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Enzimas de restricción y
electroforesis
Enzimas de restricción
• Son endonucleasas específicas capaces de
reconocer secuencias palindrómicas de
DNA y cortar los enlaces fosfodiéster del
material genético en un punto específico.
• Palindrómicas quiere decir que leen en
direcciones opuestas el mismo orden de
nucleótidos.
5’ G T T A A C 3’
3’ C A A T T G 5’
Tipos de endonucleasas
• Endonucleasa Tipo I – corta lejos de la
sucuencia que reconoce, ya sea río arriba o
río abajo.
• Endonucleasa Tipo II – cortan dentro de la
secuencia que reconocen.
• Endonucleasa Tipo III – cortan de 5-8
bases antes o después de la secuencia que
reconocen.
Enzimas de restricción
• Son suceptibles a cambios en temperatura, pH, etc.
• Estas enzimas se obtienen de células bacterianas.
• El nombre de estas está dado según el género y la
especie de la bacteria de dónde se aisló por
primera vez esta enzima.
• La primera letra representa el género de la
bacteria, las próximas dos indican la especie, la
cuarta letra indica la cepa y el número al final
indica el número de enzima que se ha aislado de
esa cepa.
Enzimas de restricción
• Por ejemplo:
EcoRI
Escherichia
coli
(género) (especie)
Primera enzima aislada
de ese organismo.
cepa R
• Otros ejemplos:
– BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de
Bacillus amyloliquefaciens
– SmaI – la primera que se aisló de Serratia marcesens
– HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de
Haemophilus influenzae
Tipos de corte
• “Sticky” o pegajosos – es
más fácil para volver a
ligarse los extremos.
– Ejms.
• EcoRI
• Bam HI
• HindIII
• “Blunt” o abruptos
– Ejm.
• SmaI
Enzimas de restricción
• Las endonucleasas son de gran importancia
para la ingeniería genética, ya que permiten
desarrollar técnicas de clonación.
• Además, te permite realizar mapas de
restricción y determinar si existe homología
entre otras moléculas de DNA.
Electroforesis
• Se define como el
movimiento de
partículas de carga
bajo la influencia de
un campo eléctrico a
través de un medio
semisólido.
• Este medio puede ser
de agarosa o de
poliacrilamida.
Electroforesis
• El DNA es de carga
negativa, por lo que
las partículas migran
del electrodo negativo
(cátodo) al electrodo
positivo (ánodo).
• Esta migración es
inversamente
proporcional al peso
molecular de las
muestras.
Electroforesis
• Materiales necesarios para
llevar a cabo una
electroforesis:
– Gel de agarosa –
generalmente se utiliza de
1% - 2% de agarosa.
– Cámara de electroforesis
– contiene los electrodos
– “Power supply” – genera
el campo eléctrico
Electroforesis
– Amortiguador de
electroforesis - usualmente
TBE 1X; facilita la
migración de DNA y
mantiene una estabilidad
– Bromuro de etidio –
compuesto carcinógeno que
se entrecruza entre las
moléculas de DNA y cuando
se irradia con luz ultravioleta
emite fluorescencia.
Electroforesis
– “Loading dye” – compuesto
que se añade a las muestras de
DNA; contiene glicerol, que le
da peso a la muestra y no
permite que se salgan de la fosa,
y bromofenol azul que tiñe la
muestra de color azul y sirve
como indicador de migración
– Lámpara de UV – permite ver
las bandas generadas
– Cámara – para tomar una foto
de la gel
Electroforesis