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PAPEL DE LA CITOGENÉTICA
EN EL DIAGNÓSTICO
HEMATOLÓGICO
Ricardo Molina Gasset Marzo 2011
El análisis citogenético convencional consiste:
Estudio de las alteraciones cromosómicas en las metafases de las
células neoplásicas obtenidas tras:
•
El cultivo "in vitro", 37ºC durante 24/72h
•
Con o sin mitógenos , dependiendo de la muestra
•
Agente antimitótico (colchicina), detención división celular en metafase
•
Choque hipotónico, rotura membrana celular, fijación de núcleos
•
Teñidos fundamentalmente con bandas G (Tripsina-Giemsa)
•
Permite detectar en un único experimento:
+ alteraciones numéricas (monosomías, trisomías, etc.),
+ alteraciones estructurales (translocaciones, inversiones, deleciones,
etc.)
DIFERENTES TIPOS DE TINCIÓN DE CROMOSOMAS
CITOGENÉTICA MOLECULAR
HIBRIDACIÓN IN SITU (CISH, FISH)
Utilidad:
*Detectar y localizar secuencias específicas de ADN o ARN
Uso:
*Preparaciones cromosómicas
*Extensiones celulares
*Cortes de tejido
*Cortes ultrafinos (Microscopia electronica)
• Sondas centroméricas están formadas por una
secuencia repetitiva de ADN que hibrida con el ADN
de la región centromérica del cromosoma. Éstas
permiten detectar alteraciones cromosómicas
numéricas (monosomías o trisomías)
• Sondas de pintado cromosómico están formadas por
una batería de sondas que en su conjunto hibridan
con todo el cromosoma. Dichas sondas permiten
visualizar alteraciones citogenéticas numéricas y
estructurales.
• Las sondas de secuencia única o locus especifico
hibridan con el ADN de una región genómica
concreta, correspondiente a un gen o a una banda
cromosómica. Con ellas es posible detectar
alteraciones numéricas y estructurales
• Las técnicas M-FISH o SKY se basan en la cohibridación de 24
sondas de pintado cromosómico marcadas con fluorescencia
sobre metafases.
•
El resultado de la hibridación permite visualizar simultáneamente
cada par cromosómico de un color diferente.
• Determina de forma inequívoca cariotipos complejos y
cromosomas no identificables con las técnicas de bandeo.
•
Limitación en aquellas patologías con un índice proliferativo bajo
debido a la necesidad de obtener células en división.
• No permiten el reconocimiento de algunos puntos de rotura como
aquellos asociados con deleciones, inserciones, adiciones y
translocaciones de pequeño tamaño (inferiores a 10 Mb
Tecnica:
Marcar el ADN de cada cromosoma con uno o varios fluorocromos, de
manera que el espectro de emisión de cada cromosoma sea único y
diferenciable de los demás.
Esta técnica, por tanto, pinta a cada cromosoma de un color.
Con el "cocktail" de 24 sondas de pintado cromosómico obtenido tras el
marcaje, se hibrida sobre los cromosomas de las metafases del tumor,
el cromosoma anómalo aparecerá no uniforme, sino con los colores de los
cromosomas que intervienen en la translocación.
Por tanto, es una forma de realizar un cariotipo, pero teñido no con bandas
G sino con colores, de forma que podamos clasificar las alteraciones de
forma unívoca.
El cariotipo multicolor se ha mostrado muy útil en neoplasias hematológicas,
donde no es difícil obtener metafases tumorales.
• En los últimos años se ha descrito la técnica de
multibanding-FISH o “cross species color
banding (RxFISH), técnica similar a las de MFISH o SKY, que permite la generación de un
patrón de bandas de distintos colores para cada
par de cromosomas homologos. Su principal
ventaja es que permite detectar inversiones y
traslocaciones entre cromosomas homólogos,
sin embargo, su principal limitación es que un
mismo color puede estar en regiones de
distintos cromosomas y esto dificulta poder
conocer la región cromosómica que está
implicada.
• La hibridación genómica comparada (HGC), también llamada
CGH (del inglés, comparative genomic hybridization), es una
técnica citogenética molecular que permite detectar cambios
numéricos de secuencias de ADN (pérdidas, deleciones,
ganancias y amplificaciones) en un tejido de la muestra a estudiar
(tumor o sangre del paciente). Dicha técnica se basa en la
hibridación del ADN tumoral y de un ADN control marcados
con fluorocromos de distinto color sobre metafases normales.
La HGC tiene particular interés en el análisis de cambios numéricos
de secuencias de ADN en tumores sólidos y en neoplasias
hematológicas de índice proliferativo bajo ya que para la realización
de la técnica no es necesaria la obtención de metafases. Así
mismo, es de gran utilidad en aquellos casos que presentan
cariotipos complejos con numerosos cromosomas marcadores,
dobles diminutos (DM) y regiones de tinción homogénea (HSR).
Esta técnica únicamente detecta cambios presentes en una
proporción elevada de células tumorales (50%) y tiene una
resolución de 10 Mb. Por otra parte, no permite detectar
translocaciones, inversiones y otras alteraciones de tipo
equilibrado que no comportan ganancias o pérdidas de
material genético.
VENTAJAS E INCONVENIENTES
• Con el mismo fundamento que la HGC, recientemente ha surgido la
técnica denominada array-CGH o matrix CGH, que en lugar de
hibridar sobre portaobjetos con metafases, hibrida sobre matrices
con BACs u oligos que pueden cubrir todo el genóma,
permitiendo detectar cambios genéticos de 0.5 a 1 Mb. Parece
que el futuro de la citogenética pasa por la realización del cariotipo
y del chip para la realización de la CGH array. Esta metodología,
tiene una serie de limitaciones que deben tenerse en cuenta, entre
las que cabe destacar:
• - precio elevado del chip de CGH array (500-1000 euros/muestra)
• - análisis de un gran número de datos
• - existencia de polimorfismos en el genóma humano que se pueden
dar lugar a ganacias o pérdidas de regiones del genóma y que es
importante conocer su valor diagnóstico
• - no detecta cambios equilibrados
• - si la población alterada está poco representada (menos del 50%),
la CGH array no puede detectar los cambios cromosómicos.
• Es por ello, que el futuro, seguira contando con la realización del
cariotipo en en algunos casos deberá complentarse, según la
orientación diagnóstica, con los estudios de CGH array.
LINFOMA DEL
MANTO
• yeast artificial chromosomes (YACs)
• bacterial or P1-derived artificial
chromosomes (BACs/PACs)