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POSIBLE REGULACIÓN POST-TRANSCRIPCIONAL
EN CÉLULAS DE MÚSCULO LISO DE AORTA DE
POLLO
Carazo, A; Alejandre, M.J.; Perales, S.; Vigil, A.; Castillo, M.; Linares, A.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Granada
INTRODUCCIÓN
Uno de los niveles de regulación de la concentración de mRNA
de la HMG-CoA reductasa se produce a través del control de la vida
media del mensajero. En el trabajo que presentamos hemos realizado
experimentos paralelos en los que se han determinado la actividad
enzimática y la concentración de mRNA de la HMG-CoA reductasa
en cultivos de SMC en distintos tiempos tras el cambio de medio y
durante un periodo de 45 h, con el objetivo de comprobar la
estabilidad del mRNA y su relación con la actividad enzimática.
1
log (Nt/Ns)
3-Hidroxi-3-Metil-Glutaril-CoA
reductasa
(HMG-CoA
reductasa) (EC 1.1.1.34) es una enzima de la membrana del retículo
endoplásmico que cataliza la conversión de HMG-CoA a mevalonato,
reacción limitante de la velocidad de biosíntesis del colesterol, además
juega un papel importante en la división celular mostrando una
activación justo antes de la fase S (1). En cultivo de células la
actividad HMG-CoA reductasa experimenta un gran incremento tras
el cambio de medio (2). Este incremento de actividad se produce en
cultivos no sincronizados por lo que es independiente del ciclo celular
(3). En nuestro laboratorio hemos comprobado recientemente que
tras el cambio de medio en cultivos de células de músculo liso (SMC)
de aorta de pollo no sincronizados se produce un incremento de la
concentración de mRNA de la HMG-CoA reductasa (4).
y = -x + 6,6164
0,8
2
R = 0,9876
0,6
0,4
0,2
0
5,6
5,8
6
6,2
6,4
6,6
6,8
log (Nos)
RT-PCR1.- 25 ng de RNA citoplásmico y 875 fg de patrón (aprox. 4∙106 moléculas).
RT-PCR2.- 25 ng de RNA citoplásmico y 437,5 fg de patrón (aprox. 2∙106 moléculas).
RT-PCR3.- 25 ng de RNA citoplásmico y 218,7 fg de patrón (aprox. 106 moléculas).
RT-PCR4.- 25 ng de RNA citoplásmico y 109,3 fg de patrón (aprox. 5∙105 moléculas).
Fig.1.- Electroforesis de los productos RT-PCR competitivo.
Análisis de los datos. Nt: cantidad final de cDNA problema.
Ns:
cantidad final de DNA patrón. N0s: cantidad inicial de
DNA
patrón
[mRNA-reductasa] (molc./ng RNA)
1200000
MÉTODOS
1000000
800000
600000
400000
200000
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tiempo (horas)
Fig.2.- Incremento del mRNA de la HMG-CoA reductasa tras el
cambio de medio en cultivos de SMC de aorta de pollo de tres pases y
degradación hasta niveles basales. Los resultados son media ± SEM de
dos experimentos.
7000
-1
(pmoles·minuto ·mg proteina )
6000
5000
-1
ACTIVIDAD HMG-CoA REDUCTASA
8000
4000
3000
2000
1000
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
TIEMPO (horas)
Fig.3.- Oscilaciones de la actividad HMG-CoA reductasa medida a
distintos tiempos tras el cambio de medio de cultivo SMC de aorta de
pollo. Los resultados son media ± SEM de dos experimentos.
Las células de músculo liso (SMC) de aorta de pollo se han
aislado y cultivado como describe Carazo y col. (5). Se aisló RNA
citoplasmático de cultivos SMC y se cuantificó el mRNA de la
reductasa mediante RT-PCR competitivo utilizando Tth polimerasa
(Gene Craft) (7). Los cebadores homólogos fueron diseñados a partir
de un fragmento de cDNA de HMG-CoA reductasa de pollo clonado y
secuenciado por Carazo y col. (4). La construcción del estándar
competitivo fue realizada mediante cebadores compuestos según
Carazo y col. (4). La actividad HMG-CoA reductasa se determinó
según Goldstein y col. (8) con ligeras modificaciones.
RESULTADOS
Se prepararon cultivos SMC con tres pases . A tiempo 0, con 6070 % de confluencia, se cambió el medio de cultivo y en cada tiempo se
recogieron las células para determinar mRNA de HMG-CoA reductasa
y actividad enzimática. La figura 1 muestra el resultado de una técnica
RT-PCR no radiactiva, muy sensible y reproducible para determinar
las concentraciones, generalmente muy bajas, de mRNA de la HMGCoA reductasa de cultivos de SMC. Esta técnica combina las ventajas
de un RT a elevadas temperaturas y la cuantificación de DNA usando
bromuro de etidio, los ensayos hechos en la zona lineal de la
densitometría de la tinción del DNA dan un R2 > 0.98. La figura 2
muestra el incremento en la concentración de mRNA tras el cambio de
medio, siendo el número de moléculas de mRNA hasta 10 veces
superior 2h después, bajando de forma lineal hasta valores basales a
las 32 h, lo que parece indicar una tasa de degradación constante con
una vida media de 12h. La figura 3 representa los valores de actividad
HMG-CoA reductasa determinados en cultivos SMC de experimentos
paralelos
en
los
que
podemos
observar
oscilaciones
independientemente de la cantidad de mRNA. Ya que la estabilidad
del mRNA de la HMG-CoA reductasa no puede explicar las
oscilaciones en la actividad de esta enzima debemos pensar en una
regulación a nivel post-transcripcional en estas células para cuya
determinación serán necesarios nuevos estudios.
BIBLIOGRAFÍA
1.- Quesney-Huneeus, V., Galick, H.A., Siperstein, M.D., Erickson, S.K., Spencer, T.A. and Nelson, J.A. 1983. The dual role of mevalonate in the cell cycle
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Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 70: 2162-2166.
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4.- Carazo, A., Alejandre, M.J., Suarez, M.D. and Linares, A. 2000. Alterations in 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Reductase mRNA concentration in cultured chick aortic
Smooth Muscle Cells. Lipids 35, 6,587-593 .
5.- Carazo, A., M.J., Alejandre, R., Díaz, A., Ríos, M. Castillo, and A. Linares. 1998. Changes in cultured Arterial Smooth Muscle Cells Isolated from Chicks upon
Cholesterol Feeding. Lipids 33: 181-190
6.- Myers, T.W. and D.H. Geldfand. 1991. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochem. 30: 7661-7666.
7.- Goldstein, J.L., Basu, S.K. and Brown, M.S. 1983. Receptor mediated endocitosis of low-density-lipoprotein in cultured cells. Methods Enzymol 98, 241-260.