Download electroforesis capilar y electrocromatografia

PRESENTA
EQUIPO 5
¿Qué es la electroforesis?
Técnica de separación que se basa en la diferente
movilidad o velocidad de migración de partículas
cargadas debido a la acción de un campo eléctrico
SEPARACIÓN DE LOS ELEMENTOS DE UNA MEZCLA
Separa los diferentes elementos que componen una mezcla compleja
en función de la carga eléctrica de los mismos
VELOCIDAD DE LAS PARTICULAS
Depende de ...
La carga de las mismas
La intensidad del campo eléctrico y
Del coeficiente de fricción de las moléculas con el medio
APLICACIÓN DE LA ELECTROFORESIS
•Fraccionamiento de las hemoglobinas
•Diferenciación de la hemoglobina fetal
•Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc
• Proteínas séricas
•Proteínas urinarias
•Lipoproteínas
•Ácidos nucleicos
•Enzimas
•Inmunoelectroforesis
Etc.
fundamento
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y
con carga neta son colocadas en un campo
eléctrico, estas experimentan una fuerza de
atracción hacia el polo que posee carga
opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las
moléculas cargadas positivamente se
desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo)
y aquellas cargadas positivamente se
desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).
 El movimiento de las moléculas esta gobernado
también por dos fuerzas adicionales; inicialmente
la fricción con el solvente dificultará este
movimiento originando una fuerza que se opone ,
por otro lado las moléculas tienen que moverse en
forma aleatoria o movimiento browniano debido a
que poseen energía cinética propia
denominado difusión. La energía cinética de las
moléculas aumenta con la temperatura, por
ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una
manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un
cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un
frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las
moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho
movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel
consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa
moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los
solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas
será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también.
electro migración
 Mucha gente cree que la electro migración es la
"migración de electrones" pero en realidad es el
material que "migra" por causa de un flujo de
electrones, por eso se llama electro-migración
 La electro migración es un fenómeno que depende
de la temperatura
Tipos de electroforesis
Las separaciones electroforéticas se llevan a cabo habitualmente en dos
modalidades que difieren notablemente: electroforesis convencional y
electroforesis capilar.
La primera es la metodología clásica que ha sido utilizada durante muchos años
para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de interés biológico y
bioquímico. Las separaciones convencionales se llevan a cabo sobre una capa
delgada y plana o placa de un gel poroso que contiene un tampon acuoso en el
interior de sus poros.
Normalmente, esta placa tiene unas dimensiones de unos pocos centímetros de
lado, y al igual que las placas de cromatografíca en capa fina, es capaz de separar
varias muestras simultáneamente. Las muestras se disponen como manchas o
bandas sobre la placa, y se aplica el potencial de corriente continua, a través de la
placa, durante un período de tiempo fijo. Cuando se juzga que las separaciones se
han completado, se interrumpe el paso de la corriente, y las especies separadas se
detienen para visualizarse de modo similar
La electroforesis convencional es, actualmente, la técnica de separacion más
ampliamente utilizada por biólogos y bioquímicos.
FUNDAMENTO DE LAS SEPARACIONES ELECTROFORETICAS
La velocidad de migración de un ion, v, en centímetros por segundo, en el seno
de un campo eléctrico, es igual al producto de la intensidad del campo
eléctrico E (V cm-1) por la movilidad electroforética µe (cm2V-1s-1 ), esto es:
v = µeE
La movilidad electroforética es directamente proporcional a la carga eléctrica
del analito e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento. El campo eléctrico actúa solamente sobre los iones. Si dos
especies difieren bien en la carga o en las fuerzas de rozamiento, se moverán a
través del tampón y se separan. Las especies neutras no se separan
ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis convencional ha sido y continua siendo de gran utilidad; sin
embargo este tipo de separación electroforética es lenta, laboriosa y difícil de
automatizar, y además no proporciona resultados cuantitativos precisos. La
investigación y la aplicación de la electroforesis llevada a cabo en capilares
tuvo un crecimiento explosivo durante la segunda mitad de la década de los
ochenta, ello unido a la aparición de varios instrumentos comerciales.
La electroforesis capilar da lugar a separaciones con volúmenes de muestra
extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL, en contraste con la
electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra del
orden de µL) y con una elevada resolución y rapidez. Además, las especies
separadas eluyen de uno de los extremos del capilar
VELOCIDADES DE MIGRACION Y ALTURAS DE PLATO EN ELECTROFORESIS CAPILAR
Esta relacion indica que es necesario que se apliquen potenciales elevados para obtener
migraciones ionicas rápidas y una rápida separacion. Si bien es deseable que las separaciones
sean rápidas, es aún más importante obtener separaciones de alta resolucion. Por ello, se hace
necesario examinar los factores que determinan la resolucion en la electroforesis.
INTRODUCCION DE LA MUESTRA
En el método de inyección electrocinética, se retiran del deposito del tampón uno de
los extremos del capilar y el correspondiente electrodo, y se colocan en un pequeño
recipiente donde está situada la muestra. Se aplica entonces un potencial durante un
tiempo determinado, lo que hace que la muestra penetre en el capilar debido a la
actuación conjunta de los fenómenos de migración iónica y flujo electro osmótico. El
extremo del capilar y el electrodo vuelven a introducirse en la disolución tampón,
donde se mantienen durante el resto del proceso de separación. Esta técnica de
inyección es discriminatoria al introducir mayor cantidad de los iones más móviles
respecto a los más lentos.
En el método de inyección por presión, el extremo del capilar se coloca
momentáneamente en un pequeño recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una
diferencia de presión para conducir la muestra al interior del capilar. Esta diferencia de
presión proviene de aplicar vacío en el extremo del detector o de la aplicación de
presión en el recipiente que contiene la muestra, o bien se consigue por elevación del
extremo que contiene la muestra. La inyección por presión no diferencia los iones
según su movilidad; sin embargo, no puede utilizarse en capilares rellenos de gel.
modalidades de detección en electroforesis capilar'
Fundamento de la
detección
Espectrometría
Absorción
Fluorescencia
Derivatizacion pre
columna
Derivatizacion en
columna
Derivatizacion pos
columna
Fluorescencia indirecta
Lentes térmicas
Ramanc
EspectrometrÃa de
masas
Electroquímica
Conductividadc
Potenciometria
Amperometria
Radiometriac
Limite de deteccion (moles
detectados)
10-15-10-13
10-17-10-20
8 x 10-16
2 x 10-17
5 x 10-17
4 x 10-17
2 x 10-15
1 x 10-17
1 x 10-16
No
7 x 10-19
1 x 10-19
APLICACIONES DE LA
ELECTROFORESIS CAPILAR
Las separaciones por electroforesis capilar se llevan a cabo de distintas
maneras, también llamadas modalidades. Es interesante destacar que estas
modalidades se emplearon en primer lugar en la electroforesis convencional, y
se adaptaron posteriormente a la electroforesis capilar. Estas modalidades son
la electroforesis capilar de zona (CZE), electroforesis capilar en gel (CGE),
isoelectroenfoque capilar (CIEF) e isotacoforesis capilar (CITP).
Métodos electroforéticos zonales.
Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos.
Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican
pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido,
que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en general
polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las
moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los
flujos de convección del solvente.
Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón,
poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este método
tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de
proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es
mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es
simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el
soporte y dos electrodos
Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida
por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de
propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y
reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad
mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten
buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además
tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede
modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente
cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.
Se utiliza para la separación de especies
anfóteras como aminoácidos y proteínas que
presentan en su estructura un grupo
carboxílico y un grupo amino