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TRABAJO PRACTICO Nº 10
PAMELA SOLEDAD CUENCA
CONTENIDOS
Velocidad de migración.
Movilidad electroforética.
Fundamentos y gráficos.
Factores que influyen.
Tipos de Electroforesis.
Equipamiento y Aplicaciones en análisis genético.
OBJETIVOS
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Describir el fenómeno de electroforesis y las técnicas para producirla
Discriminar los factores que influyen en la movilidad electroforética
Justificar el uso de un campo eléctrico en el proceso de separación
de biomoléculas
Fundamentos teóricos
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Fue empleada por primera vez en 1937 por Teselius
Es un método analítico- semipreparativo en el que se separan biomoléculas
en dependencia entre otros factores de su carga y bajo la acción de un
campo eléctrico.
Consiste en la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo
eléctrico, produciendo la migración de las partículas hacia el ánodo o el
cátodo (electrodos – y + ) en dependencia de su carga, peso molecular y
estructura tridimensional.
Es un método de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad.
Aporta un potente criterio de pureza.
Permite evaluar las características acido básicas de las proteínas presentes
en un extracto crudo.
Permite determinar peso molecular, punto isoelectrico y numero de
cadenas polipeptídicas.
1- Velocidad de migración:
La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al
efecto de su carga efectiva (q) y el gradiente del potencial eléctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente de fricción f (relativo) según la forma y
el tamaño de la partícula.
v=qE/f
2- Movilidad electroforética:
Es el caso particular de la migración de un ión cuando se aplica un campo
de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga de la partícula.
• la movilidad (u): es la velocidad que toma la partícula por unidad de campo.
u= v / E = q / f
(u) depende del coeficiente de fricción, que responde a parámetros físicos
de la molécula, que pueden dar información del tamaño y forma de las
moléculas.
La velocidad de migración depende de:
 La densidad de carga (relación carga/peso)
 Del voltaje aplicado.
Si se aumenta se produce calentamiento.
Si disminuye pobre separación por difusión prolongada
 De la porosidad del gel.
 pH (otorga la carga neta de la partícula y puede modificarla)
 Punto isoeléctrico:
Por debajo la partícula tiene carga (+ ) y migra hacia el cátodo
Por debajo la partícula tiene carga (–) y migra hacia el ánodo.
3- Fundamentos y gráficos:
Mezcla de
moléculas ionizadas
de q neta,
sometidas a un
campo eléctrico.
Sobre el movimiento de las moléculas actúan también dos fuerzas
adicionales:
• fricción con el solvente (dificulta el movimiento)
• movimiento browniano (el movimiento molecular es aleatorio, por EK
propia)
La sumatoria de fuerzas provoca que las moléculas no migren de
manera homogénea. Los iones comienzan a moverse formando un
frente cuya anchura aumentará con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente
se puede utilizar un medio que
oponga mas resistencia al movimiento
como por ejemplo un gel. Entonces la
migración será mas lenta pero el
ensanchamiento del frente será
reducido.
•Si se aumenta la intensidad del campo eléctrico, se puede acelerar la migración sin
variar la difusión del frente, provocando que este sea mas compacto, esto mejora la
definición del mismo. Esto esta limitado por la capacidad de la solución para disipar
el calor generado por paso de la corriente eléctrica.
• La presencia del gel hace que las moléculas de mayor tamaño sufran mayor
resistencia al avanzar por los poros del gel que las moléculas mas pequeñas.
•El solvente puede producir una fricción diferente sobre distintas moléculas, pero este
efecto es despreciable cuando no existe el entramado del gel.
4- Factores que influyen en la electroforesis:
1. El pH: dentro de los electrolitos mas habituales es el NaCl o el TRIS-HCl, ambos
presentan el ión Cl -, que tiene como consecuencia el aumento del pH de la
disolución, que aunque esta tamponada puede dañar la muestra.
2. El borato: este tampón no es del todo inerte y puede originar bandas desdobladas,
correspondientes a una sola proteína, una pura y otra modificada por el borato.
3. El calentamiento: el gel se calienta debido al paso de la corriente eléctrica (efecto
joule), esto puede desnaturalizar proteínas.
5- Tipos de electroforesis
ELECTROFORESIS
Electroforesis
convencional
Electroforesis
capilar
E.
capilar en gel
E. capilar de Zona.
Enfoque isoeléctrico
Isotacoforesis
Electroforesis convencional:
 Es muy utilizada para la detección, control de pureza, caracterización y
cuantificación (por comparación con controles), así como para la
purificación y preparación de fragmentos de ADN Y ARN.
 Se lleva a cabo sobre una capa delgada y placa de gel, semisólido y poroso
que contiene un tampón en el interior de sus poros que ofrece resistencia al
movimiento.
 Se pueden separar varias muestras simultáneamente.
 Se aplica un potencial de corriente continua por un tiempo fijo, transcurrido
éste se corta la corriente. una vez que se produjo la separación de las
especies se realiza la coloración para visualizarlas,
 Se utilizan geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen
entre sus ramificaciones espacios llenos de liquido. Esto permite la
electroforesis: separación por relación carga/tamaño y el tamizado:
separación por tamaño.
 Los geles mas comunes son agarosa y poliacrilamida.
 La concentración del gel define el poder de reticulación.
Electroforesis capilar (CE):
 Surge debido a que la velocidad de separación
y resolución de los compuestos mejora a
medida que aumenta la intensidad del campo
eléctrico aplicado
 Se realiza electroforesis en un tubo capilar de
menos de 0.1 mm de diámetro y 50 a 100 cm.
de longitud
 Reduce el efecto Joule aumentando la
disipación del calor generado
 El mecanismo de separación esta basado en la
relación carga/masa
 Se utilizan volúmenes pequeños de 0,1 a 10
nL., con una elevada resolución y rapidez.
Tipos de CE.:
 Electroforesis capilar en gel
 E. Capilar de zona
 Enfoque isoeléctrico
 Isotacoforesis
Electroforesis capilar en gel
Combina la técnica de electroforesis con la
cromatografía de reparto.
Separación en función de la migración
electroforética y el peso molecular.
Se lleva a cabo en la matriz polimérica de
un gel poroso contenido en un tubo capilar
E. Capilar de zona
Basada en la separación de analitos según
la relación carga/tamaño.
La composición del tampón es constante en
toda la zona de separación.
Los componentes de la mezcla migran
cada uno según su propia movilidad y se
separan en zonas que pueden estar
completamente
resueltas o parcialmente
solapadas.
No permite separar compuestos neutros
Enfoque isoeléctrico
Se basa en establecer un gradiente de pH
estable en una disolución o gel.
Este gradiente se logra por un conjunto de
anfolitos que migran hasta alcanzar sus
puntos isoeléctricos.
Cuando en el gradiente de pH se introduce
una proteína, cada zona intercambia
protones con la muestra proteica generando
una separación isoeléctrica.
Isotacoforesis
Electroforesis a velocidad uniforme tiempo
transcurrido en el capilar bajo condiciones
isotacóforeticas es independiente de la
velocidad.
Se
basa
en
la
separación por
desplazamiento.
El capilar se debe llenar de un electrolito
líder, éste debe tener una gran movilidad,
mayor a la de los componentes a separar,
luego se introduce un electrolito terminal, de
movilidad menor a la muestra.
ELECTROFORESIS:
• Es el movimiento de partículas cargadas (micelas o iones
coloidales) a través de su medio de dispersión sometidas a un
campo eléctrico.
• Algunos autores prefieren el termino de ionoforesis para designar la
migración de iones pequeños.
• En bioquímica clínica la migración electroforética se utiliza para
aislar los principales grupos de proteínas del suero, y a veces de la
orina, para reconocer cambios en las concentraciones relativas y
para identificar proteínas anormales .
• Dicha migración electroforética, corrientemente es estudiada en
soportes o sustratos diversos como ser papel de filtro, agarosa,
acetato de celulosa, gel de almidón, gel de poliacrilamida etc.
Embebidas en soluciones buffers.
6- Equipamiento y aplicaciones al
análisis genético.
En el comercio existen distintos aparatos para electroforesis que constan
de una fuente de poder y una cámara de separación.
FUENTE DE PODER:
La corriente eléctrica es suministrada por una fuente
rectificadora de onda completa que transforma la
corriente alternada de 220 V y 50 ciclos por segundo en
corriente contínua purificada.
CÁMARA DE
SEPARACIÓN:
Las cubas electroforéticas
consisten en cubetas de
poliestireno tabicadas con
planchas de poliestireno de
alto impacto y electrodos de
platino.
Equipamiento y aplicaciones al análisis genético.
Equipos modernos:
PROTEÍNOGRAMA
Análisis de proteínas plasmáticas en suero
humano utilizando electroforesis en papel de
celulosa
El objetivo de esta técnica es poder analizar de forma
rápida la presencia de proteínas plasmáticas que
podemos encontrar en una muestra de suero
sanguíneo, mediante un método bioquímico, basado
en reacciones enzimáticas. Además este método nos
permite cuantificarlas.
El método consiste en obtener las proteínas presentes en
el suero sanguíneo humano.
Se lo somete a una electroforesis para lograr la migración
de las proteínas que será diferencial dependiendo esta
diferencia de la carga eléctrica de la proteína.
Posteriormente, teñiremos, y valoraremos los resultados.
Marco teórico:
1.Preparación de la muestra:
La sangre entera, esta compuesta de agua, proteínas,
electrolitos y células o elementos formes como las células
blancas que son los encargados de la defensa, las plaquetas
encargadas de la coagulación, y los hematíes o eritrocitos
(células rojas), encargados de transportar el O2 a los tejidos.
El suero (porción líquida de la sangre que contiene a los
electrolitos, agua y proteínas) se obtiene dejando coagular la
sangre entera, unos minutos en un tubo de ensayo. Luego se
divisaran dos fases, un decantado (coágulo) que corresponde
a la fase semisólida celular . El sobrenadante (suero) se
extrae con una pipeta Pasteur.
2. Descripción de las proteínas
plasmáticas:
Albúmina
Globulina Alfa 1
Globulina alfa 2
Globulina Beta
Globulina gamma
ALBUMINA
• La albúmina (PM de 69.000) es una proteína que se
encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo,
siendo la principal proteína de la sangre y a su vez la
más abundante en el ser humano. Es sintetizada en el
hígado.
• La concentración normal en la sangre humana oscila
entre 3,5 y 5,0 gramos por decilitro, y supone un 54,31%
de la proteína plasmática
• La albúmina tiene carga eléctrica negativa. La
membrana basal del glomérulo renal, también está
cargada negativamente, lo que impide la filtración
glomerular de la albúmina a la orina. En el síndrome
nefrótico, esta propiedad es menor, y se pierde gran
cantidad de albúmina por la orina.
Tipos de albúmina
Seroalbúmina: Es la proteína del suero
sanguíneo.
Ovoalbúmina: Es la albúmina de la clara
del huevo.
Lactoalbúmina: Es la albúmina de la leche.
Causas de la deficiencia de albúmina
Cirrosis hepática: Por disminución en su síntesis hepática.
Desnutrición.
Síndrome nefrótico: Por aumento en su excreción.
Trastornos intestinales: Pérdida en la absorción de aminoácidos
durante la digestión y pérdida por las diarreas.
Enfermedades genéticas que provocan hipoalbuminemia, que son
muy raras.
GLOBULINAS:
• Las globulinas son un grupo de proteínas
insolubles en agua que se encuentran en todos
los animales y vegetales.
• Entre las globulinas más importantes destacan
las seroglobulinas (de la sangre), las
lactoglobulinas (de la leche), las ovoglobulinas
(del huevo), la legúmina, el fibrinógeno, los
anticuerpos (α-globulinas) y numerosas
proteínas de las semillas.
• Las globulinas son un importante componente
de la sangre, específicamente del plasma. Éstas
se pueden dividir en varios grupos.
Principales grupos de globulinas
-globulinas alfa 1 y 2
-globulinas beta
-globulina gamma
Algunas de las siguientes globulinas se clasifican como "reactivo
de fase aguda". Esto quiere decir que son proteínas que van a
aumentar o disminuir su concentración en el plasma, a partir de
los procesos inflamatorios o infecciosos. Y que van a servir para
determinar ciertas patologías.
La concentración promedio de las alfa globulinas en sangre es de
1,5 g/dl, mientras que la concentración de albumina es
aproximadamente 4,2 g/dl y la de las demás proteínas séricas,
menor que 0,5 g/dl.
ALFA GLOBULINAS:
• Las alfa globulinas son un grupo de globulinas
circulantes en el plasma sanguíneo y que se
caracterizan por tener mobilidad eléctrica en
soluciones alcalinas o soluciones cargadas.
Tienen la peculiaridad funcional de inhibir ciertas
proteasas sanguíneas.
• alfa 1 globulinas: las mas importantes son la
alfa-1 antitripsina y la globulina fijadora de
tiroxina;
• alfa 2 globulinas: que contiene la
haptoglobulina, ceruloplasmina, HDL,
angiotensinógeno y alfa-2 macroglobulinas.
GLOBULINAS BETA:
• Las beta globulinas son un grupo de
globulinas circulantes en el plasma
sanguíneo y que se caracterizan por tener
cierta mobilidad eléctrica en soluciones
alcalinas o soluciones cargadas, donde
son más migratorias que las
gamaglobulinas pero menos que las alfa
globulinas. Estas proteínas han sido
medidos en mamíferos y otros animales
como las ranas.
Tipos
Las principales proteínas sanguíneas son la albúmina
y las globulinas, las cuales son más pequeñas y menos
numerosas que la albumina. Las globulinas se dividen
en alfa, beta y gamaglobulinas. Algunos ejemplos de
beta globulinas son:
angiostatinas
beta-2 microglobulina
plasminógeno
properdina
globulina fijadora de hormona sexual
transferrina ... un transportador de hierro.
La concentración promedio de las beta globulinas
en sangre es menor que 0,5 g/dl
GAMMA GLOBULINAS:
• Corresponden a las inmunoglobulinas séricas o anticuerpos (IgA, E,
G, M).
• Pueden encontrarse de forma soluble en la sangre o en otros fluidos
corporales de los vertebrados, disponiendo de una forma idéntica
que actúa como receptor de los linfocitos B y son empleados por el
sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraños
tales como bacterias, virus o parásitos.
• En general, se considera que anticuerpo e inmunoglobulina son
sinónimos, haciendo referencia el primer término a la función,
mientras que el segundo alude a la estructura. El término
gammaglobulina se debe a las propiedades electroforéticas de las
inmunoglobulinas solubles en suero.
• La fracción de las gammaglobulinas supone entre 10.3 y 20.8% del
• total de proteínas del suero.
Protocolo de laboratorio:
Reactivos:
Solución buffer:
Buffer Borato-Acetato
pH=8.6
Solución colorante:
Negro Amido:
Amidoschwartz…….0.5 g.
Alcohol metílico…….45 ml
Agua destilada……...45 ml
Ácido acético………..10 ml
Líquido Lavado:
• Alcohol metilico…….250ml….62.5 ml
• Agua destilada……...225ml…56.25 ml
• Ácido acético………..25ml…..6.25 ml
Líquido de Elución:
• Alcohol metilico…….50%
• Agua destilada……..50%
Líquido de transparentización:
• Alcohol metilico…….16ml
• Ácido acético……….4ml
Conservación de las tiras de cellogel:
Se trasvasan las tiras de cellogel a otro envase que
cierre herméticamente y que contenga metanol al
40%.
Estas tiras deben permanecer siempre en medio
liquido ya que si se secan al aire pierden sus
dimensiones y su estado de gelidificación, dejando
de ser útiles para la electroforesis.
Deben manejarse con pinzas tomándolas de los
extremos teniendo la precaución de no estirarlas ni
romperlas.
La tira de cellogel presenta un lado con la
superficie mas opaca que es el de la parte
superior y es en el que se realiza la siembra de
la muestra, y otro mas brillante que se sitúa en
el lado inferior.
APLICACIÓNDEL SUERO:
• Puede hacerse con los mas variados dispositivos que
presentan bordes completamente lisos para no rasgar la
superficie de la tira y que permiten depositar escasa
cantidad de suero.
•
La mejor forma de depositar el suero es mediante
aplicadores que se fabrican comercialmente y que
consisten en una pieza horizontal que lleva en un punto
una guía para que se deslice a través de otra pieza en
forma vertical y que hace el movimiento de ascenso y de
descenso.
Técnica:
1. Unos 10 o 15 minutos antes de utilizar las tiras de cellogel se las
suspenden en un recipiente que contenga la solucion buffer.
2. Se remueve el exceso de liquido entre dos hojas de papel
absorbente.
3. Se procede a la siembra del suero, colocándolo de una manera
que quede a dos cm. del cátodo. Y de tal modo que la cara mate
quede hacia arriba Cuando se realiza la siembra, con el hansa de
3 microlitros, se debe tener la consideración de que esta no tiene
que estar sobre cargada y además no debe efectuarse mucha
presión sobre el cellogel.
4. . Se extiende sobre el soporte de la cuba electroforética, la misma
debe quedar tensa y plana.
5. Se lleva el soporte a la cubeta teniendo en cuenta que los
extremos de las tiras deben tener contacto con el buffer de la
cuba. Se conecta el aparato con un voltaje fijo de 200 V por
aproximadamente 30 minutos.
6. Una vez finalizada la electroforesis, se deja escurrir la tira sin secar y
se sumerge en la solución colorante durante 5 minutos.
Seguidamente se lava 3 a 4 veces con el liquido de lavado.
7. Una vez que el lavado se termino, se procede a colocar el eluyente, y
por ultimo se procede al transparentado, el cual permite otorgar a el
cellogel un aspecto transparente. Para posterior secado en estufa a
60ºC por 3 minutos.
8. Después se procede a la determinación cuantitativa cortando las
fracciones coloreadas e introduciéndolas en tubos de ensayos
preparados en serie de 5. se coloca a cada tubo 3 ml del eluyente.
Se lee en fotocolorimetro a 620nm. O bien por medio de un densímetro
que permite cuantificar las proteínas además de graficarlas en función
de su concentración en suero.
INTERPRETACIÓN DE LOS
RESULTADOS:
•
•
•
En el estudio general de las variaciones del proteinograma se deben tener
en cuenta las variaciones en mas (hiperproteinemias) o en menos (
hipoproteinemias, de la proteinemia total, y de las diferentes fracciones
proteicas que integran el proteinograma.
Todas las hiperproteinemias son debidas a un gran aumento de las
globulinas y las hipoproteinemias a un descenso de la albúmina.
Los valores normales de las proteínas plasmáticas son las siguientes:
PROTEINAS
g/100 ml
% relativos
Proteínas totales
6a8
Albúmina
3.6 a 5.2
60 a 65
Globulina alfa
0.24 a 0.64
4a8
Globulina beta
0.42 a 0.80
7 a 10
Globulina gamma
1.08 a 1.60
18 a 20
VARIACIÓN DE LA PROTEINEMIA
TOTAL
VARIACIÓN DE LAS FRACCIONES
Albúmina baja y
gran aumento de
globulina.
Hiperproteinemia
Aumento de Gβ:
plasmocitoma y macroglobulinemia.
Aumento de Gγ:
plasmocitoma, macroglobulinemia,
kala-azar, linfogranuloma, cirrosis
esplenomegálicas y endocarditis lenta
abacteriana.
Albúmina baja y aumento de la Gα y
discreto de Gγ
Variación ligera o nula de la
proteinemia total
Albúmina baja, aumento dominante de
Gγ y a veces ligero de Gβ
Albúmina baja y aumento discreto de
Gα, Gβ y Gγ
Albúmina muy baja, aumento de Gα2 y
Gβ. Gγ normal o disminuida.
Hipoproteinemia
PROCESOS TÍPICOS A QUE
CORRESPONDEN
Albúmina muy baja y aumentos nulos
o discretos de Gα, Gβ y Gγ
Albúmina muy baja y aumentote Gγ
Inflamaciones, infecciones agudas y
subagudas. Neoplasias.
Hepatitis, cirrosis hepàtica e
infecciones crónicas.
Neoplasias.
Nefrosis.
Neoplasias digestivas, esteatorreas,
enfermedades consuntivas y
carenciales
Cirrosis hepaticas de larga evolución,
infecciones crónicas consuntivas.
Geles de electroforesis
Salting out de DNA
• Esta técnica consiste
en la purificación de
DNA para someterla a
una posterior
electroforesis. En la
imagen se observa
DNA en estado de
cromatina en
suspensión de
isopropanol.
Gel de agarosa – Muestra: ADN
• En cada pocillo se ha corrido una muestra de ADN.
Como se trata de moléculas de gran tamaño migran
lentamente.
Muestras de diferentes extracciones
A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3
B4 C1
C2 C3 C4
Gel de agarosa - PCR
• En cada pocillo se han depositado 10 ul de una PCR. Se
separan fragamentos de pequeño tamaño por lo que la
migración es mayor.
1: Control negativo
2: PCR1
3: PCR2
Gel de poliacrilamida – muestra
PCR
• Se separan los amplicones producto de una PCR. El
método de revelado es mas sensible.
M
PCR1 PCR2 PCR3 PCR4
Gel de poliacrilamida – Muestra
proteínas
• Se separan muestras de proteínas extracelulares que
migran en un gel de PAGE desnaturalizante. Se separan
por masa. Tinción con plata.
M
Diferentes extractos de hongos
Cada banda corresponde
con tamaños diferentes
Revelado de los resultados
Bioinformática: Simulación de
electroforesis.
Esta miniaplicación (applet) simula el proceso de
electroforesis de las proteínas en un gel de
poliacrilamida con SDS.
Tras la separación, se puede obtener un gráfica
con los resultados.
En ésta, se determina la masa molecular
experimental de las muestras a partir de su
movilidad comparada con la de los patrones.
http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/inicio.htm
http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof2.html
Agradecimientos:
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Dr. Prof: Pedro Darío Zapata
Bqca. Prof: Sandra Liliana Gregnon
Técnico Qco: Marcelo Ortíz.
Ing. Prof: Sandra Liliana Hase
• Y a ustedes por su especial atención!!!