Download Pruebas bioquímicas de identificación

Pruebas
Bioquímicas de
Identificación
Pruebas de Identificación
rápidas
CATALASA
• EN COCOS G+
COAGULASA
• EN COCOS G+
PYR – LAP
• EN COCOS G+
OXIDASA
EN COCOS Y BACILOS
G+ G -
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
PARA COCOS GRAM +
CATALASA – COAGULASA -DNAsa
PYR – LAP – BILIS ESCULINA
MANITOL SALADO – CAMP HIPURATO
SE UTILIZAN ALGUNOS ATB: BACITRACINA - NOVOBIOCINA
Prueba de la catalasa
Fundamento: Detecta la presencia de la
enzima catalasa.
Procedimiento: En portaobjetos colocar
sobre una colonia unas gotas de H202 3 %.
H202
H20 + 02
Liberación de burbujas rápida y sostenida
indica la producción de oxígeno molecular
= prueba (+)
Consideraciones:
No Agar sangre (peroxidasa en los
eritrocitos).
PRUEBA DE LA CATALASA
PRUEBA DE LA COAGULASA
Fundamento: Detecta un factor de agregación “clumping
factor” en la superficie de la bacteria.
Procedimiento: se coloca una colonia sospechosa de
pertenecer a una especie de Staphylococcus y se
emulsifica en una gota de plasma de conejo.
Interpretación: “arracimamiento” aglutinación ,bacteriana
en 1 minuto = prueba (+).
Si el resultado es negativo ensayar la producción de
coagulasa en tubo.
Consideraciones:
Utilizar plasma con EDTA y no citratado, ya que hay
organismos capaces de metabolizar el citrato
(Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos (+).
Las pruebas (-) luego de 4 hs de incubación a 35ºC, dejar
a temperatura ambiente y leer luego de 18-24 hs a fin de
evitar la fibrinólisis que producen algunas cepas al ser
incubadas en forma prolongada a 35ºC.
COAGULASA
PRUEBA DEL PYR:
Fundamento: detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se
utiliza como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida
(PYR), para la identificación rápida de enterococos.
Procedimiento: Realizar un alto inóculo en Sol Fis
(2 MacFarland) e introducir un disco de PYR.
Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C.
Tiempo de lectura: 5 minutos.
Interpretación:
Disco rosado o rojo (+)
Disco y/o solución amarillo a incoloro (-).
Consideraciones: Algunas especies de Staphylococcus y los
estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva.
Prueba de PYR
PRUEBA DE DNAsa
PRUEBA DE LA DNASA
Fundamento: El S. aureus produce una DNAasa
termoestable que hidroliza DNA.
La producción de DNAsa puede determinarse
incorporando ácido desoxirribonucleico (DNA) en agar
nutritivo .
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en
manchas densas sobre agar DNA y después de 18 a 24
hs de incubación. Revelar con HCl al 1%, que precipita
el DNA nativo del medio.
Interpretación: colonias rodeadas por una zona clara
donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado =
prueba (+). Sin cambios , prueba (-).
MANITOL SALADO
Agar Manitol salado
Fundamento: el medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5
%), rojo de fenol y peptonas.
Procedimiento: Sembrar la cepa e incubar 18 a 24 hs a 35ºC.
Interpretación: Crecimiento y viraje Staphylococcus aureus
Crecimiento sin viraje.
S. epidermidis y otros coagulasa negativos
Consideraciones:
La alta concentración de sal inhibe otros microorganismos excepto
enterococos (por lo tanto usar la placa para identificación, no para
aislamiento).
Bilis Esculina
PRUEBA DE LA BILISESCULINA:
Fundamento: bacterias como estreptococos del grupo D
hidrolizan la esculina en presencia de 1-4% de sales biliares.
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en la superficie
de un pico de flauta. Incubar 24 hs.
Interpretación: La beta glucosidasa escinde la esculina en
glucosa y esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y
forma un complejo de color negro con Fe 3+ .La hidrólisis de
esculina se observa como un oscurecimiento del medio (color
negro) en 24 hs de incubación a 35ºC, raramente se requieren
48 hs de incubación hasta que la hidrólisis sea aparente.
Consideraciones: Es importante que el medio contenga 40%
de bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo
que lleva a confundir algunos estreptococos viridans con
enterococos
PRUEBA DE CAMP
Fundamento: Los estreptococos grupo B secretan el factor
CAMP que interactúa con la ß-hemolisina secretada por una
cepa ß-hemolítica de S. aureus (ATCC 25923) lo que causa un
acrecentamiento o sinergismo de la hemólisis.
Procedimiento: En placa de agar sangre sembrar una estría
de la cepa de S. aureus y perpendicularmente a ésta (lo más
cerca posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de
estreptococo en estudio.
Tiempo y Tº de incubación: Incubar 24 hs a 35ºC en
aerobiosis (en CO2 aumentan los falsos positivos).
Interpretación: El sinergismo se observa como un área de ßHemólisis en forma de “punta de flecha” en la zona
de desarrollo más cercana a ambas estrías.
Prueba de CAMP
PRUEBA DEL HIPURATO DE SODIO
Fundamento: Enterococos son capaces de hidrolizar el
hipurato de sodio. La producción de hipuricasa resulta en la
hidrólisis del hipurato de sodio con la formación de benzoato de
sodio y glicina.
Procedimiento:
Inocular un tubo con medio hipurato de sodio con el
microorganismo. Incubar 24 hs a 35ºC. Centrifugar. Pipetear
0.8 ml el sobrenadante. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico 7%.
Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sodio con el
microorganismo. Incubar 2 hs a 35ºC. Agregar 0.2 ml de
Ninhidrina.
Interpretación: Formación de un precipitado denso y
persistente por 10 minutos = prueba (+) benzoato
La aparición de un color púrpura profundo = prueba (+) glicina.
Hidrólisis de hipurato
Prueba de la susceptibilidad a
la Novobiocina
Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la
novobiocina.
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en agar Mueller
Hinton según técnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de
Novobiocina (5 µg).
Interpretación: Sensible: inhibición del desarrollo con un diámetro
mayor o igual a 16 mm
Staphylococcus
Sensibles
Micrococcus
Resistentes
Consideraciones:
Kirby Bauer (Difusión en disco)
Inoculo sin incubación previa
Tiempo de lectura: 24 hs.
Tº de incubación: 33º a 35º
PRUEBA DE LA BACITRACINA:
Fundamento: Algunos Streptococos son sensibles a la
bacitracina.
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en AS
según técnica de Kirby-Bauer utilizando discos de
Bacitracina (0.04 U).
Interpretación: Sensible: Cualquier zona de inhibición
del desarrollo.
Consideraciones: Kirby Bauer (Difusión en disco)
Inoculo sin incubación previa
Tiempo de lectura: 18 a 24 hs.
Tº de incubación: 33º a 35º en CO2
Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma
directa en las placas primarias de cultivo puede dar
como resultado un 40% a 50% de falsos negativos.
PRUEBA DE LA BACITRACINA
PRUEBA DE LA OPTOQUINA
Fundamento: se usa el disco de optoquina para diferenciar
entre S. pneumoniae (sensibles) y otras especies de
estreptococos a hemolíticos (resistentes). La sensibilidad a la
optoquina es una medida de la fragilidad de la membrana
celular bacteriana.
Método: se toma una suspensión de colonias puras en caldo
Mueller Hinton o tioglicolato y con un hisopo se estría una
placa de agar sangre de carnero al 5 %. Sobre la estría se
coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmósfera de CO2
al 5 % ( jarra con vela ). durante 24 hs. a 35° C.
Interpretación: Sensible, cuando hay inhibición alrededor del
disco. Se considera como punto de corte 16 mm. (discos de 10
mm) o 14 mm (discos de 6 mm). Resistente, cuando el
crecimiento no es inhibido alrededor del disco.
PRUEBA DE LA OPTOQUINA
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
PARA BACILOS GRAM
NEGATIVOS
OXIDASA – PRUEBAS OF
TSI
SIM
CITRATO
UREA
FAL
LIA (DESCARBOXILASAS) Y AA lïquidos
ONPG
ROJO DE METILO – VOGES
PROSKAUER
CITOCROMOOXIDASA O PRUEBA
DE LA OXIDASA
Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla en microorganismo
aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos.
Procedimiento: Hacer una suspensión del microorganismo con solución
fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, agregar un disco (disco comercial
de papel impregnado de tetrametil-para-difenilamina) se agita y antes de
los 2 minutos se debe leer.
Interpretación: Un cambio de color del disco a rosado o violeta = prueba
(+). Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasa negativo.
Consideraciones Esta prueba no puede realizarse con colonias que
provengan de medios de cultivo que contenga hidratos de carbono ni
indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe incubar los
microorganismos en un placa de AS o bien un TSA (tripteina-soya-agar)
OXIDASA
NEG
POS
PRUEBA DE OXIDACIÓN FERMENTACIÓN (O-F)
Fundamento: Determina el metabolismo oxidativo o fermentativo
de un hidrato de carbono o su NO utilización. Se usa el medio O-F
de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de carbono en
una relación 1:5. Al ser menor la concentración de peptonas, hay
menor producción de productos de oxidación a partir de los AA que
tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los ácidos débiles
producidos por los microorganismos no fermentadores.
Procedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la
siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de
los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina
estéril.
Interpretación:
Microorganismos oxidativos: producen ácido solo en el tubo
abierto, expuesto al O2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo
expuesto al aire atmosférico cambia su color original a amarillo.
Microorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos.
O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo.
Microorganismos sacarolíticos: son inertes a este medio que
conserva su pH alcalino después de la incubación, conservando su
color original.
PRUEBA OF
OXIDACIÓN - FERMENTACIÓN
TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO
AGAR)
Fundamento: Detecta la fermentación de hidratos de
carbono. El medio contiene: glucosa al 0.1%, lactosa
1%, sacarosa al 1% y peptonas; también tiene un
indicador rojo de fenol y sulfato de hierro para
evidenciar la formación de SH2.
Procedimiento: El medio se fracciona en pico de
flauta con una capa basal profunda (2 cm. por lo
menos). Con el ansa en punta se siembra por
punción y estría.
El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o rojo
pálido. Incubar 24 hs a 35º C.
AGAR TSI
TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO
AGAR)
Interpretación:
Fermentación de la glucosa (alcalino/ácido)
Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo
ácidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamente
utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la
glucosa que se halla en baja concentración se consume (antes de las 24hs)
los microorganismos comienzan a utilizar la peptonas con producción de
amoníaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en el
pico, quedando el fondo ácido.
Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (ácido/ácido)
Como la lactosa y sacarosa están en una proporción 10 veces mayor que la
glucosa, en un período de 24hs., la lactosa y sacarosa, aún no se
consumen quedando ácido el medio o sea totalmente amarillo.
No hay fermentación de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino).
Un microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos de
carbono, los obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son
degradadas libran amoníaco y alcalinizan el medio. Produciéndose
entonces intensificación del color.
VARIACIONES DEL TSI
SIM (SULFHÍDRICO – INDOL –
MOVILIDAD)
Fundamento: Es un medio semi-sólido transparente que pone en
evidencia la movilidad, la producción de triptofanasa y de SH2. Contiene:
Triptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone
de manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovac
Citrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2
ennegrecen el medio de cultivo
Si los microorganismos son móviles, al ser éste un medio semi-sólido se
produce enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en
la punción, inmovil.
Procedimiento: se inocula el microorganismo por punción con ansa de
punta. Se deja incubar a 35ºC durante 24hs. y luego de este tiempo se
agregan unas gotas del reactivo de Erlich o Kovac dejándolo resbalar por
las paredes del tubo.
Interpretación:
Triptófano (+): observar la interfase, la aparición de un color rojo fucsia
brillante por la formación de un complejo entre el indol y el pdimetilaminobenzaldehido.
M (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medio
M (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medio
M (-) / SH2 (-) se observa crecimiento solamente en la estría
M (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro alrededor de la estría (pero no
ennegreciendo de todo el medio).
SIM
SIM
SH2+ Ind+
Mot+
SH2+ IndMot-
SH2- Ind+
Mot+
SH2- IndMot-
ROJO DE METILO –
VOGES PROSKAUER:
Fundamento: El acido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la
fermentación de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de cierto
numero de vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producción
de acetoína (acetil-metil-carbinol) un producto final de reacción neutra. En
presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es convertida en diacetilo
y el α naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo.
Procedimiento: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos
pruebas (2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a
incubar a 35ºC durante como mínimo 24-72hs..
Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la
de VP.
Rojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la
superficie del medio aparece un color rojo intenso es RM (+) =
microorganismos que utilizan la glucosa fermentándola hasta llegar a un pH
menor a 4,4.
VP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es
esencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude
suavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 min. La aparición de color
rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-carbinol).
Prueba de VP y RM
ONPG
O-NITROFENIL-β-GALACTOPIRANÓSIDO
Fundamento: Lo microorganismos lactosa (+) tienen β-galactosidasa y
permeasa, dos enzimas necesarias para la formación de ácidos a partir de
la lactosa
La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en la
célula bacteriana.
Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de
permeasa, pero sí tienen β-galactosidasa, en realidad son lactosas (+).
Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-)
Procedimiento: Hacer un inóculo con SF estéril, agregar un disco de papel
comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer.
Interpretación: Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo
es productor de β-galactosidasa= prueba (+).
Consideraciones
Se hace un inóculo del microorganismo en solución fisiológica estéril, se
agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC durante 24hs.
ONPG
CITRATO
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos
microorganismos que utilizan el citrato como única
fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol.
Procedimiento: El color original del medio es verde, y
se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra
se hace por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC.
Interpretación: Si el microorganismo utiliza citrato, se
produce alcalinización del medio de cultivo pasando éste
a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para
el citrato.
Citrato
UREA
Fundamento: Pone de manifiesto a aquellos
microorganismos que poseen la enzima ureasa.
Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flauta
contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color
original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra
se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como
en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º C.
Interpretación: Si el microorganismo es productor de
ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco,
consecuentemente produce alcalinidad que se
manifiesta porque el medio toma un color fucsia.
Urea
Positivo
Negativo
FENIL-ALANINA-DESAMINASA
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos
microorganismos que poseen la enzima FENILALANINA-DESAMINASA. El medio se prepara con un
pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la
superficie del medio de cultivo.
Procedimiento: Se siembra sobre la superficie del
medio solamente, se incuba 24 hs a 35º C, se revela
con cloruro férrico.
Interpretación: El color original es amarillo, si el
microorganismo es productor de la enzima, al agregar
sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de
manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.
Fenilalanina FAL
(-)
(+)
AMINOÁCIDOS / DESCARBOXILASAS
Fundamento: Las descarboxilasas son enzimas sustrato-específicas
(presentes o no en los microorganismos) capaces de reaccionar con la
porción carboxilo (COOH) de AA formando aminas de reacción alcalina.
Esta reacción, conocida como descarboxilación, forma C02 como producto
secundario. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido.
Lisina, arginina y ornitina son los aminoácidos evaluados de rutina en
la identificación de enterobacterias.
El medio Moeller es la base (semi-sólida) que se emplea con más
frecuencia. El aminoácido se agrega a la base. El color original es lila.
Procedimiento: Se inoculan por punción 2 tubos y se sellan con aceite
mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no.
Interpretación: Si el aminoácido es descarboxilado, se forman aminas
alcalinas y el medio pasa a violeta más intenso, POSITIVO. Si no es
descarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al amarillo por la formación
de ácidos, NEGATIVO.
LISINA DECARBOXILASA
LIA:
Agar de ensayo para la demostración simultánea de lisina decarboxilasa
(LD) y de la formación de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificación
de enterobacterias.
► La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas
que la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al
violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol,puesto que la
descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a 6.0).
Es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio de
cultivo, por fermentación de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede
utilizarse para la diferenciación de bacterias que fermentan glucosa.
► Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa,
producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La
incubación prolongada puede ocasionar alcalinización en la zona de la
superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al
violeta. La formación de H2S produce una coloración negra debido al
sulfuro de hierro producido.
Lisina Hierro Agar (LIA)
LIA – SH2 -
LIA + SH2 -
LIA + SH2 -