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CAPÍTULO 2.1.9.
ANEMIA INFECCIOSA DEL SALMÓN
1. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD
La anemia infecciosa del salmón (AIS) es una enfermedad del salmón del Atlántico cultivado (Salmo
salar) (47) causada por un ortomixovirus, el virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV) (13, 24,
31). La AIS afecta fundamentalmente a peces mantenidos en agua marina o expuestos al agua de mar.
Sin embargo, también se han descrito brotes en peces mantenidos en agua dulce (37). La enfermedad
puede aparecer con carácter sistémico y letal, caracterizado por anemia grave y hemorragias en varios
órganos. Los síntomas observables más llamativos son branquias pálidas, exoftalmos, abdomen
dilatado y petequias en la cámara ocular; pueden ocurrir hemorragias en el abdomen y edemas en las
escamas. Los principales hallazgos en un examen post-mortem son anomalías circulatorias en varios
órganos debidos a daño endotelial en los vasos sanguíneos periféricos. Estas manifestaciones clínicas
de la AIS afectan a cuatro órganos: hígado, riñón, intestino y branquias. La manifestación hepática se
caracteriza por el color oscuro del hígado causado por necrosis hemorrágica. En el riñón se presenta
una moderada inflamación con hemorragia intersticial y necrosis tubular. El intestino aparece de color
rojo oscuro debido a hemorragias dentro de la pared intestinal pero no en el lumen. En las branquias,
además de estar pálidas, se observa en algunos casos acumulación de sangre, sobre todo en el seno
venoso central de los filamentos de las branquias. Las lesiones en el hígado y en el intestino son fáciles
de observar, mientras que las del hígado y las branquias son menos obvias. En algunos brotes de AIS
puede dominar una de las manifestaciones en estos órganos, mientras que en otros brotes se pueden
encontrar las cuatro manifestaciones. En peces individuales se pueden encontrar todas las
manifestaciones en alguna medida. Los brotes en los que predominan manifestaciones en el hígado o
en el riñón parecen ser los más comunes. Se puede observar un hematocrito <10 en los estadios
finales. Los salmones del Atlántico enfermos que presentan anemia y alteraciones circulatorias deben
examinarse en cuanto a infección por el ISAV como se indica más adelante, si no existe otra causa
evidente para explicar dicha situación.
La mortalidad durante un brote de AIS puede variar notablemente. Inicialmente, la mortalidad diaria
en unidades de producción afectadas puede variar del 0.5 al 1%, pero puede aumentar con el tiempo.
La mortalidad acumulada varía de moderada a alta, y puede sobrepasar el 90% en casos graves.
Normalmente la enfermedad se inicia en una unidad de producción y pueden pasar muchos meses
antes de que se desarrolle en unidades vecinas. Aunque solo se han descrito brotes naturales de AIS en
el salmón del Atlántico cultivado, se han identificado formas cultivadas de salmones del Atlántico,
trucha común y trucha marina (S. trutta), con infección subclínica (41). El ISAV se ha detectado
también en dos especies marinas, el carbonero (Pollachius virens) y el bacalao del Atlántico (Gadus
morhua) (28). En la sección 5 de este capítulo se resumen los criterios para confirmar el diagnóstico.
2. INFORMACIÓN PARA EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA
a)
Factores del agente
• Agentes etiológicos, cepas del agente
El ISAV es un virus con envuelta, de 100-130 nm de diámetro, con un genoma que consta de
8 segmentos monocatenarios de ARN con polaridad negativa, y con actividad hemaglutinante,
destructora de receptores y con capacidad de adsorción (6, 9, 11, 13, 31).
Las propiedades morfológicas, fisicoquímicas y genéticas del ISAV coinciden con las de los
Orthomyxoviridae (42) y recientemente se ha clasificado al ISAV como la especie tipo del nuevo
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género Isavirus1 dentro de esta familia de virus. Se ha descrito la secuencia de nucleótidos de
cada uno de los ocho segmentos genómicos (4). Se han identificado cuatro proteínas
estructurales principales, incluyendo una nucleoproteína de 68 kDa, una proteína de la matriz
de 22 kDa, una hemaglutinina-esterasa de 42 kDa y una glicoproteína de superficie de 50 kDa
con capacidad potencial de adsorción, que están codificadas en los segmentos genómicos 3, 8,
6, y 5, respectivamente (11).
El análisis de la secuencia de varios segmentos genómicos ha revelado diferencias entre
aislamientos dentro y entre áreas geográficas definidas (2, 7, 20, 25). El análisis del gen de la
hemaglutinina-esterasa ha demostrado la presencia de dos grupos principales de aislados del
ISAV, uno europeo y otro norteamericano. El grupo europeo se puede subdividir en otros tres
principales como sugieren Nylund et al. (35). Se ha identificado una pequeña región
(hipervariable) muy polimórfica (HPR) del gen de la hemaglutinina (25), y todos los aislados
del ISAV europeo presentan un genotipo similar o con variaciones en esta región. Sin
embargo, no hay correlación directa entre grupos filogenéticos y grupos establecidos según la
HPR.
• Supervivencia fuera del hospedador
El ARN del ISAV se ha detectado mediante la reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa (RT-PCR) en agua de mar tomada de sitios de producción con salmones
del Atlántico positivos para el ISAV (26). Es difícil estimar exactamente cuanto tiempo puede
permanecer infeccioso el virus en el medio natural, porque muchos factores pueden influenciar
su supervivencia, como la presencia de partículas o sustancias que puedan unirse o inactivarlo,
la radiación con luz UV y la temperatura. La exposición del ISAV propagado en cultivo celular
a 15ºC durante 10 días, o a 4ºC durante 14 días, no tiene efecto sobre la capacidad infecciosa
del virus (13).
• Estabilidad del agente
El ISAV es sensible a la radiación UV (UVC): en agua estéril fresca y en agua marina se logró
una reducción de 3-órdenes de magnitud en la capacidad infecciosa con una dosis de
aproximadamente 35 Jm-2 y 50 Jm-2, respectivamente, mientras que la dosis correspondiente
fue de cerca de 72 Jm-2 en el caso del ISAV en las aguas residuales de una planta procesadora
de peces (40). Estudios recientes han mostrado que el ISAV puede inactivarse en agua marina
con ozono (resultados no publicados). Los aislados del ISAV pueden sobrevivir semanas a
temperatura baja, pero la capacidad infectiva se pierde en 30 minutos a 56ºC (13, 48). La
incubación de homogeneizados de tejidos de peces muertos de AIS a pH 4 o pH 12 durante
24 horas inactivó la capacidad infecciosa del ISV. La incubación en presencia de cloro
(100 mg/ml) durante 15 minutos también inactivó el virus (48).
• Ciclo de vida
La principal ruta de infección es probablemente a través de las branquias (29, 49) pero no se
puede excluir la infección intestinal. Por microscopía electrónica, las células endoteliales
parecen ser las primeras células objetivo del ISAV (16, 23). Esto se ha confirmado
recientemente por examen inmunohistoquímico de varios órganos (resultados no publicados).
También se ha comprobado la replicación del virus en leucocitos (5, 16, 46), y los macrófagos
sinusoidales de tejido renal dan tinción positiva para el ISAV por inmunohistoquímica. Como
las células endoteliales son las células diana, la replicación del virus puede tener lugar en varios
órganos.
La molécula del ISAV con actividad hemaglutinina-esterasa, como la hemaglutinina de otros
ortomixovirus, es esencial para la unión del virus a los restos superficiales de ácido siálico. En
el caso del ISAV, el virus se une a glicoproteínas que contienen ácidos siálicos 4-O-acetilados,
que también sirven de substrato para el enzima destructor de receptores (15). La entrada
posterior y la replicación parecen seguir la vía descrita para los virus de la influenza A, como lo
indica la demostración de una adsorción dependiente de un pH bajo (9), la inhibición de la
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm
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replicación por Actinomicina D y α-amanitina (13, 44), la acumulación de nucleoproteína
seguida de la proteína de la matriz en el núcleo (1, 11), y la gemación por la superficie celular
(6, 16).
La ruta de transmisión del ISAV a partir de peces infectados puede ser a través de las
secreciones naturales (49).
b)
Factores del hospedador
• Especies hospedadoras susceptibles
Se han registrado brotes naturales de AIS solamente en el salmón del Atlántico cultivado, pero
se han identificado por RT-PCR formas asilvestradas del salmón del Atlántico, trucha común y
trucha marina (S. trutta) con infección subclínica (41). El ISAV se ha detectado asimismo en
dos especies marinas, el carbonero (Pollachius virens) y el bacalao del Atlántico (Gadus morhua),
pero solo en peces recogidos en la proximidad de jaulas con salmón del Atlántico que
manifestaban AIS (28).
Mediante infección experimental, se ha demostrado la replicación del ISAV en varias especies
de peces, incluyendo la trucha común, la trucha marina, la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss),
la trucha alpina (Salvelinus alpinus), y el arenque (Clupea harengus) (33, 34, 36, 38).
Se ha intentado inducir la infección o la enfermedad en P. virens, pero con resultados negativos
(45).
• Fases susceptibles del hospedador
Los brotes de enfermedad en el salmón del Atlántico se han descrito principalmente en jaulas
marinas; solo se han descrito unos cuantos casos en las fases de agua dulce, incluyendo un caso
de un alevín con saco vitelino (37). Además, la AIS se ha inducido experimentalmente en agua
dulce en formas juveniles y esguines del salmón Atlántico. La genética parece tener un papel
importante en la susceptibilidad del salmón del Atlántico a la AIS, ya que se ha demostrado
una asociación funcional entre la resistencia a la enfermedad y el polimorfismo de las clases I y
II del complejo mayor de histocompatibilidad (MCH) (14).
• Órganos diana y tejido infectado
Células endoteliales de muchos órganos (corazón, hígado, riñón, bazo y otros).
• Infecciones persistentes en portadores asintomáticos
La infección persistente en portadores asintomáticos no ha sido documentada en el salmón del
Atántico, pero a nivel de piscifactoría la infección puede persistir en la población por la
infección continuada de nuevos individuos que no causa ningún problema reconocible de
enfermedad. La infección experimental de la trucha arco iris y de la trucha común indica que
es posible la infección persistente en estas especies (33, 36).
• Vectores
Se ha demostrado en condiciones experimentales la transferencia pasiva de la AIS por los
piojos del salmón (Lepeophtheirus salmonis) (39).
c)
Patrón de la enfermedad
• Mecanismos de transmisión
La enfermedad se transmite horizontalmente a través del agua como se ha demostrado en
estudios de infección experimental. No hay evidencia clara de transmisión vertical por
productos infectados de las gónadas. Se ha sugerido que la extensión de la enfermedad a
grandes distancias se origina por el transporte de peces en fase murgón (de 12–14 meses y
unos 15 cm de longitud) infectados antes del envío o por contenedores contaminados con el
ISAV. La contaminación de los contenedores puede deberse al transporte previo de peces
infectados o a la toma de agua de áreas con piscifactorías que contienen peces con la
enfermedad.
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Los estudios epidemiológicos (17, 50) indican que el riesgo de transmisión de la AIS está muy
relacionado con las prácticas de la cría en acuicultura y la transmisión horizontal. En conjunto,
se consideran factores importantes de riesgo la proximidad geográfica (< 5 km) a factorías con
brotes de AIS o a plantas de sacrificio o procesadoras que liberan agua contaminada, las
numerosas entregas de peces en fase murgón, el uso de contenedores de transporte, y el
compartir personal y equipamiento.
• Prevalencia
En una jaula de red con peces enfermos la prevalencia puede variar ampliamente, mientras que
en una jaula adyacente el ISAV puede ser difícil de detectar incluso por el método más
sensible. Por tanto, para investigaciones de diagnóstico es importante muestrear en jaulas que
contengan peces muertos.
• Distribución geográfica
Desde que se describió inicialmente, hacia mediados de los 1980s en Noruega, la AIS se ha
descrito en Canadá (New Brunswick en 1996, Nova Scotia en 2000), el Reino Unido (Escocia
en 1998 y posteriormente en las islas Shetland), las islas Faroe (2000) y EE.UU. (Maine en
2001) (3, 27, 43). El virus causal se ha aislado del salmón coho en Chile (18) y de la trucha arco
iris en Escocia en 2002.
• Mortalidad y morbilidad
La morbilidad y la mortalidad varían mucho dentro de y entre las distintas jaulas de una
piscifactoría de agua salada, y entre diferentes piscifactorías. La morbilidad y la mortalidad
dentro de una jaula de producción pueden comenzar con niveles muy bajos. Típicamente, la
mortalidad diaria varía de 0,5 a 1% en las jaulas infectadas. Sin intervención, la mortalidad
aumenta y parece alcanzar el máximo a principios de verano y en el invierno. El margen de
mortalidad acumulada durante un brote va desde un valor insignificante a moderado, pero en
casos graves puede sobrepasar el 90%. Inicialmente, un brote de AIS puede estar limitado a
una o dos jaulas de red durante un largo período de tiempo y la extensión a otras puede llevar
meses. En brotes donde se han infectado en contenedores durante el transporte las formas
juveniles en desarrollo (fase murgón) puede ocurrir una aparición simultánea.
• Impacto económico y/o productivo de la enfermedad
La AIS está considerada como una enfermedad importante en los países donde se ha descrito.
En consecuencia, la mayoría de los países han iniciado medidas legislativas generales y/o
programas de control para combatir la enfermedad. El impacto económico y productivo sobre
la industria de la acuicultura se debe principalmente a las pérdidas causadas por la enfermedad
misma y a la aplicación de medidas gubernamentales como planes de erradicación y programas
de control.
d)
Control y prevención
• Vacunación
Se ha llevado a cabo vacunación contra la AIS en Norteamérica durante los últimos 5 años,
pero las vacunas actualmente disponibles no parecen ofrecer una protección completa. Las
vacunas, que son vacunas de virus completos inactivados, no eliminan los virus en los peces
inmunizados, que pueden por tanto hacerse portadores (19).
• Prácticas generales de manejo
La incidencia de la AIS puede reducirse notablemente aplicando medidas legislativas o
prácticas generales de manejo en lo que respecta al movimiento de peces, controles sanitarios
obligatorios y regulaciones de sacrificio y transporte. También pueden contribuir a reducir la
incidencia de la enfermedad las medidas específicas que incluyan restricciones sobre
piscifactorías afectadas, sospechosas o próximas, el sacrificio sanitario obligatorio, la
segregación generacional, así como la desinfección de los desechos y el agua residual de las
pesquerías y las plantas de procesamiento de peces.
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3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
El diagnóstico de la AIS se basaba inicialmente tan solo en hallazgos clínicos y patológicos (10). Tras el
aislamiento del agente causal, se han establecido varios métodos directos para la detección del virus y la
confirmación del diagnóstico. Estos incluyen el aislamiento del virus en cultivo celular seguido por su
identificación inmunológica (6, 12), la demostración inmunológica del antígeno del ISAV en tejidos
(12) y las técnicas de PCR (8, 31). Los diagnósticos diferenciales son: otras condiciones anémicas y
hemorrágicas, la úlcera de invierno y las septicemias causadas por infecciones con Moritella viscosa.
a)
Métodos de diagnóstico de campo
• Síntomas clínicos
Generalmente, los peces con AIS parecen letárgicos y pueden mantenerse próximos a las
paredes de las jaulas. Los síntomas externos más característicos son branquias pálidas (excepto
en casos con estancamiento sanguíneo en las branquias), exoftalmos, abdomen dilatado,
petequias en la cámara ocular, a veces hemorragias epidérmicas especialmente en el abdomen,
y edema de las escamas.
b)
Métodos clínicos
Los peces infectados con el ISAV pueden mostrar un espectro de cambios patológicos, que varían
desde ninguno a graves, dependiendo de factores tales como la dosis infecciosa, la temperatura del
agua, la edad, el estado inmune, la cepa de virus y su patogenicidad, la variación estacional, etc.
Ninguna de las lesiones descritas es patognomónica de la AIS. Siempre están presentes alteraciones
circulatorias. Se han descrito los siguientes hallazgos que coinciden con la AIS:
• Síntomas generales
• Líquido amarillento o sanguinolento en la cavidad peritoneal y pericárdica.
• Edema en la vejiga natatoria
• Pequeñas hemorragias del peritoneo visceral y parietal
• Hígado de color rojo oscuro focalizado o difuso. Se puede presentar una fina capa de
fibrina superficial.
• Bazo inflamado de color rojo oscuro con márgenes redondeados.
• Enrojecimiento oscuro de la mucosa de la pared intestinal en los sacos ciegos, intestino
medio y posterior, sin sangre en la luz intestinal de ejemplares frescos.
• Riñón inflamado de color rojo oscuro con sangre y líquido exudando de cortes
superficiales.
• Hemorragias petequiales en el músculo esquelético.
• Hallazgos hematológicos
• Hematocrito <10 en los estadios finales (a menudo 25-30 en casos menos severos).
• Frotis sanguíneos con eritrocitos vacuolizados o degenerados y presencia de eritroblastos
con núcleos de forma irregular. Reducción en la proporción de leucocitos a eritrocitos,
con reducciones mayores entre linfocitos y trombocitos.
Un valor de hematocrito por debajo de 10 no es un hallazgo singular de AIS. Los peces con
enfermedades tales como ulceraciones y el síndrome del cuerpo de inclusión eritrocítica
pueden regularmente mostrar valores tan bajos de hematocrito.
• Lesiones microscópicas
Los siguientes hallazgos histológicos son típicos de la enfermedad y comprenden:
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• En las branquias, numerosos eritrocitos en el seno venoso central y en los capilares de las
lamelas donde los eritrocitos también forman trombos.
• Hemorragias multifocales o confluentes y/o necrosis de hepatocitos a alguna distancia de
los grandes vasos del hígado. Acumulaciones focales de eritrocitos en sinusoides
hepáticos dilatados.
• Acumulación de eritrocitos en vasos sanguíneos de la lámina propia intestinal y
hemorragias eventuales en la lámina propia.
• El estroma del bazo se distiende por la acumulación de eritrocitos.
• En el riñón, hemorragia intersticial ligera o extensa, multifocalizada o difusa, con necrosis
tubular en las áreas hemorrágicas y acumulación de eritrocitos en los glomérulos
• Eritrofagocitosis en el bazo y hemorragias secundarias en el hígado y riñón.
• Microscopía electrónica/citopatología
Mediante microscopía electrónica de preparaciones de tejidos se ha observado el virus en
células endoteliales por todo el cuerpo, pero este método no se ha empleado con propósitos
de diagnóstico.
c)
Métodos de detección e identificación del agente
• Métodos de detección directa
i)
Métodos microscópicos
• Frotis
a)
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
Una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) usando un anticuerpo
monoclonal (Mab) (mezcla de 3H6F8 y 10C9F5) contra la hemaglutinina-esterasa
(HE) del ISAV ha dado reacción positiva con cortes finos congelados de tejido
renal, cardíaco y hepático o con frotis renales de salmón del Atlántico infectado
natural o experimentalmente. Los casos sospechosos (véase la sección 5) se
pueden confirmar mediante una IFI positiva.
i) Preparación de frotis tisulares
Se transfiere brevemente un pequeño trozo del riñón medio a un papel
absorbente para eliminar el exceso de líquido y se fijan en un área del tamaño
de una huella digital varias improntas sobre portas para microscopía
recubiertos de poli-L-lisina. Los frotis se secan al aire, se fijan durante 10
minutos en acetona congelada al 100% y se guardan a 4ºC durante unos días o
a –80ºC hasta su uso.
ii) Preparación de criocortes
Se recogen muestras de riñón, hígado y corazón de peces moribundos, se
congelan en isopentano enfriado con nitrógeno líquido, y se guardan a –80ºC.
Se realizan cortes en un criostato, se colocan en portas para microscopía
recubiertos de poli-L-lisina, se fijan durante 10 minutos en acetona congelada
al 100% y se guardan a –80ºC hasta el uso.
iii) Procedimiento de tinción
Tras bloquear durante 30 minutos con 5% de leche desnatada en polvo
preparada en solución salina tamponada con fosfato (PBS), las preparaciones
se incuban durante 1 hora con sobrenadante de Mab contra el ISAV diluido
(por ejemplo, 1/100) seguido de tres lavados. Para la detección de los
anticuerpos unidos, las preparaciones se incuban con Ig anti-ratón conjugada
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Capítulo 2.1.9. — Anemia infecciosa del salmón
con isotiocianato de fluoresceína (FITC) durante 1 hora. Se utiliza PBS con
0.1% de Tween 20 para los lavados: Todas las incubaciones se realizan a
temperatura ambiente.
• Cortes fijados
a)
Inmunohistoquímica (IHC)
Se emplea un anticuerpo policlonal contra la nucleoproteína del ISAV sobre
cortes de tejido fijados con formalina y embebidos en parafina. Esta tinción por
IHC ha dado resultados positivos en salmones del Atlántico infectados tanto
naturalmente como experimentalmente. Los órganos preferidos son el riñón
medio y el corazón (el área transicional que incluye las tres cámaras y las
válvulas). Los casos sospechosos debidos a síntomas patológicos se verifican
mediante una IHC positiva. Los cortes histológicos se preparan siguiendo
métodos estándar.
i) Preparación de cortes de tejidos
Los tejidos se fijan en formalina neutra al 10% tamponada con fosfato
durante al menos 1 día, se deshidratan en una serie de alcohol graduado, se
lavan en xileno y se incluyen en parafina según protocolos estandarizados. Los
cortes gruesos de aproximadamente 5 μm de espesor se calientan a 56-58ºC
(máximo 60ºC) durante 20 minutos (colocados para IHC en portas
recubiertos con poli-L-lisina), se desparafinan en xileno, se rehidratan en
alcohol graduado y se tiñen con hematoxilina y eosina para patomorfología y
para IHC como se describe a continuación.
ii) Procedimiento de tinción para IHC
En cada procedimiento de tinción por IHC se incluyen cortes control de
tejidos alterados patológicamente con y sin ISAV. Todas las incubaciones se
realizan a temperatura ambiente en un agitador oscilante, excepto indicación
contraria.
a) Se colocan los cortes rehidratados en 200 ml de tampón citrato 0.1 M
(ácido cítrico 10 mM, pH ajustado a 6,0 con NaOH) en un horno
microondas. Se hierve dos veces durante 6 minutos y tras cada
calentamiento se dejan los cortes en el agua caliente durante 5 y
15 minutos, respectivamente. Se lava en solución salina tamponada con
Tris (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.6).
b) Se incuba 20 minutos con solución bloqueadora (2% [v/v] de suero
normal de cabra en TBS con 5% [p/v] de leche en polvo desnatada).
c) Se decanta la solución bloqueadora sin lavar.
d) Se incuba toda la noche a 4ºC con anticuerpo primario (anticuerpo de
conejo contra la nucleoproteína del ISAV) a la dilución recomendada en
TBS con 1% (p/v) de leche desnatada en polvo. Si es necesario, se
adsorbe, incubando toda la noche a 4ºC, 6 ml de antisuero de dilución
apropiada en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre células
fijadas con acetona (ASK o SHK-1 infectadas con ISAV) en un frasco de
cultivo celular de 175 cm2.
e) Se lava dos veces durante 5 minutos en TBS y otros 5 minutos en TBS con
0,1% (v/v) de Tween 20.
f) Se incuba 60 minutos con IgG anti-conejo biotinada (Vector AK 5001)
diluida 1/200 en TBS con 2.5% de BSA,
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g) Se lava dos veces durante 5 minutos en TBS y otros 5 minutos en TBS con
Tween
h) Se incuba 45 minutos con el complejo ABC/AP del reactivo comercial
(Vectastin PK 4000) diluido en TBS.
i) Se lava dos veces durante 5 minutos en TBS y otros 5 minutos en TBS con
Tween
j) Se visualiza incubando 20 minutos con Fast Red TR (2,0 mg de fosfato de
naftol AS-MX, 2 ml de N, N-dimetilformamida, 0,01 ml de 0,1 M
levamisol y 10 mg de Fast Red TR en 9,8 ml de TBS, pH 8,2).
k) Se lava en agua.
l) Se tiñe para contraste con
aproximadamente 2 minutos.
hematoxilina
de
Harris
durante
m) Se lava primero con agua y después con TBS y Tween.
n) Se prepara con montaje en Aquamount o similar.
iii) Interpretación
Los cortes de control negativo no deben tener ninguna reacción coloreada
significativa. Los cortes de control positivo deben tener una coloración
citoplásmica e intranuclear rojiza claramente visible en las células endoteliales
de los vasos sanguíneos o del endocardio. Un corte de la muestra debería
considerarse positivo solamente si se observa claramente la tinción roja
intranuclear de las células endoteliales. La localización intranuclear es
característica de la nucleoproteína de los ortomixovirus durante una fase de la
replicación vírica. La tinción citoplásmica simultánea es con frecuencia
dominante. La tinción citoplásmica sola u otras tinciones sin localización
intranuclear debe considerarse inespecífica y no concluyente.
La tinción positiva más fuerte suele obtenerse en las células endoteliales del
corazón y del riñón. Las reacciones de tinción en zonas de hemorragia fuerte
suelen ser ligeras o nulas, posiblemente debido a la lisis de las células
endoteliales infectadas.
ii)
Aislamiento e identificación del agente
• Cultivo celular
El material infectado adecuado para examen virológico es el bazo, corazón y riñón.
Se pueden usar SHK-1(6), ASK (8) u otras líneas celulares susceptibles, como TO (51)
y CHSE-214 (21), pero se debe tener en cuenta la variabilidad de la cepa y la capacidad
para replicarse en las diferentes líneas celulares. Las células SHK-1 (30) y
probablemente también las células ASK, parecen permitir el crecimiento de los
aislados de virus conocidos hasta la fecha. En células ASK puede aparecer un efecto
citopático (ECP) más característico.
Las células SHK-1 y ASK se multiplican a 20ºC en medio de cultivo celular L-15 de
Leibovitz suplementado con suero bovino fetal (5 o 10%), L-glutamina (4 mM),
gentamicina (50 μg/ml) y 2-mercaptoetanol (40 μM) (puede omitirse).
Para el aislamiento del virus se pueden usar células multiplicadas en frascos de cultivo
celular de 25 cm2 o placas multipocillo de cultivo, que pueden sellarse con papel
parafilm para estabilizar el pH del medio. Las células multiplicadas en placas de
24 pocillos puede que no crezcan bien en monocapas, pero este carácter puede variar
entre laboratorios y depende del tipo de placa utilizado. Se deben de inocular, en
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paralelo con las muestras de tejido, unos controles positivos con diluciones seriadas
del ISAV como prueba de la susceptibilidad de las células al virus.
a)
Inoculación de las monocapas celulares
Tras el procedimiento de extracción del virus descrito en la sección B.3.2 del
capítulo I.1, se inoculan monocapas en crecimiento activo (de 1-3 días) con un
pequeño volumen de sobrenadante de homogeneizado tisular (por ejemplo, 1–
1.5 ml por frasco o pocillo), después de haber eliminado el medio de crecimiento.
El sobrenadante del tejido se diluye con medio L-15 sin suero a una dilución final
de material tisular de 1/50 o más. Se incuba 3-4 horas a 15ºC, se elimina el
inóculo y se añade medio fresco de cultivo suplementado. Por este
procedimiento raramente se observa citotoxicidad incluso a la dilución menor del
sobrenadante. Alternativamente, se puede usar una dilución 1/1000 y realizar una
inoculación directa sin sustitución del medio.
Cuando las muestras de peces proceden de sitios de producción donde la
infección por el virus de la necrosis pancreática (IPNV) es común, antes de la
inoculación los sobrenadantes de homogeneizados titulares deben incubarse
(durante un mínimo de 1 hora a 15ºC) con antisuero contra el serotipo
correspondiente del IPNV.
b)
Control de la incubación
Los cultivos celulares inoculados (mantenidos a 15ºC) se examinan
periódicamente (al menos cada 7 días) para observar ECP. El ECP típico debido
al ISAV corresponde a células vacuolizadas que luego se redondean y se separan
de la superficie de crecimiento. Si aparece ECP que corresponda a ISAV o a
IPNV, se debe tomar una alícuota del medio para identificación del virus como
se describe más adelante. En el caso de infección por IPNV, se reinoculan las
células con sobrenadante de homogeneizado celular que ha sido incubado con la
menor dilución del antisuero contra el IPNV. Si no se desarrolla ECP tras
14 días, se subcultiva a cultivos frescos.
c)
Procedimiento de subcultivo
Se recogen alícuotas del medio (sobrenadante) de los cultivos primarios a los
14 días de la inoculación (o antes en caso de ECP evidente). Se pueden mezclar
los sobrenadantes de pocillos inoculados con diluciones diferentes de muestras
idénticas.
Los sobrenadantes se inoculan en cultivos celulares frescos como se describe
para las inoculaciones primarias: se elimina el medio de crecimiento, se inoculan
las monocapas con un pequeño volumen de sobrenadantes diluidos (1/5 o más)
durante 3-4 horas antes de la adición de medio fresco. Alternativamente, se
añaden los sobrenadantes (a una dilución final 1/10 o más) directamente a los
cultivos celulares con medio de crecimiento.
Los cultivos celulares inoculados se incuban durante al menos 14 días y se
examinan a intervalos regulares tal como se describió para la inoculación
primaria. Al final del período de incubación o antes del mismo, si aparece un
ECP claro, se recoge el medio para la identificación del virus como se describe
más adelante. Siempre se deben examinar los cultivos celulares sin ECP para
detectar la presencia de ISAV mediante IFAT, hemadsorción o PCR, porque
puede ocurrir una replicación del virus sin que vaya acompañada del desarrollo de
ECP manifiesto.
208
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.9. — Anemia infecciosa del salmón
• Métodos de detección del antígeno basados en anticuerpos
a)
Identificación del virus por IFI
i)
Se preparan monocapas de células en placas apropiadas de cultivo celular
(de 96 o 24 pocillos), en frascos lisos o en portas de plástico, dependiendo
del tipo de microscopio disponible (se necesita un microscopio invertido
equipado con luz UV para monocapas crecidas sobre placas de cultivos
celulares). Las células SHK-1 crecen más bien pobremente sobre portas de
vidrio. Se deben incluir necesariamente monocapas para controles negativos
y positivos.
ii)
Se inoculan las monocapas con diluciones decimales de las suspensiones
víricas a identificar, con dos monocapas por cada dilución. Añadir el control
positivo del virus a diluciones conocidas para que den una buena reacción
de tinción.
iii) Los cultivos celulares inoculados se incuban a 15ºC durante 7 días, o menos
si aparece ECP.
iv) Se elimina el medio de cultivo y se lava una vez con 80% de acetona. Se
añade acetona al 80% y se deja fijar por 20 minutos a temperatura ambiente.
Se elimina el fijador y se deja secar al aire durante 1 hora. El cultivo celular
fijado se puede guardar seco hasta una semana como máximo a 4ºC o por
más tiempo a -20ºC.
v)
Se prepara una solución de anticuerpo contra el ISAV (MAb 3H6F8 contra
ISAV o mezcla de MAb 3H6F8/10C9F5) a una dilución apropiada en PBS
con leche en polvo desnatada al 0,5%. Las monocapas celulares se tratan
con la solución de anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente o
durante 30 minutos a 37ºC.
vi) Se lava dos veces con PBS/0,05% de Tween 20. Las monocapas se
mantienen en la oscuridad durante 1-2 minutos antes de eliminar la última
solución de lavado.
vii) Siguiendo las instrucciones del suministrador, las monocapas celulares se
tratan con inmunoglobulina de cabra contra ratón que está conjugada con
FITC (o si se usa un anticuerpo primario obtenido en conejo, se emplea un
anticuerpo conjugado con FICT contra la inmunoglobulina de conejo). El
conjugado se diluye con PBS hasta una dilución de trabajo adecuada y se
incuba durante 1 hora a temperatura ambiente o durante 30 minutos a 37ºC
en la oscuridad.
viii) Lavar una vez con PBS/0,05% de Tween 20, como antes.
ix) Para teñir los núcleos (color rojo) se añade yoduro de propidio (100 μg/ml
en agua destilada) y se incuba 1-2 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad seguido de un lavado con PBS/0.05% de Tween 20.
x)
Si las placas no se pueden examinar de inmediato, se añade una solución de
1,4-diazabiciclooctano (DABCO 2,5% en PBS, pH 8,2) o un reactivo similar
como solución contra la atenuación.
xi) Las monocapas teñidas se examinan inmediatamente con luz UV o se guardan
en la oscuridad a 4ºC durante 2–3 días antes de examen (con el
almacenamiento puede observarse alguna reducción de la señal fluorescente).
• Técnicas moleculares
a)
Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)
Las muestras de tejido de peces (riñón y corazón) para examen del ISAV
mediante RT-PCR deben transportarse de modo que se evite la degradación del
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
209
Capítulo 2.1.9. — Anemia infecciosa del salmón
ARN. La muestra debe transportarse en hielo, o en una solución o medio
diseñado para conservar el ARN.
El ARN total se extrae de pequeños trozos de tejidos y de homogeneizados
tisulares o de capas celulares infectadas. Se dispone de varios métodos para
extraer ARN (para detalles, ver la ref. 30). Los métodos basados en columnas de
membrana de sílice tienen la ventaja de que no emplean compuestos peligrosos
en comparación con el método clásico del fenol-cloroformo. La concentración y
pureza del ARN debe estimarse midiendo la densidad óptica a 260 y 280 nm
(OD260 y OD280). La relación OD260 /OD280 debe estar entre 1.7 y 2.1
dependiendo del diluyente. Actualmente hay reactivos disponibles en el mercado
para el aislamiento del ARN de líquidos corporales (suero/plasma) o de
sobrenadantes de cultivos celulares que contienen poco ARN celular. En estos
equipos se incluye ARN portador para mejorar la extracción del ARN vírico,
pero existe el inconveniente de que no puede estimarse la cantidad de ARN
extraído de la muestra.
Desde que en 1997 se describió la primera RT-PCR para el ISAV (31), se han
realizado varios intentos para optimizar en método (para una revisión, ver la ref.
29). Se puede realizar una RT-PCR en dos pasos, en la que los pasos de RT y de
PCR se llevan a cabo en tubos separados. La introducción de procedimientos de
un solo paso, donde las dos reacciones se realizan en un solo tubo, ha sido
ventajosa en cuanto a sensibilidad de la prueba. En este caso, sin embargo, no se
deja cADN para uso en amplificaciones adicionales, lo que puede ser una
desventaja cuando de deban incluir varios juegos de cebadores en el examen.
Se han descrito varios juegos de cebadores para RT-PCR del ISAV y algunos se
indican en el cuadro adjunto. Los cebadores derivados del segmento genómico
8 se han utilizado en varios laboratorios y parecen adecuados para la detección
del ISAV durante los brotes de enfermedad y en peces portadores (8, 29). El par
de cebadores ILA1/ILA2 se ha usado también para la detección de la AIS en
Canadá y Escocia (27). El par de cebadores derivado del segmento 6 es adecuado
para la detección de cepas de virus que pueden mostrar alguna variación en la
región amplificada del segmento 8. Los cebadores del segmento 6 pueden ser
útiles para verificar los resultados de PCR basados en cebadores del segmento
8 como una alternativa a secuenciar el producto de la PCR.
Designado
Segmento
genómico
Tamaño
del
producto
Referencia
GGC-TAT-CTA-CCA-TGA-ACG-AAT-C
ILA1
8
155
30
GCC-AAG-TGT-AAG-TAG-CAC-TCC
ILA2
GAA-GAG-TCA-GGA-TGC-CAA-GAC-G
FA-3
8
211
8
GAA-GTC-GAT-GAA-CTG-CAG-CGA
RA-3
GGA-ATC-TAC-AAG-GTC-TGC-ATT-G
Seg6U
6
130
CTT-CAA-AGG-TGT-CTG-ACA-CGT-A
Seg6L
Designado por el
Lab. Ref. OIE
Secuencia de cebador (5’–3’)
El uso de la TR-PCR en tiempo real puede aumentar la especificidad, y
probablemente también la sensibilidad, de la prueba (32), especialmente cuando
se incluye una sonda específica de secuencia. Este método es más rápido
comparado con el método convencional de RT-PCR en un tubo, el riesgo de
contaminación puede reducirse y es posible estimar la cantidad relativa de ARN
vírico en la muestra.
210
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.9. — Anemia infecciosa del salmón
• Purificación del agente
El ISAV propagado en cultivo celular puede purificarse por centrifugación en
gradiente de sacarosa según Falk et al. (13) o mediante purificación por afinidad
utilizando bolas inmunomagnéticas recubiertas con MAb contra el ISAV como se
describe en Falk et al. (11).
• Métodos indirectos de detección
i)
Métodos serológicos
Tanto el salmón del Atlántico como la trucha arco iris desarrollan una respuesta inmune
humoral contra la infección por el ISAV (22). Para detectar anticuerpos específicos contra
el ISAV se han establecido pruebas de enzimoinmunoensayo (ELISA) con virus
purificado o con lisados de cultivos celulares infectados por el ISAV. Los títulos ELISA
pueden ser muy elevados y parecen muy específicos para la nucleoproteína en
transferencias de tipo Western (K. Falk, comunicación personal). La prueba no está
estandarizada para vigilancia o uso diagnóstico, pero puede emplearse como suplemento
para dirigir la detección del virus y la patología en casos oscuros. Además, el nivel y la
distribución de la seroconversión en una población infectada por el ISAV pueden dar
alguna información sobre la extensión de la infección.
4. ADECUACIÓN DE LAS PRUEBAS EN FUNCIÓN DE SU UTILIDAD
Cuadro 1. Adecuación de los métodos diagnósticos para vigilancia del virus y para el diagnóstico de la AIS
Método
Examen para infección vírica
en peces sin síntomas clínicos
Examen de peces enfermos
Patología
(macroscópica e histológica)
No adecuado
Adecuado (presuntivo)
IFI en frotis renales
No adecuado
Adecuado (confirmativo)
Inmunohistoquímica
No adecuado
Adecuado (confirmativo)
RT-PCR (con secuenciación para
confirmación/caracterización)
Adecuado (no confirmativo para
virus infeccioso)
Adecuado (confirmativo junto a
otras pruebas positivas para AIS)
Cultivo celular
Adecuado
Adecuado (confirmativo)
Serología
Adecuado (no confirmativo para
virus infeccioso)
Adecuado (no confirmativo)
5. CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO
En la sección 5.a. que sigue se señalan motivos razonables para sospechar que un pez está infectado
por el ISAV. La Autoridad Competente debe asegurar que, tras la sospecha de que un pez está
infectado con el ISAV en una factoría, se realizará una investigación oficial para confirmar o excluir la
presencia de la enfermedad tan pronto como sea posible, aplicando la inspección y el examen clínico,
así como la recogida y selección de muestras y empleando los métodos de laboratorio que se describen
en la sección 3.
a)
Definición de un caso sospechoso
Se sospechará de la AIS si al menos se cumple uno de los siguientes criterios.
i)
Cambios clínicos o patológicos coincidentes con la AIS (secciones 3.a y b), con o sin
síntomas clínicos de la enfermedad;
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
211
Capítulo 2.1.9. — Anemia infecciosa del salmón
ii)
Aislamiento e identificación del ISAV en cultivo celular de una muestra única de un pez de la
piscifactoría como se describe en la sección 3.c.ii;
iii) Evidencia de la presencia del ISAV por dos pruebas independientes de laboratorio como la
RT-PCR (sección 3.c.ii) y la IFI sobre frotis de tejidos (sección 3.c.ii);
iv) Transferencia de peces vivos de una planta donde se sospecha que está presente la AIS a
granjas sin sospecha de AIS;
v)
Cualquier otra relación epidemiológica con plantas de producción sospechosas de AIS o con
enfermedad confirmada.
vi) Detección de anticuerpos contra el ISAV.
b)
Definición de un caso confirmado
Los criterios indicados en (i), o en (ii), o en (iii), son confirmativos de AIS
i)
La mortalidad, los síntomas clínicos y las lesiones patológicas concuerdan con AIS (secciones
3.a y b), y la detección del ISAV se realiza por algunos de los siguientes métodos:
a) aislamiento e identificación del ISAV en cultivo celular a partir de al menos una muestra
de cualquier pez de la planta como se describe en la sección 3.c.ii;
b) detección del ISAV por RT-PCR por los métodos descritos en la sección 3.c.ii.
c) detección del ISAV en preparaciones de tejidos con anticuerpos específicos contra el
ISAV (por ejemplo, IFI sobre frotis titulares o cortes finos como se describe en la
sección 3.c.ii.).
ii)
Aislamiento e identificación del ISAV en cultivo celular de al menos dos muestras
independientes de cualquier pez de la planta analizadas en ocasiones diferentes como se
indica en la sección 3.c.ii;
iii) Aislamiento e identificación del ISAV en cultivo celular de al menos una muestra de
cualquier pez de la planta con evidencia confirmativa del ISAV en preparaciones de tejido
usando RT-PCR (sección 3.c.ii) o por IFI (sección 3.c.ii).
6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Y DETECCIÓN PARA DECLARAR LA AUSENCIA DE INFECCIÓN
Las inspecciones sanitarias regulares combinadas con investigaciones sobre la AIS cuando el aumento
de mortalidad se asocie con alguno de los síntomas clínicos dados pueden ser satisfactorias en regiones
donde la AIS nunca se ha descrito. En regiones donde se ha descrito, se deben llevar a cabo pruebas
para el ISAV, preferentemente mediante RT-PCR con cierto intervalo.
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la anemia infecciosa del salmón (véase el cuadro al
final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la OIE:
www.oie.int).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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