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Aspectos virológicos y epidemiológicos de los nuevos virus A(H1N1)v en España INMACULADA CASAS Laboratorio de Gripe y Virus Respiratorios Área de Virología CNM, ISCIII Ecología de los virus de la Gripe A - Múltiples hospedadores, Aves acuáticas son los reservorios naturales -Transmisión desde aves a mamíferos - Desarrollo de pandemias humanas por transmisión directa o indirecta desde aves - Cerdo es susceptible de infección por virus aviares y porcinos - Han existido reagrupamientos genéticos en cerdo - Se conocía al cerdo como “vasija mezcladora” de virus H1N1 estacional 2008-2009 Mecanismos de adaptación de los virus 1. DERIVA GENÉTICA “drift” necesidad de actualización anual de las vacunas antigripales A/NewCaledonia/20/99 A/Brisbane/59/2007 7 AA mutados Mecanismos de adaptación de los virus 2. REAGRUPAMIENTO DE GENES DE VIRUS DIFERENTES Cambio antigenico mayor “shift” GRIPE A: POTENCIAL PANDÉMICO A/H5N1 Nuevo virus CAMBIO ANTIGÉNICO MAYOR “GENETIC SHIFT” o REAGRUPAMIENTO 'mixing vessels theory’ 1918 “Gripe Española” H1N1, 20-40 millon PANDEMIAS HUMANAS POR GRIPE A 1957 “Gripe Asiática” H2N2, 1-2 millon 1977 “Gripe Rusa” H1N1, No pandémica 1968 “Gripe HongKong” H3N2, 700.000 Evolución antigénica de los virus 8 cambios del componente vacunal H1 2009-VIRUS EPIDÉMICOS Maximum likelihood tree of concatenated genome sequences (54 whole genomes) of European and classical swine H1N1 IAVs. Classical sw H1N1 •genetically and antigenically stable viral lineage •emerged by transfer of the human 1918 pandemic virus to swine •spread to swine in America and other parts of the world, including Europe (1976). European sw H1N1 •novel lineage of avian-like H1N1 swine IAV •emerged in Europe in 1979 that essentially replaced classical swine IAV •is enzootic in swine-producing regions of Western Europe, where it cocirculates with swine IAVs of the H3N2 and H1N2 subtypes Origin of A(H1N1)v 1998 Contemporary human From 1918 A(H1N1) Occasionally isolated from humans Limited human-to-human trnsmission PB2, PB1, PA July-August 2008? H1 NS, NP Where? N1 M Host and lineage origins for the gene segments of the 2009 A(H1N1) virus A1 8 Centros Colaboradores de la OMS St. Jude Children's Memphis MRC Londres Institut Pasteur Paris CSL Melbourne NIID Tokio CDC Atlanta 2008-2009 2000-2001 110 Centros Nacionales de Gripe: Laboratorios de Virología MADRID, VALLADOLID, BARCELONA • Laboratorios de Virología de las CCAAs • Epidemiología Médicos centinelas: recogida de muestras clínicas CIRCUITO DE INFORMACIÓN ANTE DECLARACIÓN DE UNA ALERTA POR GRIPE AVIAR EN HUMANOS ALERTA “CASO SOSPECHOSO HUMANO” según los criterios de OMS Red de Vigilancia de Gripe en las CCAAs • Epidemiología • Laboratorios de Virología Laboratorio de Referencia OMS Laboratorio de Virología ISCIII CNE CNM OMS y ECDC MSPS Procesamiento de muestras clínicas en el laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (CNM, ISCIII) Recepción y registro de muestras Procesamiento e inactivación de las muestras Salida de las muestras del laboratorio P3 y reparto a los Servicios y Laboratorios del CNM Diagnóstico • Específico de Gripe aviar-Gripe estacional • Diferencial con el resto de patógenos RT-nested PCR genérica para detección de gripe A+B+C Gen NP New SW clas Influenza ABC NP uded in the extraction buffer to detect false negative A particular emphasis was put on the suitability of RT-nested PCR genérica para subtipar gripe A thisA method the detection of on both Eurasian particularforemphasis was put thethe suitability of Gen HA1 and American lineages of H5of viruses. H5N1 this the method for the detection both the Eurasian d/2-SP-33/2 004 n/Vietnam/HD1/2004 H5N1 and the American lineages of H5 viruses. Thirteen different reference strains of subtypes H5N1, H5N2,different H5N3, H5N8 and H5N9 used for Thirteen reference strainswere of subtypes the evaluation of the PCR method. H5N1, H5N2, H5N3, H5N8 and H5N9 were used for H5N1 n/d/2-SP-33/2 Thailand/Tak-01/2004 004 H5N1 H5N1 d/1-KAN-1/2004 H5N1 H5N1 / Thailand/Bangkok/01 H5N1 nd/1-KAN-1/2004 H5N1 am/3046/2004 H5N1 H5N1 n/ Thailand/Tak-01/2004 H5N1 n H5N1 n/oi/03/2004 Thailand/Nakornsawa / Thailand/Nakornsawa n en/Vietnam/HD1/2004 m/3062/2004 H5N1 n/ Thailand/Bangkok/01 H5N1 H5N1 H5N1 e peafo/Thailand/CU-11/04 H5N1 noi/03/2004 H5N1 m/1194/2004 m/3062/2004 H5N1 H5N1 a iland/3.1/2 004 Nam/3046/2004 am/1203/2004 ha iland/3.1/2 004 H1 H1 by testing theSensitivity evaluation theassay PCR method. ofofthe was estimated serial tenfold ofdilutions of was H1, estimated H3 and H5 Sensitivity the assay byspecific testing plasmids. Detection levels serial tenfold dilutions ofwere H1, 10 H3copies. and H5 specific H5N1 H5N1 ken/HK/213 3.1/2003 H5N1 te peafo/Thailand/CU-11/04 H5N1 Indonesia/4/2004H5N1 H5N1 m/1194/2004 n/Indonesia/2A/2003 am/1203/2004 H5N1H5N1 ken/Guangdong/174/0 H5N1 cken/HK/213 3.1/2003 4 H5N1 uck/Novosib irsk/56/2005 /Indonesia/4/2004 H5N1H5N1 i cken/Crimea/1/2005 H5N1 H5N1 n/Indonesia/2A/2003 domestic cat/Iraq/820/064 H5N1 cken/Guangdong/174/0 H5N1 hicken/Nigeria/641/2006 uck/Novosib irsk/56/2005 H5N1 H5N1 mallard/Bavaria/1/2006 hi cken/Crimea/1/2005 H5N1 H5N1 H5N1 H5N1 / mallard/Ital y/332/2006 domestic cat/Iraq/820/06 / chicken/Egypt/960N3-004/2006 chicken/Nigeria/641/2006 H5N1 H5N1 l in/9/2004 H5N1 mallard/Bavaria/1/2006 H5N1 Kong/2986.1/2000 H5N1H5N1 A/ mallard/Ital y/332/2006 HongKong/31.4/02 H5N1 A/ chicken/Egypt/960N3-004/2006 H5N1 H5N1 ng/AVL-1/20 01 H5N1 Kong/2986.1/2000 H5N1 n/01/2002 H5N1 H5N1 HongKong/31.4/02 Kong/437-10/99 H5N1 H5N1 ghai/35/2002 Kong/317.5/2001 H5N1 ang/AVL-1/20 01 H5N1 dong/2/03 H5N1 an/01/2002 H5N1 uangdong/1/96H5N1 H5N1 gKong/437-10/99 ghai/35/2002 Jil in/9/2004 481/97 H5N1 H5N1 Kong/317.5/2001 56/97 H5N1 ndong/2/03 H5N1 / 97/98 H5N1 Guangdong/1/96 H5N1 Kong/p46/97 H5N1 481/97 H5N1 ngKong/120 3/97 H5N1 56/97 H5N1 486/97 g/ 97/98 H5N1 H5N1 7 H5N2 H5N1 Kong/p46/97 8 H5N2 3/97 H5N1 ongKong/120 3486/97 0/97 H5N2 H5N1 /9 7 H5N3 97 H5N2 7 H5N9 98 H5N2 1 0/97 H5N1 33 H5N2 3/9 H5N2 7 H5N3 H5N3 H5N9 91H5N3 H5N1 77 H5N1 Eurasian Eurasian Primer H1 sense Primer H1 antisense H3 sense H1 sense H3 antisense H1 antisense H5 H3 sense sense H5 antisense H3 antisense H5 sense PHA2 sense H5 antisense PHA2 antisense CAA CCC ACT CAA CCC CCC TTC ACT TAT CCC TTC WHH TAT AAI PHA2 sense WHH Second round PCR oligon PHA2 antisense AAI Second round PCR oligo plasmids. Detection levelsofwere 10 copies. Phylogenetic analysis the second amplification product nucleotide sequences ofsecond H5 viruses (Kimura Phylogenetic analysis of the amplification N-terminal signal Fusion peptide 2-parameter MEGA v3.1 ) wouldoffitH5 a particular strain product nucleotide sequences viruses (Kimura into one of theMEGA two previously described lineages. RT+common 1st amplification 2-parameter v3.1) would fit a particular strain round PCR as into one of the two previously described lineages. H1 specimens. As for the firs MW 104 103 102 10 1 104 103 102 10 1 10 1 104 103 102 H3 4 3 2 MW 10 10 10 10 1 4 3 2 10 10 10 10 1 4 3 specimens. of any of the antisense) As for thewere fir regions evidence antisense) were H5 HA Subtyping substituted round PCRprim as of any of the prim substituted 2 10 10 10 10 1 1009bp H1 1009 bp 847 bp 847bp H3 591 bp 591bp H5 1009 bp H1 H3 H5 H1 350bp IC H3 847 bp bp 350 IC 591 bp H5 350 bp IC very regionsdifferent evidence hemagglutinin very different t date of the virus.t hemagglutinin date of the virus Direct sequen 93 H1N1-A/Baleares/R3205/08 94 H1N1-A/Baleares/R3210/08 44 H1N1-A/Aragon/R3207/08 82 H1N1-A/PaisVasco/R3174/08 H1N1-A/Brisbane/59/2007 70 50 H1N1-A/Norway/1630/07 H1N1-A/Taiwan/603/05 98 57 H1N1-A/Hawaii/01/07 90 H1N1-A/Singapore/19/06 H1N1-A/Texas/02/07 Generic amplification of each 16 sybtypes HA H1N1-A/New Caledonia/20/99 51 SM H1N2-A/Yokohama/22/02 87 H1N2-A/England/2/02 56 H1N2-A/New York/217/02 69 100 Human seasonal 52 105 104 103 102 10 1 H2O H1N1-A/Norway/2159/06 H1N1-A/SolomonIslands/3/06 10079 94 RT-nested PCR genérica para detección de los 16 subtipos de HA Gen HA1 A/swine/Ontario/55383/04 H1N2 H1N1-A/USSR/90/77 56 H1N2-A/swine/England/690421/95 77 H1N9-A/NWS-G70c/70 H1 A/swine/Ontario/11112/04 H1N1 H1N2-A/duck/NC/91347/01 68 88 A/swine/NorthCarolina/36883/02 100 H1N2-A/swine/Minneso/55551/00 A/swine/Kansas/00246/04 H1N2 57 100 450-500 bp H1N1-A/swine/Wisconsin/168/97 60 A/swine/Ohio/24366/07 H1N1 99 100 A/swine/Ohio/C62006/06 H1N1 Classical sw lineage A/Swine/Indiana/P12439/00 H1N2 49 A/Swine/Ohio/891/01 H1N2 54 44 A/Swine/Indiana/9K035/99 H1N2 35 A/swine/Minnesota/00194/03 H1N H1N3-A/duck/New Zealand/160/76 H1N5-A/pintail duck/Alberta/63 62 100 99 H1N6-A/mallard duck/Alberta/42 H1N4-A/teal/Alberta/141/92 74 H1N1-A/swine/Netherlands/3/80 62 H1N1-A/swine/Netherlands/609/9 99 H1N1-A/swine/Belgium/1/98 85 H1N1-A/swine/Italy/110971/01 90 H1N1-A/swine/Spain/53207/04 82 24 H1N1-A/Switzerland/8808/02 46 H1N1-A/Aragon/R3218/08 35 27 96 100 68 H1N1-A/swine/Spain/50047/03 H2 100 100 100 38 100 99 83 H5 H6 H8 H12 H9 H11 H16 H13 H3 H4 H14 H10 H15 H7 100 100 100 75 100 99 100 100 99 96 100 100 100 99 100 96 Euroasiatic sw lineage Primer caso gripe AH1N1v en Europa Almansa (Castilla La Mancha, Spain): GP1-GP2 Detección + secuenciación del fragmento amplificado + análisis de la seq H1 H3 H5 Influenza ABC NP Multiplex RESP Inf A subtyping Multiplex BRQ Inicio del brote: Casos estudiados y confirmados en el Centro Nacional de Gripe (CNM, ISCIII) Semana 1 Fechas Casos Casos Estudio Positivos Otros virus Gripales encontrados 17 26 Abril- 2-Mayo 196 80 10 FluB; 3 FluA H1N1; 1 FluA H3N2 18 3-Mayo- 9 Mayo 70 29 3 FluB; 1 AH1N1 19 10 Mayo- 16 Mayo 13 3 3 FluB 20 17 Mayo- 23 Mayo 47 26 1 FluB; 1 FluA H1N1; 1 FluA H3N2 21 24 Mayo- 30 Mayo 81 43 2 FluA H3N2 22 31 Mayo- 6 Junio 154 142 23 7 Junio- 13Junio 183 152 744 375 TOTAL 17 FluB; 5 FluAH1N1; 4 FluH3N2 Sistema de Vigilancia de la gripe en España Temporada 2008-2009 250 B A(H1N1) A(H1) A(H3N2) A(H3) A (no subtipado) Nº detecciones 200 150 100 Semana 17 26 Abril- 2-Mayo 50 0 40 42 44 46 48 50 52 2 4 6 8 Semanas 10 12 14 16 18 20 Cronología de los casos según el comienzo de los síntomas 17 18 19 20 21 22 23 250 100 200 80 150 60 100 40 50 20 0 % detecciones virales positivas Casos gripe /100.000 h. Tasa de incidencia semanal de gripe y porcentaje de detecciones virales positivas. Temporada 2009-2010. Sistemas centinela 0 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 Junio Julio Ago Sept 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Oct Semanas Porcentaje detecciones positivas Tasa 2008-09 (a partir de semana 20/2009) Umbral basal Tasa 2008-2009 Tasa 2009-2010 (a partir de semana 40/2009) Tasa de detección viral (%) y número de detecciones virales centinela. Temporada 2009-2010 Nula Esporádica Local Situación Epidémica 26 Abril a 5 Junio Pacientes positivos secuenciados: 157 97 M1+M2 39 NP 81 NS 63 HA1 / 365 88 NA Análisis de cada segmento secuenciado A(H1N1)v A/Madrid/289/GP578/09 military A/Madrid/378/GP781/09 military A/Madrid/292/GP587/09 military A/Madrid/294/GP593/09 military A/Madrid/340/GP727/09 military A/Madrid/296/GP599/09 military A/Madrid/299/GP608/09 military 61 A/Madrid/385/GP796/09 military A/Madrid/295/GP596/09 military A/Madrid/293/GP590/09 military A/Madrid/290/GP581/09 military A/Madrid/390/GP805/09 military 42 A/Madrid/291/GP584/09 military A/Madrid/360/GP752/09 military A/Madrid/297/GP602/09 military 26 A/Madrid/298/GP605/09 military A/Madrid/381/GP786/09 military A/Madrid/391/GP807/09 military A/Valencia/78/GP155/09 A/Murcia/43/GP78/09 46 18 62 A/Catalua/66/GP145/09 A/Catalua/9/GP25/09 A/Andalucia/126/GP242/09 54 A/CastillaLaMancha/129/GP248/09 A/CastillaLaMancha/1/GP12/09 5 A/Valencia/77/GP160/09 A/CastillaLaMancha/95/GP181/09 14 A/CastillaLaMancha/4/GP7/09 A/Valencia/82/GP158/09 29 A/Valencia/2/GP3/09 A/Andalucia/117/GP230/09 A/Valencia/264/GP494/09 6 A/Baleares/265/GP500/09 A/Catalua/69/GP148/09 61 A/Valencia/79/GP161/09 A/Andalucia/167/GP317/09 A/Madrid/37/GP65/09 A/Andalucia/119/GP234/09 55 A/Madrid/36/GP62/09 A/Andalucia/100/GP201/09 38 A/Andalucia/118/GP232/09 A/Andalucia/255/GP490/09 A/Madrid/111/GP216/09 A/Catalua/13/GP29/09 A/Catalua/19/GP35/09 A/Andalucia/130/GP251/09 35 A/Catalua/8/GP24/09 A/Catalua/121/GP237/09 A/Catalua/123/GP239/09 A/Catalua/15/GP31/09 A/Catalua/68/GP147/09 A/Valencia/73/GP154/09 A/Catalua/25/GP41/09 A/Valencia/72/GP153/09 100 A/Catalua/122/GP238/09 A/Catalua/120/GP236/09 A/Andalucia/71/GP151/09 A/Catalua/65/GP144/09 A/Catalua/63/GP142/09 A/Madrid/308/GP636/09 A/Madrid/288/GP575/09 86 A/Madrid/305/GP628/09 A/PaisVasco/5/GP19/09 62 Hemaglutinina H1 63 casos positivos A(H1N1)v L58I P109S (todas) T216A D291E I338V A/Swine/Indiana/P12439/00 H1N2 100 A/swine/Kansas/00246/04 H1N2 57 A/swine/Minnesota/00194/03 H1N2 57 A/Swine/Ohio/891/01 H1N2 48 A/Swine/Indiana/9K035/99 H1N2 A/swine/Ohio/24366/07 H1N1 87 98 84 A/swine/Ohio/24366/07(H1N1) A/swine/Ohio/C62006/06 H1N1 100 98 A/swine/Ohio/C62006/06(H1N1) A/swine/NorthCarolina/36883/02 H1N1 94 A/swine/Korea/CAS08/2005(H1N1) 100 A/swine/Shanghai/3/2005(H1N1) 81 100 A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1) A/swine/Shanghai/1/2005(H1N1) 39 A/swine/Maryland/23239/1991(H1N1) 51 A/swine/Memphis/1/1990(H1N1) 82 A/swine/California/T9001707/1991(H1N1) Linaje de la gripe clásica porcina 44 76 A/swine/Ratchaburi/NIAH550/2003(H1N1) 18 A/swine/Iowa/1/1986(H1N1) 57 A/swine/Kansas/3024/1987(H1N1) 20 A/swine/Ontario/11112/04 H1N1 99 cambio de AA A/California/07/2009 vs Cepas españolas A/swine/Tennessee/4/1978(H1N1) Virus contienen sustituciones de aa en lugares antigénicos concretos cuando se compara con las cepas H1 estacionales A/swine/Tennessee/2/1978(H1N1) A/swine/Kyoto/3/1979(H1N1) 50 31 A/swine/Wisconsin/30954/1976(H1N1) 37 A/swine/Tennessee/19/1976(H1N1) 52 A/swine/Tennessee/107/1977(H1N1) 55 100 100 A/swine/Tennessee/109/1977(H1N1) A/swine/Tennessee/9/1978(H1N1) A/swine/Thailand/HF6/2005(H1N1) 100 100 A/swine/Chonburi/NIAH977/2004(H1N1) A/swine/Tennessee/7/1978(H1N1) 100 69 A/swine/Ohio/K1207/06(H1N1) A/swine/Ohio/K1130/06(H1N1) 93 A/swine/Ontario/55383/04 H1N2 100 A/Nyiregyhaza/01/2007(H1N1) A/swine/Tianjin/01/04(H1N1) 100 A/swine/Henan/01/06(H1N1) A/swine/France/WVL8/1992(H1N1) 52 A/swine/Hokkaido/2/1981(H1N1) A/swine/England/WVL7/1992(H1N1) 96 100 A/swine/Spain/WVL6/1991(H1N1) A/swine/Hungary/19774/2006(H1N1) 74 A/Aragon/Spain/RR3218/2008(H1N1) 85 81 0.05 A/swine/Haseluenne/IDT2617/03(H1N1) Linaje Eurasiático Ensayos antigénicos IHA Neuraminidasa N1 88 casos positivos No hay resistencias a oseltamivir H274, E119, N294 Linaje Eurasiático cambios de AA A/California/07/2009 vs Cepas españolas S247N N248D V338I S340F No se han encontrado cambios genéticos conocidos que puedan disminuir la sensibilidad a INA Linaje de la gripe clásica porcina H1 humana epidémica Matrix 97 casos positivos M gen, codifica 2 proteinas: M1 y M2 Determinante del tropismo a un determinado hospedador Euroasian sw lineage M2 presenta S31N Resistencia a adamantanos presente en todas las secuencias Marcador molecular del linaje Eurasiático M Human seasonal Classical sw lineage cambios de AA A/California/06/2009 vs Cepas españolas M1 T185M S224N V147M Análisis de cada segmento secuenciado A(H1N1)v NP T373I CastillaLaMancha/GP369 Andalucia/GP381 Cataluña/GP144 Cataluña/GP145 Valencia/GP154 Andalucia/GP196 Andalucia/GP201 Cataluña/GP224 Andalucia/GP234 Cataluña/GP237 Cataluña/GP236 Andalucia/GP251 Valencia/GP280 Madrid/GP62 PaisVasco/GP20 Valencia/GP4 HA S91P Todas las cepas españolas Mutaciones pareadas Garten et al. Science. 22 May 2009 NP PA 1 T373I M582L not available at momment NP NA 2 V100I V106I N248D 3 NP NA V100I V106I N248D HA1 PA 4 S91P S224P V323I HA1 S206T NS1 I123V NP NA V100I N248D Madrid/GP523 Andalucia/GP527 Madrid/GP216 Valencia/GP272 Valencia/GP278 NP NA HA1 NS1 V100I N248D S206T I123V Madrid/GP523 Análisis de cada segmento secuenciado A(H1N1)v Marcadores moleculares de la adaptación al hospedador • 1918 H1H1 • Virus H5N1 altamente patogénico Dunham et al. J Virol June 2009 H1N1v Avian 1918/H5N1 swClass swEurop Human E E K PB2 627 E E PB1-F2 12 Truncated Compl NS1 220 25 66 227 Truncated N E - Compl-PDZ Q E E N,K,R,W E R,G R,W*,L K* E,G* Q E R,del NS2 26 49 52 70 E V M G E V M S E V M G K* L* T* G* E V M G M1 214 H Q Q H* Q NP 284 384 A R A R A R V,I* K* A R * A/Aragon/R3218/Spain/08 Virus nH1N1 crecido en células MDCK Servicio de Microscopia Electrónica, CNM, ISCIII