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Aspectos virológicos y epidemiológicos de
los nuevos virus A(H1N1)v en España
INMACULADA CASAS
Laboratorio de Gripe y Virus Respiratorios
Área de Virología
CNM, ISCIII
Ecología de los virus de la Gripe A
- Múltiples hospedadores, Aves acuáticas son los reservorios naturales
-Transmisión desde aves a mamíferos
- Desarrollo de pandemias humanas por transmisión directa o indirecta desde aves
- Cerdo es susceptible de infección por virus aviares y porcinos
- Han existido reagrupamientos genéticos en cerdo
- Se conocía al cerdo como “vasija mezcladora” de virus
H1N1 estacional
2008-2009
Mecanismos de adaptación
de los virus
1. DERIVA GENÉTICA “drift”
necesidad de actualización
anual de las vacunas antigripales
A/NewCaledonia/20/99
A/Brisbane/59/2007
7 AA mutados
Mecanismos de adaptación
de los virus
2. REAGRUPAMIENTO DE GENES DE VIRUS DIFERENTES
Cambio antigenico mayor “shift”
GRIPE A: POTENCIAL PANDÉMICO
A/H5N1
Nuevo virus
CAMBIO ANTIGÉNICO MAYOR
“GENETIC SHIFT” o REAGRUPAMIENTO
'mixing vessels theory’
1918
“Gripe Española”
H1N1, 20-40 millon
PANDEMIAS HUMANAS
POR GRIPE A
1957
“Gripe Asiática”
H2N2, 1-2 millon
1977
“Gripe Rusa”
H1N1, No pandémica
1968
“Gripe HongKong”
H3N2, 700.000
Evolución antigénica de los virus
8 cambios del componente vacunal H1
2009-VIRUS EPIDÉMICOS
Maximum likelihood tree of
concatenated genome sequences
(54 whole genomes) of European
and classical swine H1N1 IAVs.
Classical sw H1N1
•genetically and antigenically stable viral lineage
•emerged by transfer of the human 1918 pandemic
virus to swine
•spread to swine in America and other parts of the
world, including Europe (1976).
European sw H1N1
•novel lineage of avian-like H1N1 swine IAV
•emerged in Europe in 1979 that essentially
replaced classical swine IAV
•is enzootic in swine-producing regions of Western
Europe, where it cocirculates with swine IAVs of
the H3N2 and H1N2 subtypes
Origin of A(H1N1)v
1998
Contemporary human
From 1918 A(H1N1)
Occasionally isolated from humans
Limited human-to-human trnsmission
PB2, PB1, PA
July-August 2008?
H1
NS, NP
Where?
N1
M
Host and lineage origins for the gene segments of the 2009 A(H1N1) virus
A1
8 Centros Colaboradores de la OMS
St. Jude Children's
Memphis
MRC
Londres
Institut Pasteur
Paris
CSL
Melbourne
NIID
Tokio
CDC
Atlanta
2008-2009
2000-2001
110 Centros Nacionales de Gripe:
Laboratorios de Virología
MADRID, VALLADOLID, BARCELONA
• Laboratorios de Virología de las CCAAs
• Epidemiología
Médicos centinelas:
recogida de muestras clínicas
CIRCUITO DE INFORMACIÓN ANTE DECLARACIÓN DE
UNA ALERTA POR GRIPE AVIAR EN HUMANOS
ALERTA
“CASO SOSPECHOSO HUMANO”
según los criterios de OMS
Red de Vigilancia de Gripe en las CCAAs
• Epidemiología
• Laboratorios de Virología
Laboratorio de Referencia OMS
Laboratorio de Virología
ISCIII
CNE
CNM
OMS y ECDC
MSPS
Procesamiento de muestras clínicas en el
laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (CNM, ISCIII)
Recepción y registro de muestras
Procesamiento e inactivación de las muestras
Salida de las muestras del laboratorio P3
y
reparto a los Servicios y Laboratorios del CNM
Diagnóstico
• Específico de Gripe aviar-Gripe estacional
• Diferencial con el resto de patógenos
RT-nested PCR genérica para detección de gripe A+B+C
Gen NP
New
SW
clas
Influenza ABC NP
uded in the extraction buffer to detect false negative
A particular emphasis was put on the suitability of
RT-nested
PCR genérica
para
subtipar
gripe A
thisA method
the detection
of on
both
Eurasian
particularforemphasis
was put
thethe
suitability
of
Gen
HA1
and
American
lineages
of H5of
viruses.
H5N1
this the
method
for the
detection
both the Eurasian
d/2-SP-33/2 004
n/Vietnam/HD1/2004
H5N1
and
the American
lineages
of H5 viruses.
Thirteen
different
reference
strains of subtypes
H5N1,
H5N2,different
H5N3, H5N8
and H5N9
used for
Thirteen
reference
strainswere
of subtypes
the
evaluation
of the PCR
method.
H5N1,
H5N2, H5N3,
H5N8
and H5N9 were used for
H5N1
n/d/2-SP-33/2
Thailand/Tak-01/2004
004 H5N1 H5N1
d/1-KAN-1/2004
H5N1
H5N1
/ Thailand/Bangkok/01
H5N1
nd/1-KAN-1/2004
H5N1
am/3046/2004
H5N1 H5N1
n/
Thailand/Tak-01/2004
H5N1 n H5N1
n/oi/03/2004
Thailand/Nakornsawa
/ Thailand/Nakornsawa n
en/Vietnam/HD1/2004
m/3062/2004
H5N1
n/
Thailand/Bangkok/01
H5N1
H5N1
H5N1
e peafo/Thailand/CU-11/04
H5N1
noi/03/2004
H5N1
m/1194/2004
m/3062/2004 H5N1
H5N1
a iland/3.1/2 004
Nam/3046/2004
am/1203/2004
ha
iland/3.1/2 004
H1
H1 by testing
theSensitivity
evaluation
theassay
PCR method.
ofofthe
was estimated
serial
tenfold ofdilutions
of was
H1, estimated
H3 and H5
Sensitivity
the assay
byspecific
testing
plasmids.
Detection
levels
serial tenfold
dilutions
ofwere
H1, 10
H3copies.
and H5 specific
H5N1
H5N1
ken/HK/213
3.1/2003 H5N1
te peafo/Thailand/CU-11/04
H5N1
Indonesia/4/2004H5N1
H5N1
m/1194/2004
n/Indonesia/2A/2003
am/1203/2004 H5N1H5N1
ken/Guangdong/174/0
H5N1
cken/HK/213
3.1/2003 4 H5N1
uck/Novosib
irsk/56/2005
/Indonesia/4/2004
H5N1H5N1
i cken/Crimea/1/2005 H5N1
H5N1
n/Indonesia/2A/2003
domestic
cat/Iraq/820/064 H5N1
cken/Guangdong/174/0
H5N1
hicken/Nigeria/641/2006
uck/Novosib irsk/56/2005 H5N1
H5N1
mallard/Bavaria/1/2006
hi cken/Crimea/1/2005
H5N1
H5N1
H5N1
H5N1
/ mallard/Ital
y/332/2006
domestic
cat/Iraq/820/06
/ chicken/Egypt/960N3-004/2006
chicken/Nigeria/641/2006
H5N1 H5N1
l in/9/2004
H5N1
mallard/Bavaria/1/2006
H5N1
Kong/2986.1/2000
H5N1H5N1
A/ mallard/Ital y/332/2006
HongKong/31.4/02
H5N1
A/
chicken/Egypt/960N3-004/2006
H5N1
H5N1
ng/AVL-1/20 01
H5N1
Kong/2986.1/2000
H5N1
n/01/2002 H5N1 H5N1
HongKong/31.4/02
Kong/437-10/99 H5N1
H5N1
ghai/35/2002
Kong/317.5/2001
H5N1
ang/AVL-1/20
01
H5N1
dong/2/03 H5N1
an/01/2002
H5N1
uangdong/1/96H5N1
H5N1
gKong/437-10/99
ghai/35/2002
Jil in/9/2004
481/97
H5N1 H5N1
Kong/317.5/2001
56/97 H5N1
ndong/2/03
H5N1
/ 97/98 H5N1
Guangdong/1/96
H5N1
Kong/p46/97
H5N1
481/97 H5N1
ngKong/120 3/97 H5N1
56/97
H5N1
486/97
g/
97/98 H5N1
H5N1
7
H5N2 H5N1
Kong/p46/97
8
H5N2 3/97 H5N1
ongKong/120
3486/97
0/97 H5N2
H5N1
/9 7 H5N3
97
H5N2
7 H5N9
98
H5N2
1 0/97
H5N1
33
H5N2
3/9 H5N2
7 H5N3
H5N3
H5N9
91H5N3
H5N1
77
H5N1
Eurasian
Eurasian
Primer
H1 sense
Primer
H1 antisense
H3 sense
H1 sense
H3 antisense
H1 antisense
H5
H3 sense
sense
H5 antisense
H3 antisense
H5 sense
PHA2
sense
H5 antisense
PHA2
antisense
CAA
CCC
ACT
CAA
CCC
CCC
TTC
ACT
TAT
CCC
TTC
WHH
TAT
AAI
PHA2 sense
WHH
Second
round PCR oligon
PHA2 antisense AAI
Second round PCR oligo
plasmids.
Detection
levelsofwere
10 copies.
Phylogenetic
analysis
the second
amplification
product
nucleotide
sequences
ofsecond
H5 viruses
(Kimura
Phylogenetic
analysis
of
the
amplification
N-terminal signal
Fusion peptide
2-parameter
MEGA
v3.1
)
wouldoffitH5
a particular
strain
product nucleotide sequences
viruses (Kimura
into
one of theMEGA
two previously
described
lineages.
RT+common
1st amplification
2-parameter
v3.1) would
fit
a particular
strain
round PCR as
into one of the two previously described
lineages.
H1
specimens.
As for the firs
MW 104 103 102 10 1
104 103 102 10 1
10 1
104 103 102 H3
4
3
2
MW 10 10 10 10 1
4
3
2
10 10 10 10 1
4
3
specimens.
of any of the
antisense)
As for thewere
fir
regions
evidence
antisense)
were
H5
HA Subtyping
substituted
round PCRprim
as
of
any of the
prim
substituted
2
10 10 10 10 1
1009bp
H1
1009 bp
847 bp
847bp
H3
591
bp
591bp
H5
1009 bp
H1
H3
H5
H1
350bp
IC H3
847 bp
bp
350
IC
591 bp H5
350 bp IC
very
regionsdifferent
evidence
hemagglutinin
very different t
date
of the virus.t
hemagglutinin
date
of the
virus
Direct
sequen
93
H1N1-A/Baleares/R3205/08
94
H1N1-A/Baleares/R3210/08
44
H1N1-A/Aragon/R3207/08
82
H1N1-A/PaisVasco/R3174/08
H1N1-A/Brisbane/59/2007
70
50
H1N1-A/Norway/1630/07
H1N1-A/Taiwan/603/05
98
57
H1N1-A/Hawaii/01/07
90
H1N1-A/Singapore/19/06
H1N1-A/Texas/02/07
Generic amplification of each 16 sybtypes HA
H1N1-A/New Caledonia/20/99
51
SM
H1N2-A/Yokohama/22/02
87
H1N2-A/England/2/02
56
H1N2-A/New York/217/02
69
100
Human
seasonal
52
105 104 103 102 10 1
H2O
H1N1-A/Norway/2159/06
H1N1-A/SolomonIslands/3/06
10079
94
RT-nested PCR genérica para detección de los 16
subtipos de HA Gen HA1
A/swine/Ontario/55383/04 H1N2
H1N1-A/USSR/90/77
56
H1N2-A/swine/England/690421/95
77
H1N9-A/NWS-G70c/70
H1
A/swine/Ontario/11112/04 H1N1
H1N2-A/duck/NC/91347/01
68
88
A/swine/NorthCarolina/36883/02
100
H1N2-A/swine/Minneso/55551/00
A/swine/Kansas/00246/04 H1N2
57
100
450-500 bp
H1N1-A/swine/Wisconsin/168/97
60
A/swine/Ohio/24366/07 H1N1
99
100
A/swine/Ohio/C62006/06 H1N1
Classical
sw lineage
A/Swine/Indiana/P12439/00 H1N2
49
A/Swine/Ohio/891/01 H1N2
54
44
A/Swine/Indiana/9K035/99 H1N2
35
A/swine/Minnesota/00194/03 H1N
H1N3-A/duck/New Zealand/160/76
H1N5-A/pintail duck/Alberta/63
62
100
99
H1N6-A/mallard duck/Alberta/42
H1N4-A/teal/Alberta/141/92
74
H1N1-A/swine/Netherlands/3/80
62
H1N1-A/swine/Netherlands/609/9
99
H1N1-A/swine/Belgium/1/98
85
H1N1-A/swine/Italy/110971/01
90
H1N1-A/swine/Spain/53207/04
82
24
H1N1-A/Switzerland/8808/02
46
H1N1-A/Aragon/R3218/08
35
27
96
100
68
H1N1-A/swine/Spain/50047/03
H2
100
100
100
38
100
99
83
H5
H6 H8
H12
H9
H11
H16
H13
H3
H4 H14
H10
H15
H7
100
100
100
75
100
99
100
100
99
96
100
100
100
99
100
96
Euroasiatic
sw lineage
Primer caso gripe AH1N1v en Europa
Almansa (Castilla La Mancha, Spain): GP1-GP2
Detección + secuenciación del fragmento amplificado + análisis de la seq
H1
H3
H5
Influenza ABC NP
Multiplex RESP
Inf A subtyping
Multiplex BRQ
Inicio del brote: Casos estudiados y confirmados
en el Centro Nacional de Gripe (CNM, ISCIII)
Semana
1
Fechas
Casos
Casos
Estudio Positivos
Otros virus Gripales
encontrados
17
26 Abril- 2-Mayo
196
80
10 FluB; 3 FluA H1N1; 1 FluA H3N2
18
3-Mayo- 9 Mayo
70
29
3 FluB; 1 AH1N1
19
10 Mayo- 16 Mayo
13
3
3 FluB
20
17 Mayo- 23 Mayo
47
26
1 FluB; 1 FluA H1N1; 1 FluA H3N2
21
24 Mayo- 30 Mayo
81
43
2 FluA H3N2
22
31 Mayo- 6 Junio
154
142
23
7 Junio- 13Junio
183
152
744
375
TOTAL
17 FluB; 5 FluAH1N1;
4 FluH3N2
Sistema de Vigilancia de la gripe en España
Temporada 2008-2009
250
B
A(H1N1)
A(H1)
A(H3N2)
A(H3)
A (no subtipado)
Nº detecciones
200
150
100
Semana 17
26 Abril- 2-Mayo
50
0
40
42
44
46
48
50
52
2
4
6
8
Semanas
10
12
14
16
18
20
Cronología de los casos según el comienzo
de los síntomas
17
18
19
20
21
22
23
250
100
200
80
150
60
100
40
50
20
0
% detecciones virales
positivas
Casos gripe /100.000 h.
Tasa de incidencia semanal de gripe
y porcentaje de detecciones virales positivas.
Temporada 2009-2010. Sistemas centinela
0
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52
Junio
Julio
Ago
Sept
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20
Oct Semanas
Porcentaje detecciones positivas
Tasa 2008-09 (a partir de semana 20/2009)
Umbral basal
Tasa 2008-2009
Tasa 2009-2010 (a partir de semana 40/2009)
Tasa de detección viral (%) y número de detecciones
virales centinela. Temporada 2009-2010
 Nula
 Esporádica
 Local
 Situación
Epidémica
26 Abril a 5 Junio
Pacientes positivos secuenciados: 157
97 M1+M2
39 NP
81 NS
63 HA1
/ 365
88 NA
Análisis de cada segmento secuenciado A(H1N1)v
A/Madrid/289/GP578/09 military
A/Madrid/378/GP781/09 military
A/Madrid/292/GP587/09 military
A/Madrid/294/GP593/09 military
A/Madrid/340/GP727/09 military
A/Madrid/296/GP599/09 military
A/Madrid/299/GP608/09 military
61 A/Madrid/385/GP796/09 military
A/Madrid/295/GP596/09 military
A/Madrid/293/GP590/09 military
A/Madrid/290/GP581/09 military
A/Madrid/390/GP805/09 military
42 A/Madrid/291/GP584/09 military
A/Madrid/360/GP752/09 military
A/Madrid/297/GP602/09 military
26
A/Madrid/298/GP605/09 military
A/Madrid/381/GP786/09 military
A/Madrid/391/GP807/09 military
A/Valencia/78/GP155/09
A/Murcia/43/GP78/09
46
18
62 A/Catalua/66/GP145/09
A/Catalua/9/GP25/09
A/Andalucia/126/GP242/09
54
A/CastillaLaMancha/129/GP248/09
A/CastillaLaMancha/1/GP12/09
5
A/Valencia/77/GP160/09
A/CastillaLaMancha/95/GP181/09
14 A/CastillaLaMancha/4/GP7/09
A/Valencia/82/GP158/09
29
A/Valencia/2/GP3/09
A/Andalucia/117/GP230/09
A/Valencia/264/GP494/09
6 A/Baleares/265/GP500/09
A/Catalua/69/GP148/09
61 A/Valencia/79/GP161/09
A/Andalucia/167/GP317/09
A/Madrid/37/GP65/09
A/Andalucia/119/GP234/09
55 A/Madrid/36/GP62/09
A/Andalucia/100/GP201/09
38
A/Andalucia/118/GP232/09
A/Andalucia/255/GP490/09
A/Madrid/111/GP216/09
A/Catalua/13/GP29/09
A/Catalua/19/GP35/09
A/Andalucia/130/GP251/09
35 A/Catalua/8/GP24/09
A/Catalua/121/GP237/09
A/Catalua/123/GP239/09
A/Catalua/15/GP31/09
A/Catalua/68/GP147/09
A/Valencia/73/GP154/09
A/Catalua/25/GP41/09
A/Valencia/72/GP153/09
100
A/Catalua/122/GP238/09
A/Catalua/120/GP236/09
A/Andalucia/71/GP151/09
A/Catalua/65/GP144/09
A/Catalua/63/GP142/09
A/Madrid/308/GP636/09
A/Madrid/288/GP575/09
86
A/Madrid/305/GP628/09
A/PaisVasco/5/GP19/09
62
Hemaglutinina H1
63 casos positivos
A(H1N1)v
L58I
P109S (todas)
T216A
D291E
I338V
A/Swine/Indiana/P12439/00 H1N2
100
A/swine/Kansas/00246/04 H1N2
57
A/swine/Minnesota/00194/03 H1N2
57
A/Swine/Ohio/891/01 H1N2
48
A/Swine/Indiana/9K035/99 H1N2
A/swine/Ohio/24366/07 H1N1
87
98
84
A/swine/Ohio/24366/07(H1N1)
A/swine/Ohio/C62006/06 H1N1
100
98
A/swine/Ohio/C62006/06(H1N1)
A/swine/NorthCarolina/36883/02 H1N1
94
A/swine/Korea/CAS08/2005(H1N1)
100
A/swine/Shanghai/3/2005(H1N1)
81
100
A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1)
A/swine/Shanghai/1/2005(H1N1)
39
A/swine/Maryland/23239/1991(H1N1)
51
A/swine/Memphis/1/1990(H1N1)
82
A/swine/California/T9001707/1991(H1N1)
Linaje de la gripe
clásica porcina
44
76
A/swine/Ratchaburi/NIAH550/2003(H1N1)
18
A/swine/Iowa/1/1986(H1N1)
57
A/swine/Kansas/3024/1987(H1N1)
20
A/swine/Ontario/11112/04 H1N1
99
 cambio de AA
A/California/07/2009
vs
Cepas españolas
A/swine/Tennessee/4/1978(H1N1)
Virus contienen sustituciones de aa
en lugares antigénicos concretos cuando
se compara con las cepas H1 estacionales
A/swine/Tennessee/2/1978(H1N1)
A/swine/Kyoto/3/1979(H1N1)
50
31
A/swine/Wisconsin/30954/1976(H1N1)
37
A/swine/Tennessee/19/1976(H1N1)
52
A/swine/Tennessee/107/1977(H1N1)
55
100
100
A/swine/Tennessee/109/1977(H1N1)
A/swine/Tennessee/9/1978(H1N1)
A/swine/Thailand/HF6/2005(H1N1)
100
100
A/swine/Chonburi/NIAH977/2004(H1N1)
A/swine/Tennessee/7/1978(H1N1)
100
69
A/swine/Ohio/K1207/06(H1N1)
A/swine/Ohio/K1130/06(H1N1)
93
A/swine/Ontario/55383/04 H1N2
100
A/Nyiregyhaza/01/2007(H1N1)
A/swine/Tianjin/01/04(H1N1)
100
A/swine/Henan/01/06(H1N1)
A/swine/France/WVL8/1992(H1N1)
52
A/swine/Hokkaido/2/1981(H1N1)
A/swine/England/WVL7/1992(H1N1)
96
100
A/swine/Spain/WVL6/1991(H1N1)
A/swine/Hungary/19774/2006(H1N1)
74
A/Aragon/Spain/RR3218/2008(H1N1)
85
81
0.05
A/swine/Haseluenne/IDT2617/03(H1N1)
Linaje
Eurasiático
Ensayos antigénicos IHA
Neuraminidasa N1
88 casos positivos
 No hay resistencias a oseltamivir
H274, E119, N294
Linaje
Eurasiático
 cambios de AA
A/California/07/2009
vs
Cepas españolas
S247N
N248D
V338I
S340F
No se han encontrado cambios genéticos
conocidos que puedan disminuir la sensibilidad a INA
Linaje de la gripe
clásica porcina
H1 humana
epidémica
Matrix
97 casos positivos
M gen, codifica 2 proteinas: M1 y M2
Determinante del tropismo a un determinado hospedador

Euroasian
sw lineage
M2 presenta S31N
Resistencia a adamantanos
presente en todas las secuencias
Marcador molecular del linaje Eurasiático
M
Human seasonal
Classical sw lineage
 cambios de AA
A/California/06/2009
vs
Cepas españolas
M1
T185M
S224N
V147M
Análisis de cada segmento secuenciado A(H1N1)v
NP T373I
CastillaLaMancha/GP369
Andalucia/GP381
Cataluña/GP144
Cataluña/GP145
Valencia/GP154
Andalucia/GP196
Andalucia/GP201
Cataluña/GP224
Andalucia/GP234
Cataluña/GP237
Cataluña/GP236
Andalucia/GP251
Valencia/GP280
Madrid/GP62
PaisVasco/GP20
Valencia/GP4
HA
S91P
Todas las cepas
españolas
Mutaciones pareadas
Garten et al. Science. 22 May 2009
NP
PA
1 T373I M582L not available at momment
NP
NA
2 V100I V106I
N248D
3
NP
NA
V100I V106I
N248D
HA1 PA
4 S91P S224P
V323I
HA1
S206T
NS1
I123V
NP
NA
V100I N248D
Madrid/GP523
Andalucia/GP527
Madrid/GP216
Valencia/GP272
Valencia/GP278
NP
NA
HA1 NS1
V100I N248D S206T I123V
Madrid/GP523
Análisis de cada segmento secuenciado A(H1N1)v
Marcadores moleculares de la adaptación al hospedador
• 1918 H1H1
• Virus H5N1 altamente patogénico
Dunham et al. J Virol June 2009
H1N1v
Avian
1918/H5N1
swClass swEurop Human
E
E
K
PB2
627
E
E
PB1-F2
12
Truncated
Compl
NS1
220
25
66
227
Truncated
N
E
-
Compl-PDZ
Q
E
E
N,K,R,W
E
R,G
R,W*,L
K*
E,G*
Q
E
R,del
NS2
26
49
52
70
E
V
M
G
E
V
M
S
E
V
M
G
K*
L*
T*
G*
E
V
M
G
M1
214
H
Q
Q
H*
Q
NP
284
384
A
R
A
R
A
R
V,I*
K*
A
R
* A/Aragon/R3218/Spain/08
Virus nH1N1 crecido en células MDCK
Servicio de Microscopia Electrónica, CNM, ISCIII