequeña, no podría comer lo suficiente para mantener su calor corporal. Coste metabólico 27 Termorregulación – seminario I El coste metabólico puede ser cuantificado (lo que hacen los deportistas profesionales), midiendo la cantidad de oxigeno consumida. También se puede determinar a la vez el nivel del ácido láctico, para saber que tipo de metabolismo lleva a cabo. Caminando, al pasar cierta velocidad (5-6km/h), se dispara la tasa metabólica. A esta velocidad, se queman más calorías caminando que corriendo. Factores que modifican la tasa metabólica Ejercicio. Aumenta la tasa metabólica. Edad. Con la edad disminuye la tasa metabólica. Sexo. La tasa metabólica es mayor en los machos que en las hembras. Masa corporal. Masa corporal superior implica tasa metabólica inferior. Temperatura ambiental. Temperatura ambiental baja implica tasa metabólica superior, y viceversa. Estados emocionales. Modifican el tono muscular y aumentan la tasa metabólica. Gestación. Fase de crecimiento. Aumenta muchísimo la tasa metabólica. Niveles de T3 y T4 (hormonas tiroideas). Regulan el metabolismo. En los hipertiroideos se observa tasa metabólica incrementada, mientras que en los hipotiroideos se observa tasa metabólica disminuida. Niveles de adrenalina circulante. Cuanto mayor sea la concentración sanguínea de adrenalina, mayor es la tasa metabólica. La adrenalina aumenta la actividad general, y la movilización de lípidos y glicógeno. La vida no es posible por encima de los 50º, ya que las enzimas desnaturalizan. Las adaptaciones se pueden hacer frente a las circunstancias extremas. Comparación homeotermos-poiquilotermos La termorregulación es un fenómeno existente en los homeotermos – las aves y los mamíferos. Consta de la compensación térmica. Los homeotermos mantienen su temperatura corporal constante, mientras que la temperatura corporal de los poiquilotermos varía en función de la temperatura ambiental. La tasa metabólica de los homeotermos baja cuando aumenta la temperatura ambiental, mientras que en los poiquilotermos es al revés – con el aumento de la temperatura ambiental, aumenta la tasa metabólica. Poiquilotermos 28 Termorregulación – seminario II Los poiquilotermos no regulan su temperatura corporal. Si la temperatura ambiental aumenta, la temperatura corporal aumenta proporcionalmente, junto con la tasa metabólica. Estos animales tienen la temperatura parecida a la temperatura ambiental. Los animales poiquilotermos pueden controla la temperatura corporal por su comportamiento. Homeotermos Endotermia primitiva. Aumenta la tasa metabólica e incrementa la cantidad de calor producida, pero el calor se pierde. Homeotermia primitiva. Fabrican un aislamiento para poder conservar el calor. Homeotermia. Control de la temperatura corporal. Heterotermia. Animales invernantes que cambian totalmente su metabolismo. También lo hacen algunos por la falta de oxigeno. Mecanismos de intercambio de calor Radiación. Los cuerpos emiten radiaciones y pierden calor aumentando la temperatura del ambiente. Es un mecanismo bidireccional – si el organismo tiene temperatura inferior que la temperatura ambiental, gana calor por radiación. Conducción. Contacto directo entre un cuerpo caliente y un cuerpo frío. Convección. Cambios posturales que modifican las perdidas de calor. Evaporación. Si uno se moja, el agua se va evaporando y así se enfría. Control de la pérdida de calor A. Mecanismo no evaporativo Cambios en la velocidad, volumen, temperatura y distribución del aporte sanguíneo cutáneo Vasoconstricción = reducir las pérdidas de calor Vasodilatación = pérdidas de calor El calor de la sangre arterial es transmitido a la sangre venosa (porque van juntas). Así irriga con sangre fría, para perder menos calor. La temperatura de una extremidad (por ejemplo, la pierna) está a una diferencia de temperatura (gradiente) menor con el ambiente. Animales marinos Presentan un mecanismo de aislamiento corporal, pero en las aletas no pueden tener aislamiento porque tienen que ser planas. Hay un sistema de venas que envuelve la arteria. Así la sangre venosa se calienta antes de vol- 29 Termorregulación – seminario II ver al corazón, y la sangre arterial se enfría para tener menos gradiente frente el exterior. Grasa Sirve como cambio morfológico que permite variar la perdida de calor. Pelo Mecanismo de la muda. Homeotermo Se mantiene constante la temperatura del núcleo corporal. La temperatura rectal siempre es igual. Las manos y los pies se enfrían. Cuanto más lejos del núcleo corporal, más frío se pone. A temperaturas ambientales elevada, el núcleo corporal se va expandiendo, entonces todo el cuerpo está homeotérmico. Al consumir alcohol, se pierde más calor. Por eso, uno cree que se calienta. Disminuye la capacidad de supervivencia porque luego se muere por hipotermia. Cambios comportamentales Disminuir la superficie corporal implica disminución de la pérdida de calor; aumentar la superficie corporal implica lo contrario: aumentar la pérdida de calor. B. Mecanismo evaporativo Sudoración Mecanismo presente en humanos y équidos. Se pierden agua y sales. Jadeo Movimientos respiratorios de elevada frecuencia para que se acumule la saliva y así se enfría el animal. También implica pérdida de agua. Chapoteo Meterse dentro de agua, fango etc. Cuando se evapora del cuerpo, se enfría el animal. Es un proceso más lento, pero ahora agua y sal. 30 Termorregulación – seminario II Control de la producción de calor (termogénesis) Contracción muscular voluntaria. Mecanismo exotérmico. Contracción muscular involuntaria (escalo frío) con finalidad de producir calor. Termogénesis independiente de la actividad muscular (grasa parda). La temperatura corporal es controlada por un mecanismo de feedback negativo: Producción de calor Receptores térmicos craneales H ipotálamo Pérdida de calor Receptroes térmicos periféricos Sistema circu latorio Zon a de neutr alidad térm ica X Y T Z Y – temperatura crítica inferior. Z – temperatura crítica superior. X – consumo de oxigeno correspondiente. T – temperatura corporal del animal. A temperaturas bajas la termorregulación implica aumento del metabolismo para contrarrestar la pérdida de calor; en la zona de neutralidad térmica la termorregulación no implica gasto energético, ya que se hace mediante vasoconstricción y vasodilatación (poco gasto energético); por encima 31 Termorregulación – seminario III de la temperatura crítica superior, la termorregulación implica mecanismos evaporativos, que gastan energía. Conductancia térmica dH c TC TA dt dH intercambio de calor por unidad de tiempo. dt C = conductancia térmica. TC= temperatura corporal. TA = temperatura ambiental. La conductancia térmica se define como la cantidad de calor intercambiado por grado centígrado de diferencia entre la temperatura ambiental y la temperatura corporal. En animal en equilibrio térmico: pérdida de calor C TC TA tasa metabólica C TM TC TA Modificación del calor perdido en la zona de neutralidad térmica Para aumentar la pérdida de calor, aumenta la irrigación sanguínea tisular; para disminuir la pérdida de calor, se produce lo contrario - disminuye la irrigación tisular. La modificación en los dos casos es dependiente del calibre del vaso. Cuando la termorregulación mediante la modificación del calibre vascular llega a su límite (vasodilatación o vasoconstricción al máximo), se ponen en marcha los mecanismos activos de termorregulación (sudor, tembleo). Relación entre factores del balance calórico y su significación Factores que producen calor Ejercicio físico Escalofrío Tensión muscular imperceptible. Aumento químico de la tasa metabólica Acción dinámica especifica de los alimentos Estados patológicos 32 Termorregulación – seminario III Factores que aumentan la pérdida de calor Sudoración Jadeo Baja temperatura ambiental Aumento de circulación cutánea Aumento de conductancia térmica cutánea Aumento de la pérdida insensible de agua Aumento de superficie de radiación Aumento del movimiento Factores que disminuyen la pérdida de calor Cambios de la distribución del flujo sanguíneo Disminución de la conductancia tisular Cambio calórico a contracorriente Adaptación a ambientes extremos El hábitat ártico se caracteriza por invierno largo con poca luz, que no permite el crecimiento y desarrollo de plantas. Eso implica un problema a los animales que se alimentan de las plantas, y para los animales que se alimentan de los herbívoros. Los animales se adaptan a este tipo de hábitat mediante la hibernación o la migración. El desierto es un hábitat que se caracteriza por temperaturas extremas (calor durante el día, frío durante la noche) y cantidades pequeñas de agua. Adaptación al desierto Camello El camello presenta varios mecanismos de adaptación al clima desértico: El camello no termorregula – no suda, por tanto no pierde agua. Sin embargo, su cerebro se irriga de sangre a temperatura de 37º constantemente, para asegurar su funcionamiento adecuado. La sangre se enfría antes de llegar al cerebro pasando por la rete mirabile (red admirable). El camello puede perder cantidades impresionantes de agua tisular (no sanguínea – el volumen sanguíneo se mantiene constante). Al llegar a agua disponible, puede recuperar el volumen de agua tisular en pocos minutos – sus hematíes no se rompen aun cuando el plasma se hace muy hipotónico (al beber mucho agua). El camello tiene grandes reservas de grasa en su giba. Al metabolizar los ácidos grasos, obtiene agua metabólica. Rete mirabile 33 Termorregulación – seminario III La rete mirabile funciona con un mecanismo de circulación contracorriente. Las venas que forman el plexo venoso vienen de las fosas nasales con sangre fría. Las venas enfrían la sangre en las arterias que se dirigen hacia el cerebro (intercambio de calor a contracorriente). En los conejos y elefantes la pérdida de calor se hace por las orejas, que tienen superficie de contacto muy grande. La pérdida de calor se regula por la constricción/dilatación de las arteriolas. Rata canguro No sale nunca durante el día. Vive de semillas de elevado contenido lipídico. Vive en una madriguera profunda, que es más húmeda. Tiene cambios bruscos en el metabolismo. En el pico de calor su tasa metabólica es mínima – casi no respira (para no perder agua por la respiración); cuando la temperatura ambiental baja, aumenta su tasa metabólica y sale de su madriguera para buscar comida. Modificación del riñón que permite concentración al doble de la orina (asa de Henle más larga). Reabsorción de agua de las heces. Mecanismo de condensación de agua en las fosas nasales para disminuir la pérdida de agua por la respiración. Animales invernantes Los animales invernantes consumen elevada cantidad de alimento durante el verano y lo almacenan en forma de grasas. Durante el periodo de hibernación, disminuye la tasa metabólica, y la frecuencia cardíaca llega a 2-3 latidos por minuto. De vez en cuando el animal respira. La hibernación es interrumpida para excretar (la excreción no para durante la hibernación). El animal sale de su hibernación cuando su reloj biológico lo despierta o cuando se agotan sus reservas de grasa. Si se despierta antes del tiempo por reservas agotadas, su supervivencia depende de su capacidad de encontrar alimento. 34