Download enzimas de restricción

GENES, GENOMAS Y TÉCNICAS
DE INGENIERÍA GENÉTICA...
... CON UN TOQUE DE BIOINFORMÁTICA
CÓDIGO GENÉTICO
DNA
Doble
Hélice
Retrotranscripción
mRNA
5'ATG CTT CCT CGG TGC TAC TGT GAA TAA 3'
Hebra
codificadora
3'TAC GAA GGA GCC ACG ATG ACA CTT ATT 5'
Hebra no
codificadora
TRANSCRIPCIÓN
5'AUG CUU CCU CGG UGC UAC UGU GAA UAA 3'
TRADUCCIÓN
Proteína
(NH2)MET-LEU-PRO-ARG-CIS-TIR-CIS-GLU-FIN(COOH)
GENES
Un gen es la unidad básica de herencia de los seres
vivos.
Un gen es una secuencia lineal de nucleótidos en la
molécula de ADN (o ARN en el caso de algunos
virus), que contiene la información necesaria para la
síntesis de una macromolécula con función celular
específica.
Por ejemplo: Proteínas, ARNm, ARN ribosómico, ARN
de transferencia y ARN pequeños.
GEN PROCARIOTA
mRNA POLICISTRÓNICOS
GEN EUCARIOTA
GENOMAS
El genoma es todo el material genético contenido en
las células de un organismo en particular.
EUCARIOTAS
CROMOSOMA
MITOCONDRIAS
CLOROPLASTOS
GENOMA HUMANO 3200 MB
Organismo
Tamaño Genoma(pares de bases)
Fago λ
5×104
Escherichia coli
4×106
Levadura
2×107
Caenorhabditis elegans
8×107
Drosophila melanogaster 2×108
Humano
3×109
Amphibians
109–1011
Psilotum nudum
2.5 x 1011
C-value enigma ó C-value
paradox
El C-value enigma ó C-value paradox es un término
usado para describir la variación en los tamaños de
genomas nucleares entre las especies eucariotas. El
objeto de estudio del C-value enigma es la
observación de que el tamaño del genome no se
correlaciona con la complejidad del organismo.
EJERCICIO



Hacer un programa que a partir del archivo
MTtabaco.gbk que contiene el genoma
mitocondrial de tabaco extraer el gen que pida
el usuario con 1000nts upstream y 1000nts
downstream y guardarlo en formato fasta.
Especificaciones del formato Genbank.
http://www.ebi.ac.uk/embl/Documentation/FT_d
efinitions/feature_table.html
Especificaciones del formato Fasta.
http://www.bioperl.org/wiki/FASTA_sequence_fo
rmat
LOCUS
BA000042
430597 bp DNA circular PLN 02-MAY-2006
DEFINITION Nicotiana tabacum mitochondrial DNA, complete genome.
ACCESSION BA000042 AP006340 AP006341
VERSION BA000042.1 GI:56806513
KEYWORDS .
SOURCE
mitochondrion Nicotiana tabacum (common tobacco)
ORGANISM Nicotiana tabacum
Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta;
Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicotyledons;
asterids; lamiids; Solanales; Solanaceae; Nicotianoideae;
Nicotianeae; Nicotiana.
REFERENCE 1
AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y., Nagase,M., Makita,N., Yagura,S., Hirai,A.
and Sugiura,M.
TITLE The complete nucleotide sequence and multipartite organization of
the tobacco mitochondrial genome: comparative analysis of
mitochondrial genomes in higher plants
JOURNAL Mol. Genet. Genomics 272 (6), 603-615 (2005)
PUBMED 15583938
REFERENCE 2 (bases 1 to 430597)
AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y. and Nagase,M.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (04-APR-2003) Yasuo Sugiyama, Nagoya University, Center
for Gene Research; Chikusa-ku, Furo-cho, Nagoya, Aichi 464-8602,
Japan (E-mail:[email protected], Tel:81-52-789-5943,
Fax:81-52-789-4526)
FEATURES
Location/Qualifiers
/db_xref="GI:56806523"
/translation="MDLYSIRNQRISPQKREEFPLLSFCSARAWHSLLAERHTEKKKR
LPYLSNSSYSYSFLVVVPILVFFFLAFLGPSVFRTVRLATMNEYYVNRVSCSLSCALN
TKLGQRCEGL"
gene
complement(24579..25766)
/gene="atp6"
Formato Genbank
CDS
complement(24579..25766)
/gene="atp6"
/note="CDS is reported in Acc# X06595"
/codon_start=1
/product="ATP synthase F0 subunit 6"
/protein_id="BAD83425.1"
/db_xref="GI:56806524"
/translation="MFRRIFLFDEDSLNSSVTSYTNASQSTTTIMDYSLKSSDTQGSS
SGIFTDHPGLNPCSERIVELQYDIRLKLGALMPKESAQKVLEASEALHGESNNIAFLE
YLLEDLQQNGVGGEAYKDAVDLSKDLVSSPLEQFEIISLIPMKIGNLYFSFTNPSLFM
LLTLSLVLLLVYFVTKKGGGNSVPNAWQSLVELIYDFVLNPVNEQIGGLSGNVKQKFS
PRISVTFTFSLFCNPQGMIPYSFTVTSHFLITLGLSFSIFIGITIVGFQKNGLHFLSF
LLPAGVPLPLAPFLVLLELIPYCFRALSSGIRLFANMMAGHSSVKILSGFAWTMLCMN
DLLYFIGDLGPLFIVLALTGLELGVAISQAHVSTILICIYLNDAINLHQSASFFIIEQ
KRV"
gene
complement(31411..31743)
ORIGIN
1 attcacagtg ctcttcgcaa tctcgatcct cgcaatgctc tgcaacccga gggtgagcgc
61 cattgaagga ctggaagcaa gcttcacacc ttccacaacg gcaactacac cgtcgactcc
121 acaagaactc caagaacact cgttcttctc tcacacagca ctcctccctc cgatcttgtc
181 ccatctcggc ttccacgcgc gtgtcgcccc tatatgctgt caccgactag gctcggacgg
241 tggaggaagc tggtagcatt aggagaattt tcagcacttt tataacacag agtcagcgcg
301 aagaaaggca gatccatact agatcaacgg ttttcctttc tcttacgaga ttttcatttc
361 tagttagagg agcagaccac tctaacttac tttagaacaa tgagaaatgt aacactcacc
421 aactgaagaa cgaatgtgag ctcgggagga aatgtgcctc tccaactcgt actttgctac
481 aacgatcttt gtatgtacgg gtatcgataa tggaagagac tagatcaaat agggcaattc
541 gtaatgctct cttcctgtcc tagaataaga aagtagcttg tctgccgtac tggctgcttc
601 attgaatgtg tcgatctgca ttctatataa ggagttgatt tgcatccttg tctggcagtt
661 agctaagcga gaagctgtga tcgaggaagc cccgcccagt agtgcctcta ctctactagt
721 cctagtacta gatactagat agacaggccg gtcaccggtg gcataagatc cttctctgct
781 tgtctaactc aagccagata gcagcaatca ctcgaaatag tcatatgcgg aacacatgca
841 agtccagatt gaaagataag gaaggcaagt caaagcggaa agaaa
Formato Fasta
>gi|142864|gb|M10040.1|BACDNAE B.subtilis dnaE gene encoding DNA primase, complete cds
GTACGACGGAGTGTTATAAGATGGGAAATCGGATACCAGATGAAATTGTGGATCAGGTGCAAAAGTCGGC
AGATATCGTTGAAGTCATAGGTGATTATGTTCAATTAAAGAAGCAAGGCCGAAACTACTTTGGACTCTGT
CCTTTTCATGGAGAAAGCACACCTTCGTTTTCCGTATCGCCCGACAAACAGATTTTTCATTGCTTTGGCT
GCGGAGCGGGCGGCAATGTTTTCTCTTTTTTAAGGCAGATGGAAGGCTATTCTTTTGCCGAGTCGGTTTC
TCACCTTGCTGACAAATACCAAATTGATTTTCCAGATGATATAACAGTCCATTCCGGAGCCCGGCCAGAG
TCTTCTGGAGAACAAAAAATGGCTGAGGCACATGAGCTCCTGAAGAAATTTTACCATCATTTGTTAATAA
ATACAAAAGAAGGTCAAGAGGCACTGGATTATCTGCTTTCTAGGGGCTTTACGAAAGAGCTGATTAATGA
ATTTCAGATTGGCTATGCTCTTGATTCTTGGGACTTTATCACGAAATTCCTTGTAAAGAGGGGATTTAGT
GAGGCGCAAATGGAAAAAGCGGGTCTCCTGATCAGACGCGAAGACGGAAGCGGATATTTCGACCGCTTCA
GAAACCGTGTCATGTTTCCGATCCATGATCATCACGGGGCTGTTGTTGCTTTCTCAGGCAGGGCTCTTGG
TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE
Las técnicas más importantes:
- Clivado del ADN en sitios específicos por
enzimas de restricción.
- Hibridación de ácidos nucléicos. Southern blot,
Northern blot, hibridación in situ y Western blot.
- Clonado molecular del ADN. Vectores de
clonado.
- PCR, reacción en cadena de la polimerasa.
MANIPULACIÓN DEL ADN IN VITRO
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
- Permiten realizar cortes en sitios específicos en
el ADN, que permiten aislar y manipular genes
individuales.
- Son endonucleasas (cortan enlaces internos de
la molécula) de origen bacteriano.
- Reconocen secuencias específicas de ADN de
diferente longitud.
- Luego del reconocimiento realizan el corte.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
- Existen alrededor de 4000 enzimas de
restricción conocidas.
- 671 disponibles comercialmente.
- Hay bases de datos de enzimas de restricción y
sus sitios de reconocimiento y corte:
REBASE
http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html
RESTRICCIÓN EN 2 PASOS
from Bio import Restriction
from Bio import Seq
from Bio.Alphabet import IUPAC
an=Restriction.Analysis(Restriction.CommOnly, Seq.Seq\
(secuencia, IUPAC.unambiguous_dna))
an.print_as ("map")
Resultado (output):
7 TspEI Sse9I Tsp509I FokI
|
| 12 HpyCH4V CviRI
| |
| |
20 BstF5I BseGI
| |
|
ATGGGTAATTGCAACGGGGCATCCAAG
|||||||||||||||||||||||||||
TACCCATTAACGTTGCCCCGTAGGTTC
1
27
HIBRIDACIÓN DE ACIDOS
NUCLÉICOS
- El apareamiento de las bases (A-T y C-G) para formar una doble
hélice se llama hibridación, dado que puede utilizarse para formar
ADN híbrido compuesto por cadenas de diferentes orígenes.
- La hibridación permite la formación de complejos DNA:DNA y
ADN:ARN usando la complementariedad de bases (A-T, C-G).
- El fenómeno de hibridación ocurre bajo condiciones especiales en
solución (pH, concentración de sales, T0, etc).
5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3'
5'- A T CT C C C G A T T G C A T -3'
5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3'
5'- A T C T C C C G A T T G C A T -3'
TÉCNICAS BÁSICAS
DNA
Cortado por enzimas de
restricción
RNA
PROTEÍNA
ELECTROFORESIS
TRANSFERENCIA
REVELADO
Tranferencia de proteínas, RNA o DNA separados por
electroforesis a membranas sintéticas.
Hibridación del DNA o RNA con
secuencias marcadas con radiactivo
(“sondas”).
Revelado por radioautografía.
Detección de Proteínas
con anticuerpos marcados.
RESULTADOS
Southern blot
Northern blot
Western blot
HIBRIDACIÓN IN SITU
CLONADO MOLECULAR
Introducción en una célula húesped de una mólecula de ADN capaz de replicarse en
paralelo con el genoma del húesped en estado episomal, es decir sin integrarse al
genoma.
VECTORES DE CLONADO
BACTERIÓFAGO O “FAGO”
PLÁSMIDOS
PCR
TM temperature melting
DNApol de bacterias
termofilas
Diseño de primers
15-30 nts
MUESTRAS
USOS DE LA PCR
Huella genética
Test de Paternidad
Diagnóstico de enfermedades
hereditarias
Clonación de genes
Mutagénesis
Análisis de ADN fósil
Genotipado de mutaciones específicas
Identificación de especies
SECUENCIACION
A partir de 1970 fue posible determinar secuencia
nucleotídica de fragmentos de DNA
Métodos clásicos: químico y enzimático
Método químico de Maxam y Gilbert
Pero en la actualidad los métodos de
secuenciación utilizados se basan en el Método
enzimático de Sanger
Ventajas
- Automatización completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la
presencia de un técnico que cargue las muestras.
- Rapidez en el análisis de cada muestra: dado el pequeño diámetro de los capilares,
por lo que pueden leerse del orden de 450 nucleótidos en el plazo de 1 hora.
Otros métodos de secuenciación
automática:
- Empleando microarray
- Pirosecuenciación
Lectura de unas 100 millones de bases por corrida del instrumento (7.5 horas).
Referencias
Molecular Biology of The Cell.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books
http://www.gbiosciences.com/Image/BE307.jpg
http://www.biologyreference.com/images/biol_02_img0140.jpg
www.biopython.org
http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/Labs/Genetics/PCR/PCR_Protocol.htm
http://members.aol.com/BearFlag45/Biology1A/LectureNotes/LNPics/Recomb/pcr.gif
Introducción a la Oncología Molecular. Goméz y Alonso. Universidad Nacional de
Quilmes, 1998.
http://www.genomesonline.org/gold_statistics.htm
Lic. Virginia González