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Dr. Antonio Barbadilla
Tema 10: Clonación y
secuenciación del DNA
Clonación y secuenciación del DNA
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Objetivos tema 10:
Clonación y secuenciación del DNA
Deberán quedar bien claros los siguientes puntos:
•¿Cómo se manipula el DNA?
•Las endonucleasas (enzimas) de restricción
• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación,
organismo huésped, selección de vectores
•Vectores eucarióticos
•Organismos transgénicos
•Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
•Mapas de restricción
•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
•La secuenciación del DNA
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Manipulación del DNA
Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse
en un conjunto heterogéneo de secuencias.
Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un
fragmento de DNA específico
Esta tecnología se denomina:
Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o
ingeniería genética
Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica
Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:
El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La
extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias
de bases complementarias constituye un poderoso instrumento
para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de
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DNA complementarios a uno dado
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Herramienta básica
Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias
que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el
esqueleto azúcar-fosfato.
•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de
reconocimiento (al azar)
•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son
repeticiones invertidas o palíndromes
5´-GGATCC- 3´
3´-CCTAGG- 5´
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EcoRI: E. Coli
BamHI: Bacillus amyloliquefaciens
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Dos tipos de cortes:
•Corte plano:
extremos romos
•Corte escalonado:
extremos pegajosos o
cohesivos
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Herramienta básica
Las enzimas de restricción tipo II:
Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en
secuencias específicas, produciendo por tanto una población
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heterogénea de fragmentos de extremos idénticos
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Clonación del
DNA
•DNA foráneo (secuencia que
se desea clonar)
•Vector de clonación
(vehículo)
Vector
híbrido
•Organismo huésped (E. Coli)
•Selección de vectores
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C
Vectores
l
híbridos
o
(quimera)
n
Fragmentos de
a
distintas
c
procedencias que
se unen in vitro
i
tras cortarse con
ó
la misma enzima
n
de restricción.
d Ligasa sella zona
híbrida
e
l Vectores de
clonación
D •Plásmido (1 sitio
N de corte) 2-15 kb
A •Fago 
(Lambda)
•Cósmido
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C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
D
N
A
Vectores de
clonación
Fago 
•Fago  (2 sitios de
corte) < 24 kb
•Cromosomas
artificiales P1
(derivados del
bacteriófago P1,
pueden aceptar
insertos de 80 y 100
kb
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C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
Vectores de clonación
•Cósmido: extremos cos  + DNA plásmido (origen replicación)
+ DNA foráneo + cápisde. ~50 kb
•BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido
F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas
Cósmido
D
N
A
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C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
Huésped: E. coli
Inserción del vector híbrido en el huésped:
•Plásmido: transformación (solución diluida
cloruro de calcio) y replicación autónoma
•Fago  (transducción, inserción en DNA
huésped)
•Cósmido (transducción como fago y
replicación como plásmido)
D
N
A
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Selección de vectores híbridos
C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
•Plásmido: resistencia a antibióticos
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N
A
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•Fago  : Inserción en E. coli (sólo se puede
empaquetar el DNA de  si contiene el
inserto foráneo)
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C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
D
N
A
Obtención de la secuencia que se
clona
•Un gen
•Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene
intrones): uso de la transcriptasa inversa que
hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina
humana recombinante en bacterias)
•Síntesis automatizada de DNA in vitro: a
partir de la secuencia aminoacídica se puede
hacer DNA con la ayuda del código (no región
promotora ni controladora de la expresión)
~100bp
•Fragmentos del genoma por digestión con enzimas
de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun)
•Se obtiene genoteca, juego completo
fragmentos clonados del genoma del organismo
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Vectores eucarióticos
Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas
•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de
levaduras (YACs):
Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de
levadura + (telómero levadura)
Puede incorporar más de 500 kb de DNA
Resistencia a antibiótico
(p.e., ampr)
Origen de replicación
del DNA de levadura
(ARS)
Región centromérica
(CEN)
Origen de replicación
bacteriano (ori)
Linealización (con
endonucleasas) y adición
de extremos teloméricos
Telómero
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ampr
ori
CEN ARS
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Telómero
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Transfección:
Introducción de DNA foráneo en eucariotas
Organismo transgénico: un eucariota con DNA foráneo
Métodos transfección
•Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con
fosfato cálcico (poco eficiente)
•Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma
(ratones transgénicos 15% eficiencia)
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Métodos transfección
•Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA
foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima
adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección
viral)
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Métodos transfección
•Electroporación: se usa corriente eléctrica para
introducir DNA
•Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de
membrana artificial)
•Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de
proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA
•Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en plantas) y
elementos móviles (Elemento P en Drosophila)
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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogéneos de fragmentos
Población de fragmentos
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Separación fragmentos
Reptación
de los
fragmentos
a través del
gel de
agarosa
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DNA teñido
con bromuro
de etidio
emite
fluorescencia
con luz UV
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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogéneos de fragmentos
Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes
fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda
•Transferencia en Southern (Southern blotting)
•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con
RNA
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Transferencia en
Southern
(esquema resumen)
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Mapas de restricción
mediante
enzimas de restricción
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Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP)
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La reacción
en cadena
de la
polimerasa
(PCR)
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•Secuenciación
Usos de la PCR
DNA fósil (evolución,
•arqueología,
historia) DNA
traza
Fósiles
Mamut lanudo (40000
años)
Abraham Lincoln
(síndrome de Marfan,
afecta tejido
conectivo, fribrilina)
Hombre Neandertal > Hablaba como
nosotros? Color
cabello?
•Huellas dactilares del DNA
(DNA forense)
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Secuenciación de DNA
La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA
permite un conocimiento más completo de la estructura y
función de un gen.
•La base molecular de mutaciones específicas
en un gen pueden investigarse
•Las secuencias del DNA han revelado regiones
reguladoras comunes a todos los genes
•La comparación de secuencias de diferentes
especies provee estimas de las tasas de
evolución molecular
•Secuenciación de genomas: estructura del
genoma
Disoxi
Métodos:
Secuenciación manual (inicial)
Químico (Maxam y Gilbert 1977)
Didesoxi (Sanger 1977)
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Secuenciación automatizada (1986,…)
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Didesoxi29
Secuenciación del DNA
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Secuenciación automatizada del DNA
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Animaciones de técnicas de la genética
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html
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