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MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL: EMPLEO DE MICROORGANISMOS COMO UNIDADES DE PRODUCCIÓN, DE CONTROL O DE DIAGNOSTICO VENTAJAS DE LOS MICROORGANISMOS COMO UNIDADES DE PRODUCCIÓN • Rapido crecimiento debido a la favorable relación área/ volumen • Diversidad metabólica • Estabilidad genetica • Crecimiento en gran escala y separacion facil de productos y sustratos * Adaptabilidad a distintos ambientes y condiciones de crecimiento (sustratos sólidos, líquidos, frascos, fermentadores) Incrementar la productividad * Facilidad de manipulación genética Modificar los productos finales * Habilidad para sintetizar enantiómeros específicos. * Tecnologias limpias Los microorganismos pueden emplearse como : • Productores de metabolitos primarios y secundarios • Productores de biomasa y sus constituyentes (Proteínas y aminoacidos, Vitaminas, Acidos Nucleicos, Polímeros de H de C y esteres, Biomasa) • Huespedes para la expresion de genes homologos y heterologos • Unidades de Biotransformacion METABOLITOS PRIMARIOS 1- Componentes esenciales y productos formados por los microorganismos: proteinas, acidos nucleicos, polisacaridos (dextranos, alginatos, gelanos, xantanos) y poliesteres (PHB y plasticos), acidos grasos (saturados e insaturados), esteroles (ergosterol) 2- Derivados del metabolismo intermedio: azucares (fructosa, ribosa, sorbosa), ácidos organicos (gluconico, ácido láctico, cítrico, acetico, propionico, succinico, fumarico), alcoholes (xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminoacidos (Lys, Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (carotenos, B2, B12), nucleotidos saborizantes (acidos inocinico y guanilico), polisacaridos y poliesteres de reserva. Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos. Etanol Producido por : 1- Levaduras * Saccharomyces (a partir de hexosas) * Kluyveromyces fragilis (a partir de lactosa) * Cándida o Pichia (a partir de pentosas) 2- Bacterias* Clostridium (a partir de celulosa) (termófilos, anaerobios) * Zymomonas 3- RecombinantesE.coli recombinante: Introducción de los genes Alcohol deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa de Zymomonas. Pir acetaldehido etanol Aminoácidos Principales productores: Bacterias de los géneros Corynebacterium y Brevibacterium * Mutantes auxotrofas y regulatorias * Mutantes alteradas en la secrecion * Cepas recombinantes Principales productos: Acido glutámico 600,000 U$S 915 milliones Lisina U$S 500 milliones Fenilalanina U$S 200 millones Aspartato U$S 43 milliones Toneladas/ año Vitaminas Vitamina B12Microorganismos productores: Bacterias de los generos Propionibacterium shermani y Pseudomonas denitrificans. Producción: 150 mg/ L. BiotinaMicroorganismo productor: cepas modificadas (mutantes) de Serratia marcescens.Producción: 150-600 mg/ L. Vitamina B2 (Riboflavina)Microorganismos productores: -hongos (Eremothecium ashby y Ashbya gossypii) Candida sp Bacillus subtilis recombinante Producción: 20 -30 g/ L PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS • Los metabolitos secundarios funcionan en los organismos que los producen como: Reguladores del crecimiento Ionoforos Defensa frente a otros microorganismos (antibióticos, toxinas, pesticidas) Agentes de simbiosis Efectores de diferenciación Respuesta a Stress ANTIBIOTICOS Desde 1940 se han introducido una gran variedad de moléculas con actividad antibiótico para su uso en medicina y agricultura. •En el mercado hay 160 antibióticos en uso por un valor de 23,000 millones de U$S. •Se han descripto 6,000 antibióticos de los cuales 4,000 se han aislado de Actinomycetes, y se describen alrededor de 500 antibióticos nuevos por año. Una sola cepa de Streptomyces hygroscopicus produce aproximadamente 200 antibióticos. •Muchos nuevos antibioticos se obtienen por semi-sintesis, es decir, por modificacion de antibioticos existentes INHIBIDORES ENZIMATICOS •Ej. Estatinas y acido zaragozico •Inhibidores competitivos de la HMGCo A reductasa y escualeno ciclasa, por lo cual se emplean como anti- colesterolemicos. • Microorganismo productor: Aspergillus terreus (hongos) •Ej. Acido clavulanico (inhibe penicilasas) •Ej. Acarbosa: Inhibidor de la glucosidasa intestinal. Disminuye la hiperglucemia y también la síntesis de triglicérido en los tejidos adiposos, el hígado y las paredes intestinales de individuos obesos, diabéticos o con trastornos de la lipemia. •Microorganismo productor: Actinoplanes (actinomycetes) BIOPESTICIDAS Se aislaron en un principio como agentes antibióticos y luego, en las sucesivas investigaciones, surgieron nuevos usos o usos mas específicos. Fungicidas: kasugamycin, polyoxins, anfotericina Insecticidas: toxina de Bacillus thuringiensis Herbicidas: bialaphos antihelminticos: avermectinas Reguladores del crecimiento de plantas: giberellinas Inmunosupresores: ciclosporinas Agentes antitumorales: mitomycin, bleomycin Antivirales: inhibidores de la transcriptasa reversa y de la proteasa de HIV (ritonavir, nevirapine, etc) EMPLEO DE LOS MICROORGANISMOS COMO VECTORES DE GENES HETEROLOGOS Los principales huespedes que se emplean para la produccion de proteinas recombinantes son E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polimorpha y Aspergillus niger. Quimosina recombinante (Clonado del gen de la quimosina bovina en una levadura). Se emplea para la coagulacion de la caseina, en la obtencion de quesos. Insulina humana (en E.coli) Hormona de crecimiento humana (en E.coli y levaduras) Vacuna Hepatitis (en levaduras ) Farmacos (interferon 2 alfa) EMPLEO DE PLANTAS TRANSGENICAS CON GENES BACTERIANOS CLONADOS (bt) •MAIZ Y ALGODON “BT” Uso de Microorganismos en biotransformaciones Reacciones Quimicas realizadas por microorganismos: Oxidaciones * Hidroxilacion : introduccion de grupos HO con regio y estereo especificidad. Ej obtencion de esteroides Produccion de 11OH derivados y eliminacion de cadena lateral (cortisol, prednisolona, testosterona, etc) * Epoxidaciones * Desaturaciones * Rupturas oxidativa de anillos Reducciones Reacciones hidroliticas Condensaciones Resolution of b-amino acid esters using P. cepacia lipase. Resolution of pipecolic acid by oxidation with D-amino acid oxidase and recycling of the achiral oxidation product. Overexpression in E.coli Ingenieria metabolica: ruta artificial para la obtencion de hidrocortisona en levaduras Artificial pathway for the biosynthesis of the hydrocortisone as rebuilt in yeast • The enzymes in red come from human, bovine and plant organisms and their genes were engineered before introduction in yeast cells. • Those in blue are original yeast enzymes whose genes were modified to change their expression levels. • The green pathway is the main pathway for hydrocortisone production, the red one corresponds to controlled side reactions and the yellow one to secondary biosynthesis pathway coexisting with the major green one. PRINCIPALES ETAPAS DE UN PROCESO DE PRODUCCION • Búsqueda y selección de microorganismos (“Screening”) Organismos mesofilos Organismos extremofilos SI BIEN LOS MICROORGANISMOS SON BUENOS PORDUCTORES DE UNA GRAN VARIEDAD DE COMPUESTOS, LOS PRODUCEN EN BAJA CANTIDAD, POR LO QUE SE REQUIERE : Aumentar los rendimientos mediante: • Obtención de mutantes (tecnicas de mutagénesis, recombinación genética, fusión de protoplastos) • Empleo de tecnología de DNA recombinante (para aumento del dosaje genético de enzimas claves, utilización de nuevos sustratos, etc). • Diseño y selección de medios de cultivo que maximicen la produccion, disminuyan los costos o faciliten la recuperacion de productos. Diseño y selección de las condiciones y sistemas de cultivo mas convenientes PRINCIPALES PRODUCTOS PRODUCTO ORGANISMO PRODUCCION (Ton/año) Solventes Etanol Acetona/butanol Saccharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum 20 millones 2000 Biomasa Starters para alimentos Proteina unicelular Levaduras y bacterias lacticas Candida utilis 500,000 50,000 Acidos organicos Acido citrico Acido gluconico Acido lactico Aspergillus niger Aspergillus niger Lactobacillus delbrueckii 250,000 50,000 50,000 Aminoacidos Acido glutamico Lisina Fenilalanina arginina Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum 300,000 30,000 2000 1000 PRODUCTO ORGANISMO PRODUCCION (Ton/año) Enzimas Proteasas Alfa-Amilasas Glucoa-amilasa Glucosa isomerasa Pectinasa Renina otras Bacillus spp Bacillus amyloliquefasciens Aspergillus niger Bacillus coagulans Aspergillus niger Mucor o levaduras recombinantes 600 500 500 500 100 50 50 Propionibacterium shermanii Eremothecium ashbyii 10 Corynebacterium diphteriae Clostridium tetani Bordetella pertussis Virus atenuado crecido en riñon de mono o celulas diploides humanas Idem anterior Antigenos de superficie expresados en levadura < 0.1 Claviceps paspali 5 Vitaminas B12 Riboflavina Vacunas Difteria Tetanos Pertussis Polio Rubéola Hepatitis B Alcaloides del ergot PRODUCTO ORGANISMO PRODUCCION (Ton/año) Pigmentos Shikoninas Beta-carotenos Lithospermum (plantas) Levaduras < 0.1 Proteinas de uso terapéutico Insulina Hormona de crecimiento Eritropoyetina FactorVIII-C Activador del plasminogeno Interferon alfa2 E. coli recombinante E. coli recombinante o celulas de mamífero recombinante celulas de mamífero recombinante celulas de mamífero recombinante E. coli recombinante < 0.1 Antibioticos Penicilinas Cefalosporinas Tetraciclinas Macrolidos (eritromicina) Polipeptidicos (gramicidina) Aminoglicosidos (estreptomicina) Aromáticos (griseofulvina) Penicillum chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces aureofaciens Streptomyces erythreus Bacillus brevis Streptomyces griseus Penicillum griseofulvum 80,000 15,000 15,000 10,000 2,000 1,000 Insecticidas Esporas bacterianas Bacillus thuringiensis < 0.1 Anticuerpos monoclonales Celulas de hibridoma < 0..01