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Diagnóstico de virus Influenza y otros virus respiratorios
Toma de muestra clínica, oportunidad,
conservación y traslado.
Métodos de laboratorio.
Centro Nacional de Influenza
Depto. de Laboratorios de Salud Publica
Aspectos de la biología del Virus
Hay 3 tipos de virus Influenza: A, B y C.
Influenza A, dividido en subtipos según la
composición de 2 proteínas de la superficie
del virus:
Hemoaglutinina (H)
16 diferentes
Neuraminidasa (N)
9 diferentes
Contenido genético:
ARN segmentado (8)
Variabilidad Genética (HA y NA)
DERIVA ANTIGENICA
SALTO ANTIGENICO
Condiciones para que una variante de influenza sea causa de
una pandemia – AÑO 2009 – Influenza A/H1N1v
Emerge un nuevo virus de influenza para
el cual la población no tiene inmunidad
El nuevo virus es capaz de replicarse en
humanos y causar enfermedad
El nuevo virus puede ser transmitido
eficientemente de persona a persona
Centro Nacional de Influenza de Uruguay
Red de Centros Nacionales de Influenza
Centro Colaborador de
OMS
Desde 1981 ubicado en el Departamento de
Laboratorios de Salud Publica.
Es miembro, junto a más de 120 países, del WHO
GISN en coordinación con WHO GIP
Roles del Centro Nacional de Influenza
•Caracterización molecular (Tipificación y subtipificación)
•Aislamiento viral y caracterización antigénica
(subtipificación)
•Conservación de muestras clínicas y cepas virales
•Envío de cepas a los laboratorios colaboradores de OMS
para caracterización final.
•Contribución a la reformulación de vacunas antigripales
•Selección de tipo de muestra clínica
•Responsable de entrenamientos y asesoramientos
• Coordinación con Unidad de Vigilancia en Salud Publica
(UVISAP)
FLUJOGRAMA DE VIGILANCIA DE LABORATORIO DE VIRUS
INFLUENZA EN URUGUAY
CENTROS
CENTINELAS,
SERV.
INTERNACIÓN
ESTUDIO
DE BROTES
ETI, IRAG,
Eventos
Inusitados
LABORATORIOS
PUBLICOS Y
PRIVADOS
Muestras clínicas
positivas para
Virus Influenza
CENTRO NACIONAL DE
INFLUENZA
INFORMACION
AL
MINISTERIO
DE SALUD
PUBLICA
INFORMACION
A
FLUNET
ENVIO DE
CEPAS
AISLADAS
AL CDC
Situación Clínica (Definición de caso)
Muestra de Calidad
Técnicas diagnósticas
Muestra de Calidad
• OPORTUNIDAD: ¿Cuándo tomar la muestra clínica?
• Hasta 72 horas de iniciado los síntomas
• TIPO: ¿Cuál muestra clínica?
• Hisopado Nasal (paciente mayor de 5 años)
• Aspirado Nasofaríngeo (paciente menor de 5 años)
• TOMA DE MUESTRA: Conocimiento del procedimiento
técnico
• TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN: Condiciones de
conservación y transporte. El tiempo máximo de envío de
las muestras al DLSP no puede superar a las 72 horas.
Hisopado nasal (HN)
1.
Introduzca un hisopo seco
por la narina y llévelo hacia
atrás, a la nasofaringe
2.
Rote el hisopo allí por unos
segundos
3.
Despacio, retire el hisopo
mientras lo hace girar
ligeramente
4.
Introduzca el mismo hisopo
por la otra fosa nasal.
5.
Coloque el hisopo en el tubo
que contenga medio de
transporte viral (MTV),
rompiendo el palillo.
HISOPADO NASAL
 Hisopos con punta sintética (poliéster
o dacron) y mango de plástico.
 No son aceptables hisopos con:
punta de algodón, alginato de calcio,
y mango de madera.
 No son aceptables: Hisopos
bacteriológicos.
Aspirado nasofaríngeo (ANF)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Una la trampa de moco con la fuente de vacío
Introduzca la sonda a través de las narinas
Aplique el vacío
Retire despacio la sonda
Repita el procedimiento con la otra fosa nasal,
usando la misma sonda
Después de tomar la muestra, aspire con la
sonda el MTV (lavado de la sonda)
Retire la tapa con la doble tubuladura y
coloque tapón bien cerrado.
Acondicione el tubo con las secreciones para el
envío para el laboratorio.
4
5
6
7
1 2
3
ETAPA PRE-ANALITICA
Verificar que:
 la muestra a obtener sea la adecuada y que este
acompañada por ficha epidemiológica (nombre,
procedencia, edad, fecha de toma, etc ).
 El envió hacia el laboratorio haya sido correcto :4 °C,
triple envoltura ,y rapido.
MEDIO DE TRANSPORTE VIRAL
 Las muestras se colocan previo envió en Medio
Transporte Viral.
 La finalidad es mantener viable el virus condición
necesaria para su posterior caracterización.
 1-3 ml por muestras.
 Compuesto por proteínas estabilizadoras,
ATB,antimicoticos y solución buffer.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO PARA
INFLUENZA
 Pruebas Rápidas (inmunológicas).
 Inmunoflurescencia Indirecta (IFI).
 Amplificación de Ácidos Nucleicos (PCR).
 Aislamiento (Cultivo celular).
Disponibilidad de ensayos
diagnósticos de INLUENZA
Método
Disponibilidad
Tiempo
Procesamiento
Sensibilidad
de
H1N1v
Distingue
IA H1N1
de otras
IA
PRUEBAS
RAPIDAS
Detección
De Ag
Amplia
Hasta 5 hs
10-70 %
No
IFD
Detección
de Ag
Amplia
24 hs
47-93 %
No
PCR
Detección
de ARN
Limitada
48 hs
(procesamiento
2 hs)
86-100 %
Si
CULTIVO
VIRAL
Aislamiento
Del Virus
Limitada
Hasta 10 días
(muy variable)
si
---------
INMUNOFLURESCENCIA INDIRECTA
(IFI)
 Detección de Antigenos usando:
 Anticuerpos monoclonales específicos y
 Anti anticuerpos conjugado a Isotiocianto de
Fluoresceína.
 Panel de Virus Respiratorios : IA, IB, Adenovirus,
Virus Respiratorio Sicicial, Parainfluenza 1,2 y 3.
 Sensibilidad: 65-93 %.
 Alta especificidad :>96 %.
 No discrimina diferentes subtipos de Inluenza A.
Amplificación de ARN por Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR)
 Extracción de ARN
 Muestra + Buffer de Lisis

Donde y como se prepara la
PCR

Zona Mix o Pre-PCR.

Condiciones de frío.

Vestimenta y materiales solo de esta
zona.
No circulación de personal.


Preparación de mezcla de reactivos
(MIX) .

Pipeteo de Mix en eppendorf PCR
convencional o en capilares si es PCR
en tiempo real.
Amplificación propiamente dicha
PCR-Tiempo Real

Los procesos de amplificación y
detección son simultáneos.

Equipos compuestos por :
termociclador + lector de
flurescencia acoplado a un sistema
informático.

La fluorescencia de cada reacción
es proporcional al ADN formado.
Interpretación de Resultados

Sistemas de detección de
fluorescencia
El incremento de fluorescencia
se refleja en curvas de cinética de
reacción.

Ct o ciclo umbral

Aislamiento Viral
Cultivo en Biosustrato
 Envió a CDC para caracterización final
 Colaboración en la reformulación de vacuna
antigripal.
 Sensibilidad alta.
 Especificidad alta.
 Aumenta a gran escala el virus.
Algoritmo de
procedimientos técnicos
CENTRALIZADOS en CNI
HN o ANF
MUESTRA ORIGINAL
(- 70°C)
DETECCION DE Ag POR IFI
AMPLIFICACION DE ARN
PROCESO DE DESCENTRALIZACION
Inmunofluorescencia Indirecta
Técnica Moleculares
EQUIPO TECNICO Y HUMANO
MsC. Natalia Goñi Lic. Leticia Coppola Lic. Viviana Ramas Lic. Dora Ruchansky Lic.
Mariana López Lic. Noelia Morel Lic. Rosa Flieler Lic. Analía Burgueño Aux. Rommy Pilati
Aux. Roque Cámera Tec. Silvana Somma Dra. Adriana Varela Dra. Elena Cánepa QF. Maria
T Perez Dra. Silvana Brasso Dr. Héctor Chiparelli
Centro Nacional de Referencia de Influenza
Unidad de Virología – DLSP
Avda. Alfredo Navarro 3051 (Acceso Norte)
Tel.: 487 25 16/26 16 Fax.: 480 70 14
E-mail: [email protected], [email protected],