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Tarea Promocional N° 3 Electroforesis de Proteínas Plasmáticas. Grupo 13 Profesor: Juan Luis Zarza Año: 2014 Introducción El termino electroforesis se refiere a una técnica separativa que emplea un campo eléctrico aplicado que actúa sobre partículas cargadas causando su movimiento a través de una matriz. El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937, quien desarrollo el concepto de frente móvil (moving boundary), que más tarde se conoció como electroforesis de zona y se usó para separar proteínas en solución. Entre 1940 y 1960 sobrevino un desarrollo de la electroforesis, aplicándose a diversas moléculas, desde proteínas grandes hasta aminoácidos e iones inorgánicos. A la electroforesis de zona se sumaron además el isoelectroenfoque y la isotacoforesis, basadas en diferentes propiedades físicas. Esto permitió realizar análisis separados a una misma muestra o bien propiedades físicas. Esto permitió realizar análisis separados en una misma muestra o bien realizar combinaciones de métodos. La distinción entre los tres métodos también se da a nivel de las matrices empleadas en cada una, que brindan ventajas comparativas dependiendo de la técnica y de la muestra a separar. Asi, se han usado geles de polímeros, papel y capilares. El papel es fácil de usar dado que no es necesaria una preparación previa, pero con el tiempo se ha privilegiado el uso de matrices tipo gel. Smithies en 1955 introdujo el uso de geles de almidón y dos años más tarde Kohn uso acetato de celulosa. En 1959 Ornstein y Davis y Raymond y Weintraub usan un gel de poliacrilamida. Los capilares fueron introducidos por Jorgenson y Lukacs a principios de los 80. Las técnicas de detección han evolucionado con los años también. Algunas de estas técnicas incluyen teñido químico, técnicas inmunoelectroforeticas, análisis bidimensional y varias técnicas de inmovilización en membranas. Hoy la electroforesis se aplica principalmente al análisis de muestras biológicas, es ampliamente usada en análisis de DNA y en la investigación biológica. Principio General La electroforesis separa partículas en base al movimiento inducido por un campo eléctrico. El campo eléctrico resulta en la aplicación de una fuerza sobre las partículas que es proporcional a su carga o potencial de superficie. La fuerza resultante induce una velocidad diferente en las distintas macromoléculas. En otras palabras, si se aplica un campo eléctrico durante un periodo de tiempo dado a través de una matriz que contiene una mezcla de macromoléculas con diferentes potenciales de superficie, las moléculas estarán en diferentes lugares al detener el campo. El estudio del movimiento electroforético se enfoca en el potencial eléctrico en la superficie de la macromolécula, y la relación de ese potencial con la velocidad del objeto en el campo eléctrico. El potencial de superficie está causado por la interacción de la superficie de la molécula con el medio que la rodea. • Consiste en la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico, produciendo la migración de las partículas hacia el ánodo o el cátodo (electrodos – y +) en dependencia de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. • Es un método de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad. Aporta un potente criterio de pureza. • Permite evaluar las características acido básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo. • Permite determinar peso molecular, punto isoeléctrico y numero de cadenas polipeptídicas. Tipos de análisis electroforético Los diferentes tipo de análisis pueden ser distinguidos por las propiedades físicas de la muestra que se van a emplear para su separación o por el tipo de matriz usadas. Los cuatro tipos básicos que se fundamentan en diferentes propiedades físicas son: límite móvil, electroforesis de zona, isoelectroenfoque e isotacoforesis. Limite Móvil: en este método la muestra se coloca en una solución buffer en un tubo con forma de U. Se aplica un campo eléctrico por medio de electrodos sumergidos en cada extremo del tubo. Las partículas de la muestra pueden entonces migrar en relación al campo eléctrico. Este método unas solamente la carga de la partícula y el potencial Z resultante cuando la muestra se encuentra en contacto con el buffer. La dirección y la velocidad de la migración están determinada por la movilidad electroforética de cada componente. Electroforesis de Zona: esta es la forma más practicada de electroforesis. Este método es parecido al límite de movilidad dado que cada componente migra de acuerdo con su propia movilidad. La gran diferencia es que se realiza sobre un medio de soporte para lograr la completa separación de cada componente. Otra de las diferencias es que la muestra es aplicada en una banda angosta o zona. En la electroforesis de límite móvil los componentes tienden a mezclarse debido a convección causada por gradientes de densidad o temperatura o por vibraciones mecánicas. A través del uso de soportes estos problemas son minimizados. Los medios más comunes son geles papel o capilares. En la electroforesis de zona los componentes son aplicados en una banda angosta rodeada por buffer. Se aplica un campo eléctrico y cada banda migra con una velocidad característica determinada por su movilidad electroforética. Cada componente separa de su vecino para formar una zona pura. Las zonas puras se estabilizan por medio del soporte, que previene el mezclado debido a corrientes de convección. Los extremos del tubo o de las placas se sumergen en un buffer apropiado y luego se aplica el campo eléctrico para comenzar el proceso separativo, este método da una rápida idea de la cantidad de componentes que tiene una mezcla biológica. Isoelectroenfoque: separa componentes usando un gradiente de pH. El gradiente va desde un pH bajo en el ánodo hasta que encuentre un pH igual a su punto isoeléctrico, donde la carga neta es 0 y en consecuencia se detiene. Cuando todos los componentes se detienen se llega al estado estacionario. Se usan geles como soporte, lo que minimiza la difusión una vez que se llega al estado estacionario y el campo eléctrico es eliminado. La clave del método es lograr un buen gradiente de pH. Isotacoforesis: Electroforesis a velocidad uniforme tiempo transcurrido en el capilar bajo condiciones isotacóforeticas es independiente de la velocidad. Se basa en la separación por desplazamiento. El capilar se debe llenar de un electrolito líder, éste debe tener una gran movilidad, mayor a la de los componentes a separar, luego se introduce un electrolito terminal, de movilidad menor a la muestra. Objetivos GENERAL Aplicar de manera teórica y experimental el análisis de proteínas plasmáticas, valiéndose de técnicas como la electroforesis. ESPECÍFICOS Aplicar los conocimientos adquiridos en la práctica experimental. Utilizar de manera adecuada e identificar los diferentes equipos, implementos y reactivos del laboratorio. Analizar y justificar de acuerdo a las propiedades de las proteínas y los resultados obtenidos. Conocer y estudiar aplicaciones clínicas y bioquímicas en las que son útiles estas técnicas de separación. Identificar las ventajas de los diferentes métodos de separación. Desarrollo 1- Velocidad de migración La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente al coeficiente de fricción (f) según la forma y el tamaño de la partícula. V= q E / f 2- Movilidad electroforética: La movilidad electroforética (me) es un caso particular de la velocidad de migración de un ion, cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Su signo es igual a la de la carga de la partícula. La movilidad, µ se define como la velocidad que toma la partícula por unidad de campo. µ= v/E = q/f q.E=𝑭𝐟 q.E=6𝝅nr v v=q.E / 6𝝅nr µ=v/E = q/6𝝅 Factores que influyen en la movilidad electroforética Densidad de carga de la molécula (relación carga / peso) Voltaje aplicado Porosidad del gel de electroforesis Punto isoeléctrico: Por debajo la partícula tiene carga (+ ) y migra hacia el cátodo. Por debajo la partícula tiene carga (–) y migra hacia el ánodo Actúan también dos fuerzas adicionales: - Fricción con el solvente (dificulta el movimiento) - Movimiento browniano (el movimiento molecular es aleatorio, por EK propia) La sumatoria de fuerzas provoca que las moléculas no migren de manera homogénea. Los iones comienzan a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo. Si se aumenta la intensidad del campo eléctrico, se puede acelerar la migración sin variar la difusión del frente, provocando que este sea más compacto, esto mejora la definición del mismo. Esto está limitado por la capacidad de la solución para disipar el calor generado por paso de la corriente eléctrica. La presencia del gel hace que las moléculas de mayor tamaño sufran mayor resistencia al avanzar por los poros del gel que las moléculas más pequeñas. El solvente puede producir una fricción diferente sobre distintas moléculas, pero este efecto es despreciable cuando no existe el entramado del gel. Factores que influyen en la electroforesis 3- Medios de soporte para realizar la electroforesis La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones mecánicas y corrientes de convección durante la separación. En algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa fricción, por lo que el mecanismo principal de separación es la magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de soporte (“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por polímeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las moléculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electroforético. Como consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren una alta relevancia en la separación. Medios de baja fricción papel acetato de celulosa separación principalmente por carga Medios de elevada fricción gel de almidón gel de agarosa gel de poliacrilamida gel de agarosa+poliacrilamida separación por carga, tamaño y forma Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la celulosa. Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción; baja tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar los componentes separados. Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida. Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad. Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa. Disposición del soporte En papel, para aminoácidos u otras moléculas pequeñas, y en soportes similares (especialmente, acetato de celulosa), para proteínas. En gel de almidón o de agarosa, para proteínas y especialmente para ácidos nucleicos. Casi siempre el tampón cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento sufrido al pasar la corriente). Soporte impregnado de disolución tampón por capilaridad, disuelve la muestra y mantiene el contacto eléctrico. Se aplica la muestra depositándola (pipeta o aplicador específico) como una gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un “pocillo” creado en el gel. FUENTE DE PODER: La corriente eléctrica es suministrada por una fuente rectificadora de onda completa que transforma la corriente alternada de 220 V y 50 ciclos por segundo en corriente continua purificada. CÁMARA DE SEPARACIÓN: Las cubas electroforéticas consisten en cubetas de poliestireno tabicadas con planchas de poliestireno de alto impacto y electrodos de platino. PROTEÍNOGRAMA Análisis de proteínas plasmáticas en suero humano utilizando electroforesis en papel de celulosa. El objetivo de esta técnica es poder analizar de forma rápida la presencia de proteínas plasmáticas que podemos encontrar en una muestra de suero sanguíneo Protocolo de laboratorio: Reactivos: Solución buffer: Buffer Borato-Acetato pH= 8.6 Solución colorante: Negro Amido: Amidoschwartz 0.5 g. Alcohol metílico 45 ml Agua destilada 45 ml Ácido acético 10 ml Líquido Lavado Alcohol metílico 250ml….62.5 ml Agua destilada 225ml…56.25 ml Ácido acético 25ml…..6.25 ml Líquido de Elución: Alcohol metílico 50% Agua destilada 50% Líquido de transparentización: Alcohol metílico 16ml Ácido acético 4ml Revelado o detección Se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se unan a las proteínas. Suelen ser colorantes orgánicos que interaccionan con las proteínas de forma poco selectiva, principalmente electrostática. Ejemplos: azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo Ponceau. Preparación La sangre entera, está compuesta de agua, proteínas, electrolitos y células o elementos formes como las células blancas que son los encargados de la defensa, las plaquetas encargadas de la coagulación, y los hematíes o eritrocitos (células rojas), encargados de transportar el O2 a los tejidos. El suero (porción líquida de la sangre que contiene a los electrolitos, agua y proteínas) se obtiene dejando coagular la sangre entera, unos minutos en un tubo de ensayo. Luego se divisaran dos fases, un decantado (coágulo) que corresponde a la fase semisólida celular. El sobrenadante (suero) se extrae con una pipeta Pasteur. Descripción de las proteínas plasmáticas: Albúmina Globulina Alfa 1 Globulina alfa 2 Globulina Beta Globulina gamma Técnica: 1. Unos 10 o 15 minutos antes de utilizar las tiras de cellogel se las suspenden en un recipiente que contenga la solucion buffer. La tira de cellogel presenta un lado con la superficie más opaca que es el de la parte superior y es en el que se realiza la siembra de la muestra, y otro más brillante que se sitúa en el lado inferior 2. Se remueve el exceso de líquido entre dos hojas de papel absorbente. 3. Se procede a la siembra del suero, colocándolo de una manera que quede a dos cm. del cátodo. Y de tal modo que la cara mate quede hacia arriba Cuando se realiza la siembra, con el hansa de 3 micro litros, se debe tener la consideración de que esta no tiene que estar sobre cargada y además no debe efectuarse mucha presión sobre el cellogel. 4. Se extiende sobre el soporte de la cuba electroforética, la misma debe quedar tensa y plana. 5. Se lleva el soporte a la cubeta teniendo en cuenta que los extremos de las tiras deben tener contacto con el buffer de la cuba. Se conecta el aparato con un voltaje fijo de 200 V por aproximadamente 30 minutos. 6. Una vez finalizada la electroforesis, se deja escurrir la tira sin secar y se sumerge en la solución colorante durante 5 minutos. Seguidamente se lava 3 a 4 veces con el líquido de lavado. 7. Una vez que el lavado se terminó, se procede a colocar el eluyente, y por último se procede al transparentado, el cual permite otorgar a el cellogel un aspecto transparente. Para posterior secado en estufa a 60ºC por 3 minutos. 8. Después se procede a la determinación cuantitativa cortando las fracciones coloreadas e introduciéndolas en tubos de ensayos preparados en serie de 5. se coloca a cada tubo 3 ml del eluyente. 9. Se lee en fotocolorimetro a 620nm. O bien por medio de un densímetro que permite cuantificar las proteínas además de graficarlas en función de su concentración en suero. Bibliografía Maidana, J. Armando, Zarza, Juan Luis y col. (Compiladores). Práctico de Electroforesis. Guías Unificadas del Departamento de Física Ed. Universitaria 2008 http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003540.htm http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/6798/mod_resource/content/0 /Electroforesis.pdf Raymond A. Serway, John W. Jewett Jr, Física para Ciencias e Ingenierías, Vol. II, Sexta Edición 2004 Ed. Thomson