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Clonación y secuenciación
del DNA
Clonación y secuenciación del DNA
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Clonación y secuenciación del DNA
Deberán quedar bien claros los siguientes puntos:
•¿Cómo se manipula el DNA?
•Las endonucleasas (enzimas) de restricción
•Mapas de restricción
•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación,
organismo huésped, selección de vectores
•Métodos de detección a partir de una sonda de DNA:
transferencia en Southern, sondeo de un gen clonado
•Vectores eucarióticos
•Organismos transgénicos
•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
•La secuenciación del DNA
Clonación y secuenciación del DNA
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Manipulación del DNA
Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse
en un conjunto heterogéneo de secuencias.
Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un
fragmento de DNA específico
La nueva tecnología se denomina:
Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o
ingeniería genética
Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica
Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:
El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La
extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias
de bases complementarias constituye un poderoso instrumento
para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de
DNA complementarios a uno dado
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Herramienta básica
Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias
que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el
esqueleto azúcar-fosfato.
•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de
reconocimiento (al azar)
•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son
repeticiones invertidas o palíndromes
5´-GGATCC- 3´
3´-CCTAGG- 5´
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EcoRI: E. Coli
BamHI: Bacillus amyloliquefaciens
Dos tipos de cortes:
•Corte plano:
extremos romos
•Corte escalonado:
extremos pegajosos o
cohesivos
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Herramienta básica
Las enzimas de restricción tipo II:
Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en
secuencias específicas, produciendo por tanto una población
heterogénea de fragmentos de extremos idénticos
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Población de fragmentos
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Separación fragmentos
Reptación
de los
fragmentos
a través del
gel de
agarosa
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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogéneos de fragmentos
Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes
fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda
•Transferencia en Southern (Southern blotting)
•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con
RNA
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Transferencia en
Southern
(esquema resumen)
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Uso de la enzimas de restricción para la
construcción de mapas de restricción
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Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP)
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Usos de los Polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP)
•Análisis de ligamiento que permite cartografiar y
“cazar” genes asociados a enfermedades o rasgos
fenotípicos (proyecto SNPs)
•Medicina forense: análisis de las huellas dactilares
genéticas (DNA fingerprinting)
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Clonación del
DNA
•DNA foráneo (secuencia que
se desea clonar)
•Vector de clonación
(vehículo)
Vector
híbrido
•Organismo huésped (E. Coli)
•Selección de vectores
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15
C
Vectores
l
híbridos
o
(quimera)
n Fragmentos de
a distintas
c procedencias
i que se unen in
ó vitro tras
cortarse con la
n misma enzima
d de restricción
e
l Vectores de
clonación
D •Plásmido (1 sitio
N de corte) 2-15 kb
A •Fago 
(Lambda)
•Cósmido
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C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
Vectores de
clonación
Fago  (2 sitios de
corte) < 24 kb
D
N
A
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17
C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
Vectores de clonación
Cósmido: extremos cos  + DNA plásmido (origen
replicación) + DNA foráneo + cápisde.
~50 kb
D
N
A
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C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
D
N
A
Huésped: E. coli
Inserción del vector híbrido en el huésped:
•Plásmido: transformación (solución diluida
cloruro de calcio) y replicación autónoma
•Fago  (transducción, inserción en DNA
huésped)
•Cósmido (transducción como fago y
replicación como plásmido)
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C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
D
N
A
Selección de vectores híbridos
•Plásmido: resistencia a antibióticos
•Fago  : Inserción en E. coli (sólo se puede
empaquetar el DNA de  si contiene el
inserto foráneo)
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C
l
o
n
a
c
i
ó
n
d
e
l
D
N
A
Obtención de la secuencia que se
clona
•Un gen
•Aislamiento a partir del mRNA: uso de la
transcriptasa inversa que hace cDNA
•Síntesis automatizada de DNA in vitro: a
partir de la secuencia aminoacídica se puede
hacer DNA con la ayuda del código (no
región promotora ni controladora de la
expresión) ~100bp
•Fragmentos del genoma por digestión con
enzimas de restricción (perdigonada, Shotgun)
•Se obtiene genoteca, juego completo
fragmentos clonados del genoma del
organismo
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Transfección:
Introducción de DNA foráneo en eucariotas
Organismo transgénico: un eucariota con DNA foráneo
Métodos transfección
•Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con
fosfato cálcico (poco eficiente)
•Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma
(ratones transgénicos 15% eficiencia)
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Métodos transfección
•Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA
foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima
adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección
viral)
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Métodos transfección
•Electroporación: se usa corriente eléctrica para
introducir DNA
•Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de
membrana artificial)
•Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de
proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA
•Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens) y elementos
móviles
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Sistemas de detección del inserto
•Sistemas marcadores (reporter systems): indican la
expresión del gen insertado; p.e., enzima luciferasa de
luciérnagas en plantas (el vector es el plásmido Ti de A.
tumefaciens). Uso como marcador de la expresión de genes
específicos
Luciferina (substrato) + ATP -> luz
luciferasa
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Vectores eucarióticos
Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas
•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de
levaduras (YACs):
Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de
levadura + (telómero levadura)
Puede incorporar más de 500 kb de DNA
Resistencia a antibiótico
(p.e., ampr)
Origen de replicación
del DNA de levadura
(ARS)
Región centromérica
(CEN)
Origen de replicación
bacteriano (ori)
Linealización (con
endonucleasas) y adición
de extremos teloméricos
Telómero
ampr
ori
CEN ARS
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Telómero
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Vectores eucarióticos
•Vectores animales: SV40, virus vacuolado del simio, de
DNA, aunque partes cambiadas. Puede tranformar en
cancerosas células conejo o hámster.
•Vectores de plantas: plásmido Ti de bacteria del suelo
Agrobacterium tumefaciens, inductor de tumores cuando
se integra en DNA huésped (agallas en dicotiledóneas)
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La reacción
en cadena
de la
polimerasa
(PCR)
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Secuenciación de DNA
La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA
permite un conocimiento más completo dela estructura y
función de un gen.
•La base molecular de mutaciones específicas
en un gen pueden investigarse
•Las secuencias del DNA han revelado regiones
reguladoras comunes a todos los genes
•La comparación de secuencias de diferentes
especies provee estimas de las tasas de
evolución molecular
Métodos:
Secuenciación manual
Disoxi
Químico (Maxam y Gilbert 1977)
Didesoxi (Sanger 1977)
Secuenciación automatizada
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Didesoxi31
Secuenciación del DNA
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Secuenciación automatizada del DNA
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