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UD 6 – BIOTECNOLOGÍA
1. La ingeniería genética
1.1. Fragmentación del ADN
1.2. Transformación por vectores
1.3. Selección de transformantes
1.4. Análisis de ADN clonado
1.5. Secuenciación
1.6. Reacción en cadena de la polimerasa
2. Aplicaciones industriales de los microorganismos
2.1. Industria farmacológica
2.2. Industria alimentaria
2.3. Industria química y minera
3. Aplicaciones medioambientales
4. Aplicaciones agrícolas, ganaderas y piscícolas
4.1. Clonación en plantas
4.2. Plantas transgénicas
4.3. Clonación en animales
4.4. Animales transgénicos
5. Aplicaciones médicas
5.1. Proyecto Genoma Humano
5.2. Detección de enfermedades genéticas y terapia génica
5.3. Vacunas y anticuerpos
6. Aplicaciones jurídicas
6.1. La huella genética
6.2. La clonación humana
1. La ingeniería genética
La biotecnología manipula y modifica microorganismos o células obtenidas
de animales y plantas en el ámbito de las industrias que manejan
organismos y de los servicios (medicina, derecho). Por tanto, no se incluyen
actividades que manipulen animales o plantas enteras, aunque éstas son
necesarias posteriormente.
La ingeniería genética, conocida también como manipulación genética,
surge en los años 70 (siglo XX) cuando se consigue introducir material
genético de una especie en células de otra especie muy distinta.
En la naturaleza se produce una transferencia de material genético entre
bacterias, fenómeno llamado transformación.
La transferencia de forma artificial se realiza mediante la técnica del ADN
recombinante. A ésta se han ido sumando otras técnicas de ingeniería
genética que se analizan seguidamente.
1.1. Fragmentación del ADN
Se basa en la capacidad de ciertas bacterias que contienen enzimas
llamadas restrictasas o endonucleasas de restricción (actualmente se
comercializan más de cien enzimas diferentes) que cortan el ADN por sitios
específicos que reconocen, obteniéndose fragmentos de restricción (cuadro
I). Para que se puedan unir después los fragmentos de ADN extraño y el
ADN que se utilizará como vector se han de cortar ambos con la misma
restrictasa. Comparando dichos fragmentos se construyen los mapas de
restricción, los cuales se usan para comparar genomas de especies
diferentes y establecer cambios evolutivos así como para detectar
mutaciones cromosómicas como delecciones e inserciones.
Cuadro I: Fragmentos de restricción originados por la enzima EcoRl
Restrictasa
(Bacteria origen)
EcoR1
(Escherichia coli)
Secuencia
reconocida
...G-A-A-T-T-C...
...G-T-T-A-A-G...
Fragmentos
de restricción
A-A-T-T-C...
G...
G...
...C-T-T-A-A
1.2. Transformación por vectores
La transformación de bacterias con ADN extraño se produce en muy pocas
células (baja eficacia) en condiciones de laboratorio. Por ello, se emplean
vectores genéticos que funcionan como taxistas que transportan a un
cliente el ADN recombinante. Los vectores más usados son:
a) un plásmido (fragmento extra de ADN bicatenario circular de unos 4,3
kb, que existe en algunas especies de bacterias).
b) un cósmido (similar al plásmido pero de mayor longitud, unos 40 kb).
c) un virus vector ( en este caso el ADN extraño que se quiere transferir se
incorpora al ADN vírico y funciona como ADN recombinante).
Si la introducción de ADN extraño se realiza en células eucariotas no
reproductoras se denomina al proceso transfección; y si la introducción se
realiza en células reproductoras de plantas y animales, la alteración génica
va a estar presente en todas células del cuerpo, en este caso se habla de
transgénesis.
1.3. Selección de transformantes
La multiplicación de las células que contienen el ADN recombinante (ADNr),
ya sea en un plásmido o en un cósmido, o en su propio ADN (si se usó un
virus vector), produce una clonación de éste, es decir, la producción de
múltiples copias idénticas de ADNr que lleva el gen extraño, una copia en
cada célula. Pero cada clon de células tendrá un fragmento de ADN extraño
distinto. Al conjunto de estas copias de ADNr diferentes se denomina
biblioteca genómica. Lo que se tiene que hacer ahora es seleccionar el clon
de células (colonia crecida en agar) en cuyo interior está contenido el
fragmento de ADN con el gen que interesa. Esto se consigue mediante la
obtención de una molécula de ADN complementario (ADNc) a partir de su
propio ARNm procedente del gen extraño que se ha expresado.
1.4. Análisis de ADN clonado
El siguiente paso es localizar la posición del gen (región codificante de
proteína) que interesa en el fragmento que está clonado en la colonia de
células seleccionada.
Se emplea la técnica de transferencia de Southern (su inventor fue E.M.
Southern). Esta técnica se basa en la obtención de fragmentos de
restricción del clon seleccionado y el tratamiento con ADNc radiactivo que
hibridará con la región transcrita del gen porque el ADNc se ha obtenido a
partir del ARNm producido en la transcripción de las células del clon
seleccionado. Como el ADNc se ha construido con isótopos radiactivos
funciona como una sonda y marcará en una autorradiografía la posición de
los fragmentos que hayan hibridado (unión según bases complementarias
de los nucleótidos) con el ADNc radiactivo. En esta técnica se basa el
procedimiento para la obtención de "huellas genéticas".
1.5. Secuenciación.
La técnica de la clonación de ADN ha permitido obtener gran cantidad de
este ácido nucleido para que pueda realizarse su secuenciación y conocer la
composición química de cada gen, conocimiento que se considera de
incalculable valor. Esto ha posibilitado la obtención de secuencias de
genomas completos (son cada vez más los organismos y virus que son
secuenciados, incluida la especie humana).
La técnica de Sanger (o del didesoxi), que es como se llama, se basa en la
síntesis de ADN, usando como molde una versión monocatenaria del ADN
que va a ser secuenciado. La técnica utiliza cuatro nucleótidos especiales,
los didesoxinucleótidos (de aquí el nombre de la técnica) que provocan la
terminación de la síntesis de fragmentos de ADN, los cuales según su
longitud se situarán en distintos sitios en una placa de gel y de ahí se
deduce la secuencia de nucleótidos.
1.6. Reacción en cadena de la polimerasa
Mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR en
inglés) se pueden obtener grandes cantidades de ADN que permiten
diferentes análisis, a partir de cantidades mínimas. Se basa en el proceso
de replicación del ADN, para ello se utilizan unos oligonucleótidos que se
han de diseñar como cebadores que inician la replicación "in vitro". La
replicación se repite multitud de veces duplicando en cada ciclo la cantidad
de ADN obtenido.
Esta síntesis artificial de ADN se ha de realizar a altas temperaturas para
que las dos cadenas de ADN no se enrollen entre sí, lo cual puede realizarse
gracias a una enzima ADN polimerasa obtenida de una bacteria termófila.
Esta técnica tiene múltiples utilidades: realizar pruebas de paternidad o
averiguar la autoría de un delito; diagnosticar enfermedades hereditarias
antes del nacimiento, analizar restos de tejidos en huesos para hacer
estudios filogenéticos; realizar secuenciaciones de genomas (mucho más
rápido que a partir de la clonación en células), etc.
Figura 1: Clonación de ADN por la reacción en cadena de la polimerasa
2. Aplicaciones industriales de los microorganismos
Existen en la naturaleza unos centenares de especies de
microorganismos(bacterias, levaduras, mohos, algas unicelulares) que
producen sustancias que presentan algún interés para la especie humana.
Los productos que tienen un interés comercial se pueden agrupar en cuatro
clases:
a) productos del metabolismo primario( dióxido de carbono, etanol, ácido
acético, aminoácidos, etc.).
b) productos del metabolismo secundario (antibióticos, toxinas).
c) macromoléculas (polisacáridos, enzimas); y células microbianas (pienso
animal llamado proteínas microbianas).
Cuadro II: Algunos de los principales productos industriales
obtenidos con la ayuda de los microorganismos
2.1. Industria farmacéutica
La industria farmacéutica produce actualmente toda una gama de
sustancias que obtiene de microorganismos como son: sustancias
antimicrobianas (sobre todo antibióticos de diversos tipos), vacunas,
vitaminas, hormonas peptídicas (como la insulina, la hormona del
crecimiento o somatotropina), factores hipotalámicos (como la
somatostatina, ver figura) y enzimas.
Figura 2: Síntesis de la somatostatina en Escherichia coli
2.2. Industria alimentaria
El proceso de fermentación ha sido manipulado por el hombre de diversas
formas para obtener toda una serie de alimentos y bebidas. Así, por
fermentación láctica se produce queso y yogur; la fermentación alcohólica
se emplea para la elaboración de pan fermentado (en este caso se
aprovechan las burbujas de dióxido de carbono para esponjar el pan) y
bebidas alcohólicas como el vino, la cerveza (ver figura 3), sidra y otras
muchas en diferentes partes del planeta. En la fermentación alcohólica se
emplean diferentes especies de levaduras (hongos unicelulares) del género
Saccharomyces.
Figura 3: Producción de la cerveza
2.3. Industria química y minera
Diversos tipos de industrias utilizan microorganismos para la obtención de
sustancias de interés como aminoácidos (ácido glutámico en forma de
glutamato monosódico usado como potenciador de sabores y aromas);
ácidos orgánicos como cítrico, acético (utilizado en la fabricación de
acetatos, películas fotográficas, etc.); butanol (empleado en la fabricación
de plastificantes), etanol (como combustible), enzimas como proteasas
(usadas en detergentes), etc.
En las industrias mineras se utilizan micoorganismos para extraer por
biolixiviación metales preciosos, metales pesados, uranio y petróleo.
3. Aplicaciones medioambientales
Para la protección del medio ambiente se utilizan técnicas de
biorremediación empleando microbios que son capaces de metabolizar el
petróleo en casos de mareas negra y en el lavado de tanques de petroleros;
así como para descontaminar aguas residuales de diferentes industrias que
contengan metales pesados, uranio, hidrocarburos, etc.
4. Aplicaciones agrícolas, ganaderas y piscícolas
Las técnicas biotecnológicas se aplican a la agricultura y a la ganadería para
obtener mayores cosechas y mejores alimentos con plantas y mayor
cantidad y calidad en la cría de ganado, así como evitar el fraude en el
consumo de alimentos (comercializar unas especies piscícolas por otras,
alimentos transgénicos, etc.).
Se trabaja en tres líneas biotecnológicas:
a) Clonación para obtener múltiples individuos iguales con una característica
que interese.
b) Modificación genética de especies con características nuevas
(transgénesis)
c) Desarrollo de huellas genéticas para identificar especies o búsqueda de
genes concretos.
4.1. Clonación en plantas
La clonación en plantas se consigue sobre todo mediante la manipulación de
cultivos celulares. La principal técnica empleada es la micropropagación o
propagación vegetativa in vitro, la cual permite clonar en corto tiempo un
gran número de especies. Este procedimiento se utiliza para la selección y
producción de plantas en grandes cantidades, así como para la investigación
en biología vegetal.
Se consigue mediante la obtención de unos fragmentos o explantes de la
planta madre. Los explantes se colocan en un medio de cultivo adecuado y
produce un callo (masa de células sin diferenciar); los callos pueden
dividirse en multitud de fragmentos o incluso hacerse una suspensión de
células. En el momento que se desee, se cambian las concentraciones de
hormonas auxina y citoquinina, esto hace que se diferencien las células de
los callos con lo que originarán plantas enteras. Esta técnica puede ser muy
útil para la conservación de especies y variedades en peligro de extinción,
así como para hacer más rentables la producción de flores o de metabolitos
secundarios (perfumes, pigmentos, etc.)
Figura 4: Método de obtención de callos caulinares
4.2. Plantas transgénicas
Para obtener plantas trásgénicas con genes de otras especies ( sean
plantas, microbios o animales) se pueden utilizar dos grupos de técnicas:
las indirectas y las directas.
La técnica indirecta más usada es la transformación de células mediante la
bacteria Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria vive en el suelo y
produce en las plantas dicotiledóneas una enfermedad tumoral llamada
"agalla de cuello". Cuando contacta con las células de la planta les
transfiere un segmento de ADN del plásmido Ti (inductor de tumores) que
contiene la bacteria. Este plásmido puede integrarse en uno o más
cromosomas de las células vegetales, por lo que puede utilizarse como
vector de genes que se deseen introducir en plantas de especies
dicotiledóneas. La célula que recibe genes extraños puede regenerar una
planta entera mediante la técnica de la micropropagación y obtener así una
planta transgénica.
Figura 5: Transferencia de ADN extraño a una célula vegetal mediante el vector
bacteriano Agrobacterium tumefaciens
Entre las diversas técnicas de transferencia directa de material genético una
de las más empleadas es la "de la perdigonada" o transformación biolística
(ver figura 6). Se trata de disparar bolitas de oro que llevan fragmentos de
ADN adheridos, con una especie de pistola, sobre una población de células.
Las bolitas que queden en el citoplasma pueden trasnferir el ADN que
transportan a algún cromosoma de la célula bombardeada.
Las aplicaciones agrícolas van desde el mejoramiento de procesos básicos
como la fotosíntesis y la fijación de nitrógeno atmosférico por parte de las
plantas, hasta la resistencia a herbicidas, agentes patógenos y factores de
estrés (salinidad del suelo, sequía, etc.), así como la obtención de productos
agrícolas de mejor calidad y características nuevas.
Figura 6: Obtención de una planta transgénica por transformación biolística
4.3. Clonación en animales
La obtención de un gran numero de animales con alguna característica
común (producir mucha leche, engordar rápidamente, producir lana azul,
etc.) es una aspiración de muchos ganaderos. La forma de conseguirlo es
mediante la clonación con la que se consiguen animales genéticamente
idénticos. Se usan para ello dos técnicas:
a) la disgregación de células embrionarias a partir de un embrión, de modo
que cada célula separada funciona como un zigoto y originará un animal.
b) la transferencia nuclear; ésta consiste en obtener óvulos enucleados (se
les ha extraido el núcleo por microsucción) y conseguir introducir un núcleo
de una célula embrionaria o de una diferenciada (especializada), con esta
última modalidad se obtuvo la famosa oveja Dolly. Cuanto más diferenciada
esté una célula más difícil es conseguir su reprogramación para que
funcione como un zigoto y origine un nuevo animal.
Figura 7: Obtención de reses clónicas mediante la transferencia
de núcleos de células embrionarias de mórula
4.4. Animales transgénicos
En los animales el ADN extraño o transgén se introduce en zigotos de modo
que el embrión que resulte haya integrado el transgén en todas las células y
origine un organismo transgénico. Una forma de conseguir la transgénesis
es mediante la técnica de la microinyección de zigotos, en la que se inyecta
con una micropipeta el material genético que se desee. Otra posibilidad es
utilizar células embrionarias en las que se inocula el transgén mediante
diversas técnicas (electroporación, transfección con virus o por
microinyección).
Figura 8: Aparato de microinyección
Las aplicaciones son múltiples, como con las plantas, desde el uso de
animales como biorreactores para la producción de proteínas de interés
(humanas o de otro tipo), hasta el estudio de genes específicos y la
posibilidad de la terapia génica en humanos.
Cuando el ADN extraño que se introduce no afecta a células germinales,
sino a las células somáticas, se denomina al proceso tranfección y para
conseguirla se usan distintas técnicas (ver figura 9). Las células
transfectadas tienen gran interés en la obtención de líneas celulares
alteradas capaces de producir compuestos comerciales.
Figura 9: Fases en la transfección de ADN según diversas técnicas
5. Aplicaciones médicas
Las aplicaciones médicas de la biotecnología son inmensas. Sólo se exponen
algunas de las más prometedoras.
5.1. Proyecto Genoma Humano
Este gigantesco proyecto de investigación tiene como objetivo averiguar la
secuenciación completa de nucleótidos (o pares de bases) de los 23 pares
de cromosomas humanos, para conocer la composición química exacta de
todos los genes (genoma) y su ubicación en cada uno de los cromosomas,
así como toda la información adicional extra no codificante (el llamado ADN
basura) y estudiar su función.
En 1997, el Genoma humano fue declarado patrimonio de la Humanidad por
la UNESCO, para evitar que se comercialice con él. En junio del año 2001 se
presenta una primera aproximación de la secuencia completa,
descubriéndose que tenemos muchos menos genes (unos 30.000) de los
inicialmente previstos (100.000).
5.2. Detección de enfermedades genéticas y terapia génica
Las enfermedades genéticas debidas a un solo gen defectuoso ascienden a
más de 4000, de las cuales 345 afectan al cromosoma X, por lo que serán
transmitidas a los niños varones, si su madre posee uno de esos defectos
genéticos.
Figura 10: Ubicación de algunas enfermedades genéticas conocidas
en el mapa genético humano
La terapia génica está siendo considerada la cuarta revolución de la
medicina (después de las medidas de salud pública, la anestesia, y las
vacunas y antibióticos). Para su aplicación se siguen dos estrategias:
a) Insertar una copia sana de un gen en las células del paciente con una
enfermedad genética, para compensar el efecto del gen defectuoso ( esto se
consiguió con una niña que tenía una inmunodeficiencia grave).
b) Introducir un gen especialmente diseñado para que proporcione una
nueva característica a las células (por ejemplo, introducir en linfocitos un
gen que produzca un inhibidor del virus del sida en pacientes afectados por
el VIH).
5.3. Vacunas y anticuerpos
Las vacunas contienen un agente patógeno causante de una enfermedad
infecciosa, pero o está muerto o está atenuado (son cepas muy poco
virulentas). También se puede vacunar con subunidades del patógeno, éstas
pueden hoy día fabricarse mediante ingeniería genética en gran cantidad.
Las subunidades son proteínas con poder antigénico. Así, se ha conseguido
obtener la vacuna de la hepatitis B mediante la tecnología del ADN
recombinante. El gen de la subunidad proteica del virus de la hepatitis fue
introducido en la bacteria Escherichia coli y en la levadura Saccharomyces
cerevisiae, las cuales produjeron en cultivo la proteína del virus.
Los anticuerpos sirven como defensa frente a enfermedades infecciosas y
sustancias extrañas, pero además son un medio de curación para aquellos
enfermos que no son capaces de producirlos.
La técnica de los anticuerpos monoclonales permite obtener gran cantidad
de ellos y sin impurezas; consiste en inmortalizar las células responsables
de su fabricación, las células plasmáticas que se forman por activación de
los linfocitos B. La forma de conseguirlo es hibridando células plasmáticas y
células tumorales con capacidad para multiplicarse indefinidamente (células
de mielomas), el resultado son células híbridas llamadas hibridomas que se
pueden clonar. Cada clon (procedente de un solo hibridoma) producirá un
anticuerpo monoclonal.
6. Aplicaciones jurídicas
La biotecnología se puede aplicar a otras facetas de la vida social además
de las mencionadas. De entre todas ellas es de destacar su utilización en
relación con el derecho y la ciencia forense.
6.1. La huella genética
En el esclarecimiento de un crimen puede ser crucial la prueba que aporte el
biólogo forense al determinar la huella genética del criminal a partir de un
resto de saliva en un cigarrillo (contiene células de la mucosa bucal), una
mancha de sangre (leucocitos), restos de semen (espermatozoides) o un
simple pelo (células del folículo piloso). La técnica que se aplica es la del
perfilado del ADN o prueba del ADN . Se basa en la presencia de regiones
en el material genético no codificante que se denominan minisatélites , y
que contienen muchas repeticiones en tándem de una pequeña secuencia
de nucleótidos. Para su detección se utilizan sondas génicas
(oligonucleótidos marcados con átomos radiactivos), de modo que cada
sonda detecta un minisatélite. Estos minisatélites son de diferente longitud
en cada persona puesto que el número de repeticiones en tándem es
variable.
La huella genética también puede utilizarse para realizar pruebas de
paternidad y para identificar a personas desaparecidas de las que se tengan
sus huesos; esto ocurrió con los restos óseos de los miembros de la familia
del último zar de Rusia asesinados por los bolcheviques.
Figura 11: Técnica utilizada en la prueba del ADN
6.2. La clonación humana
La posibilidad de clonar animales mamíferos, tanto a partir de células
embrionarias como de células diferenciadas (caso de la oveja Dolly), abre la
puerta para la clonación de humanos. Para mayor polémica se publica en
1993 un experimento de clonación humana hecho con embriones humanos
que no podrían haber sobrevivido, pero que mediante la disgregación de sus
células se obtuvieron 48 embriones clónicos (idénticos genéticamente) que
fueron posteriormente destruidos.
Clonar personas enteras está prohibido en muchos países y condenado por
muchas instituciones, pero clonar tejidos humanos con fines terapéuticos es
pedido por multitud de científicos, sobre todo desde que se puede dirigir la
diferenciación de células madre hacia la obtención de tejidos concretos.
Figura 12 : Técnica de clonación
Centro Nacional de Información y Comunicación Educativa.
© Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. Año 2001.