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Electroforesis en proteínas
plasmáticas
Comisión: Grupo E - Jueves 14:30hs.
Profesor: Juan Luis Zarza
Introducción
La corrida electroforética fue empleada por primera vez en 1937 por Teselius.
Este es un método analítico- semipreparativo en el que se separan biomoléculas.
Permite evaluar las características acido básicas de las proteínas presentes en un
extracto crudo como así determinar peso molecular, punto isoeléctrico y numero de
cadenas polipeptídicas.
Es el movimiento de partículas cargadas (micelas o iones coloidales) a través
de su medio de dispersión sometida a un campo eléctrico. Algunos autores prefieren
el término de ionoforesis para designar la migración de iones pequeños.
En bioquímica clínica la migración electroforética se utiliza para aislar los
principales grupos de proteínas del suero, y a veces de la orina, para reconocer
cambios en las concentraciones relativas y para identificar proteínas anormales.
Dicha migración electroforética, corrientemente es estudiada en soportes o
sustratos diversos como ser papel de filtro, agarosa, acetato de celulosa, gel de
almidón, gel de poliacrilamida etc. Embebidas en soluciones buffers.
Fundamentos Teóricos
Velocidad de migración
La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente
proporcional al efecto de su carga efectiva (q) y el gradiente del potencial
eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción f (relativo)
según la forma y el tamaño de la partícula.
v=qE/f
La velocidad de migración depende de:
 La densidad de carga (relación carga/peso).
 Del voltaje aplicado.


Si se aumenta se produce calentamiento.
Si disminuye pobre separación por difusión prolongada.
 De la porosidad del gel.
 pH (otorga la carga neta de la partícula y puede modificarla).
 Punto isoeléctrico: es el pH la cual la carga neta de la biomolécula es igual a
cero y esta no migra.
Por debajo del punto isoeléctrico la partícula tiene carga (+) y migra hacia el
cátodo.
Por encima del punto isoeléctrico la partícula tiene carga (–) y migra hacia el
ánodo.
Movilidad electroforética
Es el caso particular de la migración de un ión cuando se aplica un campo
de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga de la partícula.
•
la movilidad (u): es la velocidad que toma la partícula por unidad de
campo.
u= v / E = q / f
(u) depende del coeficiente de fricción, que responde a parámetros físicos de
la molécula, que pueden dar información del tamaño y forma de las moléculas.
Sobre el movimiento de las moléculas actúan también dos fuerzas adicionales:
• fricción con el solvente (dificulta el movimiento).
• movimiento browniano (el movimiento molecular es aleatorio, por EK
propia)
La sumatoria de fuerzas provoca que las moléculas no migren de manera
homogénea. Los iones comienzan a moverse formando un frente cuya anchura
aumentará con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente se puede utilizar un medio que oponga
más resistencia al movimiento como por ejemplo un gel. Entonces la migración
será más lenta pero el ensanchamiento del frente será reducido.
Si se aumenta la intensidad del campo eléctrico, se puede acelerar la
migración sin variar la difusión del frente, provocando que este sea más
compacto, esto mejora la definición del mismo. Esto está limitado por la
capacidad de la solución para disipar el calor generado por paso de la
corriente eléctrica.
La presencia del gel hace que las moléculas de mayor tamaño sufran
mayor resistencia al avanzar por los poros del gel que las moléculas más
pequeñas.
El solvente puede producir una fricción diferente sobre distintas
moléculas, pero este efecto es despreciable cuando no existe el entramado
del gel.
Factores que influyen en la electroforesis:
• El pH: dentro de los electrolitos más habituales es el NaCl o el TRIS-HCl,
ambos presentan el ión Cl -, que tiene como consecuencia el aumento
del pH de la disolución, que aunque esta tamponada puede dañar la
muestra.
• El borato: este tampón no es del todo inerte y puede originar bandas
desdobladas, correspondientes a una sola proteína, una pura y otra
modificada por el borato.
• El calentamiento: el gel se calienta debido al paso de la corriente
eléctrica (efecto joule), esto puede desnaturalizar proteínas.
Tipos de electroforesis:
• Convencional:
Utilizada para la detección, control de pureza, caracterización y
cuantificación (por comparación con controles), así como para la purificación
y preparación de fragmentos de ADN Y ARN.
Se lleva a cabo sobre una capa delgada y placa de gel, semisólido y
poroso que contiene un tampón en el interior de sus poros que ofrece
resistencia al movimiento. En esta placa se pueden separar varias muestras
simultáneamente.
Se aplica un potencial de corriente continua por un tiempo fijo,
transcurrido éste se corta la corriente, una vez que se produjo la separación
de las especies se realiza la coloración para visualizarlas,
Se utilizan geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen
entre sus ramificaciones espacios llenos de líquido. Esto permite la
electroforesis: separación por relación carga/tamaño y el tamizado:
separación por tamaño.
Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida y la concentración
del gel define el poder de reticulación.
• Capilar:
Surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los
compuestos mejora a medida que aumenta la intensidad del campo eléctrico
aplicado basado en la relación carga/masa. Reduce el efecto Joule
aumentando la disipación del calor generado.
Se realiza electroforesis en un tubo capilar de menos de 0.1 mm de
diámetro y 50 a 100 cm. de longitud. Se utilizan volúmenes pequeños de 0,1 a
10 nL., con una elevada resolución y rapidez.
Tipos de electroforesis capilar:
 Electroforesis capilar en gel:
Combina la técnica de electroforesis con la cromatografía de reparto. La
separación se da en función de la migración electroforética y el peso
molecular.
Se lleva a cabo en la matriz polimérica de un gel poroso contenido en un
tubo capilar.
 E. Capilar de zona
Basada en la separación de analitos según la relación carga/tamaño. La
composición del tampón es constante en toda la zona de separación. Los
componentes de la mezcla migran cada uno según su propia movilidad y se
separan en zonas que pueden estar completamente resueltas o parcialmente
solapadas. No permite separar compuestos neutros.
 Enfoque isoeléctrico
Se basa en establecer un gradiente de pH estable en una disolución o gel.
Este gradiente se logra por un conjunto de anfolitos que migran hasta alcanzar
sus puntos isoeléctricos. Cuando en el gradiente de pH se introduce una
proteína, cada zona intercambia protones con la muestra proteica generando
una separación isoeléctrica.
 Isotacoforesis
Electroforesis a velocidad uniforme, el tiempo transcurrido en el capilar
bajo condiciones isotacóforeticas es independiente de la velocidad. Se basa en
la separación por desplazamiento.
El capilar se debe llenar de un electrolito líder, éste debe tener una gran
movilidad, mayor a la de los componentes a separar, luego se introduce un
electrolito terminal, de movilidad menor a la muestra.
La corriente eléctrica es suministrada por una fuente rectificadora de onda
completa que transforma la corriente alternada de 220 V y 50 ciclos por
segundo en corriente continua purificada.
CÁMARA DE SEPARACIÓN:
Las cubas electroforéticas consisten en cubetas de poliestireno
tabicadas con planchas de poliestireno de alto impacto y electrodos de platino.
PROTEÍNOGRAMA
Es el análisis de proteínas plasmáticas en suero humano utilizando
electroforesis en papel de celulosa.
El objetivo de esta técnica es poder analizar de forma rápida la presencia
de proteínas plasmáticas que podemos encontrar en una muestra de suero
sanguíneo mediante un método bioquímico, basado en reacciones
enzimáticas. Este método también nos permite cuantificarlas.
Consiste en obtener las proteínas presentes en el suero sanguíneo
humano. Se lo somete a una electroforesis para lograr la migración de las
proteínas que será diferencial dependiendo esta diferencia de la carga
eléctrica de la proteína.
Posteriormente, teñiremos, y valoraremos los resultados.
Marco teórico
 Preparación de la muestra:
La sangre entera, está compuesta de agua, proteínas, electrolitos y células o
elementos formes como las células blancas que son los encargados de la
defensa, las plaquetas encargadas de la coagulación, y los hematíes o
eritrocitos (células rojas), encargados de transportar el O2 a los tejidos.
El suero (porción líquida de la sangre que contiene a los electrolitos, agua y
proteínas) se obtiene dejando coagular la sangre entera, unos minutos en un
tubo de ensayo. Luego se divisaran dos fases, un decantado (coágulo) que
corresponde a la fase semisólida celular. El sobrenadante (suero) se extrae con
una pipeta Pasteur.
Tipos de proteínas plasmáticas:
Las principales proteínas sanguíneas son la albúmina y las globulinas, las
cuales son más pequeñas y menos numerosas que la albumina. Las globulinas
se dividen en alfa, beta y gamaglobulinas.
Albumina
La albúmina (PM de 69.000) es una proteína que se encuentra en gran
proporción en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre y
a su vez la más abundante en el ser humano. Es sintetizada en el hígado.
La concentración normal en la sangre humana oscila entre 3,5 y 5,0
gramos por decilitro, y supone un 54,31% de la proteína plasmática
La albúmina tiene carga eléctrica negativa. La membrana basal del
glomérulo renal, también está cargada negativamente, lo que impide la
filtración glomerular de la albúmina a la orina. En el síndrome nefrótico, esta
propiedad es menor, y se pierde gran cantidad de albúmina por la orina.
Tipos de albúmina
Seroalbúmina: Es la proteína del suero sanguíneo.
Ovoalbúmina: Es la albúmina de la clara del huevo.
Lactoalbúmina: Es la albúmina de la leche.
Causas de la deficiencia de albúmina:




Cirrosis hepática: Por disminución en su síntesis hepática.
Desnutrición.
Síndrome nefrótico: Por aumento en su excreción.
Trastornos intestinales: Pérdida en la absorción de aminoácidos durante
la digestión y pérdida por las diarreas.
 Enfermedades
genéticas
que
provocan
hipoalbuminemia
(infrecuentes).
Globulinas
Las globulinas son un grupo de proteínas insolubles en agua que se
encuentran en todos los animales y vegetales.
Entre las globulinas más importantes destacan las seroglobulinas (de la
sangre), las lactoglobulinas (de la leche), las ovoglobulinas (del huevo), la
legúmina, el fibrinógeno, los anticuerpos (α-globulinas) y numerosas proteínas
de las semillas.
Las globulinas son un importante componente de la sangre,
específicamente del plasma. Éstas se pueden dividir en varios grupos.
Principales grupos de globulinas
- globulinas alfa 1 y 2
- globulinas beta
- globulina gamma
Algunas de las siguientes globulinas se clasifican como "reactivo de fase
aguda". Esto quiere decir que son proteínas que van a aumentar o disminuir
su concentración en el plasma, a partir de los procesos inflamatorios o
infecciosos. Y que van a servir para determinar ciertas patologías.
La concentración promedio de las alfa globulinas en sangre es de 1,5
g/dl, mientras que la concentración de albumina es aproximadamente 4,2 g/dl
y la de las demás proteínas séricas, menor que 0,5 g/dl.
La concentración promedio de las beta globulinas en sangre es menor
que 0,5 g/dl.
Protocolo de laboratorio:
Reactivos:
 Solución buffer:
Buffer Borato-Acetato
pH=8.6
 Solución colorante:
Negro Amido:
Amidoschwartz…….0.5 g.
Alcohol metílico…….45 ml
Agua destilada……...45 ml
Ácido acético………..10 ml
 Líquido Lavado:
Alcohol metilico…….250ml….62.5 ml
Agua destilada……...225ml…56.25 ml
Ácido acético………..25ml…..6.25 ml
 Líquido de Elución:
Alcohol metilico…….50%
Agua destilada……..50%
 Líquido de transparentización:
Alcohol metilico…….16ml
Ácido acético……….4ml
 Conservación de las tiras de cellogel:
Se trasvasan las tiras de cellogel a otro envase que cierre herméticamente
y que contenga metanol al 40%.
Estas tiras deben permanecer siempre en medio líquido ya que si se
secan al aire pierden sus dimensiones y su estado de gelidificación, dejando de
ser útiles para la electroforesis.
Deben manejarse con pinzas tomándolas de los extremos teniendo la
precaución de no estirarlas ni romperlas.
La tira de cellogel presenta un lado con la superficie más opaca que es
el de la parte superior y es en el que se realiza la siembra de la muestra, y otro
más brillante que se sitúa en el lado inferior.
Aplicación del suero:
Puede hacerse con los más variados dispositivos que presentan bordes
completamente lisos para no rasgar la superficie de la tira y que permiten
depositar escasa cantidad de suero.
La mejor forma de depositar el suero es mediante aplicadores que se
fabrican comercialmente y que consisten en una pieza horizontal que lleva en
un punto una guía para que se deslice a través de otra pieza en forma vertical
y que hace el movimiento de ascenso y de descenso.
Técnica:
1- Unos 10 o 15 minutos antes de utilizar las tiras de cellogel se las
suspenden en un recipiente que contenga la solución buffer.
2- Se remueve el exceso de líquido entre dos hojas de papel absorbente.
3- Se procede a la siembra del suero, colocándolo de una manera que
quede a dos cm. del cátodo. Y de tal modo que la cara mate quede hacia
arriba. Cuando se realiza la siembra, con el hansa de 3 microlitros, se
debe tener la consideración de que esta no tiene que estar sobre
cargada y además no debe efectuarse mucha presión sobre el cellogel.
4- Se extiende sobre el soporte de la cuba electroforética, la misma debe
quedar tensa y plana.
5- Se lleva el soporte a la cubeta teniendo en cuenta que los extremos de
las tiras deben tener contacto con el buffer de la cuba. Se conecta el
aparato con un voltaje fijo de 200 V por aproximadamente 30 minutos.
6- Una vez finalizada la electroforesis, se deja escurrir la tira sin secar y se
sumerge en la solución colorante durante 5 minutos. Seguidamente se
lava 3 a 4 veces con el líquido de lavado.
7- Una vez que el lavado se terminó, se procede a colocar el eluyente, y
por último se procede al transparentado, el cual permite otorgarle al
cellogel un aspecto transparente. Para posterior secado en estufa a 60ºC
por 3 minutos.
8- Después se procede a la determinación cuantitativa cortando las
fracciones coloreadas e introduciéndolas en tubos de ensayos preparados
en serie de 5. Se coloca a cada tubo 3 ml del eluyente.
Se lee en fotocolorimetro a 620nm. O bien por medio de un densímetro
que permite cuantificar las proteínas además de graficarlas en función de su
concentración en suero.