Download Manual CLART ENTHERPEX V2 SC castellano

CLART ENTHERPEX
DETECCIÓN Y TIPADO DE
HERPES Y ENTEROVIRUS HUMANOS
MEDIANTE
IDENTIFICACIÓN GENÓMICA
PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
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Los contenidos del presente Kit se encuentran bajo el ámbito de protección de la solicitud de
Patente internacional WO2009122201
CLART, ENTHERPEX y CLART-Strip son marcas registradas por GENOMICA
EL CE0318 sólo ampara el diagnóstico in vitro de CMV.
GENOMICA, S.A.U.
Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain
Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91
www.genomica.es
Versión 2
Mayo 2010
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ÍNDICE:
1. GLOSARIO DE TÉRMINOS
2. INTRODUCCIÓN
®
3. DESCRIPCIÓN DEL KIT CLART ENTHERPEX
4. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
4.1. Reactivos de extracción-purificación
4.2. Reactivos de amplificación
4.3. Reactivos de visualización
4.4. Otros componentes
5. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO
5.1. Reactivos y material
5.2. Equipos
6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
6.1. Recomendaciones generales
6.2. Precauciones para la visualización
7. TOMA DE MUESTRAS
7.1. Torundas
7.2. Suero, plasma
7.3. Líquido cefalorraquídeo
7.3. Tejido fijado en formol o etanol e incluido en parafina
8. PROTOCOLO DE TRABAJO
8.1. Extracción manual del ADN/ARN a partir de diferentes muestras
8.1.1. Torundas
8.1.2. Suero, plasma
8.1.3. Líquido cefalorraquídeo
8.1.4. Tejido fijado en formol o etanol e incluido en parafina
8.2. Extracción automática
8.3. Reacción de amplificación
8.4. Visualización del producto amplificado
8.4.1. Visualización en Array Tubes (AT)
8.4.2. Visualización en CLART-Strip® (CS)
9. LECTURA DE RESULTADOS
10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
12. BIBLIOGRAFÍA
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1. GLOSARIO DE TÉRMINOS
Consúltense las instrucciones de uso
Fecha de caducidad
Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro
Lote
25ºC
Conservar a temperatura ambiente
20ºC
8ºC
Conservar entre 4 ºC y 8 ºC
4ºC
-18ºC
Conservar entre –30 ºC y –18 ºC
30ºC
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2. INTRODUCCIÓN
De los más de 100 tipos diferentes de herpes virus que se conocen, sólo ocho
infectan exclusivamente al hombre: Virus Herpes Simple tipos 1 y 2 (HSV-1 y
HSV-2), Virus la Varicela-Zoster (VZV), Virus Epstein-Barr (EBV), Citomegalovirus
Humano (CMV), Herpesvirus Humano tipos 6, 7 y 8 (HHV6, HHV7 y HHV8). Un
virus herpes de primates, conocido como virus B, puede también infectar
ocasionalmente al hombre.
Los estudios epidemiológicos demuestran que los virus de la familia
Herpesviridae son extraordinariamente ubicuos y están ampliamente extendidos
en la población general. Los menos ubicuos son el HSV-2 y el HHV-8, debido
quizás a que su principal vía de transmisión es la sexual. En contraste con la gran
prevalencia en la población general, la mayor parte de las infecciones son
asintomáticas. Este tipo de infecciones pueden clínicamente oscilar desde la
benignidad hasta un grave compromiso de la salud o la vida del paciente. Son
estas últimas, las que motivan el interés principal del diagnóstico de laboratorio,
máxime teniendo en cuenta la inespecificidad de los signos y síntomas clínicos
que se presentan.
Aunque estos virus pertenecen a distintas subfamilias, todos ellos comparten una
característica única de los herpes virus, como es la de persistir latentes en las
células o tejidos específicos tras la infección primaria. Durante este período de
latencia el genoma del virus puede o no integrarse en el ADN del huésped y ser
replicado. Esto conlleva el peligro de reactivaciones posteriores, las cuales se ven
favorecidas por ciertos factores; como el stress, la inmunodepresión (enfermos de
SIDA, transplantados…), una edad avanzada, cambios hormonales (menstruación
y gestación), exposiciones a la luz solar, etc. En estos casos pueden aparecer
diversos tipos de síndromes, principalmente neurológicos, como encefalítis,
polirradiculitis o neuropatías periféricas.
Los Enterovirus causan de 10 a 30 millones de infecciones anuales en Estados
Unidos, siendo la causa más común e importante de las infecciones pediátricas,
que oscilan desde estados febriles a meningitis, miocarditis u otras sepsis
neonatales.
Dentro de la familia de los Enterovirus los más importantes desde el punto de
vista clínico humano son: Poliovirus, Coxsackivirus y Echovirus. El Poliovirus a
pesar de ser causa de parálisis infantil en 4 de cada 100 niños es el virus menos
significativo ya que actualmente se dispone de una vacuna en el mercado.
El diagnóstico microbiológico de estas patologías es de gran interés,
especialmente de las más graves, como la Encefalitis que puede ser causada
tanto por herpesvirus como por Enterovirus. Muchas de las patologías presentan
el mismo cuadro clínico que el causado por otros agentes víricos y bacterianos por
lo que la posibilidad de realizar un diagnóstico diferencial es de gran importancia.
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Históricamente, el diagnóstico microbiológico de Herpesvirus y Enterovirus ha
dependido de su cultivo en el laboratorio, pero esta técnica tiene los
inconvenientes de ser un procedimiento largo (1-2 semanas), poco sensible,
laborioso y difícil de implantar en la práctica rutinaria del laboratorio. Además, no
puede ser utilizado con algunos tipos de muestras clínicas (líquido
cefalorraquídeo).
El kit CLART® ENTHERPEX se ha desarrollado para determinar de forma rápida
el agente (Herpes o Enterovirus) causante de enfermedad, permitiendo así
instaurar el tratamiento clínico más efectivo en cada caso.
El Kit CLART® ENTHERPEX para el genotipado de Herpesvirus humanos y
Enterovirus está basado en la amplificación de fragmentos específicos del genoma
vírico mediante RT-PCR múltiple y su posterior hibridación con sondas de captura
en arrays, específicas para cada microorganismo. Esto conlleva una serie de
ventajas:
1 Alta sensibilidad permitiendo la detección de cantidades mínimas de ADN.
Esto supone una gran ventaja en muestras clínicas en las que la cantidad
de moléculas de virus son escasas.
2 Detección simultánea de múltiples virus presentes en una misma muestra.
3 Elevada especificidad, al utilizar una secuencia correspondiente a una
región altamente conservada dentro del genoma vírico y sondas de captura
específicas para cada tipo de Herpes humano y Enterovirus.
4 Fácil de estandarizar en un laboratorio hospitalario.
5 Rápido ya que se obtienen los resultados de los análisis en 8 h.
3. DESCRIPCIÓN DEL KIT CLART® ENTHERPEX
CLART ENTHERPEX detecta la presencia en muestras clínicas (torundas, suero,
plasma, líquido cefalorraquídeo y biopsias) de los 8 virus herpes humanos: HSV-1,
HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6, HHV-7 y HHV-8; y de los tres virus más
importantes desde el punto de vista clínico humano de la familia de Enterovirus,
pero sin diferenciarlos entre ellos: Poliovirus, Echovirus y Coxsackievirus.
La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de un fragmento de
entre 106-328 pb, cuya secuencia aunque está altamente conservada es lo
suficientemente específica como para identificar cada tipo de virus. De esta
manera, se asegura la especificidad de la detección.
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La amplificación de los distintos virus se lleva a cabo en dos tipos distintos de
tubos de RT-PCR/PCR (PCR reversa). Los tubos de la Mix 1 son transparentes y
se utilizan para la amplificación y posterior detección de HSV-1, HSV-2 y VZV. Los
tubos de la Mix 2 son de color verde y se utilizan para la amplificación y
visualización de los virus: CMV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8 y Enterovirus
(Echovirus, Poliovirus y Coxsackivirus).
La detección del producto amplificado por RT-PCR/PCR se lleva a cabo mediante
una nueva plataforma tecnológica basada en microarrays de baja densidad:
CLART® (Clinical Array Technology). La plataforma se fundamenta en un principio
muy sencillo pero a la vez muy cómodo y eficaz que consiste en incluir un
microarray en la parte inferior de un tubo de 2 ml (Array Tube / AT) o en el fondo
de un pocillo de una tira de 8 (CLART-Strip® / CS) (Figura 1), lo que simplifica
todo el proceso de hibridación y visualización frente a los sistemas de arrays
clásicos.
Tubo AT
Tira de 8 pocillos CS
12 tiras de 8 pocillos
Figura 1: Esquema de la plataforma CLART®
*El sistema ArrayTube
TM
está licenciado por CLONDIAG Chip Technologies GMBH.
Este tipo de tecnología permite la detección simultánea de múltiples marcadores
moleculares de utilidad diagnóstica y de los controles necesarios para asegurar la
fiabilidad de los resultados obtenidos.
El sistema de detección con CLART ENTHERPEX se basa en la precipitación de
un producto insoluble en aquellas zonas del microarray en las que se produce la
hibridación de los productos amplificados con las sondas específicas. Durante la
RT-PCR/PCR, los productos amplificados se marcan con biotina. Después de la
amplificación, estos productos se hibridan con sus respectivas sondas específicas
que están inmovilizadas en zonas concretas y conocidas del microarray, tras lo
que se incuba con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se
une a través de la estreptavidina con la biotina presente en los productos
amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus sondas específicas) y la
actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto insoluble en presencia
del sustrato o-Dianisidina, que precipita sobre las zonas del microarray en las que
ocurre la hibridación (Figura 2).
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Producto marcado
Sondas sobre array
biotina
Hibridación
Conjugado
Incubación
con el conjugado
Reacción de revelado
Precipitación
del sustrato
Figura 2: Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la superficie,
capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A través de la biotina, se
une el conjugado, en este caso estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano, HorseRadish Peroxidase). El
sustrato o-Dianisidina por la acción de la HRP, produce un precipitado sobre la zona en la que se produce
la hibridación.
La sensibilidad obtenida combinando la amplificación genómica y la visualización
en el microarray con el kit CLART ENTHERPEX es tan alta, que no es necesario
hacer dobles amplificaciones (nested-PCR), evitando así el riesgo de
contaminación que éstas conllevan.
Uno de los principales inconvenientes de la detección por amplificación genética
son los falsos negativos, debidos principalmente a la presencia de inhibidores de
la mezcla de enzimas (RT y ADN polimerasa) en las muestras en las que se
quiere detectar el virus (hemoglobina, sales, etc).
Con el kit CLART ENTHERPEX se han eliminado estos falsos negativos
añadiendo a cada uno de los tubos de amplificación un control interno de la
eficiencia de la reacción de amplificación.
Si la extracción RNA/DNA se realiza de forma incorrecta la técnica dará lugar a un
falso negativo, por lo que se recomienda especial cuidado a la hora de realizar
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este proceso.
A su vez, se debe incluir un control negativo de extracción para comprobar que las
muestras no hayan sufrido contaminaciones durante los procesos de extracción,
amplificación y visualización; lo que daría lugar a un falso positivo.
4. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
El kit CLART ENTHERPEX contiene suficientes reactivos para la extracción y
análisis del ADN/ARN de 24 ó 48 muestras clínicas. Los reactivos incluidos en el
kit se han agrupado en varias cajas, dependiendo de la temperatura a la que se
han de conservar. Todos los reactivos son estables en las condiciones indicadas
de conservación hasta la fecha de caducidad del kit.
4.1. Reactivos de extracción
El kit de Extracción y Purificación CLART ENTHERPEX se envía a -20º C y se
debe conservar a esta temperatura hasta su uso.
Sus componentes son:
• SEML (solución de extracción). Una vez descongelada se debe guardar a
4ºC y consumir antes de 8 días.
• SD (solución de dilución). Conservar a -20ºC o a 4ºC.
• IP (Isopropanol). Conservar a -20ºC.
• DE (Etanol 70%). Conservar a -20ºC.
• DB (Solución de digestión 5X). Una vez descongelada guardar a 4ºC.
• PK (Proteinasa K 10X). Una vez descongelada se debe mantener en hielo y
guardar a 4ºC. No usar este reactivo si ha transcurrido más de un mes tras
su descongelación.
4.2. Reactivos de amplificación
Se envían y conservan a -20º C.
• Tubos de amplificación
Se envían dos tipos de tubos de amplificación:
•
•
Tubo incoloro (multiplex PCR 1) para la amplificación de HSV1, HSV-2 y VZV. Contienen 45 µl de mezcla de reacción. Mix1.
Tubo verde (multiplex-RT-PCR 2) para la amplificación de
CMV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8 y Enterovirus (Echovirus,
Poliovirus y Coxsackivirus). Contienen 43 µl de mezcla de
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reacción. Mix2
¡ADVERTENCIA!: Hay que añadir 2 µl de mezcla de enzima
antes de introducir el material genético extraído en los tubos de
amplificación verdes. Los tubos incoloros ya llevan incorporada
la enzima.
•
Mezcla de Enzima: es una mezcla de las enzimas de RT
(retrotranscriptasa) y DNA Polimerasa. Lista para su uso.
Conservar a -20ºC.
NOTA: En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de
temperatura; la aparición de un color rojizo en la ventana de visualización
indica que en algún momento los productos han sobrepasado la temperatura
de conservación de –20oC y no deben utilizarse.
4.3. Reactivos de visualización
Se envían a 4º C. Son los siguientes:
• Microarrays: Tubos AT o tiras de 8 pocillos (CS) (sondas específicas
incluídas). Se suministran en un sobre termosellado. Conservarlos
siempre cerrados, a temperatura ambiente y protegidos de la luz.
• SH (Solución de Hibridación). Conservar a 4 ºC.
• DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC.
• CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC. Dar un pulso en la centrífuga antes de
usar.
• RE (Solución de Revelado). Conservar a 4º C.
• TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4º C.
¡ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, los microarrays deben conservarse a
temperatura ambiente.
4.4. Otros componentes
La técnica requiere un equipo que capture y procese la imagen obtenida del
microarray, generando de manera totalmente automática un único informe por
cada muestra analizada. En la siguiente tabla se indican las características del
equipo del que dispone GENOMICA. Cuenta con un Software específico para
CLART ENTHERPEX, diseñado y validado por GENOMICA.
- lector CAR (Clinical Array Reader): Este lector está fabricado para su uso
exclusivo con los kits de diagnóstico de GENOMICA. Es distribuido por
GENOMICA.
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- En el caso de utilizar CLART-Strip® / CS es necesario colocar en el lector
un adaptador sobre el que se sitúa la placa con las tiras a visualizar.
- Software: específico para CLART ENTHERPEX, instalado y listo para su
uso.
5. MATERIAL REQUERIDO, NO SUMINISTRADO
A continuación enumeramos todo el material requerido y que no es suministrado.
5.1. Reactivos y material
• Agua destilada.
• Suero salino.
• Guantes desechables.
• Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo.
• Recipiente con hielo picado.
• Tubos Eppendorf de 1,5 ml autoclavados.
• Gradillas para tubos de 1,5 ml.
• Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.
5.2. Equipos
• Microcentrífuga.
• Termociclador.
• Cabina de bioseguridad para el laboratorio de extracciones
• Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl
para el laboratorio de extracción.
• Una micropipeta ajustable entre 1-20 µl, para añadir la mezcla de
enzimas al tubo de color de amplificación y para añadir el material
genético a los tubos de amplificación
• Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl
para el laboratorio de visualización.
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• Termobloque con agitación ajustable a 25ºC, 30ºC, 50ºC y 53ºC.
Compatible con tubos tipo Eppendorf y con tiras de 8 pocillos.
• Vórtex.
• Sistema de vacío (opcional).
6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
¡Muy importante para evitar contaminaciones! Leer detenidamente
antes de comenzar la técnica.
6.1. Recomendaciones generales:
1. La técnica se debe realizar en dos áreas separadas físicamente, para evitar
la contaminación de las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada
una de las áreas debe tener su propio material de trabajo identificado (pipetas,
puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de cada una de ellas.
1 Área pre-PCR: En esta área se hace la extracción del ADN/ARN, se añade
a los tubos de amplificación la mezcla de enzimas y se añade el ADN/ARN
a los tubos de amplificación. Se debe usar campana de flujo laminar.
2 Área post-PCR: En esta área se lleva a cabo la amplificación y la
visualización del producto amplificado. El material de esta área nunca ha de
entrar en contacto con el del área de extracción. Evitar ir al área de prePCR después de haber estado trabajando en el área de visualización.
2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes
con cierta frecuencia y obligatoriamente cada vez que se empiece a trabajar en las
áreas antes descritas. Siempre hay que utilizar guantes nuevos cuando se
preparen los tubos de amplificación y cuando se añada el ADN/ARN a esos tubos.
3. Limpiar las zonas de trabajo, material y equipos (poyatas, campanas,
gradillas, pipetas, termociclador…) en profundidad con lejía diluida al 10% cada
vez que se procese una tanda de muestras, y obligatoriamente después de una
contaminación. Poner papel de filtro nuevo cada vez que se comience a trabajar.
Se recomienda limpiar los pocillos del termociclador y termobloque con un hisopo
humedecido con la concentración de lejía indicada (no añadir la lejía directamente
sobre el bloque).
4. Emplear siempre puntas con filtro o pipetas de desplazamiento positivo
para evitar contaminaciones debidas a la micropipeta. Se debe trabajar con un
juego de pipetas distinto para cada área.
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5. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado.
6. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes aunque sean del mismo
lote.
7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente después de su uso para
evitar contaminaciones.
8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo.
9. Separar los tubos unos de otros en todo momento durante la manipulación,
con especial precaución durante la extracción.
10. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el
kit si se emplean otras muestras distintas a las indicadas o ADN/ARN
extraído por un protocolo distinto al indicado.
6.2. Precauciones para la visualización
1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el cristal situado en
el fondo del tubo, ya que podría dañarse el micro-array.
2. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del tubo AT/CS, nunca
directamente sobre el fondo.
3. Es conveniente no añadir la solución SH hasta que se vayan a añadir los
productos desnaturalizados de PCR.
4. A la hora de aspirar la solución de hibridación utilizar una punta distinta para
cada muestra con el fin de evitar contaminaciones.
5. Es muy importante eliminar completamente todo resto de solución antes de
añadir la siguiente.
6. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el tubo
AT/CS y la tapa del tubo para evitar que queden restos de éste y que reaccionen
con la solución RE, produciendo un precipitado inespecífico que pueda dar lugar a
interpretaciones erróneas del resultado.
7. Tras los lavados tener la precaución de retirar todo el TL, de manera que el
cristal quede completamente seco antes de echar cualquier reactivo de la
visualización. Esto es especialmente importante en los lavados tras el conjugado.
8. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de las
distintas soluciones.
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9. Mantener limpia la base del tubo AT/CS para evitar posibles interferencias en la
lectura de resultados.
10. Antes de realizar la lectura de las muestras, asegurarse de haber elegido el
programa correcto de lectura.
11. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores
de posición y de que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En
caso contrario, limpiar el fondo del tubo por fuera con un papel de celulosa,
golpear suavemente el tubo con el dedo o eliminar las burbujas con micropipeta.
7. TOMA DE MUESTRAS
7.1. Torundas
Tomar la muestra con una torunda seca y estéril, de algodón o alginato,
preferentemente del tipo uretral (incluso para los frotis vaginales). No utilizar
dispositivos que produzcan el sangrado de la lesión. Volver a introducir la torunda
en su tubo sin ningún tipo de medio. Conservar la muestra a 4º C si se va a
procesar antes de 7 días o a -20º C si se va procesar después. Las torundas son
de un solo uso con lo que una vez procesadas deben desecharse. Es importante
evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.
7.2. Suero o plasma
Las muestras de sangre de las que se desee extraer el plasma han de tomarse en
tubos que contengan citrato o EDTA como anticoagulante, nunca heparina.
Para extraer el suero hay que dejar coagular la muestra de sangre durante 30 min
y centrifugar a 1500 g durante 20 min.
En algunos casos, tras la toma de este tipo de muestras es posible aislar la
fracción celular y proceder a la extracción del DNA/RNA a partir de ésta.
Si la muestra se va a procesar antes de 12 h se debe conservar a 4º C. Si el
análisis se realiza con posterioridad, la muestra se debe alicuotar y almacenar
congelada a -70º C y descongelar justo en el momento de su procesamiento. Es
importante evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.
7.3. Líquido cefalorraquídeo
Si la muestra se va a procesar antes de 12 h se debe conservar a 4º C. Si el
análisis se realiza con posterioridad, la muestra se debe alicuotar y almacenar
congelada a -70º C y descongelar justo en el momento de su procesamiento. Es
importante evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.
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7.4. Biopsias fijadas en formol o etanol e incluidas en parafina
Fijar las muestras en formol tamponado durante el menor tiempo posible (nunca
más de 24h), para evitar la degradación del DNA/RNA. El empleo de formol no
tamponado o la fijación durante más de 24h podría conducir a un resultado falso
negativo.
Es importante limpiar cuidadosamente la cuchilla con xileno o usar cuchillas de
un solo uso, antes y después de cortar la muestra, para evitar arrastrar restos de
otra muestra cortada anteriormente. Hacer con el microtomo 2-3 cortes de 5 µm y
ponerlos en un tubo estéril de 1,5 ml.
8. PROTOCOLO DE TRABAJO
8.1. Extracción manual del ADN/ARN a partir de diferentes muestras
Se recomienda que, para obtener unos óptimos resultados, el rendimiento de
la extracción sea, como mínimo de 5-10 ng/µl de ADN/ARN, independientemente de
que la extracción se realice de forma manual o automática.
Recomendaciones específicas antes de comenzar la extracción:
•
•
•
•
•
Trabajar en el área pre-PCR de extracción, siempre en campana y
siguiendo las recomendaciones del punto 6.1.
Antes de comenzar y al finalizar se debe limpiar cuidadosamente el área de
la campana con lejía diluida al 10%.
Limpiar las pipetas antes y después de cada uso con lejía diluida al 10%.
Mantener las muestras en hielo.
Utilizar tubos eppendorf de 1.5 ml estériles. Mantenerlos lo más separado
posible en la gradilla durante la extracción para evitar contaminaciones.
Extracción del ADN/ARN
8.1.1. Torundas
Al final de cada serie de muestras incluir un control negativo constituido por 1,5 ml
de suero salino y procesarlo igual que el resto de las muestras.
1. Añadir 1,5 ml de suero salino (cloruro sódico 0,9 %) al tubo que contiene la
torunda y agitar en el vortex durante 1 min.
2. Decantar el sobrenadante en un tubo Eppendorf de 1,5 ml autoclavado y
centrifugarlo durante 10 minutos en microcentrífuga a la máxima velocidad.
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3. Quitar el sobrenadante con la pipeta cuidando de no arrastrar el precipitado de
células.
4. Descongelar un tubo de DB 5X (Solución de Digestión 5X), un tubo de PK 10X
(Proteinasa K 10X) y un tubo de SD (Solución de Dilución). La Proteinasa K se
debe mantener en hielo mientras se esté usando y después se debe guardar a
4ºC. Nunca volver a congelarla una vez descongelada. Preparar la mezcla de
digestión, mezclando las siguientes cantidades por cada muestra a analizar:
70 x (nº tubos + 1) = __ µl de SD (Solución de Dilución).
20 x (nº tubos + 1) = __ µl de DB5X (Solución de Digestión 5X).
10 x (nº tubos + 1) = __ µl de PK 10X (Proteinasa K 10X).
5. Añadir 100 µl de mezcla de digestión a cada muestra. Resuspender
suavemente el precipitado de células con la ayuda de la micropipeta.
6. Incubar a 55-60ºC durante 2 h.
7. Hervir durante 10 min para inactivar la Proteinasa K. Si el cierre de los tubos no
es lo suficientemente fuerte, se recomienda perforar los tapones con una aguja
para impedir que se abran durante la incubación a 100 ºC. Procurar que el
agua del baño no entre en el tubo por este agujero. No cerrar la tapa del baño.
8. Centrifugar en microcentrífuga a máxima velocidad durante 10 min. Pasar
inmediatamente el sobrenadante a un tubo limpio y tomar una alícuota de 5 µl
para hacer la reacción de amplificación. Guardar el resto a -20 ºC.
8.1.2. Suero o plasma
Es necesario procesar una muestra formada por 100 µl de suero salino y que
servirá como control negativo de la reacción de amplificación y visualización.
1. Descongelar la muestra en hielo.
2. En un tubo Eppendof poner 100 µl de muestra clínica
3. Añadir 400 µl de SEML (solución de extracción de muestras líquidas). Esperar
a que la solución se descongele y se vuelva transparente antes de usarla.
Mezclar invirtiendo los tubos varias veces e incubar durante 15 min a Tª
ambiente.
4. Añadir 500 µl de Isopropanol (almacenado a -20º C), mantener el isopropanol
en hielo hasta su uso. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces y centrifugar,
preferiblemente a 4º C, a 13000 rpm durante 20 min.
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5. Aspirar el sobrenadante con micropipeta. Se puede utilizar la micropipeta de
1000 µl para eliminar el sobrenadante, siempre y cuando se emplee al final una
micropipeta de menor escala, por ejemplo la de 20 µl, para los restos del fondo
del tubo y evitar eliminar el precipitado por equivocación.
6. Añadir 500 µl de Etanol 70% (almacenado a -20º C), mantener en hielo hasta
su uso. Agitar ligeramente para limpiar el precipitado del fondo y centrifugar 15
min a 13000 rpm.
7. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente como se indica en el paso 5. Secar
perfectamente en la campana durante 15 ó 20 min dejando los tubos abiertos.
Antes de resuspender la muestra comprobar que no queden restos de etanol
que podrían inhibir la PCR.
8. Resuspender en 25 µl de Solución de dilución. El ADN/ARN extraído se puede
utilizar directamente para su análisis (se mantendrá en hielo hasta el momento
de añadirlo al tubo de amplificación) o se puede guardar a -20º C.
8.1.3. Líquido cefalorraquídeo
Es necesario procesar una muestra formada por 50 µl de suero salino y que
servirá como control negativo de la reacción de amplificación y visualización.
1. Descongelar las muestras en hielo.
2. En un tubo Eppendof poner 50 µl de muestra clínica
3. Añadir 200 µl de SEML (solución de extracción de muestras líquidas). Esperar
a que la solución se descongele y se vuelva transparente antes de usarla.
Mezclar invirtiendo los tubos varias veces e incubar durante 15 min a Tª
ambiente.
4. Añadir 250 µl de Isopropanol (almacenado a -20º C), mantener el isopropanol
en hielo hasta su uso. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces y centrifugar,
preferiblemente a 4º C, a 13000 rpm durante 20 min.
5. Aspirar el sobrenadante con micropipeta. Se puede utilizar la micropipeta de
1000 µl para eliminar el sobrenadante, siempre y cuando se emplee al final una
micropipeta de menor escala, por ejemplo la de 20 µl, para los restos del fondo
del tubo y evitar eliminar el precipitado por equivocación.
6. Añadir 500 µl de Etanol 70% (almacenado a -20º C), mantener en hielo hasta
su uso. Agitar ligeramente para limpiar el precipitado del fondo y centrifugar 15
min a 13000 rpm.
- 17 -
7. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente como se indica en el paso 5. Secar
perfectamente en la campana durante 15 ó 20 min hasta que no queden
residuos de etanol. Antes de resuspender la muestra comprobar que no queda
etanol.
8. Resuspender en 25 µl de Solución de dilución. El ADN/ARN extraído se puede
utilizar directamente para su análisis (se mantendrá en hielo hasta el momento de
añadirlo al tubo de amplificación) o se puede guardar a -20º C.
8.1.4. Biopsias fijadas en formol o etanol e incluidas en parafina
1.a. Incluidas en parafina: Hacer con el microtomo 2 cortes de 5 µm y ponerlos
en un tubo Eppendorf de 1,5 ml autoclavado. Es importante limpiar
cuidadosamente la cuchilla con xileno, antes y después de cortar la muestra,
para evitar arrastrar restos de otra muestra cortada anteriormente.
1.b. Fijadas en formol o etanol: Cortar/Machacar un fragmento de muestra de
unos 2-3ml con una cuchilla estéril sobre un porta estéril e introducirlo en un
tubo estéril de 1,5 ml. Machacar el tejido con la punta de la pipeta, mezclar en el
vortex para facilitar la lisis.
2. Descongelar a temperatura ambiente un tubo de DB 5X (Solución de Digestión
5X), un tubo de PK 10X (Proteinasa K 10X) y un tubo de SD (Solución de
Dilución). La Proteinasa K se debe mantener en hielo mientras se esté usando y
después se debe guardar a 4ºC, nunca volver a congelarla una vez
descongelada. Preparar la mezcla de digestión, mezclando las siguientes
cantidades por cada muestra a analizar:
70 x (nº tubos + 1) = __ µl de SD (Solución de Dilución).
20 x (nº tubos + 1) = __ µl de DB5X (Solución de Digestión 5X).
10 x (nº tubos + 1) = __ µl de PK 10X (Proteinasa K 10X).
Añadir 100 µl de mezcla de digestión a cada muestra. Empujar el corte con la
punta de la micropipeta para que quede completamente cubierto por la mezcla
de digestión.
Añadir 100 µl de la mezcla a un tubo de 1,5 ml vacío, que se procesará como
control negativo de extracción y visualización.
3. Incubar a 56º C durante 3 h en un termobloque o en un baño.
4. Hervir durante 10 min para inactivar la Proteinasa K. Si el cierre de los tubos no
es lo suficientemente fuerte, se recomienda perforar los tapones con una aguja
para impedir que se abran durante la incubación.
- 18 -
5. Centrifugar inmediatamente en microcentrífuga durante 10 min. Recoger el
sobrenadante en un tubo de 1,5 ml limpio, atravesando con la micropipeta la
capa superior de parafina solidificada. El DNA extraído se puede utilizar
directamente para su análisis o se puede guardar a -20º C.
8.2. Extracción automática
Seguir recomendaciones del fabricante.
8.3. Reacción de amplificación
8.3.1 Recomendaciones específicas para la amplificación:
•
Trabajar en el área de Pre-PCR, siempre en campana y siguiendo las
recomendaciones del punto 6.1.
•
Tener especial cuidado a la hora de añadir la mezcla de enzimas a los
tubos de amplificación, ya que contiene un elevado porcentaje de glicerol,
de forma que si se introduce demasiado la punta de la pipeta, la mezcla se
adhiere a las paredes provocando, por un lado, que se añada más mezcla
de lo necesario al tubo de reacción, y por otro lado, se produzca una
pérdida del producto, pudiendo darse el caso de no tener suficiente para el
resto de tubos de amplificación del kit.
•
Añadir el ADN/ARN en el área de Pre-PCR, siempre en campana y
siguiendo las recomendaciones del punto 6.1. Durante el proceso mantener
los tubos cerrados separados y en hielo.
8.3.2 Protocolo de la Reacción de amplificación:
1. Descongelar por cada muestra que se vaya a analizar dos Tubos de
amplificación (uno incoloro y otro verde, correspondientes a las dos
multiplex difierentes) y mantenerlos en hielo. No usar temperaturas
superiores a 37º C para la descongelación.
2. Centrifugar unos segundos en la microcentrífuga para que quede todo el
líquido en el fondo del tubo. Si no se dispone de adaptadores de
microcentrífuga, se pueden utilizar en su lugar tubos de un tamaño mayor
a los que se les haya cortado la tapa.
3. Añadir 2 µl de la mezcla de enzima a los tubos de amplificación
verdes (Mix 2). Mantener la mezcla de enzimas en hielo durante su
manipulación.
- 19 -
4. Añadir 5 µl del ARN/ADN con una concentración mínima de 3ng/µl
extraído de las muestras, a cada uno de los Tubos de Reacción y
resuspender varias veces con la micropipeta. Dejar los tubos en el hielo.
5. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas para
ambos tipos de multiplex:
1 ciclo
45ºC 45min
95ºC 15min
45 ciclos
95ºC 30 seg
56ºC 90 seg
72ºC 60 seg
1 ciclo
72ºC 10 min
4ºC continuo hasta la recogida de tubos (opcional)
6. Arrancar el programa y colocar los Tubos de Reacción en el
termociclador. La duración de la amplificación es de unas 5 horas, aunque
puede variar ligeramente dependiendo del equipo empleado.
8.4. Visualización del producto amplificado
8.4.1. Visualización en Array Tubes (AT)
Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización:
•
EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR
SIEMPRE EN EL ÁREA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO
AMPLIFICADO AL ÁREA DE PRE-PCR.
•
Encender el lector de ATs al comienzo del proceso, la autocalibración del
equipo tarda unos minutos y debe estar listo en el momento de la lectura
para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado.
•
PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO, NO
REUTILIZAR
SOLUCIONES
O RESTOS
PREPARADAS
CON
ANTERIORIDAD.
- 20 -
•
Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de poner
en marcha el programa de desnaturalización. Es recomendable limpiar los
pocillos con un hisopo humedecido con dicha concentración de lejía y no
aplicar esta directamente sobre el bloque. Colocar los tubos de
amplificación lo más separados posible y nunca sobrepasar los 10 min. de
desnaturalización.
•
Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro, salvo en la
adición de amplificados al tubo AT donde si es necesario.
•
Cambiar las pipetas Pasteur utilizadas para la aspiración en las bombas de
vacío obligatoriamente después de terminar un ensayo y cada vez que se
aspire una nueva muestra tras el paso de hibridación
•
Atemperar la SH (solución de hibridación) a temperatura ambiente,
asegurarse antes de utilizarlo que no tiene cristales, si los tuviera dejarla a
temperatura ambiente hasta que desaparezcan.
•
Asegurarse de que los termomixers han alcanzado la temperatura
adecuada antes de introducir los tubos AT. Si no es así dejar el AT en
tampón de lavado antes de retirarlo, nunca dejar seco el cristal.
•
En caso de fallo de lectura, introducir manualmente el número que aparece
en el tubo AT especificado como Assay ID.
Visualización
1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los
productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el
termociclador, lo más separado posible, e incubar a 95º C durante 10
minutos, NUNCA SOBREPASAR LOS 10 MINUTOS. Programar en el
termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos
los amplificados sigan a 95º C. Sacar los tubos de la incubación a 95º C
y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo.
2. Preparación de la Solución TL diluida:
•
Para 12 muestras, añadir 2 ml de Solución TL a 18 ml de agua
destilada.
•
Para 24 muestras, añadir 3 ml de Solución TL a 27 ml de agua
destilada.
•
Para 48 muestras, añadir 6 ml de Solución TL a 54 ml de agua
destilada.
- 21 -
3. Pre-lavado del tubo AT: antes de empezar el ensayo es necesario lavar
los tubos AT añadiendo 300 µl de Solución TL diluida a cada AT e
invirtiendo el tubo 10-15 veces. Desechar la Solución TL diluida con
pipeta o preferiblemente con vacío.
Repetir este paso de lavado una vez más. Este paso es necesario para
lavar los tubos, que vienen envasados, antes de añadir la muestra. El
tubo debe quedar sin restos de la solución de lavado, para ello también
secamos las tapas, pero en ningún momento se deben dejar los tubos
secos durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución
inmediatamente.
4. Hibridación: Antes de usar la Solución SH, ésta debe estar a Tª
ambiente. Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100
µl de Solución SH (evitar que se forme espuma) a cada tubo AT. Añadir
5 µl de producto de PCR desnaturalizado de cada uno de los tubos de
amplificación (incoloro y verde) al tubo AT. Resuspender varias veces
para que se mezcle con la solución de hibridación, con cuidado de no
tocar el cristal. Incubar en el termobloque durante 1 hora a 50ºC,
agitando a 550 rpm.
Tras esta incubación, sacar los tubos y desechar la Solución SH con
pipeta o vacío. UTILIZAR UNA PUNTA O PIPETA PASTEUR
DIFERENTE PARA CADA TUBO en el caso de utilizar vacío. Dejamos
programado el termobloque a 30ºC y en movimiento para su utilización
posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la
temperatura.
5. Lavado: añadir 300 µl de Solución TL diluida a cada tubo AT e invertir
los tubos de 10-15 veces. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o
vacío. Si llegado a este paso, el termobloque no hubiera llegado a los
30ºC se dejan los tubos con Solución TL diluida hasta que el
termobloque alcance la temperatura.
6. Bloqueo y conjugado: 15 minutos antes de concluir la hibridación, se
debe preparar la solución de conjugado y mantener en hielo. Se
recomienda centrifugar la solución CJ durante 10 segundos antes de
usarla. A continuación, preparar la solución CJ diluida. Hacer este
proceso en hielo. Para ello, mezclar en un tubo 100 µl de Solución DC y
1 µl de Solución CJ por cada AT (preparar mezcla para un AT extra por
cada serie de diez, para compensar los errores de pipeteo). La Solución
CJ diluida conservada a 4º C es válida hasta 4 horas después de su
preparación. No utilizar una vez transcurrido este tiempo.
Vortear la solución una vez diluida para homogenizar y añadir al tubo
AT 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos*
- 22 -
a 30ºC, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, desechar la solución
del tubo AT con pipeta o vacío rápidamente, asegurarse de que se ha
retirado todo el volumen y el cristal quede seco.
Bajamos la temperatura del termomixer a 25 ºC para su utilización en el
paso 8.
* El margen de esta incubación es de 13-18 minutos, Genómica no se responsabiliza de los
resultados obtenidos fuera de este rango de tiempo.
7. Lavado 1: Añadir inmediatamente 300 µl de Solución TL diluida a cada
tubo AT e invertir los tubos de 10-15 veces, desechar la solución con la
pipeta o vacío. Si este lavado no se realiza rápidamente puede
causar en la lectura una señal no legible. Asegurarse de que se ha
retirado todo el volumen y el cristal quede seco.
8. Lavado 2: Este lavado es el más importante. Añadir 300 µl de
Solución TL diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 10-15 veces,
desechar la solución con la pipeta o vacío. Es importante que no
queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría con la Solución
RE dando lugar a una señal inespecífica. No es necesario el cambio de
punta para cada tubo, pero sí es importante no tocar el cristal.
9. Revelado con Solución RE: Se recomienda trabajar en tandas de 12
tubos AT. Coger en el momento de su uso y mantener durante su
manipulación en hielo Quitar la solución TL, asegurarse de que se ha
retirado todo el volumen y el cristal quede seco. Añadir 100 µl de
solución RE al tubo AT e incubar 10 minutos exactos* a 25º C en el
termobloque sin agitación.
* El margen de esta incubación es de 10-15 minutos, Genómica no se responsabiliza de los
resultados obtenidos fuera de este rango de tiempo.
¡Advertencia! Es muy importante utilizar el Termobloque sin agitación y
leer las muestras inmediatamente después de la incubación.
10. Leer en forma “Análisis seriados” en la que se toman las imágenes de
todos los tubos para posteriormente ser analizadas automáticamente.
8.4.2. Visualización del producto CLART® ENTHERPEX CS
Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización:
1. Encender el CAR (Clinical Array Reader) al comienzo del proceso. La
autocalibración del equipo tarda unos minutos y es necesario, si se desea,
introducir el nombre de las muestras de cada pocillo en el programa antes
de la lectura. El aparato debe estar listo en el momento de la lectura para
evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado.
- 23 -
2. PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO, NO
REUTILIZAR
SOLUCIONES
O RESTOS
PREPARADAS
CON
ANTERIORIDAD.
3. Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de poner
en marcha el programa de desnaturalización. Colocar los tubos de
amplificación separados en el termociclador durante el proceso y nunca
sobrepasar los 10 min. de desnaturalización.
4. Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro pero sí es
necesario usar una punta diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez
que se añada un nuevo reactivo, aunque se trate de TL. Sí es necesario
utilizar puntas con filtro durante la adición de amplificados al pocillo CS.
5. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas
para aspirar las soluciones, desechar los peines después de cada uso o
descontaminarlos con una solución de lejía diluida al 10% tras cada ensayo.
Asegurarse de que la bomba aspira correctamente y aclarar la solución de
lejía aspirando agua destilada.
6. Al aspirar las diferentes soluciones dentro de los pocillos de la tira NO
se dejará volumen residual.
7. Atemperar la SH a temperatura ambiente. Asegurarse de que no tiene
cristales en el momento de uso.
8. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridación el termomixer de
placas ha estado a 59ºC al menos durante 30 min o 1 hora.
9. Introducir la tira en el termomixer INMEDIATAMENTE después de añadir
los productos amplificados especialmente si se van a realizar muchas tiras.
10. En el caso de que se realicen un número alto de tiras a la vez, se
recomienda añadir los reactivos (salvo los amplificados) con pipetas
multicanal y cubetas específicas, para esto se debe seleccionar una cubeta
para cada tipo de reactivo. Al final de cada ensayo se deben lavar las
cubetas con lejía al 10%, y después con agua destilada.
VISUALIZACIÓN:
1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos
de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador,
lo más separado posible, e incubar a 95º C durante 10 minutos, NUNCA
SOBREPASAR LOS 10 MINUTOS. Programar en el termociclador 15
minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos los amplificados
sigan a 95º C. Sacar los tubos de la incubación a 95º C y colocarlos
- 24 -
inmediatamente en un recipiente con hielo.
2. Preparación de la Solución TL diluida:
Por cada CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado
diluida, añadiendo 1 ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada.
3. Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los
CS añadiendo 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo. Resuspender de
10 a15 veces con la pipeta multicanal, teniendo en cuenta que no se debe
tocar la superficie del array. Se recomienda realizar este lavado mientras
se están desnaturalizando los amplificados y mantener la solución de
lavado en la tira hasta que se vaya a proceder a la adición de los
mismos. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con
bomba de vacío.
El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe
permanecer seco durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución
inmediatamente.
4. Hibridación: Antes de usar la Solución SH, ésta debe estar a Tª ambiente y
sin cristales. Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl
de solución SH (evitar que se forme espuma) a cada pocillo de los CS. A
continuación, añadir 5 µl de producto de PCR desnaturalizado.
Resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de
hibridación SH, con cuidado de no tocar el fondo del pocillo. Se
recomienda cargar cada tira de manera independiente y separada del resto
para evitar contaminaciones. Al concluir la adición de muestra en cada tira,
debe ir inmediatamente al termomixer de placas, para evitar que esté
demasiado tiempo a temperatura de laboratorio y evitar las posibles
renaturalizaciones de los amplicones. Incubar la tira cubierta con la tapa de
plástico transparente en el termomixer de placa tapado durante 1 hora a
59º C, agitando a 550 rpm.
Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la Solución SH de los CS
con pipeta o bomba de vacío: El array debe quedar sin restos de solución,
aunque nunca debe permanecer seco durante mucho tiempo. Añadir la
siguiente solución inmediatamente. (Dejamos programado el termomixer de
placa a 30º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 6.
Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura).
5. Doble Lavado: añadir 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS,
resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal. Desechar la
Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío
multicanal sin dejar remanente. Repetir la operación. Este paso se debe
realizar con puntas diferentes para cada pocillo en ambos lavados. Si
llegado a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 30º C, se dejan
- 25 -
los pocillos con esta solución hasta que el termomixer alcance la
temperatura.
6. Bloqueo y conjugado: se recomienda centrifugar la solución CJ de alta
afinidad durante 10 segundos antes de usarla. A continuación, preparar la
solución CJ diluida. Por cada CS, se añade 1 ml de solución DC y 7.5 µl de
Solución CJ de alta afinidad.
Desechar la Solución TL diluida sin dejar restos de solución y añadir a cada
pocillo del CS 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos
exactos en el termomixer de placa a 30º C, agitando a 550 rpm. Tras esta
incubación, sacar la placa y desechar la solución rápidamente con pipeta o
bomba de vacío multicanal. (Dejar programado el termomixer de placa a
25º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 8. Podemos
quitar la tapa para que baje antes la temperatura).
7. Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de Solución TL diluida a
cada pocillo del CS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal
y desechar completamente la solución con la pipeta o vacío. Repetir la
operación dos veces más.
Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta
reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica.
8. Revelado con Solución RE: quitar la solución TL diluida completamente y
añadir 100 µl de solución RE a cada pocillo del CS e incubar 10 minutos a
25 º C en el termomixer de placa sin agitación.
¡Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación
9. Desechar la Solución RE completamente con pipeta o vacío. El array debe
quedar seco.
10. CAR (Clinical Array Reader): Se coloca en el CAR el adaptador y encima la
placa para tomar las imágenes de todos los pocillos para posteriormente
ser analizadas automáticamente.
9. LECTURA DE RESULTADOS
El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se
realiza de forma automática. El equipo de lectura y análisis presentará un informe
en el que se indican los resultados.
En la pantalla del equipo aparecerá una tabla con tres columnas, en la columna de
la izquierda aparecerán los virus que se caracterizan en el micro-array. En la
- 26 -
columna del centro aparece el resultado de positivo o negativo para cada virus, y
en la columna de la derecha aparecerá la conformidad del control de amplificación.
10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los
falsos negativos debidos fundamentalmente a la presencia de inhibidores de la
ADN polimerasa en las muestras en las que se quiere analizar la presencia del
virus (hemoglobina, restos de parafina, sales, etc). Con el kit CLART
ENTHERPEX se han eliminado estos falsos negativos de amplificación gracias a
la introducción de un control interno en ambos tubos de reacción donde se analiza
la muestra.
Cada tubo de amplificación contiene los siguientes oligos:
•
•
Oligos que amplifican un plásmido modificado incluido en el tubo de
amplificación y que se usa como control de amplificación de la reacción de
RT-PCR/PCR.
Oligos específicos de Herpes virus y Enterovirus.
El tubo de RT-PCR se ha diseñado para favorecer la amplificación de los virus
frente a la del control de amplificación. De manera que, en ciertas condiciones (ej.
cuando hay un elevado número copias de un virus o cuando la muestra presenta
coinfecciones con varios virus a la vez), puede suceder que no se amplifique el
control y aparezca una lectura de: CONFORME.
Teniendo en cuenta estas observaciones, podemos considerar las siguientes
interpretaciones de los resultados de lectura:
1. Muestras positivas:
1.1. Con control de amplificación positivo
Virus
Especie
Resultado
Positivo
Control
Control Interno
Control
Conforme
Señal
> 0.150
Resultado
Conforme
AT
- 27 -
Marca de alineamiento
VIRUS
Control de amplificación
CS
VIRUS
Marca de alineamiento
Control de amplificación
Este se considera un RESULTADO VÁLIDO. Podemos decir que se trata de un
verdadero resultado positivo.
1.2. Con control de amplificación negativo
Virus
Especie
Resultado
Positivo
Control
Control Interno
Control
Conforme
Señal
< 0.150
Resultado
Sin señal
AT
- 28 -
Marca de alineamiento
VIRUS
CS
VIRUS
Marca de alineamiento
Este se considera un RESULTADO VÁLIDO, aunque el control de amplificación se
muestre SIN SEÑAL. Esto se debe al efecto de la competencia con los virus. Podemos
decir que se trata de un verdadero resultado positivo.
2. Muestras negativas
Virus
Especie
Resultado
Negativo
Control
Control Interno
Control
Conforme
Señal
> 0.150
Resultado
Conforme
AT
Marca de alineamiento
Control de amplificación
CS
- 29 -
Marca de alineamiento
Control de amplificación
Este se considera un RESULTADO VÁLIDO. En este caso podemos decir que se trata de
un verdadero resultado negativo.
3. Muestras inadecuadas, inhibidas
Virus
Especie
Resultado
Negativo
Control
Control Interno
Control
PCR Inhibida
Señal
< 0.150
Resultado
Sin señal
AT
Marca de alineamiento
CS
Marca de alineamiento
Este se considera un RESULTADO NO VÁLIDO. Esto se debe a que algunas sustancias
pueden inhibir la reacción de PCR al perjudicar la actividad de la enzima ADN polimerasa.
- 30 -
La solución es verificar que en la muestra o el material genético extraído no hay presencia
de ninguna de estas sustancias. Se recomienda repetir la extracción o, si esto no es
posible, pedir al facultativo una nueva toma de muestra al paciente.
Existen dos posibilidades que dan lugar a un resultado de Virus No Concluyente:
•
En aquellos casos en que las réplicas de una sonda sean muy distintas
entre sí.
•
En coinfecciones de más de 5 virus.
11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
Control de interferencias conocidas:
Existen sustancias que pueden interferir en funcionamiento del kit CLART
ENTHERPEX. Principalmente, son sustancias que inhiben la mezcla de enzimas
y, por tanto, la reacción de amplificación. Las interferencias más conocidas son:
1 Presencia de hemoglobina o parafina tras la extracción del DNA/RNA.
Tanto el ADN extraído a partir de muestras de sangre total o hemoderivados,
como el obtenido a partir de muestras de tejidos incluidos en parafina, puede
contener restos de hemoglobina y parafina respectivamente. Este problema se
puede evitar purificando el DNA/RNA tras su extracción
2 Restos de Isopropanol en el ADN/ARN. En el proceso de extracción del
ADN/ARN a partir de muestras de suero, plasma y LCR, se tiene que precipitar
este con Isopropanol. Si no se procede a un secado correcto del precipitado, la
presencia de Isopropanol en la muestra puede producir una inhibición de la
reacción de amplificación.
3 Utilización de muestras no adecuadas. El análisis de cualquier otro tipo de
muestra clínica distinta a las indicadas en el manual del kit CLART
ENTHERPEX, así como una toma incorrecta de las muestras, puede conllevar
que el resultado del análisis no sea concluyente o no conforme por falta de
amplificación por reacción inhibida. Por ejemplo, si la torunda ha sido incluida
en algún tipo de medio, la PCR puede resultar inhibida. Si el tiempo de fijación
de un tejido en formol es excesivo, el ADN puede degradarse.
4
Actividad residual de la Proteinasa K. En el proceso de extracción de
ADN/ARN en muestras de torundas y biopsias, se tiene que inactivar la
Proteinasa K mediante incubación a 100 ºC durante 10 minutos. Bajo estas
condiciones, la inactivación se produce de forma completa. Si este paso fuera
omitido o las condiciones se suavizaran significativamente, podría ocurrir que
permaneciese una actividad residual de la Proteinasa K, lo que podría resultar
- 31 -
en una degradación de la ADN polimerasa y, por tanto, inhibición de la PCR.
5 La conservación inadecuada de las muestras puede influir en el resultado
del análisis. Si las muestras se someten a condiciones que puedan provocar
una degradación del ADN/ARN que contienen.
Especificaciones técnicas:
1. Parámetros Analíticos:
•
Sensibilidad analítica. La sensibilidad analítica se determina mediante la
amplificación de diluciones seriadas de ADN de plásmidos recombinantes
para cada uno de los virus detectados en el kit. Cada uno de ellos lleva
inserto el producto amplificado (incluyendo la parte complementaria a las
sondas específicas de detección). La visualización se realizó tanto en AT
como en CS, dando lugar a los mismos resultados, que se resumen en la
siguiente tabla.
VIRUS
Nº copias de plásmido
recombinante por
reacción de PCR
VZV
HHV-7
HSV-1
HSV-2
CMV
EBV
HHV-6
HHV-8
Coxsackivirus
Echovirus
Poliovirus
10
100
1000
Tabla 1: Relación de número de copias de plásmido recombinante (especificadas
por tipo vírico) necesarias para obtener una sensibilidad del 100% en la
detección de cada uno de los virus.
•
Especificidad analítica. Se llevaron a cabo experimentos de especificidad
con plásmidos recombinantes, visualizados en AT y CS. Los resultados
fueron idénticos en ambas plataformas.
VIRUS
HSV-1
VZV
CMV
HHV-6
HHV-7
HHV-8
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
100 %
- 32 -
HSV-2
EBV
Enterovirus
99.4 %
92.2 %
Tabla 2: Especificidad analítica por tipo vírico
2. Parámetros de utilidad diagnóstica.
Para determinar los parámetros diagnósticos del kit, se han realizado estudios
comparativos de la técnica CLART® ENTHERPEX con extracción manual
exclusivamente y visualización en AT, frente a las siguientes técnicas:
-
Herplex® : para los virus HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV y HHV-6
PCR cuantitiva: en algunos de los casos, para CMV y EBV
PCR tiempo real: para Enterovirus
PCR de desarrollo propio y detección en gel: para los virus HHV-7 y HHV-8
Inmunohistoquímica para HHV-8
Se ha validado el kit en los centros Hospital Universitario Marqués de Valdecilla
(Santander), Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa (Zaragoza) y Hospital
Universitario La Paz (Madrid). El total de muestras estudiadas ha sido 173, de las
cuales 30 son torundas, 56 sueros/plasmas, 19 LCR y 68 son biopsias.
El análisis de los resultados de las muestras estudiadas se refleja en la siguiente
tabla:
VIRUS
HSV-1
Torundas
Suero/Plasma
LCR
Biopsias
Total
HSV-2
Torundas
Suero/Plasma
LCR
Biopsias
Total
VZV
Torundas
Suero/Plasma
LCR
Biopsias
Total
CMV
Muestras
Positivas
Analizadas
Muestras
Negativas
Analizadas
Total
Sensibilidad (%)
Especificidad
(%)
16
4
7
8
35
14
52
12
60
138
30
56
19
68
173
100
75
57.1
87.5
100
100
100
100
4
0
0
4
8
26
56
19
64
165
30
56
19
68
173
75
--100
100
--100
3
1
2
4
10
27
55
17
64
163
30
56
19
68
173
100
100
100
100
100
100
94.1
95.3
- 33 -
Torundas
2
28
30
50
Suero/Plasma
47
9
56
87.2
LCR
8
11
19
62.5
Biopsias
41
27
68
95.1
Total
98
75
173
EBV
Torundas
6
24
30
100
Suero/Plasma
2
54
56
100
LCR
2
17
19
100
Biopsias
38
30
68
94.7
Total
48
125
173
HHV-6
Suero/Plasma
9
47
56
77.8
Torundas
0
30
30
-LCR
3
16
19
33.3
Biopsias
23
45
68
91.3
Total
35
138
173
HHV-7
Torundas
3
27
30
100
Suero/Plasma
2
54
56
100
LCR
1
18
19
100
Biopsias
11
57
68
100
Total
17
156
173
HHV-8
Torundas
0
30
30
-LCR
0
19
19
-Suero/Plasma
3
53
56
100
Biopsias
2
66
68
100
Total
5
168
173
ENTEROVIRUS
Suero/Plasma
0
56
56
-Biopsias
0
68
68
-Torundas
0
30
30
-LCR
10
9
19
80
Total
10
163
173
®
Tabla 3: Parámetros diagnósticos de la Técnica CLART ENTHERPEX
100
100
100
100
100
98.1
94.1
93.3
100
-100
100
100
100
100
100
--100
100
---100
Para la validación de la plataforma CLART-Strip® se visualizaron
comparativamente 126 amplificados en la plataforma candidata a ser sustituida
Array Strip (AS) y que previamente había sido validada por comparación con la
plataforma Array Tubes (AT), y en la plataforma CS, con el siguiente reparto de
virus:
N = 120
Nº Muestras virus analizados
- 34 -
Resultado AS
Versión 8.0
Resultado CS
Versión 8sc.0
24
36
24
30
28
24
24
31
24
6
HSV1
HSV2
VZV
CMV
EBV
HHV6
HHV7
HHV8
ENTEROVIRUS
NEGATIVAS
24
36
24
30
28
24
24
31
24
6
24
36
24
30
28
24
24
31
24
6
TABLA 4. MUESTRAS ANALIZADAS PARA LA COMPARATIVA AS/CS.
La concordancia en los resultados en ambas visualizaciones es del 100%, lo que
no modifica los parámetros diagnósticos antes descritos.
12. BIBLIOGRAFÍA
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