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Nuevo Influenza
A H1N1
Contardi , Lorena Gabriela
Reverendo, María Amelia
CEMIC 2009
Influenza



Los virus influenza son virus pertenecientes a
la familia Orthomyxoviridae
3 tipos de influenza, A, B y C
Los virus B y C causan enfermedad solo en
el hombre mientras que influenza A además
infecta aves y otros animales
Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.
Síndrome Gripal

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





Fiebre,escalofríos,malestar general
Mialgias
Dolor de garganta
Tos no productiva, rinitis
Cefalea
Fatiga extrema
Convalecencia: 1-2 semanas
Complicaciones: Neumonía, exacerbación de
problemas cardíacos ó pulmonares,
encefalopatías, mielitis, síndrome de Reye,
miositis, miocarditis y pericarditis
Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.
Transmisión por aerosoles




Periodo Incubación: 1-4 días
Adultos eliminan virus: 1 día antes de los
síntomas hasta 5 días
Niños: > a 10 días
Inmunocomprometidos:
semanas a meses
Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.
Influenza A



Genoma de ARN segmentado
y de polaridad negativa. La
replicación es nuclear.
Los viriones son envueltos por
una cubierta lipídica
proveniente de la célula
huésped.
En la envoltura poseen
distintas proyecciones con
forma de espícula.
Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.
Influenza A
Influenza A


La HA y la NA son los antígenos claves
contra los que la respuesta inmune es
dirigida.
Utilizados para tipificar los virus de influenza
A en 16 HA y 9 NA subtipos.
Emergence of a novel swine-origin influenza A virus (S-OIV) H1N1 virus in humans. J.S.Malik Peiris, Leo L.M.Poon,
Yi Guan. Journal of Clinical Virology 45 (2009) 169-173
Hemaglutinina




Adsorción del virus a la
célula. HA se une a los
residuos de ácido siálico
que se encuentran en el
receptor de las células
Fusión de la envoltura
viral con la membrana del
endosoma. Clivaje en dos
péptidos HA1 y HA2
Responsable de la
hemoaglutinación
mediante la HA1
Induce la aparición de
Acs. neutralizantes
Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.
El rol de la Hemaglutinina viral
Hemaglutinina se une al
ácido siálico
Virus es incorporado
dentro de la célula
RNA del virus se replica
en el núcleo
Neuraminidasa

Integrada por 4 subunidades

Enzima destructora de receptores

Permite transportar al virus a través de las mucinas y
destruir los receptores de la HA sobre la célula huésped

Estimula la producción de anticuerpos inhibidores de la NA
Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.
El rol de la Neuraminidasa
viral
La neuraminidasa corta la unión
entre la hemaglutinina y el ácido
siálico, lo que libera el virus de la
célula
Ciclo de vida del virus de la
Influenza
Subtipos de Hemaglutinina
Subtype
Human
Swine
Horse
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
H14
H15
H16
Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission
Bird
Subtipos de Neuraminidasa
Subtype
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
Human
Swine
Horse
Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission
Bird
Variación antigénica en
Influenza A

Drift antigénico o cambios menores:
mutación puntual en el gen de HA y/o NA. No
reconocida por su Ac correspondiente.
epidemia

Shift antigénico o cambios mayores:
involucra grandes cambios HA y/o NA por el
reemplazo de los genes de estas proteínas.
pandemia
Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.
“Shift” antigénico: origen de
las cepas pandémicas

Reasociación genética entre cepas animales y
cepas humanas en circulación. (1957/1968)

Cepas aviarias o de mamíferos adquieren la
capacidad de infectar al hombre. (1918)

Cepas que desaparecieron, se mantuvieron
escondidas y reaparecen luego de un período.
(1977)
Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.
Orígenes de las pandemias de
influenza
The Origins of Pandemic Influenza – Lessons from the 1918 Virus. Robert B. Belshe, MD. NEJM 353;21 November
24, 2005.
Nuevo Influenza A H1N1
Geographic Dependance, Surveillance and Origins of the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. Vladimir Trifonov, Hossein
Khiabanian and Raul Rabadan. NEJM 10.1056, May 27, 2009.
Proteínas de superficie del
virus porcino
5 genes de origen porcino
2 genes de origen
aviar
1 gen de origen humano
¿Por qué es el cerdo un huésped
intermediario apropiado?

Su tracto respiratorio
expresa acido siálico (SA)
α 2,3 Gal que une la
influenza aviar y SA α 2,6
Gal que une la influenza
humana, esto permitiría la
infección con ambos
virus.
Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott
Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8
Inicios de la
pandemia
Nuevo Influenza A H1N1, 2009
Abril: Emerge en México o en USA
Se disemina en USA, Canadá y en el mundo
La OMS declara alerta Mundial.
Junio 3: PANDEMIA FASE 5: transmisión
interhumana sostenida
Junio 11: FASE 6: PANDEMIA GLOBAL
Hoy
Virus respiratorios:
diagnóstico

MÉTODOS DIRECTOS
Cultivo: Gold standard clásico
Rápidos:
Detección de Antígenos: IF, ELISA, Inmunocromatografía
Detección de Genomas: PCR, RT-PCR, PCR a
tiempo real

MÉTODOS INDIRECTOS: Serología
Escaso valor diagnóstico de infección reciente
WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update
Obtención de la muestra
¿Cuando? Dentro de los 3 días del inicio del cuadro
Aspirado nasofaringeo
Hisopados nasal/faríngeo
combinado
Hisopado nasofaríngeo
Hisopado nasal
Aspirado traqueal
BAL
Biopsia
WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update
Transporte y conservación

Medios de transporte para virus: Caldo
triptosa/Solución salina Hanks + gelatina
ó albúmina al 1% + atb-antimicóticos 1%

Transporte: en frío. A 4 ºC menos de 72
hs. No congelar
Conservación por tiempos mayores a
72 hs –70 °C ó N2 líquido (Para aislamiento)

ASPIRADO NASOFARINGEO
Métodos clásicos
Métodos Rápidos
IFI
Cultivo
Centrifugación
sobrenadante
sedimento
HEP 2 o MRC 5 ó MDCK ó LLC-MK2
ACP
IFI células infectadas
tinción IFI
IFI panel respiratorio
 Virus sincicial respiratorio (Paramixoviridae)
 Adenovirus (Adenoviridae)
 Influenza A (Orthomixoviridae)
 Influenza B (Orthomixoviridae)
 Parainfluenza (Paramixoviridae)
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Detección directa de antígeno: IFI en
ANF
Ventajas: Rápida
< costo
Desventaja:
Personal entrenado
Adecuado Nº células
Requiere microscopio IF
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ASPIRADO NASOFARINGEO
Diagnóstico molecular
 PCR, RT-PCR
 PCR en tiempo real.
Permite cuantificar
WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update
Diagnóstico molecular de
nuevo H1N1


Diferentes protocolos
Genes targets importantes:



Gen de proteína de la matriz de influenza A
Gen de hemaglutinina específico de H1N1
Gen de hemaglutinina específico para influenza
estacional
WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update
Diagnóstico
La OMS recomienda que los casos sospechosos de
Influenza A H1N1 sean confirmados por:



Ensayos RT-PCR que diferencien S-OIV de los
virus de influenza estacional
Aislamiento e identificación de Influenza H1N1
La detección de un aumento de cuatro veces en los
anticuerpos S-OIV por neutralización o inhibición de
la hemoaglutinación (HAI).
WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update
Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott
Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8
Experiencia del CEMIC en el
diagnóstico de influenza A H1N1
Objetivos:
 Determinar la frecuencia de positividad en
nuestro hospital del nuevo influenza A H1N1
por PCR en tiempo real
 Evaluar la sensibilidad del panel de virus
respiratorio versus la PCR en tiempo real
 Evaluar la sensibilidad de un método rápido
inmunocromatográfico para screening de
nuevo H1N1 versus PCR en tiempo real
Materiales y Métodos
1741 muestras respiratorias
Buenos Aires y Jujuy
Desde 11/06 al 31/08/09
HNF
ANF
Aspirado traqueal
BAL
Protocolo CDC (11/06-1/07)
RT-PCR en tiempo real
Light Cycler Roche (1/07-31/08)
IFI panel virus respiratorios (Chemicon)
224 muestras respiratorias
RT-PCR en tiempo real
Método Inmunocromatográfico (SD Bioline)
16 muestras respiratorias
RT-PCR en tiempo real
Método rápido
inmunocromatográfico
Método rápido
inmunocromatográfico
Método rápido
inmunocromatográfico
Resultados
Resultados
Figura: Detección de Influenza A H1N1
por PCR en Tiempo Real (n=1741)
Periodo 10/06 al 31/08/ 2009
700
Positividad total: 39%
Positivos
Negativos
600
500
400
n
300
38%
52%
200
100
16%
0
Junio
n: 535
Julio
n: 972
Agosto
n: 234
Meses
Resultados
Sensibilidad panel viral
vs.
RT-PCR en tiempo real
PCR H1N1 (+)
PCR H1N1(-)
Total
IFI FLUA (+)
45
7
52
IFI FLUA (-)
31
141
172
76
148
224
Total
IFI RSV : 3 (H1N1 +) y 15 ( H1N1-)
Sensibilidad : 59 %
VPP: 86 %
Especificidad : 95 %
VPN:82%
Resultados
Sensibilidad Inmuno-cromatografía
vs.
RT-PCR en tiempo real
PCR H1N1 (+)
PCR H1N1(-)
Total
Inmunocrom
atografía (+)
2
0
2
Inmunocrom
atografía (-)
11
3
14
Total
13
3
16
Controles Flu A estacional: 2/3 . Controles Flu B estacional: 2/3
Sensibilidad : 15.4 %
VPP: 100 %
Especificidad : 100 %
VPN: 21%
Conclusiones:

La frecuencia de casos positivos para influenza A H1N1
fue variando a lo largo de los meses siendo mayor al
principio de la pandemia (52%).

Comprobamos que los mismos monoclonales que
utilizamos para la detección de gripe estacional por IFI
también detectan al nuevo influenza, pero con una menor
sensibilidad (59%) que la observada para influenza A
estacional (70-80%).

Se comprobó que la sensibilidad del método rápido
inmunocromatografico estudiado fue baja (15%) y es
similar a lo publicado en otros trabajos.
Poor Clinical Sensitivity of Rapid Antigen Test for Influenza A Pandemic (H1N1) 2009 Virus. Jan Felix Drexler, Angelica Helmer, Heike Kirberg et al. Emerging
Infectious Diseases. Vol 15. N° 10, October 2009.
Field performance of an Inluenza Rapid Diagnostic Test in an ambulatory setting. Isabelle Rouleau, Hugues Charest, Monique Douville- Fradet, JCM..00762-09
Muchas gracias por su atención!!
Agradecimientos:
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Laboratorio de Virología
Dra. Cristina Videla
Dr. Alfredo Martínez
A nuestras compañeras de residencia