Download 7-7.4 DNA Rec

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIHUAHUA
FACULTAD DE DIENCIAS QUIMICAS
BIOLOGÍA MOLECULAR
TECNOLOGÍAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y DNA
RECOMBINANTE.
TEMAS 7 - 7.4
Alondra Olivia Chavez Amaya
168117
INDICE
• Objetivos
• Errores mas frecuentes.
• Tecnologías en biología molecular y DNA
recombinante.
• Digestión de DNA con enzimas de restricción.
• Mapas de restricción.
• Electroforesis en geles de agarosa.
• Bibliografía.
OBJETIVOS
• Reconoce los fundamentos químicos para el aislamiento de DNA de
organismos. Conoce las características y funciones de los
plasmidos bacterianos. Explica el procedimiento para el aislamiento
de plasmidos y su cuantificación. Reconoce las propiedades y
funciones de las enzimas de restricción.
• Explica los procedimientos para la elaboración de mapas de
restricción de genes y genomas, así como la importancia de este
análisis para la caracterización del DNA. Reconoce los
fundamentos de la electroforesis para la separación de ácidos
nucleicos . Explica los procedimientos para la separación de
fragmentos de DNA, por medio de electroforesis submarina en
geles de agarosa, así como la importancia de este análisis para la
caracterización del DNA
ERRORES FRECUENTES
• Confundir la acción de las enzimas que
participan en la digestión del DNA.
• No comprender el sentido de los mapas
de restricción.
Tecnologías en biología molecular
y DNA recombinante
• Creación de nuevas combinaciones de
segmentos o moléculas de DNA.
• Se reserva a las moléculas de DNA que
proviene de diferentes fuentes biológicas.
• El proceso consiste en tomar una
molécula de ADN de un organismo, sea
un virus, planta o una bacteria y en el
laboratorio manipularla y ponerla de nuevo
dentro de otro organismo.
ESQUEMA BASICO
Vector + Fragmento de DNA
DNA Recombinante
Replicación del DNA recombinante dentro de las
células huésped
Aislamiento, secuenciación y manipulación del
fragmento de DNA purificado
Enzimas de restricción
• También conocidas como endonucleasas, cortan los
enlaces fosfodiester a partir de ua secuencia que
reconocen.
• La secuencia que reconocen es una secuencia
palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas
direcciones).
• Son extraídas de bacterias, donde actuan como
mecanismo de defensa para degradar material genético
extraño que entre en la célula.
• Las enzimas - BamHI, HindIII y EcoRI, toman el nombre
de las bacterias que la producen:
– EcoRI: E = género Escherichia.
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
TIPOS DE ENDONUCLEASAS
- Las del tipo I cortan el DNA al azar.*
- Las de tipo III cortan el DNA a unos 25 pb de
la secuencia de reconocimiento.*
- Las de tipo II no necesitan ATP y cortan el
DNA en la misma secuencia de
reconocimiento.
* Se mueven a lo largo del DNA mediante un
mecanismo que requiere ATP
CLONACION EN E. coli
• E. coli fue el primer organismo utilizado y
todavía es la célula huésped mas común.
• Tiene muchas ventajas:
- Se conoce bien el metabolismo de su DNA.
- Muchos vectores de clonación que se
encuentran asociados de manera natural, están
bien caracterizados
- Se dispone de técnicas efectivas para la
transferencia de DNA de una bacteria a otra.
CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.
• Los
fragmentos
pueden ligarse
a un plasmido
CORTE DE MOLECULAS DE DNA
MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION
Un fragmento sintético de
DNA que contenga las
secuencias de
reconocimiento de
varias endonucleasas
de restricción se puede
insertar en un plásmido
tratado previamente
con una endonucleasa
de restricción
Electroforesis de DNA:
– Después de tratar el lambda DNA con las
diferentes enzimas, los fragmentos son
separados por su tamaño usando un gel de
electroforesis.
– Luego de que la gel se “corre” el DNA se tiñe
para revelar los patrones de bandas formados
en el gel que corresponden a fragmentos de
diferentes tamaños.
Principios de electroforesis
• Técnica usada para separar y purificar
macromoléculas (i.e. proteinas, ácidos
nucleicos) que varían en tamaño, carga o
conformación.
• Cuando moléculas cargadas son
colocadas en un campo eléctrico, estas
migran hacia el polo positivo (ánodo) o
polo negativo (cátodo) de acuerdo a su
carga.
Geles comúnmente usados:
• Agarosa: polisacárido extraido de algas.
No tóxico. Poco poder de resolución pero
alto grado de separación. Separa
fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb.
• Poliacrilamida: polímero de acrilamida.
Tóxico. Menor grado de separación pero
alto poder de resolución. Usado para
fragmentos de DNA de 500 pb. Usado
para separar mezclas de proteínas.
BIBLIOGRAFIA
• Nelson, D; Cox, M. LEHNINGER PRINCIPIOS DE
BIOQUIMICA. 4ª edicion. Edit. Omega. Pags. 306317.
• Alberts y cols. BIOLOGIA MOLECULAR DE LA
CELULA. 4ª edicion. Ediciones Omega. Pags. 500504.
• Lodish y cols. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR.
5ª edicion. Ed. Medica Panamericana. Pags.
• Karp, G. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 4ª
edicion. Edit. Mc Graw Hill. Pags. 822-835
• http://laguna.fmedic.unam.mx/lenpres/CH29.ppt#286
• http://cultura.terra.es/cac/articulo/html/cac1321.htm