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Estudio Virológico por
PCR en tiempo real
Diagnóstico Molecular de Herpes virus
MSc. Mónica Cappetta
Lab. Biología Molecular, AEPSM
Biología Molecular en la Clínica
• Los
métodos moleculares han potenciado la capacidad de los
laboratorios de identificar y caracterizar los agentes infecciosos en
profundidad.
• Las aplicaciones incluyen:
detección cualitativa y cuantitativa
genotipado y detección de subtipos
testeo de resistencia molecular
• Cuando
se aplican estas metodologías selectivamente en un
laboratorio se potencian los diagnósticos y el manejo clínico de los
pacientes.
Agentes Virales
Detección viral directa por amplificación de ác. nucleicos:
- Eliminación en algunos casos de la utilización de
métodos indirectos.
- Eliminación del cultivo viral altamente complejo.
- Rápido diagnóstico de infecciones virales.
- Alta sensibilidad y especificidad
Familia Herpes virus
• Principal causa de enfermedad humana viral luego de la gripe.
• Infección – latencia – reactivación
• 25 tipos
8 infectan al hombre.
• Mayoría de población humana infectada; adultos en gral. con Ac
para la mayoría de los herpes virus excepto HHV-8.
• Virus envueltos de ADN doble cadena.
• Se clasifican por su localización
en el estado latente.
Propiedades de los virus Herpes humanos
Tipo
1
Nombre
Herpes simplex-1 (HSV-1)
Sub Familia
Alfaherpesvirinae
Células blanco
Mucoepitelio
Latencia
Transmisión
Neurona
Contacto cercano
Contacto sexual
Madre-bebé
2
Herpes simplex-2 (HSV-2)
Alfaherpesvirinae
Mucoepitelio
Neurona
Contacto cercano
Contacto sexual
Madre-bebé
3
Varicella Zoster virus
(VSV)
Alfaherpesvirinae
Mucoepitelio
Neurona
Contacto
4
Epstein-Barr Virus (EBV)
Gamaherpesvirinae
Linfocito B,
epitelio
Linfocito B
Monocitos,
linfocitos y otros
Saliva, ruta
respiratoria
Secreciones,
transfusión
sangre, transplante, congenita
5
Cytomegalovirus (CMV)
Betaherpesvirinae
Epitelio,
monocitos,
linfocitos
6
Herpes lymphotropic virus
Betaherpesvirinae
Linfocitos T y
otros
Linfocitos T y
otros
Contacto, ruta
respiratoria
7
Human herpes virus-7
(HHV-7)
Betaherpesvirinae
Linfocitos T y
otros
Linfocitos T y
otros
Desconocido
8
Human herpes virus-8
(HHV-8)
Gamaherpesvirinae
Cél. endoteliales
Desconocido
Intercambio de
fluido corporales?
Manifestaciones clínicas
HSV 1 y 2: Lesiones
VZV: varicela (niños)
herpes zoster (adultos/react.)
EBV: Asintomático (niños)
Mononucleosis (jóvenes/adultos)
CMV: asintomático
Complicaciones
Encefalitis (HSV, VZV)
Neumonia (VZV)
Linfomas luego de transplantes o SIDA (EBV)
Infección congénita (VZV, CMV)
Retinitis, neumonia, esofagitis, encefalitis en inmunodeprimidos (CMV)
Diagnóstico Molecular de Herpes virus
 Encefalitis virales : estudio de LCR
 Pacientes inmunodeprimidos
Herpes virus y encefalitis
Agente causal de infecciones SNC
(10% encefalitis virales)
70% tasa mortalidad
diagnóstico precoz - terapia antiviral
morbilidad/moratlidad 20%
en Uruguay: 9% encefalitis viral por HSV
Menos agresivo: Biopsia cerebro vs Punción LCR
Reactivación en inmunodeprimidos
Ejemplo Citomegalovirus:
•
Las pruebas serológicas presentan un uso limitado:
- individuos con infección latente
- anticuerpos aparecen 2 semanas después de la
infección aguda
•
Se produce la enfermedad al reactivarse como resultado de
Inmunodepresión: ej transplantes, SIDA, etc.
•
La detección del ADN del CMV en plasma permite detectar
esta reactivación.
•
Seguimiento de respuesta al tratamiento: carga viral.
LCR
Orina
Plasma
Biopsia
ADN
PCR
1er. round
2do. round
2n copias
DNA
Producto
nested-PCR
Electroforesis
en gel
Diagnóstico por real time-PCR
 Detección rápida.
 Detección cualitativa y cuantitativa.
 No requiere manipulación post-PCR.
 Menor probabilidad de contaminación o errores
de manipulación.
Implementación en el laboratorio
• Detección cualitativa de familia Herpes virus en LCR
por PCR en tiempo real:
- Entrega de resultados en unas horas
• Cuantificación de CMV y EBV por PCR en tiempo
real:
- Seguimiento de pacientes con reactivación
- Evaluación de tratamientos
Detección cualitativa de familia Herpes por Real time
3
Reacciones de amplificación:
HSV / CMV
Multiplex
EBV / HHV-6
VZV
 6 diagnósticos en la misma corrida de amplificación.
 Detección por Sybergreen
Tm específica
 Utilización de Uraciloglicosilasa durante la implementación
en el laboratorio del protocolo.
Identificación de productos de PCR por perfiles de Curvas de Melting
• La Tm depende de la secuencia del ADN, el largo del producto y
el contenido de GC.
• La Tm puede variar para:
- Prod. de igual tamaño pero distinto contenido de GC
- Prod. de igual tamaño y %GC pero con una distribución
de GC diferente
- Productos que difieran en 1 o más bases.
Análisis:
Se monitorea la fluorescencia de la muestra mientras la T° aumenta.
Se grafica la d/dT de la Fluorescencia en función de la Temp (°C).
Análisis de Tm de los productos amplificados
VZV
HHV6
EBV
Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real
PCR
24-36 hrs
2-4 cicladores
Alta manipulación
Riesgo de contaminación
Utilización de Kit comercial
Costos más elevados
Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real
PCR
24-36 hrs
2-4 cicladores
Alta manipulación
Riesgo de contaminación
Áreas pre y post-amplificación
físicamente separadas
Cabina de UV
Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real
PCR
PCR tiempo real
24-36 hrs
2-3 hrs
2-4 cicladores
LightCycler
Alta manipulación
Poca manipulación
Riesgo de contaminación
Riesgo de contaminación
Multiplex con Sybergreen
Menor costo que Kit
comercial
MUCHAS GRACIAS !!